CN114034852A - 基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，属于氟喹诺酮类抗生素的检测领域。本申请将适配体、AuNPs、环丙沙星依次加入到含有Tris‑HCl缓冲溶液中形成反应体系，反应体系在20‑45℃下静置反应20‑90min；然后加入增敏剂HAuCl₄和NHOH·HCl，适配体与环丙沙星特异性结合而失去对AuNPs的保护作用，同时增敏剂促进反应体系中AuNPs的增长，溶液颜色发生变化，根据LSPR波峰的红移程度，分析环丙沙星的浓度，实现简单、快速、高灵敏及可视化检测环丙沙星。

Description

基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法

技术领域

本发明属于氟喹诺酮类抗生素(FQs)的检测领域，更具体地说，涉及一种基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器及利用该传感器快速检测环丙沙星(CIP)的方法。

背景技术

氟喹诺酮类药物广泛应用于人类和兽医学，治疗由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起的各种感染性疾病。由于不加控制的使用，在不同的物质中，如食品和地表水，都可以检测到FQs。环丙沙星(Ciprofloxactin，CIP)是第三代氟喹诺酮类抗生素，广泛应用于医疗保健和农业行业，用于治疗人类和牲畜的呼吸道和消化道感染。虽然CIP在医学上具有显著的治疗效果，但其可在肉和牛奶中残留，导致一些不良副作用和疾病，如皮肤感染、呼吸道感染、慢性细菌性前列腺炎和医院获得性肺炎等。CIP的富集是对人类健康和生态系统的主要威胁。还有一个更严重的问题是在环境中产生超级细菌。考虑到这些问题，抗生素在家畜中的使用受到了严格的管制。在欧盟，牛奶、鸡肉和猪肌肉中环丙沙星的最大残留水平(MRL)被设定为100μg/Kg。CIP在地表水中的浓度可能达到约1μg/L(3nmol/L)，在废水中的浓度可能达到0.1mg/L(0.3μmol/L)。在最新的欧盟水框架指令中，CIP被认为是优先饮用水污染物之一。

已经报道了多种用于检测FQs的分析技术，如分子印迹固相萃取、免疫层析试纸条试验、荧光光谱法、毛细管电泳、免疫分析法、电化学技术、高效液相色谱法和ELISA等检测方法。然而，复杂的检测过程，高成本，可能需要昂贵的仪器和高技能人员，这限制了他们对快速、现场和实时测定的应用。因此，迫切需要开发具有可行性、经济、省时、简便和实时的检测方法，在食品和水环境中FQs的检测具有重要意义。

相较于以上几种方法，基于局域表面等离子体共振(Localized Surface PlasmonResonance，LSPR)的比色法能够快速、简单地检测各种环境中的危害物质，既可以用仪器又可以在无仪器的条件下比较直观的进行检测。贵金属纳米粒子，特别是金纳米粒子(AuNPs)具有独特的LSPR特性。AuNPs的LSPR一般处于可见光波段，其胶体溶液能够显示出醒目的颜色，可用于可视化检测。AuNPs的LSPR特性带来的高吸光系数，以及醒目的胶体溶液颜色使其成为构建高灵敏度、可视化检测比色传感器的优秀显色底物。基于LSPR的比色法能够同时用仪器法和可视法2种方式进行检测，即在不同环境下检测不同浓度的危害物质。目前尚未有基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器及利用该传感器简单、快速、高灵敏及可视化检测环丙沙星的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种AuNPs的LSPR比色适配体传感器。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种AuNPs的LSPR比色适配体传感器，适配体通过碱基与AuNPs表面的负电荷发生静电作用而直接附着在AuNPs的表面，形成AuNPs/适配体，其中，适配体为环丙沙星单链适配体，核苷酸序列为：5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTCGTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′。

基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其原理是：在无靶标环丙沙星存在的情况下，在AuNPs/适配体中加入增敏剂四氯金酸(HAuCl4)和盐酸羟胺(NHOH·HCl)，因适配体的保护作用，以AuNPs/适配体为核，AuNPs生长为红色的溶液。当加入靶标环丙沙星(CIP)，适配体与CIP特异性结合而失去对AuNPs的保护作用，AuNPs会发生聚集现象。通过加入增敏剂，聚集的AuNPs为核，生长为尺寸更大的AuNPs，可以观察到溶液由红色变成紫色甚至蓝色。根据反应体系里的AuNPs的颜色变化，可用于可视化检测CIP，而且通过仪器分析LSPR波峰的红移现象，实现CIP的高灵敏检测。

具体包括以下步骤：

1)将AuNPs、适配体、环丙沙星依次加入到含有Tris-HCl缓冲溶液中形成反应体系，反应体系在20-45℃下静置反应20-90min，适配体与环丙沙星特异性结合而失去对AuNPs的保护作用，AuNPs聚集；适配体的浓度为100nmol/L；AuNPs的体积为反应体系体积的1/2；

其中，AuNPs的制备方法为：取0.2mmol/LHAuCl₄ 60rpm加热搅拌至沸腾，加入1％柠檬酸三钠，当溶液由淡黄色变为酒红色时继续加热10分钟后停止加热，搅拌至室温；用0.45μm的微孔过滤器过滤溶液，制得AuNPs；

2)加入增敏剂HAuCl₄和NHOH·HCl，促进反应体系中AuNPs的增长，观察AuNPs颜色的变化，根据LSPR波峰的红移程度，分析CIP的浓度。

进一步的，步骤1)中，AuNPs在525nm处的吸光度值为0.5。

进一步的，步骤1)中，Tris-HCl缓冲溶液为含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mmol/L，pH＝7.4。

进一步的，步骤1)中，反应体系在室温下静置反应50min。

进一步的，步骤2)中，HAuCl₄的浓度为1mmol/L，NHOH·HCl的浓度为2mmol/L，增敏剂HAuCl4和NHOH·HCl溶解在10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液。

进一步的，反应体系与增敏剂的溶液体积比为1∶1。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本方法不需要大型仪器，通过肉眼观察/比色光谱识辨检测结果；

2)检测的目标物CIP能够促进AuNPs的聚集，加入增敏剂后使得LSPR波峰发生红移现象，提高了本方法检测的灵敏度；

3)本方法特异性强，使用该方法检测环丙沙星时，可以排除样品中其他氟喹诺酮类抗生素的影响，实验结果更加准确；

4)本方法操作简单、快速，可用于现场原位高灵敏及可视化检测。

附图说明

图1是LSPR比色适配体传感器检测CIP的工作原理图；

图2是适配体浓度对AuNPs的LSPR波峰红移的影响图；

图3是反应温度对AuNPs的LSPR波峰红移的影响图；

图4是反应时间对AuNPs的LSPR波峰红移的影响图；

图5是一系列浓度梯度的CIP对AuNPs的LSPR波峰红移的影响图；

图6是环丙沙星的标准曲线图；图中，横坐标为CIP浓度；纵坐标为相对LSPR波峰红移的波长差；

图7是特异性柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所使用的适配体序列为：5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTCGTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′。通过适配体的碱基与AuNPs表面的负电荷发生静电作用而直接附着在AuNPs的表面，形成AuNPs/适配体，保护AuNPs。

实施例1 AuNPs的制备

量取100mL的HAuCl₄(0.2mmol/L)于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪(60rpm)上加热搅拌至沸腾(100℃)；快速加入1％的柠檬酸三钠3.5mL，淡黄色逐渐消失，当溶液呈酒红色时继续加热10分钟后停止加热，搅拌至室温；用0.45μm的微孔过滤器过滤溶液，制得AuNPs备用。AuNPs在4℃下离心浓缩或稀释至525nm处的吸光度为0.5，4℃保存。

实施例2

一、适配体浓度的确定

取20-200nmol/L的适配体于Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，然后加入AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)和靶标CIP(0和10μM)组成反应体系，在室温(25℃)静置反应50min后，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。不同浓度的适配体对体系溶液中AuNPs的LSPR波峰红移的影响见图2。(λ位移；λ位移＝λ_f-λ_i；λ_f是CIP 10μM时的波峰波长，λ_i是CIP 0μM时的波峰波长。)由图2可知，随着适配体浓度的增大，AuNPs的波峰红移波长差先增大后减小，当适配体浓度为100nmol/L时，LSPR波峰红移最大。因此，选取100nmol/L为最佳适配体浓度。

二、反应温度的确定

取100nmol/L适配体、AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)于Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，加入一定浓度的目标物CIP(0和10μM)，组成反应体系，分别设置20℃、25℃、30℃、37℃和45℃的温度，在不同温度下静置反应50min后，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/L pH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。不同温度对体系溶液中AuNPs的LSPR红移的影响见图3。由图3可以看出，在适配体传感器适宜的几个温度条件下，AuNPs的波峰红移波长差没有显著差异。因此，选取25℃室温为最适反应温度。

三、反应时间的确定

取100nmol/L适配体、AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)于Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，加入一定浓度的目标物CIP(0和10μM)，组成反应体系，设置一定的时间梯度20min、30min、40min、50min、60min、90min，在室温(25℃)静置反应不同时间后，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。不同反应时间对体系溶液中AuNPs的LSPR波峰红移的影响见图4。由图4可以看出，当反应为50min时，AuNPs的波峰红移波长差最大。因此，选取50min为最佳反应时间。

四、标准曲线的建立

配制浓度分别为0、1、10、100、200、500、1000、5000、10000、20000、50000nmol/L的CIP溶液，加入到含100nmol/L适配体、AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)的Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，在室温(25℃)静置反应50min，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。将上述溶液置于酶标仪中，得到CIP不同浓度范围的的紫外-可见光光谱图，且每个浓度设计三组平行试验。以CIP浓度为横坐标，以相对LSPR波峰红移波长差为纵坐标作标准曲线，建立环丙沙星的线性回归方程，计算回归方程及相关系数。如图5和6所示，在CIP的浓度在0～1000nmol/L范围内，此方法表现出良好的线性关系，相对LSPR波峰红移波长差与CIP浓度之间线性关系为y＝0.00095x+2.4017，R²＝0.995，检测限低至1nmol/L以内，表明此方法对CIP的高灵敏度。

五、特异性检测

取100nmol/L适配体、AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)于Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，依次加入10μmol/L氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、恩氟沙星(ENR)、培氟沙星(PEF)、诺氟沙星(NOF))、四环素类抗生素(四环素(TC)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、米诺环素(MIN)、强力霉素(DOX)、美他环素(MTC))和甘氨酸(Gly)，使每种抗生素在反应体系中的最终浓度为1μmol/L。在室温(25℃)静置反应50min，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。每种抗生素做三组平行样。由图7可知，其他抗生素对本发明的没有明显的干扰，该检测方法对CIP的检测具有良好的特异性。

六、实际水样中的回收率实验

在超纯水、饮用水、自来水、湖水、河水五种水质中配制浓度为1μmol/L的环丙沙星溶液，重复三组实验。取100nmol/L适配体、AuNPs(525nm处吸光度为0.5的AuNPs的加入体积占反应体系体积的1/2)加入到Tris-HCl(10mmol/L，pH＝7.4，含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺)缓冲溶液中，加入含1μmol/L的CIP的不同水质，在室温(25℃)静置反应50min，加入与反应体系同体积的增敏剂(含1mmol/LHAuCl₄和2mmol/LNHOH·HCl的10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液)，促进AuNPs的生长。用酶标仪测定可见光谱，检测不同水质类型对AuNPs的LSPR波峰红移的影响。

如表1所示，在饮用水、自来水、湖水、河水等实际水样的CIP加标实验中，与超纯水相比CIP的回收率均分布在90～110％左右。CIP在不同水样中的具体回收率分别为：百岁山天然矿泉水109.09％、实验室自来水90.91％、玄武湖100.00％、紫湖溪90.91％。结果显示，该检测方法在实际水样中检测CIP具有准确性和可靠性。

表1不同水样中CIP的回收率

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 98

<212> DNA

<213> 环丙沙星单链适配体(Artificial)

<400> 1

ataccagctt attcaattgc agggtatctg aggcttgatc tactaaatgt cgtggggcat 60

tgctattggc gttgatacgt acaatcgtaa tcagttag 98

Claims (8)

1.一种AuNPs的LSPR比色适配体传感器，其特征在于，适配体通过碱基与AuNPs表面的负电荷发生静电作用而直接附着在AuNPs的表面，形成AuNPs/适配体，所述适配体为环丙沙星单链适配体，核苷酸序列为：5′-ATACCAGCTTATTCAATTGCAGGGTATCTGAGGCTTGATCTACTAAATGTCGTGGGGCATTGCTATTGGCGTTGATACGTACAATCGTAATCAGTTAG-3′。

2.基于权利要求1所述的AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将AuNPs、适配体、环丙沙星依次加入到含有Tris-HCl缓冲溶液中形成反应体系，反应体系在20-45℃下静置反应20-90min，AuNPs、适配体首先形成AuNPs/适配体，以AuNPs/适配体为核进行生长，当加入环丙沙星后，适配体与环丙沙星特异性结合而失去对AuNPs的保护作用，以AuNPs为核进行聚集；所述适配体的浓度为100nmol/L；所述AuNPs的体积为反应体系体积的1/2；

2)加入增敏剂HAuCl₄和NHOH·HCl，促进反应体系中AuNPs的增长，观察AuNPs颜色的变化，根据LSPR波峰的红移程度，分析环丙沙星的浓度。

3.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，步骤1)中，AuNPs的制备方法为：取0.2mmol/LHAuCl₄60rpm加热搅拌至沸腾，加入1％柠檬酸三钠，当溶液由淡黄色变为酒红色时继续加热10分钟后停止加热，搅拌至室温；用0.45μm的微孔过滤器过滤溶液，制得AuNPs。

4.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，步骤1)中，AuNPs在525nm处的吸光度值为0.5。

5.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，步骤1)中，所述Tris-HCl缓冲溶液为含1mmol/LK⁺和1mmol/LMg²⁺的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为10mmol/L，pH＝7.4。

6.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，步骤1)中，反应体系在室温下静置反应50min。

7.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，步骤2)中，HAuCl₄的浓度为1mmol/L，NHOH·HCl的浓度为2mmol/L，增敏剂HAuCl₄和NHOH·HCl溶解在10mmol/LpH＝4的柠檬酸缓冲溶液。

8.根据权利要求2所述的基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法，其特征在于，反应体系与增敏剂的溶液体积比为1∶1。

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