CN114507706A - 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用 - Google Patents

基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用，属于荧光检测技术领域。所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被的磁珠。采用本发明生物传感器进行端粒酶检测，可以有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，从而使其在早期临床诊断和抗癌药物开发等方面具有巨大潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及 其在端粒酶检测中的应用
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
端粒是位于染色体末端的特殊的非编码串联DNA重复序列(TTAGGG)n结构，随着细胞的分裂逐渐缩短，会导致基因组不稳定和细胞衰老。人类端粒酶是一种重要的核糖核蛋白，通过在端粒的3′端添加端粒重复序列5-(TTAGGG)n来维持端粒长度和细胞分裂潜能。端粒酶由人端粒酶RNA(hTER)、端粒酶相关蛋白(hTEP1)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)组成，其中hTERT在端粒酶的合成功能中起着决定性作用，是端粒酶活性的限制因素。在大多数人体细胞中，端粒酶的表达水平极低，但是在癌细胞中，例如胃癌、肺癌和肝癌等超过85％的癌细胞，端粒酶具有很高的表达，由于端粒酶活性在正常体细胞和癌细胞之间存在显著差异，端粒酶已被视为早期癌症诊断和预测的重要生物标志物。同时，随着端粒酶抑制剂和靶向抗癌剂的发展，抑制端粒酶活性被认为是一种很有前途的癌症治疗方法。因此，准确、快速、灵敏地检测端粒酶活性对生物医学研究、临床诊断和癌症治疗具有重要意义。
近几十年来，端粒酶检测方法层出不穷，其中最经典的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增方案(TRAP)，它广泛用于端粒酶活性的高灵敏度检测。然而，这个经典的方法具有程序复杂、聚合酶活性受到细胞提取物的干扰以及无法避免的产生非特异性扩增的缺点。
为了优化复杂的实验程序，人们开发出了一些比经典方法更简单的检测端粒酶的方法，如：基于DNA镊子的荧光法、基于链位移的比率荧光法、基于氧化石墨烯的荧光法和基于单分散金纳米棒的电化学生物传感器。这些方法不仅能够更加快速简便的检测端粒酶，而且一些方法还具有能够确定端粒酶反应产物长度分布或同时检测端粒酶和其他生物标记物的优势。然而，这些分析方法涉及繁琐的纳米材料合成、复杂的探针设计，并且由于缺乏信号放大过程，因此这些方法的灵敏度不令人满意。
为了提高灵敏度，人们开发出了一系列与信号放大策略相结合的方法，如：催化发夹组装(CHA)、指数等温扩增反应(EXPAR)、核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、滚环扩增(RCA)和杂交链式反应(HCR)。这些方法改善了之前方法所存在的不足，具有良好的灵敏度和特异性，但是这些方法依赖于严格的序列要求、温和的反应条件和复杂的表面改性过程。此外，值得注意的是聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增反应(EXPAR)是模板依赖性扩增，而核酸外切酶辅助信号扩增(EASA)、催化发夹组装(CHA)以及杂交链式反应(HCR)依赖于DNA探针序列，它们的扩增过程也表现出模板依赖性，这导致非特异性扩增产生的扩增子交叉污染产生不可避免的假阳性信号。因此，开发一种用于端粒酶检测的具有高灵敏度和低模板依赖性的简单信号放大分析方法成为本领域研究人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用。本发明基于端粒定向级联DNA修复介导的荧光团编码/解码，开发一种用于敏感检测端粒酶的模板独立的生物传感器以及相应单分子分析方法，从而有效防止非特异性扩展，降低背景信号，使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，从而可以实现在单细胞水平灵敏检测端粒酶，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器，所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被磁珠；
其中，所述AP探针为一个单链的DNA，所述AP探针含有无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，并位于AP探针核苷酸序列中间；
进一步的，所述AP探针5'末端和3'末端分别修饰有生物素和磷酸基团；
同时，所述AP探针可以与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交形成包含AP位点的双链DNA，而与未能发生反应的TS引物只会部分杂交。
所述TS引物能够被端粒酶快速识别，并催化将重复序列5-(TTAGGG)n添加到TS引物的3'端，产生端粒酶延伸产物(TRPs)。
所述无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)是一种通过随机序列水解双链DNA(dsDNA)中的DNA磷酸二酯骨架来切割AP位点的核酸内切酶，其能够特异性识别和切割与所述AP探针与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交所形成的双链DNA上的AP位点，而对于未反应的TS引物与所述AP探针部分杂交形成的双链DNA只表现出极低的活性；则APE1特异性识别和切割双链DNA中的AP位点，在5'和3'端分别产生一个含有生物素和羟基的短单链DNA。随后，通过添加链霉亲和素包被磁珠(MBs)，MBs通过生物素和链霉亲和素之间的强非共价键捕获具有游离3'-OH末端的短ssDNA，然后通过磁分离去除未结合的寡核苷酸，生成MB短ssDNA复合物；随后，TdT可以催化将dATP和荧光基团修饰的dATP添加到ssDNA的3'-OH中，在MBs表面形成荧光基团标记的长ssDNA，随后通过磁分离从反应溶液中分离，以去除所有多余的荧光基团修饰的dATP。
其中，所述荧光基团修饰的dATP中，荧光基团不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光基团可以为Cy5。
进一步的，所述Cy5 dATPs在总dATPs中占比少于50％，进一步少于30％，优选为20％，这样Cy5 dATPs可以更加高效地延伸至磁珠所捕获短单链DNA的3'-OH末端使得后面荧光信号更加明显，信噪比得到很大的提高。
同时，本发明中采用链霉亲和素包被磁珠进行捕获，商业化的链霉亲和素涂层生物相容性磁珠避免了复杂的表面修饰过程，磁选过程消除了所有干扰(如：细胞提取物、缓冲液和酶等上一步可能影响后续反应中酶活性的步骤)，提供最佳的酶反应环境，有效降低背景荧光。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是负责基因组链断裂修复的核内聚合酶，并且能够以无模板的方式催化随机核苷酸并入单链DNA(ssDNA)链的游离3′-羟基(OH)末端。TdT扩增不需要模板，而且被切开的所述5'端带生物素的探针有3'-OH末端，未被切开的探针3'端保持了修饰的PO4，因此有效的避免和减少TdT所可能引起的非特异性扩增，有助于会降低背景荧光，从而增加信噪比。
最后，MBs表面纯化的Cy5标记的长单链DNA被核酸外切酶快速消化，释放出大量Cy5dATP，可通过基于TIRF的单分子检测进行后续分析，以评估端粒酶活性。因此，所述生物传感器还包括核酸外切酶(核酸外切酶I)。
本发明的第二个方面，提供上述生物传感器在检测端粒酶中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种检测端粒酶的方法，所述方法包括采用上述生物传感器进行检测。
本发明的第四个方面，提供上述生物传感器和/或检测方法在端粒酶相关药物筛选和/或生物样品端粒酶检测分析中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)防止非特异性扩增的产生
以往的一些信号放大策略对于序列以及反应条件具有较高的要求，通常可能通过扩增子交叉污染产生假阳性信号。本发明所使用的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)不需要模板即可将dATPs添加到ssDNA的3'-OH末端，但几乎不能将dATPs添加到ssDNA的3'-PO4末端，从而确保在没有端粒酶的情况下不会发生TdT延伸反应。
(2)能有效降低背景信号
磁分离步骤有效消除了先前步骤中可能降低TdT和核酸外切酶活性的干扰，如细胞提取物和pH值，提供最佳的酶反应环境，有效的降低了背景荧光。
(3)可以在单细胞水平灵敏检测端粒酶
酶DNA修复级联反应显示一个癌细胞的超高灵敏度，优于以前的端粒酶检测。
(4)有较高的灵敏度
基于TIRF的单分子成像具有高分辨率和信噪比，具有超高的检测灵敏度。
综上，上述技术方案与之前方法相比具有操作简单、灵敏度高等优势，而且，上述技术方案采用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量检测，信噪比高。同时，上述技术方案通过对各项反应条件(Cy5dATP的比例、酶反应时间、酶反应用量等)进行细致的优化，因此在检测过程中极大提高了检测灵敏度。
经实验验证，该方法可以灵敏地检测单个Hela细胞中的端粒酶提取物，这相比基于CHA的动态光散射法(3-10个细胞)、基于氧化石墨烯的荧光法(10个细胞)、基于CHA的比色分析法(15个细胞)、基于DNA纳米水凝胶的荧光法(33个细胞)和基于链位移的比率荧光法(102个细胞)，灵敏度的得到了进一步提升。并且，该方法还可进一步应用于端粒酶抑制剂的筛选，在早期临床诊断和抗癌药物开发方面具有巨大潜力。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1本发明所述基于APE1辅助TdT催化标记在单细胞水平灵敏检测端粒酶活性的机理示意图。
图2为本发明实施例中可行性分析相关图，其中，A为聚丙烯酰氨凝胶电泳分析端粒酶延伸产物，其中以SYBR gold作为指示剂；带1表示端粒酶不存在时的端粒酶底物不发生反应；带2表示端粒酶存在时底物发生了延伸，其中端粒酶用量相当于10000个HeLa细胞；B为存在相当于10000个HeLa细胞的端粒酶提取物和不存在端粒酶提取物的情况下测量Cy5荧光发射光谱；C为通过全内反射荧光显微镜为基础的单分子成像检测癌细胞中端粒酶活性的显像图；其中C(a)代表端粒酶提取物不存在，C(b)代表存在相当于10000个HeLa细胞的端粒酶提取物；其中，使用Cy5作为荧光指示剂，C中各比例尺均为5微米。
图3为本发明实施例中F/F0的值随着Cy5dATPs占总dATPs的比例不同而发生的变化；F是10000HeLa细胞端粒酶提取物存在时的Cy5荧光强度，F0是没有端粒酶时的Cy5荧光强度。误差条代表三个实验的标准偏差。
图4为本发明实施例中不同浓度的dATPs所对应的F/F0的值，其中Cy5dATPs占总dATPs的比例均为10％。F是10000HeLa细胞端粒酶提取物存在时的Cy5荧光强度，F0是没有端粒酶时的Cy5荧光强度。误差条代表三个实验的标准偏差。
图5为本发明实施例中不同浓度的AP探针所对应的F/F0的值，其中dATPs总浓度为200微摩尔每升、Cy5dATPs占总dATPs的比例均为10％。F是10000HeLa细胞端粒酶提取物存在时的Cy5荧光强度，F0是没有端粒酶时的Cy5荧光强度。误差条代表三个实验的标准偏差。
图6为本发明实施例中不同浓度的APE1酶所对应的F/F0的值，其中dATPs总浓度、Cy5dATPs占总dATPs的比例以及AP探针浓度均为所优化的最佳条件。F是10000HeLa细胞端粒酶提取物存在时的Cy5荧光强度，F0是没有端粒酶时的Cy5荧光强度。误差条代表三个实验的标准偏差。
图7为本发明实施例中不同浓度的TdT酶所对应的F/F0的值，除了TdT酶的量之外其余条件均为优化的最佳条件。F是10000HeLa细胞端粒酶提取物存在时的Cy5荧光强度，F0是没有端粒酶时的Cy5荧光强度；误差条代表三个实验的标准偏差。
图8为本发明实施例中灵敏度检测相关图，其中，A为通过基于TIRF的单分子成像检测不同数量HeLa细胞的端粒酶提取物，其中比例尺为5μm；B为对于从不同数量的HeLa细胞中提取的端粒酶产生的Cy5计数的测量；C为Cy5计数与HeLa细胞数对数之间的线性关系，误差条代表三个实验的标准偏差。其中实验各项条件均为优化后的最佳条件。
图9为本发明实施例中不同数量Hela细胞的端粒酶提取物Cy5荧光信号的差异。其中实验各项条件均为优化后的最佳条件。
图10为本发明实施例中在仅存在裂解缓冲液(对照)、0.1单位每微升核酸内切酶(HaeIII)、10纳克每微升人10-11易位2蛋白(TeT2)、0.1单位每微升甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(FpG)、0.1单位每微升人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和相当于10000个HeLa细胞的端粒酶提取物Cy5的计数；误差棒代表三个实验的标准偏差；其中实验各项条件均为优化后的最佳条件。
图11为本发明实施例中抑制剂分析相关图，其中，A为MST-312的结构，B为不同浓度MST-312对10000个HeLa细胞端粒酶提取物相对催化活性的影响；误差条代表三个实验的标准偏差；其中实验各项条件均为优化后的最佳条件。
图12为本发明实施例中对照组仅使用裂解缓冲液、相当于10000个人胎儿肺成纤维细胞系(MRC-5细胞)、10000个人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)、10000个人肺癌细胞系(A549细胞)和10000个人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)的端粒酶提取物测量Cy5计数；误差条代表三个实验的标准偏差；其中实验各项条件均为优化后的最佳条件。
图13为本发明实施例中dATP和Cy5-dATP的结构图，A为dATP结构，B为Cy5-dATP结构。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，现有技术对端粒酶的测定存在实验程序复杂、灵敏度低、序列要求严格、环境要求高和具有复杂的表面改性等各种问题。
有鉴于此，本发明基于端粒定向级联DNA修复介导的荧光团编码/解码，开发了一种用于敏感检测端粒酶的模板独立的单分子分析方法。其检测的原理如下：首先设计一个名为AP的单链DNA探针，该探针在序列的中间用无嘌呤/无嘧啶(AP)位点修饰，并在5'和3'末端分别用生物素和PO4标记。当端粒酶存在时，端粒酶快速识别TS引物并催化将重复序列5-(TTAGGG)n添加到TS引物的3'端，产生端粒酶延伸产物(TRPs)，其可与AP探针完全杂交，形成包含AP位点的双链DNA。然后，APE1特异性识别和切割双链DNA中的AP位点，在5'和3'端分别产生一个含有生物素和羟基的短单链DNA。随后，通过添加链霉亲和素包被磁珠(MBs)，MBs通过生物素和链霉亲和素之间的强非共价键捕获具有游离3'-OH末端的短ssDNA，然后通过磁分离去除未结合的寡核苷酸，生成MB短ssDNA复合物。随后，TdT可以催化将dATP和Cy5 dATP添加到ssDNA的3'-OH中，在MBs表面形成Cy5标记的长ssDNA，随后通过磁分离从反应溶液中分离，以去除所有多余的Cy5 dATP。最后，MBs表面纯化的Cy5标记的长单链DNA被核酸外切酶快速消化，释放出大量Cy5 dATP，可通过基于TIRF的单分子检测进行后续分析，以评估端粒酶活性。相反，在缺乏端粒酶的情况下，TS不能延伸形成TRP，只能与AP探针部分杂交，从而在ssDNA中形成AP-sit。APE1对ssDNA中的AP位点表现出极低的活性，并且在3'端保持了具有PO4的AP探针的完整性，这可以防止TdT介导的非特异性扩增。磁分离后，MBs表面的AP探针不能通过TdT延伸，导致所有Cy5 dATP都是游离的，然后被冲走。最后，在核酸外切酶消化步骤中，没有Cy5 dATP被释放，因此没有观察到Cy5信号。因此，Cy5信号的强度可以指示端粒酶的存在和活性。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器，所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及链霉亲和素包被磁珠；
其中，所述AP探针为一个单链的DNA，所述AP探针含有无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，并位于AP探针核苷酸序列中间；
本发明的又一具体实施方式中，所述AP探针5'末端和3'末端分别修饰有生物素和磷酸基团；
同时，所述AP探针可以与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交形成包含AP位点的双链DNA，而与未能发生反应的TS引物只会部分杂交；
本发明的又一具体实施方式中，所述AP探针长度为30nt，所述AP探针的碱基序列为:5'-Biotin-CCT CCC TAA XCC TAA CTC TGC TCG ACG GAT-PO4-3'(SEQ ID NO.1)，其中下划线标出的碱基序列即为磁珠捕获的后续进行TdT扩增的序列，下划线标出的X即无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，所述探针5'端标记有生物素(Biotin)，3'端标记有磷酸基团(PO4)；
所述TS引物能够被端粒酶快速识别，并催化将重复序列5-(TTAGGG)n添加到TS引物的3'端，产生端粒酶延伸产物(TRPs)，所述TS引物其碱基序列为：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'(SEQ ID NO.2)。
所述无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)是一种通过随机序列水解双链DNA(dsDNA)中的DNA磷酸二酯骨架来切割AP位点的核酸内切酶，其能够特异性识别和切割与所述AP探针与端粒酶延伸产物(TRPs)完全杂交所形成的双链DNA上的AP位点，而对于未反应的TS引物与所述AP探针部分杂交形成的双链DNA只表现出极低的活性；则APE1特异性识别和切割双链DNA中的AP位点，在5'和3'端分别产生一个含有生物素和羟基的短单链DNA。随后，通过添加链霉亲和素包被磁珠(MBs)，MBs通过生物素和链霉亲和素之间的强非共价键捕获具有游离3'-OH末端的短ssDNA，然后通过磁分离去除未结合的寡核苷酸，生成MB短ssDNA复合物；随后，TdT可以催化将dATP和荧光基团修饰的dATP添加到ssDNA的3'-OH中，在MBs表面形成荧光基团标记的长ssDNA，随后通过磁分离从反应溶液中分离，以去除所有多余的荧光基团修饰的dATP。
其中，所述荧光基团修饰的dATP中，荧光基团不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光基团可以为Cy5。
进一步的，所述Cy5 dATPs在总dATPs中占比少于50％，进一步少于30％，优选为20％，这样Cy5 dATPs可以更加高效地延伸至磁珠所捕获短单链DNA的3'-OH末端使得后面荧光信号更加明显，信噪比得到很大的提高。
同时，本发明中采用链霉亲和素包被磁珠进行捕获，商业化的链霉亲和素涂层生物相容性磁珠避免了复杂的表面修饰过程，磁选过程消除了所有干扰(如：细胞提取物、缓冲液和酶等上一步可能影响后续反应中酶活性的步骤)，提供最佳的酶反应环境，有效降低背景荧光。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是负责基因组链断裂修复的核内聚合酶，并且能够以无模板的方式催化随机核苷酸并入单链DNA(ssDNA)链的游离3′-羟基(OH)末端。TdT扩增不需要模板，而且被切开的所述5'端带生物素的探针有3'-OH末端，未被切开的探针3'端保持了修饰的PO4，因此有效的避免和减少TdT所可能引起的非特异性扩增，有助于会降低背景荧光，从而增加信噪比。
最后，MBs表面纯化的Cy5标记的长单链DNA被核酸外切酶快速消化，释放出大量Cy5dATP，可通过基于TIRF的单分子检测进行后续分析，以评估端粒酶活性。因此，所述生物传感器还包括核酸外切酶(核酸外切酶I)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述生物传感器在检测端粒酶中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测端粒酶的方法，所述方法包括采用上述生物传感器进行检测。
具体的，所述方法包括：
S1、将待测样品加入反应溶液I中，进行端粒酶延伸以及酶切反应，然后高温灭活处理并进行磁珠捕获，构建MB单链DNA纳米结构(DNA-MBs)；
S2、向步骤S1制得的MB单链DNA纳米结构中加入TdT酶，dATPs和荧光基团修饰的dATP，进行延伸反应，得到荧光基团标记的多尾单链DNA链(Cy5-DNA-MBs)；
S3、向步骤S2中荧光基团标记的多尾单链DNA链中加入核酸外切酶进行反应。
其中，所述步骤S1中，反应溶液I中至少包括TS引物、APE1酶和AP探针；
更具体的，所述反应溶液I中还可以包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及反应buffer等，从而有助于反应的顺利进行；
端粒酶延伸以及酶切反应具体反应条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应30-60min(优选为30min)；高温灭活的温度为60℃以上，优选为65℃；
所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠，磁珠使用浓度控制为1-10mg mL-1，优选为5mgmL-1。
所述步骤S2中，延伸反应具体条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应0.5-2h(优选为1h)。
所述步骤S3中，反应具体条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应10-60min(优选为15min)。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括对步骤S3获得的反应产物进行检测分析。
所述检测分析包括但不限于荧光检测分析和单分子成像检测分析等。
具体的，可以使用FLS1000分光光度计定性检测荧光强度，在620nm处激发Cy5并收集665nm处的信号；使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进行定量，具体的，用640nm激光激发Cy5，使用油浸物镜(CFI复消色差TIRF 100)收集Cy5的光子，并将其成像到EMCCD相机(光度测量学，Evolve 512)上。
上述待测样品可以是生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。经试验证明，本发明可以灵敏地检测单个Hela细胞中的端粒酶提取物，真正实现单细胞水平检测。
本发明又一具体实施方式中，提供上述生物传感器和/或检测方法在端粒酶相关药物筛选和/或生物样品端粒酶检测分析中的应用。
所述端粒酶相关药物包括端粒酶促进剂和端粒酶抑制剂。
所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞，本发明的生物传感器能够灵敏检测单细胞水平中的端粒酶活性，因此在生物医学基础研究、临床诊断、相关药物(如抗癌药物)研发等领域均具有巨大潜力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
实验方法与步骤
1.细胞培养及端粒酶提取物的制备：子宫颈癌系细胞HeLa、肺腺癌细胞系A549和人乳腺癌细胞系MCF-7细胞在杜尔贝科改良的Eagle培养基(DMEM)中生长，DMEM中添加1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清，培养基置于37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养至细胞成熟。人胎儿肺成纤维细胞系MRC-5在最低基本培养基(MEM)中生长，培养基中添加有1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清，培养基置于37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养至细胞成熟。在细胞指数生长期通过胰蛋白酶消化收集细胞，用冰冷PBS洗涤两次，并在4℃下以2000rpm离心10分钟。然后，约100万个细胞均匀分散在200μL冰冷1×CHAPS裂解缓冲液中，然后将混合物置于冰上孵育30分钟，然后在4℃下以12000g离心20分钟，低温离心后，收集含有端粒酶的上清液，并在-80℃下储存，直至随后的检测。
2.端粒定向级联DNA修复介导的荧光团编码/解码用于单细胞端粒酶活性检测：首先，将不同浓度的端粒酶提取物添加到30微升反应溶液中，该溶液含有33纳摩尔每升TS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3',SEQ ID NO.2)、66微摩尔每升dNTPs、20单位的RNase抑制剂、500纳摩尔每升AP探针(5'-Biotin-CCT CCC TAA XCC TAA CTC TGC TCG ACG GAT-PO4-3',SEQ ID NO.1)、6单位APE1和3微升10×NEBuffer 4以及1微升反应缓冲液(30毫摩尔每升Tris-HCl、3毫摩尔每升MgCl2、70毫摩尔每升KCl、1毫摩尔每升EGTA、0.05％(v/v)吐温20、pH 8.3)，37℃孵育30min，进行端粒诱导的AP位点切除。切除反应后，将所有切除产物与10微升5毫克每毫升链霉亲和素包衣磁珠(MBs)混合，在混匀仪上以20rpm的转速室温下转20min。将DNA功能化MBs洗涤三次以进行后续反应。然后，将6单位TdT、250微摩尔每升CoCl2、180微摩尔每升dATP和20微摩尔每升Cy5 dATP添加到含有10微升DNA-MBs和10×TdT反应缓冲液的30微升反应溶液中，在37℃下培养1小时，以产生带有许多Cy5分子标记的Cy5标记的多尾单链DNA链，然后洗涤三次以去除多余的Cy5-dATP。最后，将Cy5-DNA-MBs复合物加入30微升含有10单位Exo I和3微升10×Exo I缓冲液的反应溶液中，在37℃下培养15分钟。最后收集上清液进行荧光测量和单分子成像。
3.凝胶成像及荧光检测：向产物中加入SYBR Gold染料对DNA进行染色，将混合物打入4％聚丙烯酰氨凝胶中，凝胶放入1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液中(9毫摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升EDTA，pH为7.9)。在110V电压下室温电泳40分钟。最后通过ChemiDoc MP成像系统对端粒酶延伸反应产物进行凝胶成像。Cy5的荧光信号使用FLS1000分光光度计测量收集，在620nm处激发Cy5并收集665nm处的信号。
4.单分子测量和数据分析：在单分子测量前，核酸外切酶反应产物使用稀释液(10毫摩尔每升Tris-HCl，50毫摩尔每升氯化钾，1毫摩尔奎诺二甲基丙烯酸酯，pH8.0)稀释3000倍。随后，取10微升稀释物打到玻片上。单分子成像通过一个全内反射荧光显微镜获得，打开640nm的激光源激发Cy5，来自Cy5的光子使用油浸物镜收集并成像到EMCCD相机上。在Image J软件中对300×300像素的成像区域进行处理、计数，Cy5的计数取10张图像取平均值。
5.抑制剂实验：将指数生长期生长的HeLa细胞与不同浓度的N，N'-1,3-亚苯基双-[2,3-二羟基苯甲酰胺](MST-312)孵育48小时，然后收集端粒酶提取物，随后反应遵循上述各反应条件，并对Cy5进行计数。
结果分析与讨论
1.可行性实验
为了验证该方法的可行性，我们采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光光谱法作为验证方法。如图2A所示，我们使用SYBR Gold作为确认端粒酶反应的指示剂，在没有端粒酶提取物的情况下，只有一条端粒酶底物带(图2A，泳道1)，这表明在没有端粒酶提取物的情况下不会产生扩增子反应。相反，当存在端粒酶提取物时，观察到来自端粒酶延伸产物的明显条带(图2A，泳道2)，表明存在端粒酶诱导的延伸产物。这一结果表明底物TS模板仅在端粒酶存在的情况下延长。
我们使用荧光光谱进一步验证了后续反应。如图2B所示，加入端粒酶提取物后，在665nm处观察到强烈的Cy5荧光信号(图2B，红线)。相反，当体系中没有端粒酶提取物时，在665nm处仅观察到微弱的Cy5荧光信号(图2B，黑线)。上述实验结果表明只有端粒酶的存在才能启动随后的反应，产生高Cy5信号。
此外，我们还使用基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测进一步证实了上述结果。如图2(C)所示，在没有端粒酶提取物的情况下，没有Cy5信号(图2C(a))，这表明没有端粒酶不能引发任何反应。相反，当端粒酶存在时，可以观察到明显的Cy5荧光信号(图2C(b))。
上述结果清晰地表明，该方法可用于以Cy5为荧光指示剂的癌细胞端粒酶提取物的灵敏检测，在单分子水平上检测癌细胞的端粒酶提取物。
2.优化实验条件
为了得到最佳的实验结果，我们优化了dATPs浓度，Cy5dATPs在dATPs中所占比例，AP探针浓度，APE1浓度和TdT浓度五个变量。
如图3所示，在Cy5dATPs占总dATPs的比例由5％增加到10％时，F/F0的值也随着比例的增加而增大，当比例由10％增加至20％时，F/F0的值相比于比例为10％时基本不变，当继续增加比例至50％时，F/F0的值逐步降低，因此，我们选择10％作为Cy5dATPs占总dATPs的最佳比例。如图4所示，在dATPs浓度由50微摩尔每升增加到200微摩尔每升时，F/F0的值也随着加入dATPs浓度的增加而增大，当dATPs浓度为250微摩尔每升时F/F0的值相比于200微摩尔每升不再变化，因此，我们选择200微摩尔每升作为最佳的dATPs浓度。如图5所示，在AP探针的浓度由200纳摩尔每升增加至500纳摩尔每升时，F/F0的值也随着浓度的增加而增大，当浓度为600纳摩尔每升时，F/F0的值开始降低，因此我们选择500纳摩尔每升作为AP探针的最佳浓度。如图6、7所示，当APE1酶浓度由0.1单位每微升增加至0.2单位每微升时，F/F0的值逐渐增大，当浓度继续增加至0.25、0.3单位每微升时，F/F0的值逐渐降低；当TdT酶的浓度由由0.1单位每微升增加至0.2单位每微升时，F/F0的值逐渐增大，当浓度继续增加至0.3、0.4、0.5单位每微升时，F/F0的值相比于0.2单位每微升到达平台期基本不变，因此我们选择0.2单位每微升为APE1酶最佳浓度、0.2单位每微升为TdT酶最佳浓度。
3.灵敏度检测
为了说明该方法检测端粒酶活性的灵敏度，我们测量了在优化的最佳条件下不同数量的HeLa细胞端粒酶提取物产生的Cy5荧光计数的变化。如图8A和B所示，Cy5荧光计数随着细胞数从0增加到10000而增加。同时，在对数刻度上，Cy5荧光计数在1到3000个细胞范围内与HeLa细胞数呈线性相关(图8C)。回归方程为N＝72.68+111.01lgX(R2＝0.996)，其中N是测量的Cy5计数，X是HeLa细胞的数量，值得注意的是，值得注意的是，在响应来自1个HeLa细胞的端粒酶提取物的实验组和没有端粒酶提取物的对照组之间，Cy5荧光计数和强度存在明显区别(图8A和图9)，该方法比基于CHA的动态光散射法(3-10个细胞)、基于氧化石墨烯的荧光法(10个细胞)、基于CHA的比色分析法(15个细胞)、基于DNA纳米水凝胶的荧光法(33个细胞)和基于链位移的比率荧光法(102个细胞)更灵敏。
4.特异性检测
为了测试该方法检测端粒酶的特异性，使用人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(FpG)、人10-11易位2蛋白(TeT2)和核酸内切酶HaeIII作为阴性对照。如图10所示，只有端粒酶实验组产生高Cy5信号，而hAAG、FpG、TeT2和HaeIII产生极低的Cy5信号，类似于没有端粒酶的对照组的Cy5信号，这一结果表明只有在端粒酶存在的情况下才能检测到Cy5，该方法对端粒酶检测具有良好的特异性。
5.抑制剂分析
为了验证所提出的抑制测定方法的可行性，我们使用合成小分子N,N'-1,3-亚苯基双-[2,3-二羟基-苯甲酰胺](MST-312)作为模型抑制剂。先前的报告表明，低剂量的MST-312可以强烈抑制端粒酶活性并导致端粒缩短。测量不同浓度MST-312产生的Cy5荧光信号，并根据图8(C)中的线性方程确定端粒酶的相对活性。如图11所示，端粒酶的相对活性随着MST-312浓度从0到5微摩尔每升的增加而显着降低。MST-312的半最大抑制浓度(IC50，抑制50％酶活性所需的抑制剂浓度)计算为0.79微摩尔每升，这与基于凝胶的southern印迹分析(0.67微摩尔每升)和基于三重扩增的荧光分析(0.88微摩尔每升)获得的结果一致。这些结果表明，该策略可用于端粒酶抑制剂筛选，并具有发现抗癌药物的潜力。
6.不同细胞端粒酶活性的测定
由于端粒酶在许多具有高端粒酶活性的癌细胞中广泛表达，而在具有低端粒酶活性的正常体细胞中几乎不表达，我们进一步测试了该方法检测不同细胞(包括人胎儿肺成纤维细胞系(MRC-5细胞)、人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)、人肺癌细胞系(A549细胞)和人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)端粒酶活性的可行性。如图12所示，在存在MRC-5细胞提取物的情况下，观察到与对照组相似的极低Cy5信号，这表明正常细胞中几乎没有端粒酶活性。相反，当MCF-7细胞、A549细胞和HeLa细胞的细胞提取物存在时，Cy5信号远高于对照组信号，这一结果表明癌细胞中的端粒酶活性较高。此外，从这三种癌细胞获得的Cy5信号也不同，A549细胞的Cy5信号略高于HeLa细胞，HeLa细胞的Cy5信号高于MCF-7细胞，这一趋势(A549细胞＞HeLa细胞＞MCF-7细胞＞MRC-5细胞)与先前的研究结果一致，这表明该方法可成功用于不同细胞系中端粒酶活性的精确定量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测
中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctccctaax cctaactctg ctcgacggat 30
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatccgtcga gcagagtt 18

Claims (10)

1.一种基于酶DNA修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少包括AP探针，TS引物，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶，荧光基团修饰的dATP，末端脱氧核苷酸转移酶以及链霉亲和素包被的磁珠；
其中，所述AP探针为一个单链的DNA，所述AP探针含有无嘌呤/无嘧啶位点；且所述AP探针可以与端粒酶延伸产物完全杂交形成包含AP位点的双链DNA，而与未能发生反应的TS引物只会部分杂交。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述AP探针5'末端和3'末端分别修饰有生物素和磷酸基团；
优选的，所述AP探针长度为30nt，所述AP探针的碱基序列为:5'-Biotin-CCTCCC TAAXCC TAA CTC TGC TCG ACG GAT-PO4-3'，其中下划线标出的碱基序列即为磁珠捕获的后续进行TdT扩增的序列，下划线标出的X即无嘌呤/无嘧啶位点。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光基团修饰的dATP中，所述荧光基团为Cy5；
优选的，所述Cy5 dATPs在总dATPs中占比少于50％，进一步少于30％，优选为20％。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括核酸外切酶，优选为核酸外切酶I。
5.权利要求1-4任一项所述生物传感器在检测端粒酶中的应用。
6.一种检测端粒酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-4任一项所述生物传感器进行检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、将待测样品加入反应溶液I中，进行端粒酶延伸以及酶切反应，然后高温灭活处理并进行磁珠捕获，构建MB单链DNA纳米结构；
S2、向步骤S1制得的MB单链DNA纳米结构中加入TdT酶，dATPs和荧光基团修饰的dATP，进行延伸反应，得到荧光基团标记的多尾单链DNA链；
S3、向步骤S2中荧光基团标记的多尾单链DNA链中加入核酸外切酶进行反应；
优选的，所述步骤S1中，反应溶液I中至少包括TS引物、APE1酶和AP探针；
进一步优选的，所述反应溶液I中还可以包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及反应buffer等，从而有助于反应的顺利进行；
优选的，端粒酶延伸以及酶切反应具体反应条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应30-60min(优选为30min)；高温灭活的温度为60℃以上，优选为65℃；
优选的，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠，磁珠使用浓度控制为1-10mg mL-1，优选为5mg mL-1；
优选的，所述步骤S2中，延伸反应具体条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应0.5-2h(优选为1h)；
优选的，所述步骤S3中，反应具体条件为：在30-45℃(优选为37℃)，反应10-60min(优选为15min)；
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤S3获得的反应产物进行检测分析；优选的，所述检测分析包括荧光检测分析和单分子成像检测分析。
优选的，待测样品是生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。
9.权利要求1-4任一项所述生物传感器和/或权利要求6-8任一项所述检测方法在端粒酶相关药物筛选和/或生物样品端粒酶检测分析中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述端粒酶相关药物包括端粒酶促进剂和端粒酶抑制剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232862A (zh) * 2022-07-18 2022-10-25 四川大学华西医院 一种金纳米颗粒-dna酶马达触发双色dna镊子荧光扩增检测双酚a的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110144384A (zh) * 2019-06-03 2019-08-20 山东师范大学 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用
CN111154839A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 山东师范大学 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用
CN112852922A (zh) * 2021-01-14 2021-05-28 山东师范大学 一种检测dna甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110144384A (zh) * 2019-06-03 2019-08-20 山东师范大学 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用
CN111154839A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 山东师范大学 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用
CN112852922A (zh) * 2021-01-14 2021-05-28 山东师范大学 一种检测dna甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232862A (zh) * 2022-07-18 2022-10-25 四川大学华西医院 一种金纳米颗粒-dna酶马达触发双色dna镊子荧光扩增检测双酚a的方法
CN115232862B (zh) * 2022-07-18 2023-03-24 四川大学华西医院 一种金纳米颗粒-dna酶马达触发双色dna镊子荧光扩增检测双酚a的方法

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