CN113418882A - 一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器及其制备方法 - Google Patents
一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器，其由三种不同粒径的表面带负电荷的纳米金颗粒作为不同通道构建而成，纳米金颗粒的粒径均在10～50nm范围内。本发明还提供了所述用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器的制备方法。该纳米金比色阵列传感器实现了四种氨基糖苷类抗生素简单、灵敏、快速的测定，与单一通道的纳米金比色法(LOD＝33nmol/L)相比，检出限更低。在最优实验条件下，通过可视化差谱图分析，纳米金比色传感阵列在65～4550nmol/L成功实现了可视化颜色比对，并实现了低浓度下四种AGs的准确区分。
Description
技术领域
本发明属于有机化学领域，具体涉及一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器及其制备方法。
背景技术
氨基酸糖苷类抗生素(简称AGs)是由氨基糖分子和氨基环醇通过醚键连接而成的一类广谱抗生素，其分子中含氨基环醇类和氨基糖分子，并由配糖键连接成苷。常见的种类有第一代的卡那霉素、新霉素、链霉素，第二代的庆大霉素、妥布霉素、地贝卡星以及第三代的阿米卡星、阿贝卡星等。
AGs抗菌谱广泛且大致相同，各AGs之间抗菌作用无明显差别，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显的抗菌效果。因其价格低廉、抗菌性强，在兽医学与畜牧业中常被添加在饲料中用于治疗细菌性肠炎、奶牛乳腺炎等，同时促进动植物的生长繁殖。AGs可与细菌核糖体结合，干扰细菌蛋白质的合成过程，并破坏细菌细胞膜的完整性，是目前治疗需氧革兰阴性杆菌感染的重要药物之一。
毒理学研究表明，AGs具有耳毒性、肾毒性、神经肌肉阻滞以及其他毒副作用，人类长期食用残留超标的畜产品将会导致前庭功能障碍、听神经损伤、肾毒性增加等副作用，从而损坏健康。
出于对AGs毒副作用的考虑，欧盟禁止将AGs作为畜禽促生长添加剂，美国FDA(食品药品监督管理局)及许多国家和机构均规定AGs在食品中的最大残留限量为0.50mg/kg。日本规定某一AGs在食品中的最大残留限量为300μg/kg，在乳制品中的最大残留限量是200μg/kg。中华人民共和国农业部发布的公告明确规定了乳制品中抗生素最高残留限量，如表1所示：
表1农业部公布乳制品中抗生素最高残留限量
纳米金(AuNPs)即指金的微小颗粒，其直径在1～150nm，形状有球形、纳米棒(AuNRs)、纳米笼、纳米星或纳米壳(AuNSs)等。它具有较大的表面积-体积比、高摩尔消光系数(108～1010M-1cm-1)的特性，且尺寸可控、良好的生物相容性，具有电子密度高、表面化学性质易于改变、可催化等优点，它能与多种生物大分子结合且不影响其原本的活性。
AuNPs具有独特的光学和化学性质。主要体现在AuNPs具有良好的光吸收和散射性能。金属表面的传导电子被特定波长的光激发时，会发生集体振动。这种振动被称为局部表面等离子体共振(LSPR)。
局部表面等离子体共振这一特性导致AuNPs的吸收和散射强度明显高于相同尺寸的非等离子体纳米颗粒。通过控制粒子的尺寸、形状和粒子表面的局部折射率，可以调节AuNPs的吸收和散射特性。LSPR的变化导致了AuNPs的颜色随直径增大而由酒红色转变为蓝紫色，进一步表现为光谱吸收带的迁移。AuNPs的LSPR特性对于其光学检测起着重要的作用，LSPR谱带强度和频率大小与AuNPs的颗粒大小、形状、粒子间距以及介质的介电常数(折射率)有关。当待测物与AuNPs相互作用时，LSPR也将发生变化，从而改变AuNPs吸收带的波长、散射强度和溶液的颜色。利用此特性，可以通过肉眼半定量确定目标物浓度或者通过UV-vis光谱、荧光光谱、散射光谱定量测定目标物的浓度。因此，基于纳米金材料的光学检测传感器极大地简化了核酸、蛋白质、小分子和重金属离子的检测过程。
阵列传感器是指以几何图形排列的一组传感器，用于采集和处理电磁、光或声信号。可视化阵列传感器是指肉眼可以直接识别光信号的一类传感器。与具有高度特异性的“锁钥”模式相比，阵列传感器中的传感器元件对被分析物有不同的影响。阵列传感器用于增加新的维度，帮助估计更多的参数和提高估计性能。可视化是为了使信号接受更加方便，提高检测效率。
可视化传感器阵列也被称为光电的舌头或鼻子，已被证明是一种优异的分析方法，可用于识别生物和环境样品中的多种分析物。在传感器阵列系统中使用交叉反应的传感器元件，其灵感来自于大自然对味觉和嗅觉感受器阵列的使用，这为同时识别和区分目标物种群铺平了道路。每种传感器元件在特定的分析物存在时产生半选择性反应，传感器的特异性是通过传感器元件对每种分析物的不同响应模式来实现的，并进一步通过模式识别方法进行分析。
蒋长龙等人可以在紫外灯下通过肉眼观察到传感器的颜色变化，进而推测抗生素的浓度。他们采用Eu3+来构建单通道荧光比色传感器，即可在没有大型检测设备的帮助下也能轻松进行抗生素定量分析。高飞等利用碳量子点设计了一种可视化阵列传感器，实现了对14种糖类的测定和识别以及对其中9种单糖的分类。李娇等利用农药使多种酶的催化作用得到抑制的原理，设计出由三种酶作为三个通道的比色阵列传感器。这样的传感器能有效地对食品中残留的农药进行识别和检测。李臻等为脑损伤药物的体外筛选模型的形成提供了很好的方向。他们通过硅纳米孔阵列构建了体外血脑屏障系统，并且成功地用该模型测试了氯霉素、环丙沙星、红霉素等多种抗生素对血脑屏障的渗透能力。然而，利用可视化阵列传感器对氨基糖苷类抗生素进行检测仍未有人涉及。
比色法(Colorimetry)是通过鉴定、比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定样品含量的方法。这种检测方法成本低、操作方便、效率高、并且能实现可视化。纳米金由于其独特的光学性质，在比色法传感器中受到了热烈欢迎。AuNPs比色法是基于AuNPs表面等离子共振效应的光学检测技术。它是利用功能化纳米金与目标物之间发生相互作用，使得金纳米颗粒的尺寸、形状和聚集状态发生改变，从而引起溶液颜色、荧光和散射强度发生变化，为目标物的快速检测提供了出色的测定平台。近年来出现的四种常见纳米金光学传感检测方法分别是纳米金聚集光学传感法、纳米金刻蚀光学传感法、纳米金荧光光学传感法、纳米金散射光学传感法。
郭晓茜等用葡萄糖氧化酶和特异性的多肽来标记纳米金颗粒作为信号放大的探针，用于检测乳腺癌抗原。胥国立等在适配体-AuNPs复合物在不同的农药中呈现不同颜色这一原理的基础之上，设计了由3种适配体作为三种不同通道的比色阵列传感器。Rotello课题组发现荧光聚合物也可以作为比色传感器的检测信号，故用6种官能团分别修饰AuNPs，并将其通过非共价键与荧光聚合物结合起来，构建出一种荧光阵列传感器，可以实现蛋白质的识别和定量检测。与其他方法相比，AuNPs比色法可以将物质浓度变化转换为颜色变化，不仅可通过肉眼进行初判断，还能通过仪器进一步定量分析测定。这样的检测方法原理简单、不需要大型仪器、操作成本低且便于直接观测，被广泛用来DNA、金属离子、蛋白质和小分子有机物的检测等。
目前，国内外检测AGs的方法囊括高效液相色谱法(HPLC)、电化学分析法、荧光光谱法、分光光度法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定、超高效液相色谱-串联质谱法、微生物法等。AGs结构里含有氨基醇环和氨基糖，由配糖键连接成苷，极性强，易溶于水。但高效液相色谱法的物质同样极性大，易溶于水，能与AGs结合紧密，样品提取后净化难度大；电化学法检测成本低、可微型化和易实现线上监测，但由于容易受到基质的干扰且电极的修饰比较复杂，只能检测具有电活性的物质，因而存在一定的局限性；激光诱导荧光检测器的灵敏度较高，但受到光源波长和荧光试剂的限制；AGs无典型紫外吸收，利用传统分光光度法进行检测时，必须使用操作繁琐的衍生化法，实验结果易受衍生化试剂干扰。毛细管电泳法分离效率高、速度快、所需样品量少，试剂消耗少，但由于毛细管直径小，进样量少，导致制备困难，灵敏度较低；酶联免疫吸附测定使用最为广泛，这种方法基于抗原抗体的相互吸附。但卡那霉素是半抗原物质，吸附效果依赖于抗体的品质变化，且抗体不易保存、容易失活；高效液相色谱-质谱法可以对AGs进行精密检测，但检测前操作步骤复杂。质谱检测器能提供的信息量大，但仪器昂贵；微生物法操作繁琐、费时，影响因素多，易受条件限制，试剂价格昂贵，重现性不佳，灵敏度也不高。
上述方法皆存在耗时长、成本高、不能同时快速的检验大量样品的问题。因此，开发一种快速、高效、灵敏的同时检测多种AGs的方法是当务之急。而多通道可视化检测法的出现为同时检测大量不同类型的氨基类抗生素提供了一个新的思路，通过该技术制备与氨基类抗生素特异性结合的纳米金聚合物不仅成本低廉、耐高温、且可长时间保存，将极大的降低检测成本，方便检测人员的使用。目前这一方法被广泛用来检测DNA、金属离子、蛋白质和小分子有机物等，但利用可视化阵列传感器对氨基糖苷类抗生素进行检测仍未有人涉及。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简单、灵敏度高、耐高温的用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器。
本发明的另一个目的是提供上述纳米金比色阵列传感器的制备方法。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器，其由三种不同粒径的纳米金颗粒作为不同通道构建而成，纳米金颗粒的粒径均在10～50nm范围内。
相比于现有技术，本发明采用三种不同粒径的纳米金颗粒作为不同通道构建形成纳米金比色阵列传感器，基于被柠檬酸根修饰后带负电的AuNPs与质子化的AGs阳离子结合，AuNPs发生聚集变色，紫外吸光度降低，吸收峰发生红移的原理，实现对AGs的可视化识别和定量检测，且操作过程简单、快速，灵敏度高。经过实验表明，该纳米金比色阵列传感器可实现低浓度下四种氨基糖苷类抗生素的准确区分，识别准确率和特异性均达到90％以上，且检出限为5.4nmol/L，约为2.6μg/kg，远小于国家对于乳制品的检测标准。
根据本发明的用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器，三通道的纳米金颗粒的粒径分别为10nm、22nm和40nm。粒径大小为10-50nm的纳米金稳定性更好，保存时间更长。在10-50nm中该三种粒径的纳米金颗粒制备方法较为简单，便于实现。
另一方面，本发明还提供了所述用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器的制备方法，制备步骤如下：采用氯金酸还原法分别制备三种粒径在10～50nm范围内的表面带负电荷的纳米金颗粒，分别构成纳米金比色阵列传感器的三个通道。
优选地，三个通道的纳米金颗粒的粒径分别为10nm、22nm和40nm。
优选地，粒径为10nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，然后将混合溶液加热至沸腾；在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色由黑变红后开始计时，继续沸腾7-10min后停止加热，冷却至室温后转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
优选地，粒径为22nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，剧烈搅拌并加热，在煮沸的同时快速加入1.5mL质量分数为1％的现配的柠檬酸三钠溶液，8-10min后，将反应容器从加热元件上移除，使其冷却至室温后，转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
优选地，粒径为40nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，强力搅拌并加热回流至沸腾；然后将1130μL质量分数为1％的新鲜柠檬酸三钠溶液快速加入烧瓶中，持续加热15min后停止加热，再强力搅拌15min即得到所需AuNPs溶液，冷却至室温后转移到洁净容器中置于4℃冰箱保存。
本发明的纳米金比色阵列传感器原理如下：由于带负电荷的AuNPs与质子化的氨基糖苷类抗生素能通过静电引力和疏水作用力结合，离子化AGs的浓度不同会导致AuNPs溶液呈现不同的颜色，紫外谱图的650nm/550nm呈线性变化。将不同粒径的纳米金粒子作为阵列传感器的不同通道，在不同AGs中会出现不同的颜色，构成可视化特异差谱图，从而构建阵列传感器。
该纳米金比色阵列传感器实现了四种氨基糖苷类抗生素简单、灵敏、快速的测定，与单一通道的纳米金比色法(LOD＝33nmol/L)相比，检出限更低。在最优实验条件下，通过可视化差谱图分析，纳米金比色传感阵列在65～4550nmol/L成功实现了可视化颜色比对，并实现了低浓度下四种AGs的准确区分。除GM与AMK以外，识别准确率和特异性均达到90％以上。在KM浓度为65～390nmol/L范围内，吸光度比值(650nm/550nm)与浓度存在良好的线性关系(R2＝0.979)，其检出限为5.4nmol/L，约为2.6μg/kg，远小于国家对于乳制品的检测标准。在比色法检测KM的研究中有较优的检测效果，表明AuNPs比色传感阵列对抗生素有定量检测的能力。且在实验中该比色阵列传感器可在100倍稀释的纯牛奶中检测出AGs，说明构建的纳米金比色阵列传感器对实际样品中的AGs有良好的检测性能。
附图说明
图1是三种不同粒径纳米金颗粒的粒径分布图。
图2是三种不同粒径纳米金颗粒电位测定图。
图3是不同粒径纳米金溶液UV-vis光谱图。
图4是五种AGs在65nmol/L下的三维散点图。
图5是KM在不同浓度下的三维散点图。
图6是AuNPs比色阵列传感器对不同浓度AGs响应信号的线性拟合。
图7是不同浓度KM反应后的紫外光谱图。
图8是不同比例KM与LM混合样品三维散点图。
图9是牛奶样品中KM与AMK响应三维散点图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
实施例1：纳米金比色阵列传感器的制备
采用氯金酸还原法分别制备粒径为10nm、22nm和40nm的纳米金颗粒，分别构成纳米金比色阵列传感器的三个通道。
10nmAuNPs的合成：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，然后将混合溶液加热至沸腾。在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色由黑变红后开始计时，继续沸腾7-10min后停止加热，冷却至室温后转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
22nmAuNPs的合成:加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，剧烈搅拌并加热，在煮沸的同时快速加入1.5mL质量分数为1％的现配的柠檬酸三钠溶液，8-10min后，将反应容器从加热元件上移除，使其冷却至室温后，转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
40nmAuNPs的合成:加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，强力搅拌并加热回流至沸腾。然后将1130μL质量分数为1％的新鲜柠檬酸三钠溶液快速加入烧瓶中，持续加热15min后停止加热，再强力搅拌15min即得到所需AuNPs溶液。冷却至室温后转移到洁净容器中置于4℃冰箱保存。
将制备的不同粒径纳米金溶液分别稀释约100倍，使之出现丁达尔效应。超声振荡10min后，用纳米粒径电位分析仪(ZetasizerNano-ZS90英国马尔文公司)测试其粒径分布与Zeta电位。
测试例1：纳米金粒径分布
利用纳米粒径电位分析仪对三种不同粒径的纳米金进行粒径测量，并测定其Zeta电位。图1中(a)、(b)、(c)分别为10nm、22nm、40nmAuNPs的粒径分布图，(a)中纳米金粒径加权平均数为15.49nm，(b)中为29.52nm，(c)中为39.53nm，计算结果与实验预期大致相同。在同一标尺下，AuNPs粒径依次增大，说明不同粒径AuNPs成功合成。
测试例2：纳米金Zeta电位检测结果
图2中(a)、(b)、(c)分别为10nm、22nm、40nmAuNPs的Zeta电位图，其中三种粒子均出现单峰，且对应的纵坐标各不相同。本发明要求纳米金粒子表面带电，进而与质子化的AGs能通过静电引力和疏水作用力结合。由于AuNPs均采用柠檬酸盐还原法合成，AuNPs粒子表面包裹了一层柠檬酸根粒子。所以合成的AuNPs表面都带负电荷，有利于吸附离子化的AGs。且不同粒径纳米金粒子所带电荷量不同，对AGs的吸附能力也有差异，满足阵列传感器中的传感元件能对分析物产生不同的影响。
测试例3：纳米金紫外光谱图
图3为不同粒径AuNPs溶液的紫外吸收光谱图(UV-vis)。10nmAuNPs的紫外吸收峰最小，吸光度低，在520nm处；22nmAuNPs的最大吸收峰位置在527nm，而40nmAuNPs的最大吸收峰为530nm、在一定范围内，随着粒径的增大，溶液的最大紫外吸收峰也增大，即发生了“红移”，说明所合成的纳米金粒子均具有相应粒径的光学性质。
实验例1：采用纳米金比色阵列传感器检测氨基糖苷类抗生素
采用10nm、22nm、40nm的纳米金颗粒作为不同通道构建可视化阵列传感器分别与130nmol/L的卡那霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星溶液进行反应。具体步骤如下：分别取20μL 2×10-5mol/L KM、SM、GM、TOB、AMK溶液，加入980μL去离子水稀释；分别加入上述实施例1制备的不同粒径纳米金溶液2mL，振荡，静置15min。
将试剂管置于暗箱内，在同等亮度的条件下用手机等摄像工具拍摄。并根据拍摄图片中的颜色绘制出AGs可视化特异差谱图。由实验得到的可视化特异差谱图来看，三种通道在辨识五种AGs时能相互补充。每一种抗生素都有特异的差谱图，可用于可视化区分。但庆大霉素与妥布霉素由于结构相似(一个分子内均含有三个氨基)，其所带电荷和分子体积也接近，因此两者的差谱图差异性较小，在10nm纳米金颗粒通道中庆大霉素与妥布霉素可以区分，但22nm和40nm通道中二者的区别较小，难以用肉眼直接分辨，需要借助计算机转码(RGB颜色码)进行区分。
用紫外分光光度计(UV2700日本岛津公司)进行7个重复样的吸光度比值检测，取五个最佳值。从而生成一个3通道×5个分析物×5个重复数据的矩阵。取紫外数据中的A650nm/A550nm作为An，扣除空白样品的吸光度A0。最终以(An-A0)/A0作为紫外信号值。通过软件spss、origin绘制三维散点图、聚类图、热图。
图4为五种AGs在65nmol/L下的三维散点图，观察可知大部分AGs能被准确分开，但GM、TOB难以直接分辨出来。说明阵列传感器的区分效果良好，但对于结构相似的抗生素不能快速区分。
在五种AGs在65nmol/L下的聚类图与热图显示三个传感元件对于AGs信号识别的贡献作用是互补的，例如10nm纳米金对于KM、SM更敏锐，22nm纳米金对AMK更敏锐，40nm纳米金则适用于GM、TOB的检测。每种AGs的五个平行样都聚成小簇，平行样之间基本无交叉或聚类错误。GM与TOB的平行样之间出现重叠，聚类规律与差谱图、三维散点图一致。依据纳米金粒径大小设计的三个通道对于不同AGs的结合作用完全不同，区别明显，说明通过不同粒径AuNPs设计阵列传感器的方法是可行的。
实验例2：卡那霉素的定量检测
为了进一步检验阵列传感器的检验、分析能力，我们将阵列传感器应用于氨基糖苷类抗生素的定量检测。卡那霉素作为五种抗生素中检出限最低的物质，被用于探究纳米金比色传感阵列定量检测AGs的能力。
取10-8mol/L的卡那霉素0μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL、60μL、80μL、100μL、200μL、400μL、600μL、700μL、800μL，加入去离子水稀释到1mL。每个浓度的样品分别加入10nm、22nm、40nm的纳米金溶液2mL，形成一组三个样品。充分振荡，静置15min。拍摄每一种浓度的颜色并绘制出浓度可视化特异差谱图。每一浓度进行七次重复样吸光度检测，取五次最佳值。利用紫外数据(An-A0)/A0绘制线性关系图和三维散点图。
对于纳米金比色传感器的可响应浓度是最小的KM进行检出限的测定。对6组空白样品进行检测，计算其标准偏差σ；通过线性关系图计算斜率S。利用检出限＝3σ/S进行计算。在KM不同浓度下的差谱图中，不同浓度的卡那霉素使纳米金溶液颜色逐渐由酒红色过渡到蓝灰色。且每一通道中颜色的变化情况各不相同。纳米金粒径越大，使其发生颜色变化的浓度就越低。
如图5～7所示，不同浓度的卡那霉素可在纳米金比色阵列传感器中有效区分，且按照浓度从小到大的顺序大致呈“V”字形。对传感元件1(10nm)中的卡那霉素进行线性拟合，得到拟合方程y＝-0.213+0.00617x，R2＝0.999。可见在65～390nmol/L的范围内，吸光度比值(A650/A550)与KM浓度之间有良好的线性关系。由加入65-520nmol/LKM后溶液的UV-vis图(图7)可知，随AGs浓度的增加，溶液的紫外峰1(500-550nm)峰值逐渐减少，紫外峰2(650-700nm)峰值逐渐增大，与文献基本相符。
通过计算可得，六个空白样品的吸光度标准偏差为0.010，线性拟合曲线斜率为0.0054，LOD＝3σ/S＝5.4nmol/L。
可见，在KM浓度为65～390nmol/L范围内，吸光度比值(650nm/550nm)与浓度存在良好的线性关系(R2＝0.979)，其检出限为5.4nmol/L，约为2.6μg/kg，远小于国家对于乳制品的检测标准。本实验例表明AuNPs比色传感阵列对AGs有定量检测的能力
实验例3：混合样品检测
为了检验传感器阵列的多重检测能力，对不同比例的混合氨基糖苷类抗生素混合样品进行了检测。取2×10-5mol/L卡那霉素与链霉素分别按照10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、0:10的比例混合，且总体积为20μL，加入980μL去离子水稀释。混合均匀后加入上述制备的不同粒径纳米金溶液2mL，振荡，静置15min。用紫外分光光度计进行7个重复样的吸光度检测，取五个最佳值。利用紫外数据(An-A0)/A0绘制三维散点图。
图8显示，五种不同比例的KM与SM混合样可在纳米金比色传感器中有效区分。混合样的紫外响应信号总是处于两种纯AGs之间。在三维散点图中，溶液比例按KM：LM＝10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、0:10从大到小呈一定顺序排列，浓度差越小，则该混合样与纯AGs样之间的距离越大。说明该阵列传感器能有效检测两种AGs的混合样。
实验例4：模拟实际样品检测
传感器在实际样品中的适用性是其功能评价的一大要素。为了证明该阵列传感器的实用性，我们选用纯牛奶提供复杂环境，模拟其实际样品检测能力。
取10mL纯牛奶，加入约2mL三氯乙酸，调节pH至4.6。倒入烧瓶中以45℃水浴10min，取出后以10000r/min的速度离心20min，用0.22μm微孔膜过滤，取滤液加入去离子水稀释100倍。
分别取20μL、50μL 2×10-5mol/L KM和AMK溶液，加入980μL待测物稀溶液代替去离子水进行稀释，加入上述制备的不同粒径纳米金溶液2mL，振荡，静置15min。用紫外分光光度计进行7个重复样的吸光度检测，取五个最佳值。利用紫外数据(An-A0)/A0绘制三维散点图。
在10倍稀释的牛奶样品中，我们能检测到AGs不同的紫外信号，但不能实现可视化颜色比对。在100倍稀释的牛奶样品中，由溶液环境带来的干扰降低，阵列传感器能顺利对多种AGs进行检测。
图9显示，两个不同浓度的KM溶液检测结果，与两个不同浓度AMK溶液检测结果呈不同的线性关系(连线的斜率不同)，说明该阵列传感器能在实际样品环境中准确识别不同的AGs，从而证明了构建的AuNPs比色阵列传感器对实际样品中的AGs有良好的检测性能。
Claims (7)
1.一种用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器，其特征在于：由三种不同粒径的表面带负电荷的纳米金颗粒作为不同通道构建而成，纳米金颗粒的粒径均在10～50nm范围内。
2.根据权利要求1所述的用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器，其特征在于：三通道的纳米金颗粒的粒径分别为10nm、22nm和40nm。
3.根据权利要求1或2所述用于检测氨基糖苷类抗生素的纳米金比色阵列传感器的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：采用氯金酸还原法分别制备三种粒径在10～50nm范围内的表面带负电荷的纳米金颗粒，分别构成纳米金比色阵列传感器的三个通道。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：三个通道的纳米金颗粒的粒径分别为10nm、22nm和40nm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：粒径为10nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，然后将混合溶液加热至沸腾；在沸腾的同时快速加入5mL现配的质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色由黑变红后开始计时，继续沸腾7-10min后停止加热，冷却至室温后转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：粒径为22nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，剧烈搅拌并加热，在煮沸的同时快速加入1.5mL质量分数为1％的现配的柠檬酸三钠溶液，8-10min后，将反应容器从加热元件上移除，使其冷却至室温后，转移至洁净容器中并放入4℃冰箱保存。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：粒径为40nm的纳米金颗粒的制备步骤如下：加入去离子水使1mL质量分数为1％的HAuCl4·3H2O溶液定容至100ml，倒入100mL圆底烧瓶中，强力搅拌并加热回流至沸腾；然后将1130μL质量分数为1％的新鲜柠檬酸三钠溶液快速加入烧瓶中，持续加热15min后停止加热，再强力搅拌15min即得到所需AuNPs溶液，冷却至室温后转移到洁净容器中置于4℃冰箱保存。
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