CN104407128B - 一种基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒。该试剂盒包括：莱克多巴胺的适配体、胶体金和NaCl溶液；所述莱克多巴胺的适配体的序列如序列表中序列1所示。实验证明：该莱克多巴胺可视化检测试剂盒的检测灵敏度为10ng/g，通过添加回收，测得回收率为93.3～109％，并与盐酸克伦特罗和沙丁胺醇无交叉反应。

Description

一种基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒。
背景技术
莱克多巴胺(RAC)是一种人工合成的β-肾上腺素受体激动剂。它可以加快畜禽生长速度，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率。人吃了残留莱克多巴胺的组织后会出现中毒症状，对患高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可能危及生命。在大量食用含有莱克多巴胺残留的肉类或内脏时，可能引发中毒症状，恶心、头晕、肌肉颤抖、心悸、血压上升、促进心血管疾病等。对此药物在养殖业的适用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。自2011年12月5日起在中国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。
目前，国内外对于动物性食品中莱克多巴胺的检测方法主要有免疫分析法、色谱分析技术、传感器技术等。这些方法灵敏度高、选择性好，但由于样品前处理较复杂、仪器设备昂贵、需专门操作人员、耗时耗力、限制了其应用，因此，有必要发展一种低成本、不使用复杂仪器、方便快捷而又灵敏的检测方法。
适配体是一种DNA短链或RNA序列，它们通过氢键、疏水作用、假碱基对堆积作用和形状匹配等形式结合到靶分子上，形成较强亲和力的复合物。适配体仅识别与其互补的分子结构，能够分辨靶标分子上的细微差别，与靶物质的结合通常表现出高度的特异性。由于适配体对其靶物质有高度的特异性和高度的亲和力，在医疗诊断、治疗手段、新药物的开发、药物输送系统、生物影像、分析试剂、危害检测、食品检验等领域扮演着重要的角色。目前，适配体已被应用在了很多检测手段中，如电感耦合等离子体质谱、纳米金、表面等离子体共振、色谱、表面增强拉曼散射、毛细管电泳、生物传感器等，以及分子适配体信标。胶体金颗粒大小多在1-100nm，微小的金颗粒稳定均一且呈单一分散状态悬浮在液体中，它具有独特的光学、电学特性，特别是具有对电解质的敏感性，电解质能够破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒而从液体中沉淀下来，发生颜色的变化。基于胶体金的光特性，近年来在DNA相关的比色分析中常被用作比色的介质。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺和/或莱克多巴胺浓度的适配体。
本发明提供的检测待测样品中是否含有莱克多巴胺和/或莱克多巴胺浓度的适配体的序列如序列表中序列1所示。
本发明的另一个目的是提供一种检测待测样品中莱克多巴胺浓度的方法。
本发明提供的检测待测样品中莱克多巴胺浓度的方法包括如下步骤：
(1)将上述所述的适配体与不同浓度的莱克多巴胺标准品或待测样品混合，得到混合液1，对混合液1进行孵育；
(2)然后向混合液1中加入胶体金，得到混合液2，对混合液2进行孵育；
(3)再向混合液2中加入NaCl溶液，得到混合液3；
(4)读取含有不同浓度的莱克多巴胺标准品的混合液3的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标、以莱克多巴胺的浓度为横坐标绘制标准曲线；
(5)读取加入待测样品的吸光度值，并代入标准曲线；从曲线上可读出待测样品中莱克多巴胺的浓度。
上述方法中，所述适配体的浓度为1-10μM；具体为5μM。
上述方法中，所述胶体金的PH值为6.0-9.0；具体为7.0。
上述方法中，所述NaCl溶液的浓度为1-2.5mol/L；具体为1.5mol/L。
上述方法中，所述孵育的时间为5-15min；具体为5min。
上述方法中，所述孵育的温度为15-30℃；具体为25℃。
上述方法中，所述适配体、莱克多巴胺溶液、胶体金、NaCl溶液的体积比5:5:5:1。
上述方法中，所述莱克多巴胺标准品的浓度梯度为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和400ng/mL。
上述方法中，所述吸光度值为光密度D520与D630的比值。
上述所述的方法在制备检测或辅助检测待测样品中莱克多巴胺浓度的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有莱克多巴胺的方法包括如下步骤：将莱克多巴胺适配体与待测样品混合，得到混合液1，对混合液1进行孵育；然后向混合液1中加入胶体金，得到混合液2，对混合液2进行孵育；再向混合液2中加入NaCl溶液，得到混合液3；
若混合液3的颜色为蓝色，说明待测样品中含有莱克多巴胺；
若混合液3的颜色为红色，说明待测样品中不含有莱克多巴胺。
上述所述的方法在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有莱克多巴胺的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明最后一个目的是提供一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺或莱克多巴胺浓度的试剂盒。
上述所述试剂盒包括：莱克多巴胺的适配体、胶体金和NaCl溶液。
上述试剂盒中，所述莱克多巴胺的适配体的序列如序列表中序列1所示。
上述所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有莱克多巴胺或莱克多巴胺浓度中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的试剂盒具有以下优点：
(1)操作简单，只需将适配体、胶体金和目标分析物进行混合反应；
(2)反应时间短，整个检测过程不超过20min；
(3)成本低，适配体可以批量化学合成获取，胶体金为常规试剂，平均检测一个样品的成本不超过1.0元。
本发明提供了一种基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒。实验证明：该莱克多巴胺可视化检测试剂盒的检测灵敏度为10ng/g，通过添加回收，测得回收率为93.3～109％，并与盐酸克伦特罗和沙丁胺醇无交叉反应。
附图说明
图1为基于适配体的莱克多巴胺可视化检测原理。其中：为胶体金，为莱克多巴胺适配体，◆为莱克多巴胺。
图2为适配体浓度为5μmol/mL时颜色梯度变化的照片(从左到右依次是：0，10，50，100，200，500，1000ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图3为适配体浓度为5μmol/mL时的紫外光谱图(从上到下依次是0，10，50，100，200，500，1000ng/mL的RAC的紫外谱图)。
图4为NaCl的浓度为1.5mol/L时颜色梯度变化的照片(从左到右依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图5为NaCl的浓度为1.5mol/L时的紫外光谱图(从上到下依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图6为孵育时间为5min时颜色梯度变化的照片(从左到右依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图7为孵育时间为5min时的紫外光谱图(从上到下依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图8为孵育温度为25℃时颜色梯度变化的照片(从左到右依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图9为孵育温度为25℃时的紫外光谱图(从上到下依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图10为体系pH值为7时颜色梯度变化的照片(从左到右依次是：0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
图11为体系pH值为7时的紫外光谱图(从上到下依次是：0，10，20，50，100， 200，400ng/mL的RAC加入后的颜色变化梯度)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒
一、试剂盒的试剂
基于适配体的莱克多巴胺可视化检测试剂盒包括莱克多巴胺适配体(SEQIDNo.1)、胶体金和NaCl溶液。
二、试剂盒的原理
单链的核酸适配体具有分子柔性，能够吸附在胶体金的表面而形成一层保护层，阻止盐诱导的胶体金颗粒的聚集，在靶标的存在下核酸适配体与靶标结合，核酸适配体不能吸附于胶体金的表面，稳定性降低，遇盐则聚集而发生颜色改变，吸收波长改变，肉眼可见(如图1所示)。
三、试剂盒的优化
1、最佳适配体浓度的确定
在25℃下，将50μL浓度为1，2，3，4，5，10μM的RAC适配体分别与50μL的浓度梯度为0，10，50，100，200，500，1000ng/mL的RAC标品混合，孵育5min；然后向其加入50μL的pH值为6.0的胶体金，孵育5min；加入10μL的2mol/L的NaCl溶液，孵育5min，检测其光密度D520和D630的值。加入2mol/L的NaCl溶液后，混合物的颜色和光谱的变化分别如图2和图3所示。
结果表明：适配体浓度为5μM时，胶体金的颜色变化梯度为最好，因此5μM为最佳适配体浓度。
2、最佳电解质浓度的确定
在25℃下，将50μL的5μM的适配体分别与50μL的浓度为0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC标品混合并孵育5min；然后分别向其加入50μL的pH值为6.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。加入不同浓度的NaCl溶液后，混合物的颜色和光谱的变化分别如图4和图5所示。
结果表明：NaCl溶液为1.5mol/L时，胶体金的颜色变化梯度为最好，因此1.5mol/L的NaCl溶液为最佳电解质浓度。
3、最佳孵育时间的确定
在25℃下，将50μL的5μM的RAC适配体分别与50μL的浓度为0，10，20，50，100，200，400ng/mL的的RAC标品混合，分别孵育5min、10min、15min；分别向其 加入50μL的pH值为6.0的胶体金，孵育5min、10min、15min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。孵育不同时间后混合物的颜色和光谱变化分别如图6和图7所示。
结果表明：在孵育时间为5min时，胶体金的颜色变化梯度为最好，因此5min为最佳孵育时间。
4、最佳孵育温度的确定
在25℃下，将50μL的5μM的RAC适配体分别与50μL的浓度为0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC标品混合，分别在15℃、20℃、25℃、30℃下孵育5min；分别向其加入50μL的pH值为6.0的胶体金，在15℃、20℃、25℃、30℃下孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。不同孵育温度后混合物的颜色和光谱变化分别如图8和图9所示。
结果表明：在25℃时胶体金的颜色变化梯度为最好，因此25℃为最佳孵育温度。
5、最佳pH值的确定
在25℃下，将50μL的5μM的RAC适配体分别与50μL的浓度为0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC标品混合，孵育5min；分别向其加入50μL的pH值为6.0、7.0、8.0、9.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。不同pH值的混合物的颜色和光谱变化分别如图10和图11所示。
结果表明：在pH为7.0时，胶体金的颜色变化梯度为最好，因此pH为7.0时是最佳pH值。
四、试剂盒的定量和定性检测方法
1、检测方法
在25℃下，向96孔酶标板中加入50μL的5μM的适配体，随后加入50μL浓度梯度为0，10，20，50，100，200，400ng/mL的RAC标品，充分混合并孵育5min；然后分别向其加入50μL的pH值为7.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。
2、定性检测
以加入0ng/mL RAC标品的溶液颜色(红色)作为参照颜色，随着莱克多巴胺浓度的增大，溶液的颜色从红色逐渐变为蓝色，浓度越大颜色越蓝。
3、定量检测
用标准曲线进行定量。横坐标为RAC的浓度，纵坐标为D520和D630的比值，然后绘制标准曲线。将待检测的样品溶液的D520和D630的比值带入标准曲线，即可得到待测样品中RAC的浓度大小。
实施例2、莱克多巴胺可视化检测试剂盒的灵敏度及回收率检测
1、灵敏度检测
在25℃下，向96孔酶标板中加入50μL的5μM的适配体，随后加入50μL浓度梯度为0，1，5，10，20，50，100ng/mL的RAC标品，充分混合并孵育5min；然后分别向其加入50μL的pH值为7.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。
结果表明：用肉眼观察，RAC标品溶度为1ng/mL和5ng/mL时相比于0ng/mL来说颜色没有明显的变化，而RAC溶度为10ng/mL时肉眼可观察出其颜色变化。用紫外分光光度计其光密度D520和D630的值，与0ng/mL相比，RAC为1ng/mL和5ng/mL时D520和D630的值变化不大。因此，确定检测灵敏度为10ng/g。
2、回收率检测
取7个离心管，编号为1、2、3、4、5、6、7，分别称取7份质量均为1g的混合饲料于离心管中，然后向离心管中加入5ml的甲醇/水(4：1)提取液，用均质器混匀，离心分离提取液与固体残渣；将离心上清液进行二次离心，取7支10ml的离心管，编号为A、B、C、D、E、F、G，分别取4ml提取液于对应的10ml离心管中，最后分别向离心管中加入一定量的标品，配置成浓度为10ppb、50ppb、200ppb的提取液，在氮气流下吹干后加入体积为4ml的二次水，用上述试剂盒进行检测。
结果表明：通过添加回收，测得回收率为93.3～109％(如表1所示)。
表1、饲料中莱克多巴胺添加回收率
序号 添加浓度(ng/g) 测得浓度(ng/g) 回收率(％) 相对标准偏差(％)
1 10 10.5 105 4.2
2 50 54.7 109 8.9
3 200 186.6 93.3 1.4
3、交叉反应检测
(1)与克伦特罗的交叉反应
在25℃下，向96孔酶标板中加入50μL，5μM的适配体，随后加入50μL浓度梯度为0，1，5，10，20，50，100，400ng/mL的CL(克伦特罗)标品，充分混合并孵育5min；然后分别向其加入50μL的pH值为7.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。
结果表明：用肉眼观察，相比于0ng/mL来说，颜色均无变化，用紫外分光光度计检测，光密度D520和D630的值几乎没有变化。因此与克伦特罗无交叉反应
(2)与沙丁胺醇的交叉反应
在25℃下，向96孔酶标板中加入50μL，5μM的适配体，随后加入50μL浓度梯度 为0，1，5，10，20，50，100，400ng/mL的SAL(沙丁胺醇)标品，充分混合并孵育5min；然后分别向其加入50μL的pH值为7.0的胶体金，孵育5min；添加10μL浓度为1.5mol/L的NaCl溶液，孵育5min，用紫外分光光度计检测其光密度D520和D630的值。
结果表明：用肉眼观察，相比于0ng/mL来说，颜色均无变化，用紫外分光光度计检测，光密度D520和D630的值几乎没有变化。因此，与沙丁胺醇无交叉反应
当克伦特罗和沙丁胺醇的浓度为400ng/mL时，与克伦特罗和沙丁胺醇无交叉反应。

Claims (6)

1.一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺和/或莱克多巴胺浓度的适配体，所述适配体的序列如序列表中序列1所示。
2.一种检测待测样品中莱克多巴胺浓度的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的适配体与不同浓度的莱克多巴胺标准品或待测样品混合，得到混合液1，对混合液1进行孵育；
(2)然后向混合液1中加入胶体金，得到混合液2，对混合液2进行孵育；
(3)再向混合液2中加入NaCl溶液，得到混合液3；
(4)读取含有不同浓度的莱克多巴胺标准品的混合液3的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标、以莱克多巴胺的浓度为横坐标绘制标准曲线；
(5)读取加入待测样品的吸光度值，并代入标准曲线；从曲线上可读出待测样品中莱克多巴胺的浓度；
所述适配体的浓度为1-10μM；所述胶体金的pH值为6.0-9.0；所述NaCl溶液的浓度为1-2.5mol/L；所述孵育的时间为5-15min；所述孵育的温度为15-30℃；所述适配体、莱克多巴胺溶液、胶体金、NaCl溶液的体积比5:5:5:1；
所述莱克多巴胺标准品的浓度梯度为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和400ng/mL；所述吸光度值为光密度D520与D630的比值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述适配体的浓度为5μM；
所述胶体金的pH值为7.0；
所述NaCl溶液的浓度为1.5mol/L；
所述孵育的时间为5min；
所述孵育的温度为25℃。
4.一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺的方法，包括如下步骤：
将莱克多巴胺适配体与待测样品混合，得到混合液1，对混合液1进行孵育；然后向混合液1中加入胶体金，得到混合液2，对混合液2进行孵育；再向混合液2中加入NaCl溶液，得到混合液3；
若混合液3的颜色为蓝色，说明待测样品中含有莱克多巴胺；
若混合液3的颜色为红色，说明待测样品中不含有莱克多巴胺；
所述莱克多巴胺的适配体的序列如序列表中序列1所示。
5.一种检测待测样品中是否含有莱克多巴胺或莱克多巴胺浓度的试剂盒，该试剂盒包括：莱克多巴胺的适配体、胶体金和NaCl溶液；
所述莱克多巴胺的适配体的序列如序列表中序列1所示。
6.权利要求5所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有莱克多巴胺或莱克多巴胺浓度中的应用。
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