CN108152258A - 一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法。本发明采用卡那霉素A核酸适配体和AAP探针，特异性识别其它的氨基糖苷类抗生素，实现了单一传感器上的多物质检测。同时本发明无需外加信号分离步骤，反应后可直接进行信号检测，传感器修饰方法保证了定量检测的稳定性与再生性。本发明制备方法简单，性能稳定，光纤的重复性好，适用于环境样品中氨基糖苷类抗生素的检测，以及生物传感器产业化的需求，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于环境监测及环境生态保护技术领域，具体涉及一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法。
背景技术
抗生素类药物在治疗感染性疾病方面发挥着重要的作用，但由于近些年来严重滥用，导致动物性食品以及环境介质(如水、土壤)的抗生素残留问题突出。这些残留的抗生素会在自然环境及人体内蓄积，致使人体产生耐药菌株，或因大量蓄积而对机体产生毒害作用。
抗生素通常可根据分子结构进行分类。氨基糖苷类抗生素是目前使用最为广泛的抗生素，如卡那霉素A、卡那霉素B、庆大霉素和阿米卡星等。氨基糖苷类抗生素滥用会导致严重的副作用，如损失听力、损害肾脏。
各国政府机构已根据其经济发展水平对动物源性食品中抗生素的最大允许残留限量(MRL)做了明确规定。欧共体规定组织及牛奶中卡那霉素A的MRL为：肉类0.1μg/g，肝脏0.6μg/g，肾脏2.5μg/g，牛奶0.15μg/g；目前我国规定牛乳中卡那霉素A的MRL为0.2μg/g。
仪器检测法和生物检测法是定量检测和筛选抗生素使用最广泛的方法。仪器检测法是利用抗生素结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，如高效液相色谱、毛细管电泳、紫外分光光度计法等。仪器检测法虽然具有高选择性，但其需要精密的仪器、有经验的实验人员、复杂的样品前处理、耗时长并且不适于现场检测。酶联免疫分析法是最常用的生物检测法，其操作方便、特异性好且耗时短，但其在定量检测和灵敏度检测等方面存在一定的局限。因此，能够用于食品及环境中的抗生素快速、简便现场检测的技术具有重要的应用价值。
核酸适配体(Aptamer)是通过体外筛选获得的DNA(脱氧核糖核酸)或者RNA(核糖核酸)序列，它能够与多种目标物质高特异性、高选择性结合，与抗体相比具有可人工合成、稳定性好、方便化学修饰和工程设计等诸多优势，因此在生物传感器领域具有很好的应用前景。
卡那霉素A的核酸适配体(即FAP，序列为：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)于2011年被筛选出来。此后，人们基于该核酸适配体构建了许多核酸适配体传感器检测卡那霉素A，如微悬臂阵列传感器、电化学发光传感器、金纳米颗粒比色法和电化学适配体传感器。通过这些传感器平台，在血清、牛奶或环境样品中，卡那霉素A的检测范围可以从pM到mM级别。但是，这些核酸适配体传感器一方面受限于界面再生性能差，不能够完成目标物的连续在线检测；另一方面，这些核酸适配体传感器只能对卡那霉素A这一单一目标物进行检测，而对其它氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素B、庆大霉素和阿米卡星)，尚没有定量响应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法，可包括步骤(a)和步骤(b)：
所述步骤(a)包括如下步骤：
(a-1)制备杂交液；所述杂交液含有FAP；
(a-2)完成步骤(a-1)后，加入待测溶液，孵育；
(a-3)完成步骤(a-2)后，采用AAP探针检测荧光信号强度；
所述步骤(b)包括如下步骤：
(b-1)制备杂交液；所述杂交液含有所述FAP；
(b-2)完成步骤(b-1)后，加入氨基糖苷类抗生素标准溶液，孵育；
(b-3)完成步骤(b-2)后，采用AAP探针检测荧光信号强度；
根据氨基糖苷类抗生素标准溶液中氨基糖苷类抗生素的浓度和相应荧光信号强度的下降率绘制标准曲线，将所述步骤(a-3)得到的荧光信号强度的下降率代入所述标准曲线，得到待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量；
所述FAP可为单链核酸分子，自5’末端到3’末端的核苷酸序列可为TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA(序列表中序列2)；所述FAP的末端可具有荧光基团；
所述AAP探针可为单链核酸分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：P1片段和所述FAP；所述P1片段可由n个T组成；n为大于等于3且小于等于12的自然数。
上述方法中，所述“FAP的末端具有荧光基团”可为所述FAP的5’末端和/或3’末端具有荧光基团。
上述方法中，所述荧光基团可为花青素荧光染料Cy5、羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3或花青素荧光染料Cy5.5。
上述方法中，所述P1片段具体可由6个T组成。所述AAP探针的核苷酸序列可如序列表中序列1所示(自5’末端到3’末端)。
上述方法中，所述“采用AAP探针检测荧光信号强度”可为采用具有所述AAP探针的全光纤倏逝波生物传感器检测荧光信号强度。
上述方法中，所述AAP探针的末端可具有修饰基团。所述AAP探针的末端具体可为AAP探针的5’末端。所述修饰基团具体可为NH2-。所述修饰基团可使所述AAP探针和传感光纤进行连接。
上述任一所述方法还可包括如下步骤：
(c)取完成步骤(b)的全光纤倏逝波生物传感器，再生；
(d)将完成步骤(c)的全光纤倏逝波生物传感器再进行步骤(a)和步骤(b)的检测。
上述步骤(c)中，所述再生的步骤可为：取完成步骤(b)的全光纤倏逝波生物传感器，先用SDS溶液洗涤，再用水洗涤，最后用PBS缓冲液洗涤。所述SDS溶液具体可为pH7.0、浓度为0.5％(0.5mg/100mL)的SDS水溶液。所述水可为超纯水。所述PBS缓冲液具体可为pH7.4、10mM的PBS缓冲液。
上述步骤(a-1)和(b-1)中，所述杂交液还可含有pH7.0-8.0、8-12mM PBS缓冲液。
上述步骤(a-1)和(b-1)中，所述杂交液具体还可含有pH7.4、10mM PBS缓冲液。
上述步骤(a-1)和(b-1)所述杂交液中，所述FAP的浓度可为0.5-5μM。
上述步骤(a-1)和(b-1)所述杂交液中，所述FAP的浓度具体可为1μM。
为解决上述技术问题，本发明还保护一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素含量的试剂盒，包括上述任一所述AAP探针和所述FAP。
上述试剂盒中，还可包括pH7.0-8.0、8-12mM PBS缓冲液。
上述试剂盒中，具体还可包括pH7.4、10mM PBS缓冲液。
上述任一所述试剂盒中，还可包括传感光纤。
上述任一所述试剂盒中，还可包括表面具有上述任一所述AAP探针的传感光纤。
上述任一所述试剂盒中，还可包括全光纤倏逝波生物传感器。
上述任一所述试剂盒中，还可包括氨基糖苷类抗生素标准溶液。
上述任一所述试剂盒在检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述全光纤倏逝波生物传感器可按照中国专利号为200610089497.4、授权公告号为CN 1873450B的发明专利的实施例制备。
上述任一所述传感光纤具体可为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。
上述任一所述氨基糖苷类抗生素标准溶液含氨基糖苷类抗生素的pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液。
上述任一所述氨基糖苷类抗生素可为卡那霉素A和/或卡那霉素B和/或庆大霉素和/或阿米卡星。
本发明采用卡那霉素A核酸适配体(即FAP)和AAP探针，特异性识别其它的氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素B、庆大霉素、阿米卡星)，实现了单一传感器上的多物质检测。同时本发明无需外加信号分离步骤，反应后可直接进行信号检测，传感器修饰方法保证了定量检测的稳定性与再生性。本发明制备方法简单，性能稳定，光纤的重复性好，适用于环境样品中氨基糖苷类抗生素的检测(准确、快速且低成本)以及生物传感器产业化的需求，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素含量的原理图。
图2为不同浓度卡那霉素A溶液的检测结果。
A为不同浓度卡那霉素A溶液的实际检测结果；B为卡那霉素A检测的标准曲线。
图3为不同浓度卡那霉素B溶液、阿米卡星溶液和庆大霉素溶液的检测结果。
图4为选择性检测结果。其中KANA为卡那霉素A，AMI为阿米卡星，TET为四环素，TER为链霉素，CHI为氯霉素，SDM为磺胺二甲嘧啶。
图5为重复性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的全光纤倏逝波生物传感器按照中国专利号为200610089497.4、授权公告号为CN 1873450 B的发明专利的实施例制备。
传感光纤为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。
AAP探针和FAP均为单链核酸分子，由上海生工生物工程有限公司合成。AAP探针和FAP的核苷酸序列详见表1。
表1
| 名称 | 序列 | 在序列表中的位置 |
| AAP探针 | 5’-NH2-TTTTTTTGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’ | 序列表中序列1 |
| FAP | 5’-Cy5-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’ | 序列表中序列2 |
注：Cy5为花青素荧光染料；NH2-为修饰基团，使AAP探针和传感光纤进行连接。
实施例1、检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法
本发明的发明人经过大量实验，发现了检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素含量的方法，具体原理图见图1：当氨基糖苷类抗生素不存在时，FAP易于形成核酸适配体分子间多聚体结构(即M-Apts)；当氨基糖苷类抗生素存在时，氨基糖苷类抗生素可以与FAP特异性结合，破坏多聚体结构并形成具有荧光淬灭效果的单链发卡结构；氧化石墨烯(GO)在溶液中能够通过选择性吸附并猝灭单链发卡结构，这种作用进一步增强了对单链发卡结构的猝灭效率，有利于增加全光纤倏逝波生物传感器的敏感性。在不经进一步信号分离的前提下，将混合物引入修饰有AAP探针的全光纤倏逝波生物传感器中，然后溶液中未反应的M-Apts以光纤表面上固定的AAP探针为核心进行重组(M-Apts转移到光纤表面)，由全光纤倏逝波生物传感器检测荧光强度变化。光纤上M-Apt的含量与氨基糖苷类抗生素的浓度成反比，最终实现对氨基糖苷类抗生素的含量检测。
A、检测待测溶液中卡那霉素A的含量的方法
一、制备AAP探针修饰光纤
1、表面羟基活化的传感光纤的制备
(1)将传感光纤浸泡于piraha溶液，100℃静置1h。
piraha溶液由3体积份98.3％(m/m)的浓硫酸水溶液和1体积份30％(m/m)的过氧化氢水溶液组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述传感光纤，用超纯水冲洗3次，然后氮气吹干，置于干燥器中冷却，即获得表面羟基活化的传感光纤。
2、表面硅烷化的传感光纤的制备
(1)将表面羟基活化的传感光纤浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置60min。
硅烷化剂溶液：将2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶于100mL脱水甲苯，得到硅烷化剂溶液。
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为sigma-aldrich公司的产品，CAS号为919-30-2。
(2)完成步骤(1)后，取所述表面羟基活化的传感光纤，先用脱水甲苯冲洗3次，再用无水乙醇冲洗3次，然后氮气吹干，180℃烘烤1h，置于干燥器中冷却，即获得表面硅烷化的传感光纤。
3、表面偶联化的传感光纤的制备
(1)将表面硅烷化的传感光纤浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置60min。
戊二醛偶联剂溶液：将戊二醛溶于pH7.4、50mM的Tris-HAc缓冲液得到戊二醛偶联剂溶液；戊二醛偶联剂溶液中，戊二醛的体积百分含量为2％。
(2)完成步骤(1)后，取所述表面硅烷化的传感光纤，先用超纯水冲洗3次，再用pH7.4、50mM的Tris-HAc缓冲液冲洗3次，然后氮气吹干，置于干燥器中冷却，得到表面偶联化的传感光纤。
4、AAP探针修饰光纤的制备
(1)取表面偶联化的传感光纤，浸泡于AAP探针溶液(含500nM AAP探针的pH7.4、10mM的磷酸盐缓冲液)，4℃过夜。
(2)完成步骤(1)后，取所述表面偶联化的传感光纤，用pH7.4、10mM的磷酸盐缓冲液冲洗3次。
(3)完成步骤(2)后，取所述表面偶联化的传感光纤，浸泡于封闭剂(目的为对非特异性位点进行封闭)15min，用pH7.4、10mM的磷酸盐缓冲液冲洗3次。
封闭剂：取1.5g NaBH4，先加入350mL pH7.4、10mM的PBS缓冲液溶解，再加入150mL乙醇，混匀。
(4)完成步骤(3)后，取所述表面偶联化的传感光纤，95℃水浴5min(目的为去除非特异性吸附)，然后氮气吹干，得到固定AAP探针的传感光纤，命名为AAP探针修饰光纤。
二、待测溶液中卡那霉素A含量的检测
设置实验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
1、核酸适配体多聚体结构(M-Apts)的获得
取含1μM FAP的pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液，先95℃水浴10min(目的为变性)，然后立即转移至0℃冰浴15min(目的为使FAP分子间发生相互结合)，得到M-Apts。
将M-Apts置于4℃备用，使用时置于室温环境。
2、M-Apts与样品结合
(1)取卡那霉素A(sigma-aldrich公司的产品)，然后用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，获得卡那霉素A溶液。
(2)取步骤1形成的M-Apts，用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，得到浓度为40nM的M-Apts溶液。
(3)取离心管，加入步骤(1)获得的500μL卡那霉素A溶液、加入步骤(2)获得的500μL M-Apts溶液和1μL浓度为1g/mL的GO(中国科学院山西煤炭化学研究所的产品)，混匀，得到反应体系。反应体系中，卡那霉素A的浓度为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM或200μM。
(4)取步骤(3)制备的反应体系，室温静置10min，得到反应液。
3、信号检测
(1)将步骤一制备的AAP探针修饰光纤安装入全光纤倏逝波生物传感器。
(2)取反应液，通入完成步骤(1)的全光纤倏逝波生物传感器，检测不同时间的荧光信号。
4、再生
完成步骤3后的AAP探针修饰光纤可以再生，再生方法为：取完成步骤3的全光纤倏逝波生物传感器，先通入pH7.0、浓度为0.5％(0.5mg/100mL)的SDS水溶液洗涤(目的为去除AAP探针修饰光纤上的M-Apts)，最后使用超纯水和pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液各清洗一遍AAP探针修饰光纤。
设置空白对照组：用等体积pH7.4、10mM的Tris缓冲液代替卡那霉素A溶液，其它操作同实验组。
实验结果见图2中A(0μM为pH7.4、10mM的Tris缓冲液)。结果表明，随着卡那霉素A在反应体系中浓度的增加，荧光信号值逐渐下降。
5、以卡那霉素A在反应体系中的浓度为横坐标，在500s时的信号下降率作为纵坐标，绘制检测卡那霉素A的标准曲线(卡那霉素A在反应体系中的浓度在0μM-1μM)。信号下降率＝(空白对照组的荧光信号值-实验组的荧光信号值)/空白对照组的荧光信号值×100％。
检测卡那霉素A的标准曲线如图2中B所示，线性关系为：y＝0.0278+0.426x，R2＝0.988；x为卡那霉素A在反应体系中的浓度，y为信号下降率。
根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，卡那霉素A的最低检测限为26nM。
6、待测溶液中卡那霉素A含量的检测
按照上述步骤，将步骤2中的卡那霉素A溶液替换为待测溶液，其它步骤均不变，得到待测溶液在500s时的信号下降率；然后根据检测卡那霉素A的标准曲线即可计算得出待测溶液中的卡那霉素A含量。
B、检测待测溶液中卡那霉素B的含量的方法
卡那霉素B为sigma-aldrich公司的产品。
一、制备AAP探针修饰光纤
同步骤A中步骤一。
二、待测溶液中卡那霉素B含量的检测
设置实验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
1、核酸适配体多聚体结构(M-Apts)的获得
同步骤A步骤二中1。
2、M-Apts与样品结合
(1)取卡那霉素B，然后用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，获得卡那霉素B溶液。
(2)取步骤1形成的M-Apts，用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，得到浓度为40nM的M-Apts溶液。
(3)取离心管，加入步骤(1)获得的500μL卡那霉素B溶液、加入步骤(2)获得的500μL M-Apts溶液和1μL浓度为1g/mL的GO，混匀，得到反应体系。反应体系中，卡那霉素B的浓度为0.5μM、1μM、5μM、20μM、50μM或200μM。
(4)取步骤(3)制备的反应体系，室温静置10min，得到反应液。
3、信号检测
(1)将步骤一制备的AAP探针修饰光纤安装入全光纤倏逝波生物传感器。
(2)取反应液，通入完成步骤(1)的全光纤倏逝波生物传感器，检测不同时间的荧光信号。
4、再生
同步骤A步骤二中4。
设置空白对照组：用等体积pH7.4、10mM的Tris缓冲液代替卡那霉素B溶液，其它操作同实验组。
在500s时的实验结果见图3。结果表明，随着卡那霉素B在反应体系中浓度的增加，荧光信号值逐渐下降。
5、以卡那霉素B在反应体系中的浓度为横坐标，在500s时的信号下降率作为纵坐标，绘制检测卡那霉素B的标准曲线(卡那霉素B在反应体系中的浓度在0μM-1μM)。
结果表明，检测卡那霉素B的标准曲线和检测卡那霉素A的标准曲线基本一致，对于高浓度靶标(如200μM)，均导致信号下降率降低(>90％)。
根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，卡那霉素B的最低检测限为73nM。
6、待测溶液中卡那霉素B含量的检测
按照上述步骤，将步骤2中的卡那霉素B溶液替换为待测溶液，其它步骤均不变，得到待测溶液在500s时的信号下降率；然后根据检测卡那霉素B溶液的标准曲线即可计算得出待测溶液中的卡那霉素B含量。
C、检测待测溶液中阿米卡星的含量的方法
阿米卡星为sigma-aldrich公司的产品。
按照步骤B的方法，将卡那霉素B替换为阿米卡星，其它步骤均不变。
在500s时的实验结果见图3。结果表明，随着阿米卡星在反应体系中浓度的增加，荧光信号值逐渐下降。检测阿米卡星的标准曲线和检测卡那霉素A的标准曲线基本一致，对于高浓度靶标(如200μM)，均导致信号下降率降低(>90％)。
根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，阿米卡星的最低检测限为68nM。
D、检测待测溶液中庆大霉素的含量的方法
庆大霉素为sigma-aldrich公司的产品。
按照步骤B的方法，将卡那霉素B替换为庆大霉素，其它步骤均不变。
在500s时的实验结果见图3。结果表明，随着庆大霉素在反应体系中浓度的增加，荧光信号值逐渐下降。检测庆大霉素的标准曲线和检测卡那霉素A的标准曲线基本一致，对于高浓度靶标(如200μM)，均导致信号下降率降低(>90％)。
根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，庆大霉素的最低检测限为57nM。
实施例2、选择性检测
一、制备AAP探针修饰光纤
同实施例1步骤A中步骤一。
二、不同抗生素的选择性检测
设置实验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
1、核酸适配体多聚体结构(M-Apts)的获得
同实施例1步骤A步骤二中1。
2、M-Apts与样品结合
(1)取待测抗生素(卡那霉素A、阿米卡星、四环素、链霉素、氯霉素或磺胺二甲嘧啶)，然后用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，得到浓度为400μM的待测抗生素溶液。
(2)取步骤1形成的M-Apts，用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，得到浓度为40nM的M-Apts溶液。
(3)取离心管，加入步骤(1)获得的500μL待测抗生素溶液、加入步骤(2)获得的500μL M-Apts溶液和1μL浓度为1g/mL的GO，混匀，得到反应体系。
(4)取步骤(3)制备的反应体系，室温静置10min，得到反应液。
3、信号检测
(1)将步骤一制备的AAP探针修饰光纤安装入全光纤倏逝波生物传感器。
(2)取反应液，通入完成步骤(1)的全光纤倏逝波生物传感器，检测在500s时的荧光信号。
设置空白对照组：用等体积pH8.0、10mM的Tris缓冲液代替待测抗生素溶液，其它操作同实验组。
比较不同抗生素的选择性实验结果，具体方法为：收集在500s时的荧光信号，计算信号减弱比例。信号减弱比例＝实验组的荧光信号值/空白对照组的荧光信号值×100％。
实验结果见图4。结果表明，非氨基糖苷类抗生素(如四环素、链霉素、氯霉素、磺胺二甲嘧啶)的信号减弱比例都相当小(<10％)。因此，本发明所提供的方法对于氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素A、阿米卡星)的检测均具有良好的选择性。
实施例3、重复性检测
一、制备AAP探针修饰光纤
同实施例1步骤A中步骤一。
二、重复性检测
1、核酸适配体多聚体结构(M-Apts)的获得
(1)取含1μM FAP的pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液，先95℃水浴10min(目的为变性)，然后立即转移至0℃冰浴15min(目的为使FAP分子间发生相互结合)，得到M-Apts。
(2)取步骤1形成的M-Apts，用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，得到浓度为20nM的M-Apts溶液。
2、信号检测
(1)将步骤一制备的AAP探针修饰光纤安装入全光纤倏逝波生物传感器。
(2)取M-Apts溶液，通入完成步骤(1)的全光纤倏逝波生物传感器，检测在500s时的荧光信号。
(3)完成步骤(2)后，取全光纤倏逝波生物传感器，先通入pH7.0、浓度为0.5％(0.5mg/100mL)的SDS水溶液洗涤(目的为去除AAP探针修饰光纤上的M-Apts)，最后使用超纯水和pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液各清洗一遍AAP探针修饰光纤。
重复步骤2中(1)-(3)，共重复60次。
实验结果见图5。在60次表面再生后，信号保持稳定，信号间相对标准偏差(RSD)为3.27％。结果表明，AAP探针修饰光纤有很好的再生性能，重复性好。
实施例4、地表水中氨基糖胺类抗生素的检测
一、绘制检测卡那霉素A的标准曲线
同实施例1步骤A步骤一和步骤二中1－5。
检测卡那霉素A的标准曲线如图2中B所示，线性关系为：y＝0.0278+0.426x，R2＝0.988；x为卡那霉素A在反应体系中的浓度，y为信号下降率。
二、地表水中氨基糖胺类抗生素的检测
将步骤一中2的卡那霉素A溶液替换为卡那霉素A加标的地表水，其它步骤均不变，得到卡那霉素A加标的地表水在500s时的信号下降率；然后根据检测卡那霉素A的标准曲线即可计算得出卡那霉素A加标的地表水中的卡那霉素A含量。
卡那霉素A加标的地表水的制备方法如下：
(1)取卡那霉素A，然后用pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液稀释，获得卡那霉素A溶液；
(2)取地表水，加入卡那霉素A溶液和pH7.4、40mM的Tris-HAc缓冲液，混匀，得到卡那霉素A加标的地表水。卡那霉素A加标的地表水中，卡那霉素A的浓度为0.3μM、0.6μM或1μM，Tris-HAc缓冲液的浓度为10mM，pH值为7.4。
实验结果见表2。三个浓度梯度的卡那霉素A加标的地表水的回收率均在80-120％之间，相对标准偏差均控制在10％以内。结果表明，本发明提供的方法具有良好的抗环境基质干扰能力，可以适用于地表水环境中氨基糖苷类抗生素的检测。
表2
<110> 清华大学
<120> 一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tttttttggg ggttgaggct aagccga 27
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tgggggttga ggctaagccg a 21
Claims (10)
1.一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法，包括步骤(a)和步骤(b)：
所述步骤(a)包括如下步骤：
(a-1)制备杂交液；所述杂交液含有FAP；
(a-2)完成步骤(a-1)后，加入待测溶液，孵育；
(a-3)完成步骤(a-2)后，采用AAP探针检测荧光信号强度；
所述步骤(b)包括如下步骤：
(b-1)制备杂交液；所述杂交液含有所述FAP；
(b-2)完成步骤(b-1)后，加入氨基糖苷类抗生素标准溶液，孵育；
(b-3)完成步骤(b-2)后，采用AAP探针检测荧光信号强度；
根据氨基糖苷类抗生素标准溶液中氨基糖苷类抗生素的浓度和相应荧光信号强度的下降率绘制标准曲线，将所述步骤(a-3)得到的荧光信号强度的下降率代入所述标准曲线，得到待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量；
所述FAP为单链核酸分子，自5’末端到3’末端的核苷酸序列为TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA；所述FAP的末端具有荧光基团；
所述AAP探针为单链核酸分子，自5’末端到3’末端依次包括如下元件：P1片段和所述FAP；所述P1片段由n个T组成；n为大于等于3且小于等于12的自然数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“所述FAP的末端具有荧光基团”为所述FAP的5’末端和/或3’末端具有荧光基团。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为花青素荧光染料Cy5、羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3或花青素荧光染料Cy5.5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“采用AAP探针检测荧光信号强度”为采用具有所述AAP探针的全光纤倏逝波生物传感器检测荧光信号强度。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述AAP探针的末端具有修饰基团。
6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：
(c)取完成步骤(b)的全光纤倏逝波生物传感器，再生；
(d)将完成步骤(c)的全光纤倏逝波生物传感器再进行步骤(a)和步骤(b)的检测。
7.一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素含量的试剂盒，包括权利要求1至6中任一所述AAP探针和所述FAP。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括传感光纤。
9.权利要求7或8所述试剂盒在检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量中的应用。
10.如权利要求1至6任一所述的方法、或、权利要求7或8所述试剂盒、或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述氨基糖苷类抗生素为卡那霉素A和/或卡那霉素B和/或庆大霉素和/或阿米卡星。
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