CN114410793A

CN114410793A - 一种无标记荧光检测fen1活性的方法

Info

Publication number: CN114410793A
Application number: CN202210142803.5A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 胡娟; 魏雪茹
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114410793B

Abstract

本发明涉及一种无标记荧光检测FEN1活性的方法。本发明提供了一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法用于无标记荧光检测FEN1活性的方法；通过环形DNA底物识别FEN1，并以环形DNA序列作为模板实现超支化滚环扩增。该方法操作简单，经济有效，特异性强，可以超灵敏检测FEN1。此外，它还可用于筛选FEN1抑制剂和定量检测癌细胞中的FEN1活性，在临床诊断和药物发现方面具有巨大的潜在应用价值。

Description

一种无标记荧光检测FEN1活性的方法

技术领域

本发明属于生物标志物检测技术领域，具体涉及一种无标记荧光检测FEN1活性的方法、用于FEN1检测的试剂组合，及所述检测方法和/或试剂组合在FEN1定量检测领域的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

结构特异性核酸内切酶是一类重要的酶，在DNA修复、复制、转录和重组过程中起着至关重要的作用。它们可以识别特定的DNA二级结构，酶活性必须严格控制以确保基因组稳定性。FEN1是结构特异性核酸内切酶家族的成员，负责从单链/双链DNA结构中去除5’分枝结构。FEN1的异常表达会造成基因组不稳定和多种疾病，包括慢性炎症、乙型肝炎病毒相关疾病和癌症。因此，FEN1可以作为疾病诊断和治疗的生物标志物。

FEN1检测的常规方法包括免疫印迹分析和免疫组织化学分析。这些方法仅适用于FEN1水平的定性或半定量评估，而且其复杂的过程和昂贵的特异性抗体可能会阻碍其实际应用。为了克服这些问题，一些其他的方法，包括比色法和荧光法已被开发用于FEN1分析。比色法可以目视检测FEN1活性，但灵敏度较低。已报道的荧光方法通常涉及荧光团标记的寡核苷酸或纳米材料的复杂合成和修饰，这不可避免地增加了实验成本和复杂性。因此，迫切需要一种新的无标记、均相、灵敏检测FEN1的简单方法。

发明内容

基于上述技术背景，本发明开发了一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法用于无标记荧光检测FEN1活性的方法。在本发明提供的检测方法中，一个带5’分枝结构的挂锁探针与一个辅助探针杂交，形成一个带5’分枝结构的环形DNA底物，用于识别FEN1。当存在FEN1时，环形DNA底物的5’分枝结构被FEN1切割，产生带有5’磷酸的挂锁探针，可通过Taq DNA连接酶连接形成环形挂锁探针，该探针可作为模板，在Vent(exo-)DNA聚合酶、引物1和2存在的情况下启动超支化滚环扩增反应。扩增生成的不同长度的双链DNA片段可被SYBR Green I染色，以产生增强的荧光信号。

本发明开发的上述无标记荧光检测FEN1的方法，具有以下明显优势：(1)设计的带有5’分枝结构的DNA底物使该方法对FEN1识别的高特异性。引入核酸外切酶处理可有效消除滚环扩增反应中的非特异性DNA副产物，使其具有极低背景信号。利用超支化滚环扩增反应的高扩增效率使该方法具有高灵敏度。该方法具有良好的特异性和高灵敏度，检出限为1.51×10^-6U/μL，优于文献报道的荧光和比色分析法。(2)等温信号放大策略避免了对热循环仪器的需求。与已报道的FEN1分析方法相比，该方法能够实现FEN1的无标记均匀检测，无需昂贵的特异性抗体、荧光标记探针和复杂的纳米材料合成和修饰。该方法可用于筛选FEN1抑制剂和定量检测癌细胞中的FEN1活性。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1、本发明发展了一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法用于无标记均相检测FEN1。该方法简单快速，反应在等温条件下进行，无需繁琐的操作步骤、热循环仪器以及复杂的分离程序等。可实现对FEN1的超灵敏检测。

2、设计的带有5’分枝结构的环状DNA底物使该方法对FEN1识别的高特异性。引入核酸外切酶处理可有效消除滚环扩增反应中的非特异性DNA副产物，使其具有极低背景信号。由于FEN1诱导的高特异性切割、滚环扩增反应的高扩增效率以及核酸外切酶处理产生的零背景信号，从而导致较高的信噪比，提高了检测灵敏度。

3、该方法即使在单细胞水平上也可用于实际样品中FEN1的灵敏定量。此外，该方法可用于FEN1抑制剂的筛选。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明中所述无标记荧光检测FEN1的原理图。

图2为实施例1中所述检测方法中各步骤反应产物的电泳分析结果；

(A)FEN1诱导裂解反应产物的电泳分析；

(B)消化反应产物的电泳分析；

(C)滚环扩增反应产物的电泳分析；

(D)在FEN1+Taq DNA连接酶、Taq DNA连接酶和FEN1存在下，以SYBR Green I作为荧光指示剂实时荧光监测滚环扩增反应；

(E)在FEN1不存在和存在的情况下测量滚环扩增产物的荧光发射光谱。

图3为扩增产物的荧光检测结果；

(A)不同浓度FEN1产生的荧光发射光谱；

(B)不同浓度的FEN1产生的荧光强度变化；插图显示荧光强度的对数与FEN1浓度的对数在2.0×10^-6U/μL到2.0×10^-4U/μL范围内呈线性相关。

图4为测量响应于0.02U/μL FEN1、0.02U/μL DNase I、0.02U/μLλexo、0.02g/LBSA、0.02U/μL PNK、0.02U/μL UDG和反应缓冲液(对照)的荧光强度。

图5为实施例2中所述FEN1相对活性随ATA浓度变化结果。

图6为实施例3中所述细胞核样品中FEN1含量的测定；

(A)测量MCF-7细胞、HepG2细胞、A549细胞、MRC-5细胞、和热灭活处理的MCF-7细胞的细胞提取物的荧光强度；所有细胞提取物的细胞个数为30000个；(B)在3到3000个细胞范围内，荧光强度的对数与MCF-7细胞数的对数呈线性关系。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中FEN1的检测只能实现定性或半定量，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种无标记荧光检测FEN1活性的方法，同时具有良好的检测特异性和灵敏度。

本发明第一方面，一种无标记荧光检测FEN1活性的方法，所述检测方法涉及环形DNA底物、引物1及引物2；所述环形DNA底物由带5’分枝结构的挂锁探针与辅助探针杂交形成；

所述检测方法包括以下步骤：将环形DNA底物投入待测样品中混合孵育诱导裂解，裂解后所述环形DNA底物中分支结构被切除暴露出5’端磷酸基团的缺口；将裂解反应产物与DNA连接酶混合，通过DNA连接酶对上述缺口进行连接获得闭合的环形序列；将连接反应产物、核酸外切酶I及核酸外切酶III混合，对环形DNA底物中的辅助探针进行消化；将消化反应产物、引物1和引物2及dNTPs混合升温孵育一段时间后加入DNA聚合酶，以闭合的环形序列为模板引发超支化滚环扩增，对扩增产物进行定量检测即可获得FEN1活性。

第一方面所述的检测方法中，所述环形DNA底物由挂锁探针及辅助探针杂交形成，所述挂锁探针5’端向3’端方向为一段单核苷酸链及环形序列，所述单核苷酸链即为分支结构，所述环形序列两个末端与辅助探针配对，在辅助探针的作用下成环，形成挂锁探针。

所述环形DNA底物的制备方式如下：将挂锁探针及辅助探针加入含MgCl₂的Tris缓冲液中加热孵育，孵育完成后缓慢冷却至室温形成；所述孵育温度为90～100℃，所述孵育时间为3～8min。

上述挂锁探针的设计中，所述分支结构的长度优选为2～20个bp。

所述辅助探针的长度优选为40～50个bp。

优选的，所述引物1能够识别并结合挂锁探针的环形序列并进行延伸，所述引物2能够识别上述延伸序列实现超支化滚环扩增。

本发明验证可行的一种实施方式中，所述挂锁探针、辅助探针、引物1及引物2的序列分别如下：

挂锁探针：TTT TAG AAC TAT ATT GTC TTT CTC TGA TTC TGA CTC GTC ATG TCTCAG CTT TAG TTT AAT ACG ACT CCA TAG GGC TCA GTG TGA TTC CAC CTT CTC CAA(SEQID NO.1)；

辅助探针：CAG AGA AAG ACA ATA TAG TTC TTG GAG AAG GTG GAA TCA CAC TGAG(SEQ ID NO.2)；

引物1：CTA AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC(SEQ ID NO.3)；

引物2：CTC AGT GTG ATT CCA CCT TCT CC(SEQ ID NO.4).

优选的，所述诱导裂解的反应中，孵育温度为50～60℃，孵育时间为25～35min。

优选的，所述DNA连接酶为Taq DNA连接酶，所述连接反应的温度为40～50℃，反应时间为25～35min。

优选的，所述消化反应的温度为34～40℃，反应时间为25～35min，随后在75～85℃下反应15～25min终止反应。

优选的，所述滚环扩增反应温度为60～70℃，反应时间为80～100min。

优选的，所述DNA聚合酶为Vent(exo-)DNA聚合酶。

优选的，所述定量检测方式为荧光定量检测。

进一步的，一种实施方式中，所述定量检测方式如下：将滚环扩增产物与荧光染料混合，通过荧光光谱仪测量荧光发射光谱；具体的，所述荧光染料为SYBR Green I，在488nm的激发波长下，在500-650nm范围内记录发射光谱。

又一种实施方式中，所述定量检测方式如下：以SYBR Gold作为荧光指示剂，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析滚环扩增反应产物。

本发明第二方面，提供一种用于FEN1检测的试剂组合，所述检测试剂中至少包括环形DNA底物、DNA连接酶、DNA聚合酶及引物。

优选的，所述检测试剂中还包括缓冲液；进一步的，所述缓冲液至少包括缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、及缓冲液D；

所述缓冲液A为15～25mM的Tris-HCl缓冲液，其中还具有(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄及Triton-X-100；

所述缓冲液B为15～25mM的Tris-HCl缓冲液，其中还具有醋酸钾、醋酸镁、NAD、DTT及Triton X-100；

所述缓冲液C为60～70mM的甘氨酸-KOH缓冲液，其中还具有MgCl₂及β-ME；

所述缓冲液D为5～15mM的Bis-Tris-Propaneuc-HCl缓冲液，其中还具有MgCl₂及DTT。

优选的，所述试剂组合中还包括定量相关的试剂，所述定量相关试剂依据本领域技术人员所选择的定量手段进行确定；本发明证实可行的一种实施方式中，采用荧光检测进行定量，所述定量相关试剂包括荧光染料，具体的实例如SYBR Green I或SYBR Gold。

本发明第三方面，提供第一方面所述无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或第二方面所述用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用。

上述在FEN1定量检测领域的应用包括但不限于以下任意一个方面：

(1)FEN1相关检测产品的制备；

(2)样品中FEN1含量的测定；

(3)FEN1抑制剂/激动剂的筛选。

上述第(1)方面的应用中，所述FEN1相关的检测产品包括但不限于检测试剂盒或检测仪器。

上述第(2)方面的应用中，所述样品的一个实例如细胞核提取物，本发明证实可行的一种实施方式中，所述检测方法可用于肿瘤细胞核提取物中FEN1含量的检测。

上述第(3)方面的应用中，所述FEN1抑制剂/激动剂的筛选方式如下：将待测的抑制剂或激动剂加入已知浓度的FEN1样品中，并对加样后样品中FEN1的活性进行测定。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例中，提供一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法，用于无标记荧光检测FEN1活性，其原理如图1所示。

FEN1检测包括四个步骤：

(1)FEN1诱导切割环状DNA底物的5’分枝结构；

(2)Taq DNA连接酶介导环状挂锁探针的形成；

(3)用核酸外切酶I和III(Exo I、Exo III)消化法纯化圆形挂锁探针；

(4)超支化滚环扩增反应和随后的无标记荧光检测。

表1寡核苷酸序列

注：挂锁DNA序列(FPP)中的分支结构序列为斜体，与辅助探针配对的部分为下划线，与引物1配对杂交的部分为加粗。

FEN1诱导的裂解反应。将5μM带5’分枝结构的挂锁探针(FPP)和5μM辅助探针(AP)在含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)和5mM MgCl₂中在95℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温，以形成带有5’分枝结构的环形DNA底物。获得的环状DNA底物在4℃下保存。在含有缓冲液A(20mM Tris-HCl,10mM(NH₄)₂SO₄,10mM KCl,2mM MgSO₄,0.1％Triton-X-100,pH 8.8)、0.5μM环状DNA底物和不同浓度FEN1的10μL反应液中进行FEN1诱导的裂解反应。混合物在55℃下孵育30分钟。

连接和消化反应。连接反应在20μL反应体系中进行，反应混合物由10μL FEN1诱导的裂解反应产物、40U Taq DNA连接酶、缓冲液B(20mM Tris-HCl,25mM醋酸钾,10mM醋酸镁,1mM NAD,10mM DTT,0.1％Triton X-100,pH 7.6)组成。反应实验在45℃下进行30分钟。连接后，在含有20μL连接产物、10U核酸外切酶I(Exo I)、20U核酸外切酶III(Exo III)、缓冲液C(67mM甘氨酸-KOH,6.7mM MgCl₂,10mMβ-ME,pH 9.5)和缓冲液D(10mM Bis-Tris-Propaneuc-HCl,10mM MgCl₂,10mM DTT,pH 7)的30μL反应混合物中进行消化反应，在37℃下反应30分钟，然后在80℃下加热20分钟终止反应。

超支化滚环扩增反应。扩增反应之前，将3μL消化产物、5nM引物1、5nM引物2和50μMdNTPs在缓冲液A中95℃孵育5分钟。缓慢冷却至室温后，向最终体积为50μL的混合物中添加1U Vent(exo-)DNA聚合酶。在65℃下进行90分钟的超支化滚环扩增反应。

荧光发射光谱的测量。将50μL扩增产物与SYBR Green I混合。使用荧光光谱仪在室温下测量荧光发射光谱。在488nm的激发波长下，在500-650nm范围内记录发射光谱。激发和发射狭缝分别设置为5.0和5.0nm。采用523nm处的荧光强度进行数据分析。

凝胶电泳。在TBE缓冲液(89mM Tris,89mM硼酸,2mM EDTA,pH 8.0)中，以SYBRGold作为荧光指示剂，在室温、110伏恒定电压下，用14％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析FEN1诱导的裂解反应产物。凝胶使用Bio-Rad ChemiDoc成像系统扫描。使用Epi-blue(460-490nm激发)光源和518-546nm滤光片观察SYBR Gold信号。Cy3信号使用Epi-green(520-545nm激发)照明源和577-613nm滤光片进行分析。以SYBR Gold作为荧光指示剂，在室温、110伏恒定电压下进行75分钟的电泳实验，使用12％聚丙烯酰胺凝胶进行外切酶消化反应产物分析。在TAE缓冲液(40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH 8.0)中，以SYBR Gold作为荧光指示剂，在室温、110伏恒定电压下进行45分钟的电泳实验，使用2％的琼脂糖凝胶电泳分析滚环扩增反应产物。

1、可行性验证

本实施例中，通过凝胶电泳、实时荧光测量及荧光发射光谱测量来验证该方法的可行性。如图2A所示，使用Cy3标记的FPP探针来研究FEN1诱导的裂解过程。99nt Cy3标记的FPP探针只观察到一条ssDNA条带，SYBR Gold和Cy3在单条带共定位(图2A,lane 3)。在没有FEN1的情况下，Cy3标记的FPP探针与辅助探针杂交后，产生一条145nt的Cy3标记环状DNA底物(图2A，lane 2)，其迁移速度比Cy3标记的FPP探针慢(图2A，lane 3)。在FEN1存在的情况下(图2A，lane 1)，出现明显的5nt Cy3标记的DNA片段和140nt DNA产物条带，说明发生FEN1切割反应。

进一步，本实施例验证了Taq DNA连接酶介导的环状挂锁探针的形成和随后的滚环扩增反应。当存在FEN1时，形成圆形挂锁探针，以防止被Exo I和III切割(图2B，lane 1)。当FEN1不存在时，未检测到明显的SYBR Gold信号(图2B，lane 2)，表明线性DNA被Exo I和III完全消化。当FEN1存在时，滚环扩增反应产物出现明显的条带(图2C,lane 1)，而当FEN1不存在时，则没有SYBR Gold信号(图2C,lane 2)。

本实施例进一步进行了实时荧光测量。如图2D所示，当存在FEN1和Taq DNA连接酶时，产生增强荧光信号。相反，在没有FEN1或Taq DNA连接酶的情况下，即使在长时间反应(3小时)后，也未检测到明显的荧光。

本实施例测量了荧光发射光谱。如图2E所示，在没有FEN1的情况下，荧光信号可以忽略。而当FEN1浓度为0.64U/μL时，检测到高荧光信号，比对照组高62.4倍。这些结果说明该方法可用于FEN1的无标记、均相检测。

2、检测灵敏度

在最佳实验条件下，本实施例通过测量不同浓度FEN1的荧光光谱来评估实验方法的灵敏度。如图3A所示，荧光信号随着FEN1浓度从0增加到0.1U/μL而显著增加(图3B)。荧光强度的对数与FEN1浓度的对数在2.0×10^-6至2.0×10^-4U/μL(图3B插图)呈线性相关。线性方程为log₁₀F＝6.37+0.756log₁₀C(R²＝0.9813)，其中F为荧光强度，C为FEN1浓度。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算检出限为1.51×10^-6U/μL(1.51×10^-5U)。该方法的灵敏度比金纳米星荧光法(1.6×10^-2U)高1060倍，比氧化石墨烯荧光法(1.52×10^- ²U)高1007倍，比比色法(1×10^-2U)高662倍。

3、检测特异性

以脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、Lambda外切酶(λexo)、牛血清白蛋白(BSA)、T4多核苷酸激酶(PNK)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)为阴性对照，评价该方法的特异性。如图4所示，在存在DNase I、λexo、BSA、PNK、UDG和反应缓冲液(对照)的情况下，未观察到明显的荧光信号。相比之下,在FEN1存在下检测到的高荧光信号，比DNase I、λexo、BSA、PNK和UDG产生的荧光信号高59.0倍、45.6倍、57.0倍、44.2倍和52.4倍，表明该方法具有较高的特异性。

实施例2

为了对实施例1中所述检测方法作为FEN1抑制剂筛选方法的可行性进行验证，本实施例采用金精三羧酸(ATA)作为抑制剂进行评估。如图5所示，本实施例测量了FEN1对不同浓度ATA的相对活性。在0-25μM范围内，FEN1的相对活性随ATA浓度的增加而降低。IC₅₀值为0.826μM，与荧光供体/猝灭实验测定的IC₅₀值(0.63μM)一致。结果表明，所提出的方法可用于FEN1抑制剂筛选。

实施例3

为了验证实施例1中所述检测方法能否应用于复杂样品中FEN1含量的测定，本实施例从MCF-7细胞、HepG2细胞、A549细胞和MRC-5细胞中提取核蛋白，并检测FEN1活性。

细胞培养及细胞提取物的制备。乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)、肝癌细胞系(HepG2细胞)、肺腺癌细胞系(A549细胞)和正常肺细胞系(MRC-5细胞)在添加了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，37℃，含有5％二氧化碳的湿润培养箱中培养。使用核提取物试剂盒(ActiveMotif)制备核提取物。将获得的提取物进行FEN1活性测定。

如图6A所示，在MRC-5细胞中检测到低荧光信号(图6A)，其略高于在热失活处理MCF-7细胞提取物中测得的荧光信号(图6A)，表明正常细胞中FEN1的活性较低。相反，在癌细胞中，MCF-7细胞、HepG2细胞和A549细胞检测到高荧光信号，荧光信号高低顺序为MCF-7细胞>HepG2细胞>A549细胞>MRC-5细胞(图6A)，与之前的研究一致。

进一步研究了荧光强度与MCF-7细胞数量之间的关系。如图6B所示，荧光强度随着MCF-7细胞数量的增加而增强。在3到3000个细胞范围内，荧光强度的对数与MCF-7细胞数量的对数具有良好的线性相关性，线性方程是log₁₀F＝1.96+0.219log₁₀N(R²＝0.9939),其中F是荧光强度，N是MCF-7细胞的数量。通过计算对照组的平均响应值加三倍标准偏差，可计算出检出限为1个细胞。这些结果证明了所提出的方法即使在单细胞水平上也可用于实际样品中FEN1的灵敏定量，在早期临床诊断中具有巨大潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种无标记荧光检测FEN1活性的方法

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttttagaact atattgtctt tctctgattc tgactcgtca tgtctcagct ttagtttaat 60

acgactccat agggctcagt gtgattccac cttctccaa 99

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagagaaaga caatatagtt cttggagaag gtggaatcac actgag 46

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctaaagctga gacatgacga gtc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcagtgtga ttccaccttc tcc 23

Claims

1.一种无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述检测方法涉及环形DNA底物、引物1及引物2；所述环形DNA底物由带5’分枝结构的挂锁探针与辅助探针杂交形成；

2.如权利要求1所述无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述的检测方法中，所述环形DNA底物由挂锁探针及辅助探针杂交形成，所述挂锁探针5’端向3’端方向为一段单核苷酸链及环形序列，所述单核苷酸链即为分支结构，所述环形序列两个末端与辅助探针配对，在辅助探针的作用下成环，形成挂锁探针。

3.如权利要求2所述无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述环形DNA底物的制备方式如下：将挂锁探针及辅助探针加入含MgCl₂的Tris缓冲液中加热孵育，孵育完成后缓慢冷却至室温形成；所述孵育温度为90～100℃，所述孵育时间为3～8min；

或，所述引物1能够识别并结合挂锁探针的环形序列并进行延伸，所述引物2能够识别上述延伸序列实现超支化滚环扩增。

4.如权利要求1-3任一项所述无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述挂锁探针、辅助探针、引物1及引物2的序列分别如下：

挂锁探针：TTT TAG AAC TAT ATT GTC TTT CTC TGA TTC TGA CTC GTC ATG TCT CAGCTT TAG TTT AAT ACG ACT CCA TAG GGC TCA GTG TGA TTC CAC CTT CTC CAA；

辅助探针：CAG AGA AAG ACA ATA TAG TTC TTG GAG AAG GTG GAA TCA CAC TGA G；

引物1：CTA AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC；

引物2：CTC AGT GTG ATT CCA CCT TCT CC。

5.如权利要求1所述无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述诱导裂解的反应中，孵育温度为50～60℃，孵育时间为25～35min；

或，所述DNA连接酶为Taq DNA连接酶，所述连接反应的温度为40～50℃，反应时间为25～35min；

或，所述消化反应的温度为34～40℃，反应时间为25～35min，随后在75～85℃下反应15～25min终止反应；

或，所述滚环扩增反应温度为60～70℃，反应时间为80～100min；

或，所述DNA聚合酶为Vent(exo-)DNA聚合酶；

或，所述定量检测方式为荧光定量检测。

6.如权利要求5所述无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述定量检测方式如下：将滚环扩增产物与荧光染料混合，通过荧光光谱仪测量荧光发射光谱；具体的，所述荧光染料为SYBR Green I，在488nm的激发波长下，在500-650nm范围内记录发射光谱；

或，所述定量检测方式如下：以SYBR Gold作为荧光指示剂，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析滚环扩增反应产物。

7.一种用于FEN1检测的试剂组合，其特征在于，所述检测试剂中至少包括环形DNA底物、DNA连接酶、DNA聚合酶及引物。

8.如权利要求7所述用于FEN1检测的试剂组合，其特征在于，所述检测试剂中还包括缓冲液；进一步的，所述缓冲液至少包括缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、及缓冲液D；

所述缓冲液A为15～25mM的Tris-HCl缓冲液，其中还具有(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄及Triton-X-100

所述缓冲液D为5～15mM的Bis-Tris-Propaneuc-HCl缓冲液，其中还具有MgCl₂及DTT；

优选的，所述试剂组合中还包括定量相关的试剂，进一步的，采用荧光检测进行定量，所述定量相关试剂包括荧光染料，具体的实例为SYBR Green I或SYBR Gold。

9.权利要求1-6任一项所述无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或权利要求7或8所述用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用；

所述在FEN1定量检测领域的应用包括但不限于以下任意一个方面：

(1)FEN1相关检测产品的制备；

(2)样品中FEN1含量的测定；

(3)FEN1抑制剂/激动剂的筛选。

10.如权利要求9所述无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用，其特征在于：

所述第(1)方面的应用中，所述FEN1相关的检测产品包括但不限于检测试剂盒或检测仪器；

所述第(2)方面的应用中，所述样品为细胞核提取物，进一步的，为肿瘤细胞核提取物。

所述第(3)方面的应用中，所述FEN1抑制剂/激动剂的筛选方式如下：将待测的抑制剂或激动剂加入已知浓度的FEN1样品中，并对加样后样品中FEN1的活性进行测定。