CN106525795A - 一种用于检测霉菌毒素的荧光传感器及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测霉菌毒素的荧光传感器及其应用方法，属于分析化学领域。在两组石墨烯量子点表面分别修饰上霉菌毒素对应的核酸适配体DNA或与适配体DNA互补的探针DNA，通过DNA杂交使石墨烯量子点聚集，发生激子能量转移，导致石墨烯量子点荧光信号淬灭；随后加入霉菌毒素，霉菌毒素与核酸适配体DNA特异性结合，结构发生转变，引起石墨烯量子点聚集体解组装而重新分散，体系荧光强度恢复。本发明所述的用于霉菌毒素的荧光传感器的制备方法，过程简单易行、绿色环保、成本低、灵敏度高、特异性好，并成功用于实际红酒样品中霉菌毒素的加标回收。

Description

一种用于检测霉菌毒素的荧光传感器及其应用方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种利用核酸适配体结构转换策略调控石墨烯量子点的聚集状态，从而调控荧光信号的淬灭和恢复来检测霉菌毒素的方法。
背景技术
霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，是一种存在饲料和原料中的抗营养因子，是毒素很强的霉菌次生代谢产物。它们可通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，
赭曲霉素A(Ochratoxin A)，简称OTA，是曲霉素和青霉素的某些菌种产生的一组有毒代谢产物，对人和动物都具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，国际癌症研究机构IARC将其定为IIB类致癌物。据报道，在全球范围内，赭曲霉素A对农作物的污染都比较严重，广泛存在于谷类(比如小麦、大麦、燕麦、玉米等)、豆类、香料、花生、咖啡豆和干果中，在饮料中(比如啤酒、葡萄酒、葡萄汁等)也可以检测到OTA，葡萄酒中OTA由Zimmerli Brand等在1995年首次检测出。欧洲整体膳食评估中心对食品中OTA进行了分析，结果发现欧洲人从谷物中摄取到的OTA含量占到总摄取量的50％，而葡萄酒以13％仅次于谷物。因此，OTA在葡萄酒中的污染日趋受到人们的关注。葡萄酒作为一种健康时尚的饮品，在全世界都非常受欢迎，有着非常大的消费量。目前，葡萄酒在我国也已经受到越来越多人的喜爱，而且成为逐渐代替传统白酒的健康饮品。我国葡萄酒的生产量和消费量均逐年增加。因此，建立一种葡萄酒中赭曲霉素A的检测方法有着重要的意义。
适配体作为一种可以和目标物进行高特异性结合的单链寡核普酸，和抗体相比，适配体更易于合成和标记，稳定性和选择性更好，结合亲和力更高，因此适配体的应用越来越广泛。其中OTA的适配体于2008年被Cruz-Aguado和Penner成功筛选，并将其应用于OTA的检测。
常用的检测霉菌毒素的方法包括高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、抗体抗原、电化学方法等。以上检测方法需要一定的操作过程如复杂的检测样品前处理，同时需较长时间检测分析样品，而且存在所用检测的实验仪器设备比较复杂昂贵等问题。而基于核酸适配体构建荧光传感器的方法，受限于传统荧光染料基团的光稳定性差等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测霉菌毒素尤其赭曲霉素A的荧光传感器及其制备方法，基于石墨烯量子点在聚集和解聚状态下荧光信号的淬灭和恢复以及核酸适配体结构转换策略来快速、简便的检测霉菌毒素如赭曲霉素A。该方法对霉菌毒素如赭曲霉素A的检测灵敏度高、特异性好。在一定的浓度范围内(如对赭曲霉素A在0-1ng/mL的浓度范围内，)检测呈现良好的线性响应，以及较低的检测限，例如赭曲霉素A检测限为13pg/mL。
一种霉菌毒素的荧光适配体传感器:在两组石墨烯量子点表面分别修饰上霉菌毒素对应的核酸适配体DNA和与适配体DNA互补的探针DNA，通过DNA杂交使石墨烯量子点聚集，发生激子能量转移，导致石墨烯量子点荧光信号淬灭；随后加入霉菌毒素，霉菌毒素与核酸适配体DNA特异性结合，结构发生转变，引起石墨烯量子点聚集体解组装而重新分散，体系荧光强度恢复。
上述的霉菌毒素包括但不限于赭曲霉素A、黄曲霉毒素B1、玉米烯酮和赭曲霉素等，只要符合上述条件的均能作为霉菌毒素的荧光适配体传感器。
本发明的技术方案是:一种检测霉菌毒素的荧光适配体传感器的应用方法，包括以下步骤：
(1)DNA杂交使石墨烯量子点聚集，荧光信号猝灭：首先利用TE缓冲液分别离心溶解粉末状霉菌毒素对应的适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA；然后通过水热法合成出石墨烯量子点，并在两组石墨烯量子点表面分别修饰霉菌毒素适配体DNA以及探针DNA，然后将表面修饰有霉菌毒素适配体DNA的石墨烯量子点溶液和表面修饰有探针DNA的石墨烯量子点溶液混合，通过DNA杂交引起石墨烯量子点发生聚集，荧光信号猝灭；
(2)霉菌毒素荧光检测：把不同标准浓度的霉菌毒素加入到步骤(1)荧光信号淬灭的溶液中，在室温条件下孵育一段时间，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的霉菌毒素对应的荧光强度，制备出曲线；
(3)检测待测霉菌毒素的方法，步骤如下：把含霉菌毒素的样品加入到对应的石墨烯量子点荧光信号淬灭溶液中，在室温条件下孵育一段时间，设定与步骤(2)一样的荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出霉菌毒素的荧光强度，根据步骤(2)霉菌毒素浓度和荧光强度的关系曲线，得出待测霉菌毒素的浓度，进一步计算转换成含霉菌毒素的样品中霉菌毒素的含量。
所述步骤(1)中所述的TE缓冲液优选组成为40mMTris,2mM EDTA,pH＝7.4。
所述步骤(1)中如赭曲霉素A适配体DNA结构优选为5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-C6H12-NH2-3’；互补的探针DNA结构优选为5’-NH2-C6H12-TGTCCGATGCT-3’(可购自上海Sangon生物技术有限公司合成并分装的)，使用前加入缓冲液离心溶解，离心速度优选为10000rpm，时间10min。
步骤(2)荧光分光光度计激发发射波长为315nm，入射发射狭缝为5.0nm，发射谱检测范围为375-600nm。赭曲霉素A的标准浓度为0-20ng/mL。
所述步骤(1)中石墨烯量子点表面修饰霉菌毒素适配体DNA或探针DNA的方法，步骤如下：合成出的石墨烯量子点溶液，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节溶液pH为5，反应一段时间后，加入霉菌毒素适配体DNA或探针DNA，调节溶液pH为7.4，再反应一段时间。
进一步优选：合成出0.1mg/mL的石墨烯量子点溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节溶液pH为5，反应30min后，均分装在两个容器中，分别加入霉菌毒素适配体DNA溶液以及与适配体DNA互补的探针DNA溶液，霉菌毒素适配体DNA溶液以及与适配体DNA互补的探针DNA溶液浓度均为100μM，调节溶液pH为7.4，反应2h，石墨烯量子点溶液：N-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：霉菌毒素适配体DNA溶液：与适配体DNA互补的探针DNA溶液为10mL：(20-25)mg：(18-20mg)：24μL：24μL。
本发明中，采用水热法合成了分散性良好、粒径均匀的石墨烯量子点，并在其表面分别修饰上霉菌毒素(如赭曲霉素A)核酸适配体DNA以及与其互补的短链探针DNA，将这两种石墨烯量子点进行混合，通过DNA杂交使石墨烯量子点聚集，发生激子能量转移，导致石墨烯量子点荧光信号淬灭；随后加入目标检测物霉菌毒素(如赭曲霉素A)，其与核酸适配体DNA特异性结合，结构发生转变，与短链探针DNA脱离，引起石墨烯量子点聚集体解组装而重新分散，体系荧光强度恢复。
本发明所述的用于检测霉菌毒素(如赭曲霉素A)的荧光传感器的制备方法，过程简单易行、绿色环保、成本低、灵敏度高、特异性好，并成功用于实际红酒样品中赭曲霉素A的加标回收。
附图说明
图1为本发明所述的基于适配体结构转换诱导石墨烯量子点由聚集到分散的荧光化学传感器对霉菌毒素检测的示意图；
图2为实施例1加入不同浓度赭曲霉素A后体系荧光强度发射曲线；
图3根据实施例1不同赭曲霉素A浓度和荧光强度对应关系绘制的拟合曲线；
图4为实施例1同一浓度不同底物下的特异性柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明书，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
一种检测赭曲霉素A的荧光适体传感器：
(1)DNA杂交使石墨烯量子点聚集，荧光信号猝灭：首先利用TE缓冲液离心溶解粉末状赭曲霉素A适配体DNA以及与其互补的短链探针DNA，然后通过水热法合成出石墨烯量子点，并在其表面分别修饰赭曲霉素A适配体DNA以及与其互补的短链探针DNA，将两种石墨烯量子点溶液混合，通过DNA杂交引起石墨烯量子点发生聚集，荧光信号猝灭；
(2)赭曲霉素A荧光检测：把不同浓度的赭曲霉素A加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育1h，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的赭曲霉素A的荧光强度，根据不同浓度的赭曲霉素A的荧光强度，拟合出公式y＝73.55+114.3x，其中y为赭曲霉素A的荧光强度，x为赭曲霉素A的浓度。
TE缓冲液pH 7.4、缓冲液组成为40mMTris,2mM EDTA；赭曲霉素A适配体DNA结构为5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-C6H12-NH2-3’；互补的短链探针DNA结构为5’-NH2-C6H12-TGTCCGATGCT-3’,由上海Sangon生物技术有限公司合成并分装。使用前加入缓冲液离心溶解，离心速度为10000rpm，时间10min。荧光分光光度计激发发射波长为315nm，入射发射狭缝为5.0nm，发射谱检测范围为375-600nm，赭曲霉素A的浓度为0-20ng/mL。
所述的石墨烯量子点修饰赭曲霉素A适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA的方法，具体步骤如下：10mL合成出的石墨烯量子点溶液(0.1mg/mL)，加入N-羟基琥珀酰亚胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐19mg，调节溶液pH为5，反应30min后，分装在两个烧瓶中，均为5mL，分别加入赭曲霉素A适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA，体积为24μL，调节溶液pH为7.4，反应2h。
所述的检测赭曲霉素A的方法，它的步骤如下：把含赭曲霉素A样品加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育1h，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取400uL孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出赭曲霉素A的荧光强度，根据公式y＝73.55+114.3x，得出赭曲霉素A的浓度。
1.原理验证及相关性实验
实验原理如图1所示，当将霉菌毒素适配体修饰的石墨烯量子点aptamer-GQDs和互补的短链探针DNA修饰的石墨烯量子点cDNA-GQDs混合之后，通过DNA的杂交使得石墨烯量子点聚集，发生激子能量转移，从而使石墨烯量子点的荧光信号猝灭。而后加入目标检测物霉菌毒素，其与核酸适配体DNA特异性结合，适配体DNA结构发生转变，与短链探针DNA脱离，引起石墨烯量子点聚集体解组装而重新分散，体系荧光强度恢复。
2.石墨烯量子点修饰赭曲霉素A适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA，具体步骤如下：10mL合成出的石墨烯量子点溶液(0.1mg/mL)，加入N-羟基琥珀酰亚胺22mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐19mg，调节溶液pH为5，反应30min后，分装在两个烧瓶中，均为5mL，分别加入赭曲霉素A适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA，体积为24μL，调节溶液pH为7.4，反应2h。
3.赭曲霉素A检测实验，具体实验步骤如下:
A:取0.5ml的aptmater-GQDs溶液和等体积的cDNA-GQDs溶液，在室温下混合均匀，孵育1h,使石墨烯量子点发生聚集,体系荧光信号猝灭；
B:取0.5mL完全猝灭的石墨烯量子点,加入不同浓度赭曲霉素A，浓度分别为0ng/mL,0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.2ng/mL,0.4ng/mL,0.6ng/mL,0.8ng/mL,1ng/mL,3ng/mL,5ng/mL,7ng/mL,9ng/mL,11ng/mL,15ng/mL,20ng/mL,室温下混合均匀，孵育1h后检测体系的荧光强度。
设定光荧光分光光度计激发波长315nm，入射发射狭缝均为5nm，发射波长检测范围为375-600nm，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的赭曲霉素A的荧光强度，结果见附图2。根据不同浓度的赭曲霉素A的荧光强度，在发射波长433nm处，根据不同赭曲霉素A浓度和荧光强度对应关系绘制曲线，结果见附图3。
4.实验条件优化
本发明分别对实验中石墨烯量子点荧光猝灭和恢复时间进行了优化，在等体积的aptmater-GQDs溶液和cDNA-GQDs溶液混合均匀后，设计了孵育时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min后检测反应液荧光强度；通过实验结果分析本发明选择最优实验条件：荧光猝灭时间为40min，荧光恢复时间为30min。
5.特异性实验
在淬灭溶液中，加入20ng/mL的赭曲霉素A以及相同浓度的黄曲霉毒素B1,玉米烯酮和赭曲霉素B,在设定条件下检测反应溶液中荧光强度。其结果如图4,可以看出本发明特异性很好。
6.实际红酒样品中赭曲霉素A的加标回收
将赭曲霉素A样品加入到稀释为5％的红葡萄酒样品中，浓度分别为0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL。测定赭曲霉素A的荧光强度，根据公式y＝36.660+0.1474x，计算得出赭曲霉素A的浓度并与实际加入浓度进行对比分析，结果如表1所示，从表中可以看出，该传感器的回收率处于92.4％-109.9％的合理范围内，表明该方法在实际样品操作中具有很好的准确度和可操作性。
表1为本发明所述的荧光传感器在实际红酒样品中的加标回收应用；
表1

Claims (8)

1.一种霉菌毒素的荧光适配体传感器，其特征在于，在两组石墨烯量子点表面分别修饰上霉菌毒素对应的核酸适配体DNA和与适配体DNA互补的探针DNA，通过DNA杂交使石墨烯量子点聚集，发生激子能量转移，导致石墨烯量子点荧光信号淬灭；随后加入霉菌毒素，霉菌毒素与核酸适配体DNA特异性结合，结构发生转变，引起石墨烯量子点聚集体解组装而重新分散，体系荧光强度恢复。
2.按照权利要求1所述的一种霉菌毒素的荧光适配体传感器，其特征在于，霉菌毒素为赭曲霉素A、黄曲霉毒素B1、玉米烯酮、赭曲霉素。
3.按照权利要求2所述的一种霉菌毒素的荧光适配体传感器，其特征在于，赭曲霉素A适配体DNA结构为5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-C6H12-NH2-3’；互补的探针DNA结构为5’-NH2-C6H12-TGT CCG ATG CT-3’。
4.权利要求1-3任一项所述的霉菌毒素的荧光适配体传感器的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA杂交使石墨烯量子点聚集，荧光信号猝灭：首先利用TE缓冲液分别离心溶解粉末状霉菌毒素对应的适配体DNA以及与适配体DNA互补的探针DNA；然后通过水热法合成出石墨烯量子点，并在两组石墨烯量子点表面分别修饰霉菌毒素适配体DNA以及探针DNA，然后将表面修饰有霉菌毒素适配体DNA的石墨烯量子点溶液和表面修饰有探针DNA的石墨烯量子点溶液混合，通过DNA杂交引起石墨烯量子点发生聚集，荧光信号猝灭；
(2)霉菌毒素荧光检测：把不同标准浓度的霉菌毒素加入到步骤(1)荧光信号淬灭的溶液中，在室温条件下孵育一段时间，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的霉菌毒素对应的荧光强度，制备出曲线；
(3)检测待测霉菌毒素的方法，步骤如下：把含霉菌毒素的样品加入到对应的石墨烯量子点荧光信号淬灭溶液中，在室温条件下孵育一段时间，设定与步骤(2)一样的荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出霉菌毒素的荧光强度，根据步骤(2)霉菌毒素浓度和荧光强度的关系曲线，得出待测霉菌毒素的浓度，进一步计算转换成含霉菌毒素的样品中霉菌毒素的含量。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的TE缓冲液优选组成为40mM Tris,2mM EDTA,pH＝7.4。
6.按照权利要求4的方法，其特征在于，步骤(2)荧光分光光度计激发发射波长为315nm，入射发射狭缝为5.0nm，发射谱检测范围为375-600nm；霉菌毒素A的标准浓度为0-20ng/mL。
7.按照权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤(1)中石墨烯量子点表面修饰霉菌毒素适配体DNA或探针DNA的方法，步骤如下：合成出的石墨烯量子点溶液，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节溶液pH为5，反应一段时间后，加入霉菌毒素适配体DNA或探针DNA，调节溶液pH为7.4，再反应一段时间。
8.按照权利要求4的方法，其特征在于，石墨烯量子点表面修饰霉菌毒素适配体DNA或探针DNA的方法：合成出0.1mg/mL的石墨烯量子点溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节溶液pH为5，反应30min后，均分装在两个容器中，分别加入霉菌毒素适配体DNA溶液以及与适配体DNA互补的探针DNA溶液，霉菌毒素适配体DNA溶液以及与适配体DNA互补的探针DNA溶液浓度均为100μM，调节溶液pH为7.4，反应2h，石墨烯量子点溶液：N-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：霉菌毒素适配体DNA溶液：与适配体DNA互补的探针DNA溶液为10mL：(20-25)mg：(18-20mg)：24μL：24μL。
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