CN113418883A - 一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法 - Google Patents
一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA‑AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法,其包括以下步骤:S1:制备的纳米金溶液;S2:将浓度为1μM的NaCl溶液分别与浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合,再分别加入待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释后振荡静置反应15min,再加入纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验;S3:定性分析:利用紫外数据(K‑K0)/K0绘制三维散点图,与标准样品的三维散点图进行比对,确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的种类;S4:定量分析:利用紫外数据(K‑K0)/K0绘制三维散点图,与标准浓度样品的三维散点图进行比对,同时通过拟合曲线确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的浓度。该检测方法实现了五种氨基糖苷类抗生素简单、灵敏、快速的测定。
Description
技术领域
本发明属于抗生素检测领域,具体涉及一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法。
背景技术
氨基酸糖苷类抗生素(简称AGs)是由氨基糖分子和氨基环醇通过醚键连接而成的一类广谱抗生素,其分子中含氨基环醇类和氨基糖分子,并由配糖键连接成苷。常见的种类有第一代的卡那霉素、新霉素、链霉素,第二代的庆大霉素、妥布霉素、地贝卡星以及第三代的阿米卡星、阿贝卡星等。
AGs抗菌谱广泛且大致相同,各AGs之间抗菌作用无明显差别,对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显的抗菌效果。因其价格低廉、抗菌性强,在兽医学与畜牧业中常被添加在饲料中用于治疗细菌性肠炎、奶牛乳腺炎等,同时促进动植物的生长繁殖。AGs可与细菌核糖体结合,干扰细菌蛋白质的合成过程,并破坏细菌细胞膜的完整性,是目前治疗需氧革兰阴性杆菌感染的重要药物之一。
毒理学研究表明,AGs具有耳毒性、肾毒性、神经肌肉阻滞以及其他毒副作用,人类长期食用残留超标的畜产品将会导致前庭功能障碍、听神经损伤、肾毒性增加等副作用,从而损坏健康。
尽管氨基糖苷类抗生素使用不当的后果严重,但依然有不法商贩滥用抗生素,造成了抗生素滥用、污染环境的现象。因此国内外许多国家都对动物性食品制定了氨基糖苷类抗生素的最高残留限量(Maximum Residue Limit,MRL),如表1所示:
表1各个国家氨基糖苷类抗生素MRLs
纳米金(AuNPs)即指金的微小颗粒,其直径在1~150nm,形状有球形、纳米棒(AuNRs)、纳米笼、纳米星或纳米壳(AuNSs)等。它具有较大的表面积-体积比、高摩尔消光系数(108~1010M-1cm-1)的特性,且尺寸可控、良好的生物相容性,具有电子密度高、表面化学性质易于改变、可催化等优点,它能与多种生物大分子结合且不影响其原本的活性。
AuNPs具有独特的光学和化学性质。主要体现在AuNPs具有良好的光吸收和散射性能。金属表面的传导电子被特定波长的光激发时,会发生集体振动。这种振动被称为局部表面等离子体共振(LSPR)。
局部表面等离子体共振这一特性导致AuNPs的吸收和散射强度明显高于相同尺寸的非等离子体纳米颗粒。通过控制粒子的尺寸、形状和粒子表面的局部折射率,可以调节AuNPs的吸收和散射特性。LSPR的变化导致了AuNPs的颜色随直径增大而由酒红色转变为蓝紫色,进一步表现为光谱吸收带的迁移。AuNPs的LSPR特性对于其光学检测起着重要的作用,LSPR谱带强度和频率大小与AuNPs的颗粒大小、形状、粒子间距以及介质的介电常数(折射率)有关。当待测物与AuNPs相互作用时,LSPR也将发生变化,从而改变AuNPs吸收带的波长、散射强度和溶液的颜色。利用此特性,可以通过肉眼半定量确定目标物浓度或者通过UV-vis光谱、荧光光谱、散射光谱定量测定目标物的浓度。因此,基于纳米金材料的光学检测传感器极大地简化了核酸、蛋白质、小分子和重金属离子的检测过程。
阵列传感器是指以几何图形排列的一组传感器,用于采集和处理电磁、光或声信号。可视化阵列传感器是指肉眼可以直接识别光信号的一类传感器。与具有高度特异性的“锁钥”模式相比,阵列传感器中的传感器元件对被分析物有不同的影响。阵列传感器用于增加新的维度,帮助估计更多的参数和提高估计性能。可视化是为了使信号接受更加方便,提高检测效率。
可视化传感器阵列也被称为光电的舌头或鼻子,已被证明是一种优异的分析方法,可用于识别生物和环境样品中的多种分析物。在传感器阵列系统中使用交叉反应的传感器元件,其灵感来自于大自然对味觉和嗅觉感受器阵列的使用,这为同时识别和区分目标物种群铺平了道路。每种传感器元件在特定的分析物存在时产生半选择性反应,传感器的特异性是通过传感器元件对每种分析物的不同响应模式来实现的,并进一步通过模式识别方法进行分析。
蒋长龙等人可以在紫外灯下通过肉眼观察到传感器的颜色变化,进而推测抗生素的浓度。他们采用Eu3+来构建单通道荧光比色传感器,即可在没有大型检测设备的帮助下也能轻松进行抗生素定量分析。高飞等利用碳量子点设计了一种可视化阵列传感器,实现了对14种糖类的测定和识别以及对其中9种单糖的分类。李娇等利用农药使多种酶的催化作用得到抑制的原理,设计出由三种酶作为三个通道的比色阵列传感器。这样的传感器能有效地对食品中残留的农药进行识别和检测。李臻等为脑损伤药物的体外筛选模型的形成提供了很好的方向。他们通过硅纳米孔阵列构建了体外血脑屏障系统,并且成功地用该模型测试了氯霉素、环丙沙星、红霉素等多种抗生素对血脑屏障的渗透能力。然而,利用可视化阵列传感器对氨基糖苷类抗生素进行检测仍未有人涉及。
比色法(Colorimetry)是通过鉴定、比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定样品含量的方法。这种检测方法成本低、操作方便、效率高、并且能实现可视化。纳米金由于其独特的光学性质,在比色法传感器中受到了热烈欢迎。AuNPs比色法是基于AuNPs表面等离子共振效应的光学检测技术。它是利用功能化纳米金与目标物之间发生相互作用,使得金纳米颗粒的尺寸、形状和聚集状态发生改变,从而引起溶液颜色、荧光和散射强度发生变化,为目标物的快速检测提供了出色的测定平台。根据纳米金颗粒有无进行修饰,可以将比色法分为有修饰与无修饰两大类。而关于有修饰的纳米金比色法的研究道路上,Mirkin课题组首先合成了经过功能化修饰的纳米金颗粒,并将纳米金颗粒用于DNA的检测。这一类基于有修饰的纳米金颗粒的比色法,通过在纳米金颗粒的表面修饰上不同的功能化分子,就可以实现对于各种物质包括DNA、蛋白质、有机小分子[26-28]和金属离子[29-30]等物质的检测。如下图所示,先在纳米金颗粒的表面修饰上不同的DNA片段,当有分析物(互补的DNA片段)存在时,两种纳米金颗粒就会发生聚集,从而使得纳米金溶液的颜色发生变化。但因为这种方法需要事先在纳米金颗粒的表面进行特定的修饰,根据待测物的不同,修饰上去的功能化分子也不同,这就造成了这类纳米金比色法的成本较高,实验操作复杂,另外还有可能存在使有生物活性的分子失去活性的情况发生。
而无需修饰的纳米金比色法就不具备此类问题。当使用经典合成法,即柠檬酸钠还原法来合成纳米金颗粒时,纳米金颗粒的表面就会包裹着一层带有负电荷的柠檬酸根离子。这时,如果往纳米金溶液中加入高浓度的盐溶液,就会使得纳米金颗粒发生聚集现象,使得溶液颜色发生改变。但是,当有DNA单链存在时,因为静电作用,带正电的DNA单链会附着在纳米金颗粒的表面,保护纳米金颗粒,从而抑制盐溶液导致的聚集作用。此时,如果有分析物(互补的DNA片段)存在时,纳米金表面的DNA单链就会与之结合,纳米金失去了DNA单链的保护,再次发生聚集现象,溶液变色。这种基于无需修饰的纳米金的比色方法较前一种比色方法更为简单,已经在DNA检测、蛋白质检测、金属离子检测、小分子的检测等多个领域应用,而且已经可以实现多个分析物同时检测。
目前针对氨基糖苷类抗生素的检测主要有仪器分析方法、微生物分析方法、免疫分析方法和适配体分析方法等,这几种各具优势。仪器分析方法主要是利用分析仪器对分析物进行检测,具备稳定性高、重复性佳且自动化程度高等优势。微生物分析方法主要是基于抗生素的抗菌作用为原理。免疫分析方法的基本原理是抗原能够与抗体发生特异性结合。这种检测方法,样品无需预处理,且检测耗时少。适配体分析方法则具有特异性强、检出限低、灵敏度高等优势。尽管,针对氨基糖苷类抗生素的检测方法多种多样,且各具优势,但都存在各自的缺陷,比如耗时长、操作过程复杂、需要大型仪器、检测单一等。所以,针对种类多样的氨基糖苷类抗生素,急需一种能够实现简单、快速、高效的方法。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题,提供一种操作简单、灵敏度高的基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法。
为了实现以上发明目的,本发明提供了一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法,其包括以下步骤:
S1:制备的纳米金溶液,其中纳米金颗粒粒径为10~20nm;
S2:将浓度为1μM的NaCl溶液分别与浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合,核酸适配体溶液与NaCl溶液的体积比为1:5;再分别加入待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释后振荡静置反应15min,再加入步骤S1制得的纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验;
S3:定性分析:利用紫外数据(K-K0)/K0绘制三维散点图,与标准样品的三维散点图进行比对,确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的种类;
S4:定量分析:利用紫外数据(K-K0)/K0绘制三维散点图,与标准浓度样品的三维散点图进行比对,同时通过拟合曲线确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的浓度。
相比于现有技术,本发明利用基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器,实现了对5种氨基糖苷类抗生素的简单、高效、可视化识别。该检测方法对5种氨基糖苷类抗生素可以实现40ng/mL最低浓度下有效区分,低于国家检测标准。同时,还在20-200ng/mL范围内获得了良好的线性关系,并对不同比例的混合氨基糖苷类抗生素混合样品成功进行了区分,还可对实际牛奶样品中的氨基糖苷类抗生素进行有效的识别。
根据本发明的检测方法,步骤S1中,步骤S1中,纳米金颗粒的粒径为10nm。该粒径大小的纳米金比色效果较佳。
优选地,步骤S1中,纳米金溶液的制备步骤如下:移取100mL 0.01%的HAuCl4溶液至烧瓶中,然后加热至沸腾,并快速搅拌;在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,继续沸腾,当溶液颜色由深蓝变为酒红色并保持稳定后,撤去热源并继续搅拌15min,然后在搅拌条件下自然冷却至室温。
优选地,步骤S2中,核酸适配体与纳米金颗粒的摩尔比为25:9。
优选地,步骤S2中,取100μL浓度为1μM的NaCl溶液分别与20μL浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合、再加入8μL待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL步骤S1制得的纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验。
优选地,步骤S2中,三种核酸适配体为妥布霉素的核酸适配体分别截取不同长度得到的。本发明采用市售的三段截取自妥布霉素的核酸适配体片段,根据本发明原理也可替换为其他氨基糖苷类抗生素的核酸适配体。
优选地,步骤S2中,三种核酸适配体序列分别为:15’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’、5’-TGGGGGTTGAGGCTA-3’、5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAAGCCGA-3’。
优选地,步骤S3中,利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到三维散点图。
优选地,步骤S3中,标准样品的三维散点图由以下步骤获取:取100μL浓度为1μM的NaCl溶液、分别与20μL浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合,再加入8μL标准样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min;分别各自进行了4次重复实验,利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到标准样品的三维散点图。
本发明的检测原理如下:表面带有负电荷的纳米金可以与单链DNA结合。当纳米金处于较高盐浓度的溶液中时,纳米金会因为静电作用发生聚集。但是当表面附着有单链DNA时,单链DNA会保护纳米金,避免聚集。当有待测物如氨基糖苷类抗生素存在时,待测物会与单链DNA结合,因为不同种类的待测物,所以结合情况不同,剩余的DNA量也不同,对于纳米金的保护情况也不同,从而可以输出不同的比色信号,进而可识别出氨基糖苷类抗生素种类。
该检测方法实现了对5种氨基糖苷类抗生素的简单、高效、可视化识别。在最优实验条件下,在比色法检测妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星的实验中,可以实现40ng/mL最低浓度下有效区分,其中卡那霉素的检出限为3.32ng/mL,阿米卡星的检出限为3.90ng/mL,妥布霉素的检出限为2.38ng/mL,低于国家检测标准。同时,还在20-200ng/mL范围内获得了良好的线性关系,表明了其具备定量检测能力。且在实验中该检测方法可在100倍稀释的纯牛奶中检测出AGs,说明该检测方法对实际样品中的AGs有良好的检测性能。
附图说明
图1为10nm纳米金颗粒的紫外-可见光光谱图
图2为10nm纳米金颗粒的粒径分布图
图3为10nm纳米金颗粒的Zeta电位图
图4为DNA浓度为0、2.5、5、7.5、10、20nM体系的紫外-可见光光谱图
图5为DNA浓度为0、2.5、5、7.5、10、20nM时体系520nm处的吸光度
图6为不同反应时间下体系的k值变化柱状图
图7为阵列传感器对5种氨基糖苷类抗生素(40ng/mL)线性判别分析(LDA)图
图8为不同浓度(20、50、80、100、150、200ng/mL)TOB的LDA图
图9为不同浓度(20、50、80、100、150、200ng/mL)KM的LDA图
图10为不同浓度(20、50、80、100、150、200ng/mL)AMK的LDA图
图11为影响因子1与TOB浓度的关系图
图12为影响因子1与KM浓度的关系图
图13为影响因子1与AMK浓度的关系图
图14为不同比例KM与TOB混合样品的LDA图
图15为加入了不同浓度的KM、TOB的实际样品的LDA图
图16为阵列传感器的特异性识别柱状图
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明,而非用于限制本发明的范围。
以下实施例、测试例和实验例中用到的试剂与材料如表2所示,仪器与设备如表3所示。
表2试剂与材料
表3仪器与设备
实施例1:基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的制备
按以下步骤制备基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器:
S1:采用柠檬酸钠法还原制备粒径为10nm的纳米金颗粒材料,制得的纳米金颗粒表面带有负电荷。具体的实验步骤为:移取100mL 0.01%的HAuCl4溶液至烧瓶中,然后加热至沸腾,并快速搅拌;在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,继续沸腾,当溶液颜色由深蓝变为酒红色并保持稳定后,撤去热源并继续搅拌15min,然后在搅拌条件下自然冷却至室温。
S2:分别将浓度为10μM的三种氨基糖苷类抗生素的核酸适配体溶液(表2中的Apt1、Apt2和Apt3)与浓度为1μM的NaCl溶液混合,核酸适配体溶液与NaCl溶液的体积比为1:5;三种氨基糖苷类抗生素的核酸适配体分别与步骤S1制得的纳米金颗粒组成三个传感单元,形成基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器。其中三种氨基糖苷类抗生素的核酸适配体为分别截取妥布霉素的核酸适配体的不同长度得到的,Apt 1的序列为:5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’,Apt 2的序列为:5’-TGGGGGTTGAGGCTA-3’,Apt3的序列为:5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAAGCCGA-3’。
为了证实10nm的纳米金材料成功合成,采用了紫外吸收光谱图(UV-vis)以及Zeta电位对其进行表征
1.UV-vis光谱表征
实施例1制备的10nm的纳米金材料UV-vis光谱图如图1所示,由图1可知10nmAuNPs的最大紫外吸收峰在520nm左右,溶液颜色为酒红色,与文献报道基本一致,说明制备的AuNPs具有10nm的光学性质。
2.Zeta电位
图2为制备的10nm AuNPs的粒径分布图,可见其粒径主要位于10-15nm,与预期结果基本一致,说明10nm AuNPs合成成功。
制备的10nm AuNPs的Zeta电位如图3所示,实施例1中的AuNPs采用经典柠檬酸钠还原法制取,在AuNPs的表面包裹着一层柠檬酸根离子,所以合成的AuNPs表面都带着负电荷,这有利于与带正电的单链DNA结合,防止在较高盐浓度下,AuNPs发生聚集,引起变色。
实施例2:基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法
本实施例提供了基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法,包括以下步骤:
S1:采用实施例1的方法制备纳米金溶液。
S2:取100μL浓度为1μM的NaCl溶液分别与20μL浓度为10μM的三种核酸适配体溶液(Apt1、Apt2、Apt3)混合、再加入8μL待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL步骤S1制得的纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验。
S3:定性分析:利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到三维散点图,然后与标准样品的三维散点图进行比对,确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的种类。
S4:定量分析:利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到三维散点图,然后与标准浓度样品的三维散点图进行比对,同时通过拟合曲线确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的浓度。
实施例3:反应条件优化
DNA浓度的优化:为了构建基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器,本实验例对DNA的浓度进行优化。
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液,分别加入0、5、10、15、20、40μL Apt1溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm处的吸收强度。
为了使适配体对AuNPs具有足够的保护能力,应使其对AuNPs覆盖完全,避免因未完全覆盖而导致加入高浓度氯化钠溶液时出现聚集变色。因此,需要对核酸适配体的用量进行优化。分别设置DNA浓度为0、2.5、5、7.5、10、20nM的体系、结果如图4~5所示。同空白样品相比,随着DNA浓度的增大,520nm处的吸光度逐渐增大,而当DNA浓度为10nM时,520nm处的吸光度为最大值,故实施例1中选择体系的DNA浓度为10nM,体系添加量为20μL浓度为10μM的DNA溶液。
反应时间的优化:
因为纳米金的发生聚集,出现颜色变化需要时间,本实施例进一步优化了阵列反应时间,分别设置了反应时间为5min、10min、15min、30min、60min的反应体系,观察K=k650nm/k520nm的变化大小。
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液、20μL浓度为10μM的Apt 1溶液、8μL浓度为10μM的妥布霉素溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,分别振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,分别反应5、10、15、30、60min,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm和650nm处的吸收强度。
从图6可以发现,当反应时间为30min时,K值为最大值,说明在30min的反应时间下,纳米金的聚集基本完成,所以30min为最佳的反应时间。
实施例4:绘制多种AGs标准三维散点图
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液、分别与20μL浓度为10μM的Apt1、Apt2、Apt3溶液混合,再加入8μL浓度为40ng/mL的样品溶液(分别为链霉素(SM)、庆大霉素(GM)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB)卡那霉素(KM)),用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min。
在上述最优的反应条件下,将比色传感阵列用于五种氨基糖苷类抗生素的识别。通过反应前后颜色RGB的差值,我们得到每种氨基糖苷类抗生素的可视化比色图。每种氨基糖苷类抗生素有不同的比色现象,可用于可视化区分。
采用LDA进一步分析阵列传感器对氨基糖苷类抗生素的识别效果。5种氨基糖苷类抗生素在阵列传感器上分别各自进行了4次重复实验,利用SPSS软件处理得到3个传感单元的影响因子分别为97.6%、2.3%、0.1%。图7是氨基糖苷类的线性判别分析三维散点图,可见五种氨基糖苷类抗生素都能清晰地分开,说明该检测方法的区分效果良好,可成功实现五种氨基糖苷类抗生素的区分和识别。以该三维散点图作为标准三维散点图,将待测样品的三维散点图与其进行比对,即可得出待测样品中所含氨基糖苷类抗生素种类。
另外,通过分析差异响应聚类热图,可得每种氨基糖苷类抗生素的四个平行样都聚成小簇,平行样之间基本无交叉或聚类错误。另外,通过分析可知,传感单元Apt 1对链霉素(SM)、庆大霉素(GM)以及传感单元Apt 2对阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB)的结合作用最为明显,这也印证了本发明的检测方法是可行的。
实施例5:妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星的定量检测
为了进一步检验阵列传感器的检验、分析能力,将阵列传感器应用于氨基糖苷类抗生素的定量检测,本实验例以妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星为例验证该比色阵列传感器的定量检测能力,
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液,分别与20μL浓度为10μM的三种适配体溶液混合、分别加入4、10、16、20、40μL浓度为10μg/ml的卡那霉素溶液(或阿米卡星、妥布霉素),用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min,重复实验6次,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm和650nm处的吸收强度。所有数据使用SPSS v16.0软件进行处理,获得线性判别分析(LDA)结果。
如图8~10所示,每种氨基糖苷类抗生素在不同浓度下产生特定的反应模式,并聚成独特的组,没有错误或错误分类。这些结果表明,该传感器阵列在较宽的浓度范围内对氨基糖苷类抗生素也有良好的识别能力。通过绘制影响因子1与抗生素浓度的关系,得到了抗生素的定量响应曲线。如图11~13所示,浓度-反应曲线的线性关系表明,识别单元与抗生素之间的相互作用是均匀的、有规律的、稳定的,且典型因子1越大,相互作用越强。经计算,卡那霉素的检出限为3.32ng/mL,阿米卡星的检出限为3.90ng/mL,妥布霉素的检出限为2.38ng/mL,远小于国家对于乳制品的检测标准。。
可见,该检测方法可在20-200ng/mL处获得了良好的线性关系。本实施例表明AuNPs比色传感阵列对AGs有定量检测的能力,实际检测中,通过对应种类AGs的拟合曲线,即可求得待测样品溶液中该种类AGs的浓度。
实施例6:混合样品检测
为了检验传感器阵列的多重检测能力,对不同比例的混合氨基糖苷类抗生素混合样品进行了检测。本实验例尝试区分两组不同氨基糖苷类抗生素(总浓度为80ng/mL)和不同比例的抗生素混合样品。
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液,分别与20μL浓度为10μM的三种适配体溶液混合、分别加入8μL按照0:10、1:9、3:7、5:5、7:3、9:1、10:0比例混合的总浓度为80ng/ml的卡那霉素与妥布霉素的混合溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min,重复实验6次,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm和650nm处的吸收强度。所有数据使用SPSS v16.0软件进行处理,获得线性判别分析(LDA)结果。
如图14所示,将不同比例的混合物汇聚成不同的组,并将所有组分开,显示了传感器阵列的多重识别能力。
实施例7:模拟实际样品检测
为了进一步检验阵列传感器的通用性和识别能力,对实际牛奶样品中的氨基糖苷类抗生素的检测能力,在对牛奶样品进行处理后,往牛奶样品中加入了不同浓度的妥布霉素、卡那霉素往牛奶样品中加入不同浓度的卡那霉素与妥布霉素,制成加标样品。
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液,分别与20μL浓度为10μM的三种适配体溶液混合、分别加入8μL浓度为0、10、50μM的卡那霉素加标样品与8μL浓度为0、10、50μM的妥布霉素加标样品,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min,重复实验6次,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm和650nm处的吸收强度。所有数据使用SPSS v16.0软件进行处理,获得线性判别分析(LDA)结果。
如图15所示,阵列能够将准确区分实际牛奶样品中是否存在氨基糖苷类抗生素,同时,两种氨基糖苷类抗生素在LDA中也能很好地识别出不同的线性变化,根据折叠分类矩阵分类准确率达到100%。毫无疑问,该检测方法可以根据定位信息检测含有不同浓度的氨基糖苷类抗生素的牛奶样品。
实施例8:对于氨基糖苷类抗生素的特异性识别
为了验证该检测方法在样品检测中对于氨基糖苷类抗生素的特异性,分别选择了其他五种不同类别的抗生素,包括四环素、诺氟沙星、阿莫西林、甲砜霉素、多西环素。使用阵列传感器检测妥布霉素与这五种抗生素、抗生素浓度为100ng/ml。
取100μL浓度为1μM的NaCl溶液,分别与20μL浓度为10μM的三种适配体溶液混合、分别加入8μL浓度为100ng/ml的妥布霉素、四环素、诺氟沙星、多西环素、甲砜霉素、阿莫西林溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min,重复实验6次,使用紫外-可见分光光度计记录混合溶液在520nm和650nm处的吸收强度。所有数据使用SPSS v16.0软件进行处理,获得线性判别分析(LDA)结果。
对于k值的测定结果如图16所示,妥布霉素的k值远远大于其他种类的抗生素,说明只有加入妥布霉素的体系中的纳米金出现聚集。这说明该检测方法只对氨基糖苷类抗生素具备特异性识别的能力,而其他种类的抗生素都不能够干扰其对于氨基糖苷类抗生素的检测。
本发明并不局限于说明书和实施方式所列运用,其完全可以被适用于各种适合本发明的领域,在不背离本发明精神及其实质的情况下,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改和变形,但这些相应的修改和变形都应属于本发明所要求的保护范围。
以上所述仅为本发明的部分实施例,并非因此限定本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所做出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于DNA-AuNPs体系的比色阵列传感器的氨基糖苷类抗生素检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1:制备的纳米金溶液,其中纳米金颗粒粒径为10~20nm;
S2:将浓度为1μM的NaCl溶液分别与浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合,核酸适配体溶液与NaCl溶液的体积比为1:5;再分别加入待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释后振荡静置反应15min,再加入步骤S1制得的纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验;
S3:定性分析:利用紫外数据(K-K0)/K0绘制三维散点图,与标准样品的三维散点图进行比对,确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的种类;
S4:定量分析:利用紫外数据(K-K0)/K0绘制三维散点图,与标准浓度样品的三维散点图进行比对,同时通过拟合曲线确定待测样品所含氨基糖苷类抗生素的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤S1中,纳米金颗粒的粒径为10nm。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤S1中,纳米金溶液的制备步骤如下:移取100mL 0.01%的HAuCl4溶液至烧瓶中,然后加热至沸腾,并快速搅拌;在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,继续沸腾,当溶液颜色由深蓝变为酒红色并保持稳定后,撤去热源并继续搅拌15min,然后在搅拌条件下自然冷却至室温。
4.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤S2中,核酸适配体与纳米金颗粒的摩尔比为25:9。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于:步骤S2中,取100μL浓度为1μM的NaCl溶液分别与20μL浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合、再加入8μL待测样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL步骤S1制得的纳米金溶液,反应30min;进行4次重复实验。
6.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤S2中,三种核酸适配体为妥布霉素的核酸适配体分别截取不同长度得到的。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:步骤S2中,三种核酸适配体序列分别为:15’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’、5’-TGGGGGTTGAGGCTA-3’、5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAAGCCGA-3’。
8.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤S3中,利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到三维散点图。
9.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:步骤S3中,标准样品的三维散点图由以下步骤获取:取100μL浓度为1μM的NaCl溶液、分别与20μL浓度为10μM的三种核酸适配体溶液混合,再加入8μL标准样品溶液,用PBS缓冲溶液稀释至200μL,振荡静置反应15min,再加入1800μL纳米金溶液,反应30min;分别各自进行了4次重复实验,利用紫外吸收光谱中520nm和650nm处两个吸收峰的变化,定义K=k650nm/k520nm,扣除空白样品的吸光度,利用SPSS软件处理(K-K0)/K0绘制得到标准样品的三维散点图。
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