CN111154839A - 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于DNA糖基化酶检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用。提供同时检测多种DNA糖基化酶的方法、提高检测精度有利于降低分析检测成本，提高临床应用实用性。本发明提供了一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法，它将单分子检测与滚环扩增驱动的编码不同的荧光分子结合起来，可用于在单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种DNA糖基化酶，并能区分正常细胞与癌细胞。它可以进一步用于酶动力学参数的分析和DNA糖基化酶抑制剂的筛选，在生物医学研究、临床诊断和药物开发中具有巨大的潜力。

Description

一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方 法及应用

技术领域

本发明属于DNA糖基化酶检测技术领域，具体涉及一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)数量及活性的荧光化学传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA损伤是生物体自发产生的危害，为了抵消DNA损伤的有害作用，细胞参与了多种修复机制，例如碱基切除修复(BER)。BER途径由DNA糖基化酶启动，DNA糖基化酶识别受损和错配的碱基，并通过水解碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键而将其从DNA中切除并产生脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP位点)，以进行下游BER修复过程。人类细胞中DNA糖基化酶的异常表达可能引起碱基切除修复的功能失调，并最终导致各种疾病。因此，同时检测多种DNA糖基化酶将有利于研究DNA损伤修复过程和早期临床诊断。为了提高检测灵敏度，提出了一些核酸扩增方法。其中，滚环扩增(RCA)可以在1小时内实现约1000倍的扩增，产生具有串联重复序列的非常长的单链DNA(ssDNA)。因其反应条件简单、扩增效率高的特点，一经建立便引起了很大关注，且日渐多元化。单分子检测是定量目标分子最简单、最直接的方法，能够对单个分子进行测量。与传统的整体荧光测量相比，基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测具有显著的优势，即灵敏度高、样品消耗低、信噪比高，是定量生物传感的理想平台，已应用于单分子水平的DNA、microRNA、蛋白和癌细胞的灵敏检测。

高效液相色谱法是一种高效的检测方法，但它需要繁琐的DNA裂解和昂贵的仪器。金纳米颗粒比色法可以直观检测DNA糖基化酶，但由于金纳米颗粒(AuNP)的制备和修饰过程复杂，检测灵敏度低。凝胶电泳结合放射性标记被认为是DNA糖基化酶(例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)分析的金标准方法，但该方法耗时长、灵敏度低、样品消耗量大、对操作技巧要求高，不适合定量分析并且伴随有害辐射。已有的与本发明最相近似的实现方案是基于滚环扩增的糖基化酶检测，它们通常涉及到荧光团-猝灭剂标记的探针，且因为所有的原材料都是在一个均匀的体系中，所以在扩增过程中没有特异性，只能检测一种DNA糖基化酶。在本发明研究团队之前的研究中，针对同时检测多种DNA糖基化酶的的方法进行了研究，提供了一种通过糖基化酶切割两种分子信标从而释放荧光信号的检测方法。

发明内容

针对上述研究背景，发明人研究团队针对同时检测多种糖基化酶的方法进行了深入的研究，提供了一种基于双链DNA底物及滚环扩增方法对人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)两种糖基化酶进行扩增的方法。本发明提供的方法中，通过巧妙地设计了两个环状模板，利用荧光染料标记的核苷酸使两个RCA过程的引物、模板和原料具有特异性，从而实现了同时检测同一系统中两种DNA糖基化酶，而且无需使用专门标记的检测探针。通过改变双功能DNA的识别位点，还可以用来检测其他酶。

针对上述技术方案，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括双链DNA(dsDNA)底物、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的环状模板；

优选的，所述含有次黄嘌呤碱基(I)碱基单链及含有尿嘧啶(U)碱基单链的5'端均采用生物素修饰，3'端均采用NH₂修饰。

优选的，所述hAAG的环状模板由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)三种碱基组成。

优选的，所述hAAG的引物通过APE1切割单链中的次黄嘌呤碱基而产生。

优选的，所述UDG的环状模板由A，T和胞嘧啶(C)三种碱基组成。

优选的，所述UDG的引物通过APE1切割单链中的尿嘧啶碱基而产生。

优选的，所述引物与模板在phi29聚合酶存在下引发RCA反应。

优选的，所述荧光化学传感器还包括磁珠、核酸外切酶及荧光分子标记的dCTP和dGTP，脱氧核糖核苷酸dATP及dTTP。

进一步优选的，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠。

进一步优选的，所述荧光分子标记的dCTP和dGTP为Cy3-dCTP和Cy5-dGTP。

本发明第二方面，提供一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括采用双链DNA底物，核酸内切酶及环状模板进行滚换扩增。

优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：

将待测物加入反应溶液A中进行孵育获得扩增产物，向孵育后的产物中加入磁珠溶液进行避光孵育，之后通过磁力将磁珠从反应液中分离得到扩增产物与磁珠的结合物，通过核酸外切酶消化所述结合物并对上清中的荧光进行检测。

进一步优选的，所述反应溶液A中包含双链DNA(dsDNA)底物，环状模板，APE1酶，phi29聚合酶，Cy3-dCTP，Cy5-dGTP，dATP和dTTP。

进一步优选的，所述磁珠溶液为链霉亲和素包被的磁珠溶液。

本发明第三方面，提供第一方面所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的荧光化学传感器和/或第二方面所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法在筛选人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)抑制剂/激活剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.经本发明验证，基于RCA的高扩增效率和单分子检测的高信噪比，该荧光化学传感器用于同时检测多种DNA糖基化酶，检测非常灵敏，hAAG的检测限为6.10×10^-9U每毫升，UDG的检测限为1.54×10^-9U每毫升。基于分子信标切割法中hOGG1检测限为2.23×10^-6U每微升，hAAG检测限为8.69×10^-7U每微升，提高了5个数量级；该方法hAAG的灵敏度与基于磁珠的荧光测定法(1×10^-4U/μL)和基于超支链信号放大的荧光测定法(9×10^-5U/μL)相比，提高了7个数量级，与碱基切除修复介导的级联三信号放大(2.6×10^-5U/μL)相比，提高了6个数量级；该方法UDG的灵敏度与发光分析法(2×10^-5U/μL)相比，提高了6个数量级，与基于酶辅助双环级联信号放大的荧光方法(1×10^-7U/μL)相比，该方法的灵敏度提高了4个数量级。该方法可以实现单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种酶，具有良好的特异性，可以用于多种肿瘤细胞的检测，应用与临床诊断与药物开发具有巨大的潜力。

2.相比发明人以往研究中提供的同时检测多种DNA糖基化酶的方法，本发明提供的检测方法无需特殊标记的检测探针，通过RCA驱动的不同荧光分子的编码，大大增加每个串联体的荧光分子数量，并且，本发明提供的方法无需复杂的分子标记方法，操作更加简便。

3.本发明提供的方法还能够通过改变双链dsDNA中的损伤位点，转用于其他DNA糖基化酶的检测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明中DNA糖化酶的检测原理图。

图2为DNA糖基化酶介导双功能dsDNA底物裂解机制图；

(A)在APE1存在下，hAAG介导的双功能dsDNA底物裂解的机制；

反应包括步骤1：次黄嘌呤碱基的切除和AP位点的形成，步骤2：裂解AP位点5'端的磷酸二酯键；

(B)在APE1存在下UDG介导的双功能dsDNA底物裂解的机制；

反应包括步骤1：尿嘧啶碱基的切除和AP位点的形成；步骤2：裂解AP位点5'端的磷酸二酯键。

图3为Cy3和Cy5的吸收和发射光谱。

图4为实施例1中凝胶电泳和荧光测量分析hAAG和UDG分析的可行性结果；

(A)DNA糖基化酶诱导的切除反应产物的非变性PAGE分析；

泳道M：DNA marker；

泳道1，Cy3标记的hAAG探针+Cy5标记的UDG探针+hAAG；

泳道2，Cy3标记的hAAG探针+Cy5标记的UDG探针+UDG；

泳道3，Cy3标记的hAAG探针+Cy5标记的UDG探针+hAAG+UDG；

泳道4，Cy3标记的hAAG探针+Cy5标记的UDG探针；

泳道5，Cy3标记的hAAG探针；

泳道6，Cy5标记的UDG探针；

(B)DNA糖基化酶诱导的RCA产物的琼脂糖凝胶电泳分析；

泳道M：DNA marker；

泳道1，双功能dsDNA底物(hAAG探针和UDG探针的杂交)+hAAG环形模板+UDG环形模板+hAAG+UDG；

泳道2，dsDNA底物+hAAG环形模板+hAAG；

泳道3，dsDNA底物+UDG环形模板+UDG；

泳道4，dsDNA底物；

泳道5，hAAG环形模板；

(C)在dsDNA底物+hAAG环形模板+hAAG和dsDNA底物+hAAG环形模板存在下，hAAG诱导的RCA产物的荧光光谱；SYBR Gold用作荧光指示剂；

(D)在dsDNA底物+UDG环形模板+UDG和dsDNA底物+UDG环形模板存在下，UDG诱导的RCA产物的荧光光谱；SYBR Gold用作荧光指示剂；

(E)在dsDNA底物+hAAG环形模板+UDG环形模板+hAAG+UDG和dsDNA底物+hAAG环形模板+UDG环形模板存在下，hAAG和UDG诱导的RCA产物的荧光光谱；SYBR Gold用作荧光指示剂；每个环形模板的浓度为50纳摩尔每升，双功能dsDNA浓度为100纳摩尔每升，hAAG和UDG浓度均为0.1U每微升。

图5为实施例1中通过基于TIRF的单分子成像同时检测hAAG和UDG；

其中，hAAG和UDG浓度均为1U每毫升，比例尺代表5微米。

图6为实施例1中传统荧光法检测灵敏度分析结果图；

(A)响应于不同浓度的hAAG的荧光光谱；

(B)响应于不同浓度的UDG的荧光光谱；

(C)568纳米处的荧光强度与hAAG浓度之间的对数线性相关性；

(D)670纳米处的荧光强度与UDG浓度之间的对数线性相关性。误差棒显示三组实验的标准偏差，本实验使用100纳摩尔每升双功能dsDNA底物和2U APE1。

图7为实施例1中不同浓度的hAAG和UDG时Cy3和Cy5荧光分子数量变化结果图；

(A)Cy3分子数随hAAG浓度的变化，插图显示Cy3分子数与hAAG浓度的对数之间的线性关系，范围为1×10^-11至1×10^-3U每微升；

(B)Cy5分子数随UDG浓度的变化，插图显示Cy5分子数与UDG浓度的对数之间的线性关系，范围为1×10^-11至1×10^-3U每微升；双功能dsDNA底物浓度为100纳摩尔每升，APE1为2U，误差棒表示三组实验的标准偏差。

图8为实施例1中Cy3和Cy5特异性响应分析结果图；

分别响应于0.1U每微升hAAG+0.1U每微升UDG、0.1U每微升hAAG、0.1U每微升UDG、0.1U每微升hOGG1、0.1U每微升TDG、0.1微克每微升BSA、0.2U每微升FPG和仅含反应缓冲液的对照组的Cy3分子数和Cy5分子数的差异；双功能dsDNA底物浓度为100纳摩尔每升，APE1为2U，误差棒表示三组实验的标准偏差。

图9为实施例1中底物浓度与反应速度的关系图；

(A)hAAG浓度为0.1U每微升时，初始速度(V)关于DNA底物浓度的变化；

(B)UDG浓度为0.1U每微升时，浓度为0.1U每微升时，初始速度(V)关于DNA底物浓度的变化，误差棒显示三个实验的标准偏差。

图10为实施例1中不同浓度抑制剂条件下DNA糖基化酶的活性检测结果图；

(A)不同浓度Cd²⁺时的hAAG相对活性；

(B)不同浓度Cd²⁺时的UDG相对活性；双功能dsDNA底物浓度为100纳摩尔每升，APE1为2U；误差棒表示三组实验的标准偏差。

图11为实施例1中不同细胞系中DNA糖基化酶的活性结果；

Cy3分子数和Cy5分子数分别关于A549细胞，HeLa细胞，SW480细胞，HL-7702细胞和灭活A549的细胞提取物(相当于1000个细胞)的响应信号；误差棒表示三组实验的标准偏差。

图12为实施例1中荧光分子数与癌细胞数量之间的关系；

(A)Cy3分子数与A549细胞数对数之间的线性关系；

(B)Cy5分子数与A549细胞数对数之间的线性关系；

(C)Cy3分子数与HeLa细胞数对数之间的线性关系；

(D)Cy5分子数与HeLa细胞数的对数之间的线性关系，本实施例使用100纳摩尔每升双功能dsDNA底物和2U APE1；误差棒表示三组实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的问题，本发明提出了一种同时检测癌细胞中人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)数量和活性的方法。

该方法的实验原理如图1所示。发明人设计了一个hAAG探针，在5'端的第22个碱基处修饰了一个次黄嘌呤碱基(I)，和一个UDG探针，在5'端的第22个碱基处修饰了一个尿嘧啶碱基(U)，两个探针的5'和3'端分别被生物素和NH₂修饰。两种探针的杂交形成了hAAG和UDG的双功能dsDNA底物。hAAG的环状模板由三种碱基组成，包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)，并且可以与hAAG引物杂交，该引物通过切割hAAG探针中的次黄嘌呤碱基而产生。UDG的环状模板也由三种碱基组成，包括A，T和胞嘧啶(C)，它可以与UDG引物杂交，该引物通过切割UDG探针中的尿嘧啶碱基而产生。这两种引物-环状模板对可以在phi29聚合酶存在下引发RCA反应。

该方法包括四个步骤：(1)hAAG和UDG特异性切割dsDNA底物；(2)引物与环状模板的杂交以及随后的RCA反应；(3)磁分离和核酸外切酶I和III裂解扩增产物而释放荧光分子，以及(4)通过全内反射荧光(TIRF)显微镜对荧光分子进行单分子检测。存在hAAG的情况下，hAAG酶可以特异性识别dsDNA底物中的I：T碱基对，并裂解脱氧核糖和次黄嘌呤碱基之间的N-糖苷键，释放次黄嘌呤碱基以形成无嘌呤/无嘧啶位点(AP位点)。随后，APE1可以催化dsDNA底物中的AP位点，以释放5'-生物素标记的带有3'-OH末端的hAAG引物(图2A)。释放的hAAG引物可以与hAAG环状模板配对，在phi29聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dTTP，Cy3-dCTP和Cy5-dGTP)存在下引发RCA反应。根据碱基互补配对规则，仅包含三种碱基(即A，T和G)的hAAG环状模板可能会导致hAAG的扩增产物仅包含三种碱基(即T，A和C)，而且Cy3修饰的dCTP的引入导致RCA产品中掺入了大量Cy3荧光分子。磁分离后，将带有5'生物素末端的hAAG扩增产物从反应溶液中分离出来，随后被核酸外切酶I和III消化成单核苷酸，释放出Cy3荧光分子。Cy3荧光分子可以通过基于TIRF的单分子检测简单地计数，以定量hAAG。类似地，当存在UDG时，它可以通过催化脱氧核糖和尿嘧啶碱基之间的N-糖苷键的水解以产生脱碱基位点而从DNA中去除尿嘧啶碱基。随后，dsDNA底物中的AP位点可以被APE1催化以释放5'-生物素标记的带有3'-OH末端的UDG引物，该引物可以与UDG环状模板配对以启动RCA反应(图2B)。UDG环状模板仅包含三种碱基(即A，T和C)，导致其扩增产物仅包含三种碱基(即T，A和G)，而Cy5修饰的dGTP的引入导致在RCA产品中掺入了大量Cy5荧光分子。磁分离后，从反应溶液中分离出5'末端带有生物素的UDG扩增产物，随后被核酸外切酶I和III消化成单个核苷酸，释放出Cy5荧光分子。Cy5荧光分子可通过基于TIRF的单分子检测简单地计数，以定量UDG。当同时存在hAAG和UDG时，同时生成hAAG引物和UDG引物分别启动两个RCA反应，从而为hAAG产生生物素和多个Cy3标记的ssDNA，为UDG产生生物素和多个Cy5标记的ssDNA。进行磁分离和用外切酶I和III消化后，Cy3和Cy5荧光分子被释放到溶液中，然后通过单分子检测进行定量，来同时检测hAAG和UDG。Cy3的最大发射波长为568纳米，Cy5的最大发射波长为670纳米，Cy3和Cy5的发射光谱之间没有光谱重叠(图3)，因此Cy3信号和Cy5信号可分别用于指示hAAG和UDG。相反，在不存在DNA糖基化酶的情况下，双功能dsDNA底物中的任何碱基都无法切除，引物也不会释放。随后的RCA反应及Cy3和Cy5荧光分子的嵌入也都不会发生。因此，无法检测到Cy3和Cy5信号。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.试剂的制备

双功能dsDNA底物的制备：将1微摩尔每升的hAAG探针和1微摩尔每升的UDG探针在含有10毫摩尔每升的Tris-HCl(pH 8.0)、50毫摩尔每升的NaCl和1毫摩尔每升的EDTA的退火缓冲液中，于95℃孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温形成双功能dsDNA底物。将获得的双功能dsDNA底物保存在4℃以便进一步使用。

DNA糖基化酶诱导的切除反应和RCA反应：在10微升反应溶液中进行DNA糖基化酶诱导的切除反应，该溶液包含100纳摩尔每升的双功能dsDNA底物，1x NEB缓冲液4、1x UDG反应缓冲液，2U APE1和不同浓度的hAAG和UDG，在37℃下反应1小时。然后将50纳摩尔每升的hAAG的环状模板，50纳摩尔每升的UDG的环状模板，0.1毫克每毫升的BSA，0.25毫摩尔每升的dATP，0.25毫摩尔每升的dTTP，10微摩尔每升的Cy3标记的dCTP(Cy3-dCTP)，10微摩尔每升的Cy5标记的dGTP(Cy5-dGTP)，1×phi29反应缓冲液和5U phi29聚合酶添加到反应溶液中，最终体积为20微升。随后，将溶液在30℃避光孵育2小时，然后在65℃孵育10分钟终止反应。

扩增产物与链霉亲和素包被的磁珠的连接：将20微升生物素化的扩增产物与10微升5微克每微升链霉亲和素包被的磁珠(MBs)溶液混合，并在室温下置于转动混匀仪上避光孵育15分钟。然后进行磁分离，并使用1x结合和洗涤缓冲液(5毫摩尔每升的Tris-HCl(pH7.5)，0.5毫摩尔每升的EDTA，1摩尔每升的NaCl)将混合物洗涤3次，以去除过量的Cy3-dCTP和Cy5-dGTP，将扩增产物与磁珠的结合物(MB-ssDNAs)重悬于1×NBE缓冲液1中。

核酸外切酶消化反应：核酸外切酶消化反应在含有MB-ssDNAs、10U Exo III、10UExo I、1x NE缓冲液1和1x Exo I反应缓冲液的20微升反应混合物中在37℃反应30分钟。然后，在黑暗中通过磁分离来分离链霉亲和素包被的磁珠3分钟，并对上清液进行检测。

荧光检测：将20微升反应产物稀释至最终体积为80微升，使用日立F-7000荧光分光光度计(日本，东京)测量荧光光谱。在532纳米的激发波长下测量Cy3的荧光光谱，并将568纳米处的荧光强度用于hAAG的定量分析。在635纳米的激发波长下测量Cy5的荧光光谱，并将670纳米处的荧光强度用于UDG的定量分析。激发和发射狭缝均设置为5.0纳米，电压为950V。

单分子检测和数据分析：在单分子测量中，将反应产物用成像缓冲液(3毫摩尔每升的MgCl₂、100毫摩尔每升的Tris-HCl(pH 8.0)，10毫摩尔每升的(NH4)₂SO₄)稀释200倍。将10微升样品铺在玻璃载玻片上，通过全内反射荧光(TIRF)显微镜(Nikon，Ti-E，日本)获取单个分子的图像。波长为561纳米和640纳米的激光分别用于激发Cy3和Cy5荧光分子。Cy3和Cy5的光子被油浸式100倍物镜收集，并通过二向色镜分成Cy3通道(573-613纳米滤光片)和Cy5通道(661.5-690.5纳米滤光片)，并成像到EMCCD相机(滨松光子学，日本)。为了进行数据分析，使用Image J软件选取一个600×600像素的区域进行Cy3和Cy5荧光分子计数。用十幅图的荧光分子数量总和进行定量分析。

抑制剂实验：对于DNA糖基化酶的抑制实验，不同浓度的CdCl₂与1U hAAG、1U UDG和2U APE1在DNA糖基化酶反应缓冲液中于37℃孵育15分钟。随后，如上所述进行DNA糖基化酶诱导的切除反应、滚环扩增和核酸外切酶消化反应。DNA糖基化酶的相对活性(RA)按公式测定:

其中N₀是不存在DNA糖基化酶时的荧光分子计数，N_t是存在DNA糖基化酶时的荧光分子计数，N_i是在DNA糖基化酶和CdCl₂同时存在下的荧光分子计数。由RA和CdCl₂浓度的曲线计算出IC₅₀值。

细胞培养和细胞提取物的制备：细胞培养和细胞提取的准备。将人肺癌细胞系(A549)、人宫颈癌细胞系(HeLa)、人结肠癌细胞系(SW480)和人肝细胞系(HL-7702)分别放入含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，在37℃，含5％CO₂的潮湿气氛中培养。使用核提取试剂盒(ActiveMotif)根据说明书进行细胞提取物的提取。对获得的上清液部分进行hAAG和UDG活性测定。

2.可行性实验

本实施例进行了凝胶电泳和荧光测量，以研究提出的方法用于hAAG和UDG分析的可行性(图4)，通过使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来验证碱基切除修复反应(图4A)，探针序列见表1。

表1.寡核苷酸序列

注：带下划线的粗体字母“I”代表脱氧肌苷，带下划线的粗体字母“U”代表尿嘧啶脱氧核糖核苷酸。在环状模板中，粗体显示的字母代表与引物的杂交区域。

Cy3标记的hAAG探针(图4A，泳道5)与Cy5标记的UDG探针(图4A，泳道6)杂交形成双功能dsDNA底物(图4A，泳道4)，因此观察到的Cy3标记的hAAG引物片段可以指示hAAG驱动的次黄嘌呤切除修复反应，观察到的Cy5标记的UDG引物片段可以指示UDG驱动的尿嘧啶切除修复反应。如图4A所示，在不存在两种糖基化酶的情况下，只有双功能dsDNA底物产生的dsDNA单条带(图4A，泳道4)被SYBR Gold、Cy3和Cy5共定位，表示dsDNA完整。在存在hAAG的情况下，dsDNA被切割，生成21nt Cy3标记的hAAG引物(图4A，泳道1)，剩下的dsDNA片段(图4A，泳道1)，表明hAAG可以识别I：T碱基对，并在APE1的帮助下切除次黄嘌呤。当存在UDG时，dsDNA被切割，生成21nt Cy5标记的UDG引物(图4A，泳道2)和剩余的dsDNA片段(图4A，泳道2)，表明UDG可以识别U:A碱基对，并在APE1的帮助下切除尿嘧啶。当同时存在hAAG和UDG时，可以同时观察到Cy3和Cy5(图4A，泳道3)，这表明hAAG和UDG可以有效地切割双功能dsDNA底物，而不会相互干扰。这些结果表明，该发明可以同时检测hAAG和UDG。

本实施例进一步使用琼脂糖凝胶电泳来验证DNA糖基化酶诱导的RCA反应(图4B)。在双功能dsDNA底物(图4B，泳道4)或hAAG环状模板(图4B，泳道5)的存在下出现单一条带。相反，在存在hAAG环状模板+hAAG(图4B，泳道2)，UDG环状模板+UDG(图4B，泳道3)和hAAG环状模板+UDG环状模板+hAAG+UDG的情况下，出现明显的扩增条带(图4B，泳道1)，表明发生了DNA糖基化酶诱导的RCA反应。

琼脂糖凝胶电泳的结果(图4B)与荧光测量的结果一致(图4C-E)。如图4C-E(黑线)所示，在dsDNA底物和环状模板存在的情况下，未检测到明显的荧光信号。相反，在存在dsDNA底物+hAAG环状模板+hAAG的情况下，使用SYBR Gold作为荧光指示剂，可以检测到高荧光信号(图4C)。同样，在存在dsDNA底物+UDG环状模板+UDG的情况下也可以检测到高荧光信号(图4D)。在存在dsDNA底物+hAAG环状模板+UDG环状模板+hAAG+UDG的情况下，可以检测到更高的荧光信号(图4E)。这些结果表明，本研究中使用的两个环状模板不会相互干扰RCA扩增，所提出的方法可用于同时检测多种DNA糖基化酶。

3.单分子成像法检测hAAG活性

通过TIRF显微镜同时检测Cy3和Cy5的荧光信号，其中Cy3指示hAAG的存在，而Cy5指示UDG的存在。在没有hAAG和UDG的情况下，无法检测到Cy3荧光信号(图5A)或Cy5荧光信号(图5E)。在存在hAAG的情况下，可以检测到明显的Cy3荧光信号(图5B)，但无法观察到Cy5荧光信号(图5F)。当存在UDG时，可以检测到明显的Cy5荧光信号(图5G)，但无法观察到Cy3荧光信号(图5C)。仅在同时存在hAAG和UDG的情况下，才能同时观察到Cy3(图5D)和Cy5(图5H)荧光信号。这些结果清楚地表明，所提出的方法可用于在单分子水平上同时检测多种DNA糖基化酶。

4.灵敏度分析

为了研究该方法的检测灵敏度，本实施例分别监测了不同浓度的hAAG和UDG引起的Cy3和Cy5荧光强度的变化。如图2A所示，随着hAAG浓度从1×10^-10增加到0.1U每微升，Cy3在568纳米发射波长的荧光强度增强，并且在1×10^-10到1×10^-3U每微升的7个数量级的大动态范围内，荧光强度与hAAG浓度的对数呈线性相关(图6C)。回归方程为F＝427.48+37.09log₁₀C(R²＝0.9909)，其中F是Cy3在568纳米波长处的荧光强度，C是hAAG的浓度(U每微升)。根据对照组信号的平均值加上三倍标准偏差计算得出的检出限(LOD)为8.69×10^{- 11}U每微升。与基于磁珠的荧光测定法(1×10^-4U每微升)和基于超支链信号放大的荧光测定法(9×10^-5U每微升)相比，该方法的灵敏度提高了6个数量级，和碱基切除修复介导的三级联信号放大(2.6×10^-5U每微升)相比提高了5个数量级。如图6B所示，随着UDG浓度从1×10^-10增加到0.1U每微升，Cy5在670纳米波长处的荧光强度增强，并且在1×10^-10至1×10^-3U每微升范围内，荧光强度与UDG浓度的对数呈线性关系(图6D)。回归方程为F＝679.62+61.41log₁₀C(R²＝0.9947)，其中F是Cy5在670纳米波长处的荧光强度，C是UDG的浓度(U每微升)。计算得出的LOD为5.20×10^-11U每微升。与荧光分析法(2×10^-5U每微升)相比，该方法的灵敏度提高了5个数量级，与基于酶辅助双环级联信号放大的荧光方法(1×10^-7U每微升)相比，该方法的灵敏度提高了3个数量级。

此外，发明人在最佳实验条件下分别监测了加入不同浓度的hAAG和UDG时Cy3和Cy5数量的变化。如图7A所示，随着hAAG浓度从1×10^-11增加到0.1U每微升，Cy3数量增加。在1×10^-11至1×10^-3U每微升的8个数量级的范围内，Cy3数量与hAAG的浓度的对数呈线性相关(图7A插图)。回归方程为N＝2927.51+238.18log₁₀C(R²＝0.9979)，其中N是Cy3个数，C是hAAG的浓度(U每微升)。计算出的检出限为6.10×10^-12U每微升。如图7B所示，随着UDG浓度从1×10^-11增加到0.1U每微升，Cy5数量增加，并且在1×10^-11到1×10^-3U每微升的8个数量级的范围内，Cy5数量与hAAG浓度的对数呈线性关系(图7B插图)。回归方程为N＝4093.30+327.48log₁₀C(R²＝0.9953)，其中N是Cy5个数，C是UDG的浓度(U每微升)。计算出的检出限为1.54×10^-12U每微升。值得注意的是，与整体荧光测量相比，本实施例的单分子检测方法的灵敏度分别提高了14.25倍和33.77倍。灵敏度的提高可归因于(1)RCA驱动的每个串联体中嵌入大量的荧光分子，以及(2)单分子检测的高信噪比。

5.特异性分析

为了评价该方法的选择性，本实施例使用了人8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶1(hOGG1)、胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、牛血清白蛋白(BSA)和甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG)作为干扰酶。hOGG1是8-氧代鸟嘌呤特异性糖基化酶，可通过BER系统负责氧化鸟嘌呤的修复。TDG可以选择性地从G/T错配中去除T。BSA无法识别和切除DNA底物中的受损碱基。FPG催化烷基化或辐射的多核苷酸和DNA释放开环咪唑形式的鸟嘌呤和腺嘌呤。从理论上讲，这些酶均无法识别和切割双功能dsDNA底物以生成引物，因此没有后续的RCA反应。如图8所示，在存在hOGG1，TDG，BSA和FPG的情况下，均未检测到明显的Cy3和Cy5荧光信号。相反，在hAAG存在下，仅观察到高的Cy3荧光信号。当存在UDG时，仅观察到高的Cy5荧光信号。当同时存在hAAG和UDG时，可以同时观察到明显的Cy3和Cy5荧光信号。这些结果表明，所提出的方法对hAAG和UDG具有良好的特异性。

6.动力学分析

本实施例进一步应用了这种方法来定量单分子水平的动力学参数。初始速度(V)分别在存在0.1U每微升hAAG和0.1U每微升UDG的情况下测定，与不同浓度(0至300纳摩尔每升)的双功能dsDNA底物在37℃反应5分钟。将实验数据与米氏方程拟合得到酶动力学参数：

其中V_max为最大初速度，[S]为双功能dsDNA底物，K_m为米氏常数。如图9所示，随着双功能dsDNA底物浓度的增加，hAAG和UDG的初始速度增大。hAAG的V_max计算为14.96每秒，K_m计算为31.39纳摩尔每升，这与放射性测定的结果(13-42纳摩尔每升)一致。UDG的V_max被确定为25.32s每秒，并且计算出的K_m为68.10纳摩尔每升，与基于分子信标的荧光方法获得的K_m(60纳摩尔每升)一致。这些结果表明，所提出的方法可用于准确评估多种DNA糖基化酶的动力学参数。

7.抑制试验

为了证明所提出的方法对DNA糖基化酶抑制试验的能力，本实施例使用镉(Cd²⁺)作为模型抑制剂。如图10所示，hAAG和UDG的相对活性随Cd²⁺浓度的增加而降低。根据hAAG相对活性与Cd²⁺浓度的相对关系图(图10A)，在APE1存在下，hAAG的半数最大抑制浓度(IC₅₀)值计算为74.43微摩尔每升，小于通过放射性实验测量的单独的hAAG值(120微摩尔每升)。因为Cd²⁺不仅会抑制hAAG的活性，还会在范围为10-100微摩尔每升时抑制APE1的活性。同样，在APE1存在的情况下，Cd²⁺可以有效抑制UDG，IC₅₀值为54.81微摩尔每升(图10B)。由于Cd²⁺可能导致UDG和APE1失活，因此所获得的IC₅₀小于通过凝胶电泳法测得的UDG值(70微摩尔每升)。这些结果清楚地表明，所提出的方法可用于同时筛选hAAG和UDG的抑制剂。

8.细胞的DNA糖基化酶活性检测

为了评估所提出的方法用于临床诊断的可行性，本实施例进一步测量了DNA糖基化酶在不同细胞系中的活性，这些细胞系包括人肺腺癌细胞系(A549细胞)，人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)和人结肠癌细胞(SW480细胞)，人肝细胞系(HL-7702细胞)和被热灭活的A549细胞提取物作为对照组。如图11所示，在存在A549细胞，HeLa细胞和SW480细胞的情况下可以分别检测到较多的Cy3和Cy5荧光分子，这与人类癌细胞中糖基化酶的过表达相一致。但是，由于正常细胞中糖基化酶的活性较低，因此在HL-7702细胞存在时检测到很少量的Cy3和Cy5荧光分子。由于灭活的细胞提取物中糖基化酶活性丧失，所以也几乎观察不到Cy3和Cy5荧光分子。

图12A显示了Cy3个数随A549细胞数增加的变化。值得注意的是，Cy3个数与A549细胞数的对数在1至1000个细胞之间呈线性关系。相关方程为N＝720.41+1125.02log₁₀X(R²＝0.9931)，其中X是A549细胞数，N是Cy3个数。检测限计算为1个细胞。图12B显示了Cy5个数随A549细胞数增加的变化，并且Cy5个数与A549细胞数的对数在1至1000个细胞之间呈线性关系，相关方程为N＝789.06+1460.64log₁₀X(R²＝0.9949)，其中X是A549细胞数，N是Cy5个数。检测限计算为1个细胞。本实施例进一步研究了Cy3个数和Cy5个数的变化与Hela细胞数量的关系(图12C和12D)。Cy3个数(图12C)和Cy5个数(图12D)随着HeLa细胞数量的增加而增加，并且在1到1000个细胞之间，其个数与HeLa细胞数量的对数呈良好的线性相关。hAAG的回归方程为N＝659.80+1081.59log₁₀X(R²＝0.9950)，其中N代表Cy3个数，X代表HeLa细胞数(图12C)。检测限计算为1个细胞。对于UDG，回归方程为N＝933.82+1469.88log₁₀X(R²＝0.9967)，其中N代表Cy5个数的数量，X代表HeLa细胞的数量(图12D)。检测限计算为1个细胞。这些结果清楚地表明，所提出的方法甚至可以在单细胞水平上用于多种DNA糖基化酶的定量检测，此方法有进一步应用于临床诊断的巨大潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

biotin-aacatcccta atttctcact aIgctagctca gtcatacact - NH2 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

biotin -aagatgggta attagagtgt aUgactgagct agcttagtga - NH2 40

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagtgagaaa ttagggatgt taagtaggat gttgagtaaa gttgaagaat ggtga 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacactctaa ttacccatct taactaccat cttcactatt caacttcaat cctca 55

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

Cy3 -aacatcccta atttctcact agctagctca gtcatacact 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

Cy5 -aagatgggta attagagtgt agactgagct agcttagtga 40

Claims (10)

1.一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的环状模板；

所述双链DNA底物中，其中一条链中具有具有次黄嘌呤碱基用于hAAG识别，另一条链上具有尿嘧啶碱基用于UDG识别，分别被APE1切割形成两个引物分别与对应的模板杂交进行扩增。

2.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述含有次黄嘌呤碱基(I)碱基单链及含有尿嘧啶(U)碱基单链的5'端均采用生物素修饰，3'端均采用NH₂修饰。

3.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述hAAG的环状模板由A、T和G三种碱基组成，或所述hAAG的引物通过APE1切割单链中的次黄嘌呤碱基而产生。

4.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述UDG的环状模板由A，T和C三种碱基组成；或所述UDG的引物通过APE1切割单链中的尿嘧啶碱基而产生。

5.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器还包括磁珠、核酸外切酶及荧光分子标记的dCTP和dGTP，脱氧核糖核苷酸dATP及dTTP。

6.如权利要求5所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠；或所述荧光分子标记的dCTP和dGTP为Cy3-dCTP和Cy5-dGTP。

7.一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用双链DNA底物，核酸内切酶及环状模板进行滚换扩增。

8.如权利要求7所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：

将待测物加入反应溶液A中进行孵育获得扩增产物，向孵育后的产物中加入磁珠溶液进行避光孵育，之后通过磁力将磁珠从反应液中分离得到扩增产物与磁珠的结合物，通过核酸外切酶消化所述结合物并对上清中的荧光进行检测。

9.如权利要求8所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述反应溶液A中包含双链DNA底物，环状模板，APE1酶，phi29聚合酶，Cy3-dCTP，Cy5-dGTP，dATP和dTTP；或所述磁珠溶液为链霉亲和素包被的磁珠溶液。

10.权利要求1-6任一项所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器和/或权利要求7-9任一项所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法在筛选人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶DNA糖基化酶抑制剂/激活剂中的应用。

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