CN103698280A - 用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法，本方法基于固定液可以迅速终止离体生物组织的自溶和腐败变化过程，进而萃取生物组织中的物质成分，并在一定时间内达到动态平衡的原理，应用各种检测方法进行分析，依据生物组织自溶和腐败发生、发展的时序性规律，最终间接推断出PMI。本方法包括取样“六定”法、“窗口期”标准曲线的拟定、PMI的推断。本发明所述的方法通过取样“六定”法，有效地避免了取材到检测之间离体生物组织继续自溶和腐败，提高了推断PMI的准确性和科学性。
Description
技术领域
本发明涉及一种推断死亡时间(Postmortem Interval，PMI)的方法，具体是一种用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法。
背景技术
PMI是指机体从死亡时刻至检验时刻之间的时间间隔。PMI在刑事案件的侦破上对于确定案发时间、排查嫌疑人、划定侦查范围的司法意义重大，对于遗产继承、保险理赔等案件处理亦具有一定意义。由于许多非自然死亡案件发生的时间并不清楚，所以如何准确地推断PMI，一直是法医实际鉴定工作中头等重要的问题。
人或其它动物死后，随着时间的推移，尸体会在相应的环境下发生一系列死后变化，其中自溶和腐败是造成尸体组织严重破坏的主要原因，自溶和腐败使尸体组织的生物大分子逐渐降解成各种不同的小分子物质，蛋白质、核酸、糖类、脂类等大分子逐渐减少，胺类、氨基酸、脂肪酸、电解质等水溶性或脂溶性中小分子、元素和离子，以及一些不溶解的大分子悬浮颗粒的物质逐渐增多，此外，还可能包括一些腐败菌的代谢产物的增加。这一过程的发生、发展具有明显单向的时序性规律。
当前国内外法医工作者利用了生物物理学、生物化学、免疫组织化学、分子生物学等方法和技术，并依据生物组织自溶和腐败后所致的物质成分含量及其理化性状的死后时序性变化的规律，进行了推断PMI的研究，但由于尸体受到自溶和腐败以及体内外各种因素的综合影响，现有推断PMI的方法均存在指标单一、窗口期短和准确性差等技术瓶颈。
生物组织固定液主要是通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用，使用固定液固定不同PMI的离体生物组织可以迅速将其固定，同时阻止其进一步的自溶和腐败，使生物组织的物质成分及其构成比固定在死后取材时刻。同时，生物组织中各种物质成分会通过溶解、扩散等途径被萃取到固定液中，并在一定时间内达到动态平衡，使得不同PMI的生物组织固定液的色度、浑浊度、吸光度及其中不同物质成分的构成呈明显的时序性区别。这说明在固定过程中可以借助固定液这一良好载体，选用合适的检测技术，发现不同生物组织自溶和腐败的时序性变化，从而依据其规律推断PMI。此外，基于不同生物组织的形态结构、物质成分不同，自溶和腐败的速率及其影响因素不同，不同尸体生物组织的推断PMI“窗口期”亦各不相同，可以相互组合从而更准确地推断PMI。
发明内容
本发明基于固定液可以迅速终止离体生物组织的自溶和腐败变化过程，进而萃取生物组织中的物质成分，并在一定时间内达到动态平衡的原理，从而应用各种检测方法进行分析，依据生物组织自溶和腐败发生、发展的时序性规律，最终间接推断出PMI。
该方法包括取样“六定”法、标准曲线的拟定、PMI的推断。
采用固定液对离体生物组织取样进行固定时应依照“六定”法：1、定时：提取死后的尸体生物组织，立即放入备制的固定液中，防止生物组织自溶和腐败，保证生物组织形态结构及其物质成分和含量等均停留在取材的时间点的水平不变；2、定位：每种生物组织均选定结构均匀、个体差异小、不易发生伤病的部位进行取材，以期最大限度地避免因同一生物器官不同部位的组织结构及其成分存在一定的差异而导致的取材误差；3、定量：每个生物组织检材均应提取相同质量，以期达到最大限度的可比性；4、定形：每个可成形的生物组织检材均应切取同一形状大小，保证其体积和表面积基本相等，难以成形的组织可等质量地研磨成组织匀浆；5、定比：统一固定液的配比参数，统一生物组织与固定液的质量体积比，从而固定生物组织并萃取其中的物质；6、定时：每个生物组织检材的固定时间应统一，一般以固定后生物组织中各种物质成分通过溶解、扩散等途径被萃取到固定液中，并在一定时间内达到稳定动态平衡的时刻为限。
利用已知PMI的生物组织样本的数据来拟合“窗口期”标准曲线Y＝a XPMI+b(其中XPMI为PMI；Y为和PMI对应的采用不同检测方法取得的参数，如Y可为固定液的色度、吸光度等参数；a和b为曲线拟合后得到的常数)。分别在机体死亡后的若干个个时间点按取样“六定”法规范化取材，取得固定液样本之后再依据固定液的色度、吸光度等参数的时序性变化，得到两个常数a和b的值。
将未知PMI的生物组织依据“六定”法进行处理后再采用相应的检测方法测定Y参数，将其导入已获得的“窗口期”标准曲线中即可推断出PMI。
所述的检测方法包括比色法、分光光度法等可检测固定液色度和吸光度的方法，也包括气相色谱法、液相色谱法、气-质联用法、液-质联用法、核磁共振波谱法等可检测固定液中各类生物大分子降解产物的方法。
所述的固定液可以为甲醛、酒精等常用固定液。
本发明所述的方法通过取样“六定”法，有效地避免了取材到检测之间离体生物组织继续自溶和腐败，提高了推断PMI的准确性和科学性。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
具体实施方式一
选取10头4月龄健康家猪，平均体重约145kg，屠宰后分离每头猪的空肠，置于恒温25℃、恒湿100％、自昼光照12h人工气候箱，让其自溶和腐败。
按取样“六定”法规范化取材：1、定时：在家猪死后2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110h、122h、134h共12个时间组分别在10头猪的空肠上取样；2、定位：剪开空肠膜缘，展平肠壁，沿空肠长轴(平行粘膜皱襞)纵行切取；3、定量：截取重量相同的空肠标本10g；4、定形：不同样本的取样应统一切取同一形状大小，保证其体积和表面积基本相等；5、定比：按9：1蒸馏水/甲醛原液配制10％甲醛固定液，空肠质量与甲醛固定液的质量体积比为1：10；6、定时：将空肠样本于甲醛固定液中固定72小时后弃去固定组织，得到固定液样本。
用快速定性滤纸过滤各时间组的固定液样本，分析时取过滤后的固定液10ml，滴加5％的茚三酮乙醇溶液5滴，用紫外-可见光分光光度计扫描测定570nm处固定液的吸光度。依据分析数据，在家猪死后2-74h内为“窗口期”，空肠组织的固定液吸光度随PMI延长而上升明显，呈线性变化趋势，组间比较差异显著p＜0.05，呈正相关性，拟合方程为Y吸光度＝0.1416XPMI+0.1998，R2＝0.9288；74h-122h内为平台期，固定液吸光度随PMI延长趋于平稳，组间比较无显著差异P＞0.05。
取过滤后的固定液10ml，应用铬钴标准比色法检测固定液的色度。依据分析数据，在家猪死后2-122h内为“窗口期”，空肠组织的固定液色度值随PMI延长而逐渐增高，组间比较差异显著p＜0.05，呈正相关性，拟合方程为：Y色度＝2.2529XPMI+8.5293，R2＝0.9697。
将需要进行PMI推断的死亡家猪，取其空肠样本依据“六定”法规范化取材后测定其固定液的吸光度或者色度，代入方程Y吸光度＝0.1416XPMI+0.1998或者Y色度＝2.2529XPMI+8.5293中，即可推断出其PMI。
具体实施方式二
选取10头4月龄健康家猪，平均体重约150kg，屠宰后提取每头猪的脑组织，置于恒温25℃、恒湿100％、白昼光照12h人工气候箱，让其自溶和腐败。
按取样“六定”法规范化取材：1、定时：在死后0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h共11个时间组分别在5头猪的脑组织样本上取样；2、定位：取脑组织额叶区，取包含皮、白质比1：1的样本；3、定量：按1：4蒸馏水/无水乙醇配制80％酒精固定液；4、定形：在设计好的时间点和部位，分别截取大小相同的标本10g；5、定比：脑组织质量与酒精固定液的溶质量体积比为1：10；6、定时：将脑组织样本于酒精固定液中固定72小时后弃去固定组织，得到固定液样本。
用快速定性滤纸过滤各时间组的固定液样本，分析时取过滤后的固定液10ml，滴加5％的茚三酮乙醇溶液5滴，用紫外-可见光分光光度计扫描测定570nm处固定液的吸光度。
依据分析数据，在家猪死后0-72h时间段内为“窗口期”，脑组织固定液吸光度随PMI延长上升明显，呈线性变化趋势，拟合方程为Y吸光度＝0.0086XPMI-0.1136，R2＝0.868；72-96h内为平台期，固定液吸光度随PMI延长趋于平稳，组间比较无显著差异P＞0.05；96h后无明显变化规律。
将需要进行PMI推断的死亡家猪，取其脑组织样本依据“六定”法规范化取材后测定其固定液的吸光度，代入方程Y吸光度＝0.0086XPMI-0.1136，即可推断出其PMI。
Claims (3)
1.用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法，其特征在于它包括取样“六定”法、“窗口期”标准曲线的拟定、PMI的推断。
采用固定液对离体生物组织取样进行固定时应依照“六定”法：a.定时：提取死后的尸体生物组织，立即放入备制的固定液中，防止生物组织自溶和腐败，保证生物组织形态结构及其物质成分和含量等均停留在取材的时间点的水平不变；b.定位：每种生物组织均选定结构均匀、个体差异小、不易发生伤病的部位进行取材，以期最大限度地避免因同一生物器官不同部位的组织结构及其成分存在一定的差异而导致的取材误差；c.定量：每个生物组织检材均应提取相同质量，以期达到最大限度的可比性；d.定形：每个可成形的生物组织检材均应切取同一形状大小，保证其体积和表面积基本相等，难以成形的组织可等质量地研磨成组织匀浆；e.定比：统一固定液的配比参数，统一生物组织与固定液的质量体积比，从而固定生物组织并萃取其中的物质；f.定时：每个生物组织检材的固定时间应统一，一般以固定后生物组织中各种物质成分通过溶解、扩散等途径被萃取到固定液中，并在一定时间内达到稳定动态平衡的时刻为限。
利用已知PMI的生物组织样本的数据来拟合“窗口期”标准曲线Y＝a XPMI+b(其中XPMI为PMI；Y为和PMI对应的采用不同检测方法取得的参数，如Y可为固定液的色度、吸光度等参数；a和b为曲线拟合后得到的常数)。分别在机体死亡后的若干个个时间点按取样“六定”法规范化取材，取得固定液样本之后再依据固定液的色度、吸光度等参数的时序性变化，得到两个常数a和b的值。
将未知PMI的生物组织依据“六定”法进行处理后再采用相应的检测方法测定Y参数，将其导入已获得的“窗口期”标准曲线中即可推断出PMI。
2.依据权利要求1中所述的用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法，其特征在于所述的检测方法包括比色法、分光光度法等可检测固定液色度和吸光度的方法，也包括气相色谱法、液相色谱法、气-质联用法、液-质联用法、核磁共振波谱法等可检测固定液中各类生物大分子降解产物的方法。
3.依据权利要求1中所述的用固定液固定兼萃取生物组织从而推断其死亡时间的方法，其特征在于所述的固定液可以为甲醛、酒精等常用固定液。
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| CN113887826A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-04 | 山西医科大学 | 一种基于核磁共振氢谱技术的大鼠死亡时间推断方法 |
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