JPWO2021183941A5

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Publication number: JPWO2021183941A5
Application number: JP2022555105A
Authority: JP
Publication date: 2024-03-25

Description

４．概要
本開示は、閉鎖系において標的核酸の検出を容易に行うことを可能にする新たな増幅方法を提供する。本方法は、バイオセンサ対を有するループプライマーを用いることにより、少量の標的核酸を高い特異性及び感度をもって検出することを可能にする。バイオセンサ対は、例えば、蛍光／クエンチャーＦＲＥＴ技術を使用して、ループプライマーの立体配座の変化を検出することによって、標的配列のループ・デ・ループ（「ＬＤＬ」）増幅の決定を可能にする。さらに、複数のバイオセンサを使用することによって、単一のチューブの中の多重化標的を検出することが可能になる。ループプライマーは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）だけでなく、鎖置換ポリメラーゼを利用する任意の他の核酸増幅方法と組み合わせて使用することができる。
本開示は、以下の［１］から［９５］を含む。
［１］標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含むループプライマー。
［２］前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［１］に記載のループプライマー。
［３］前記第１のバイオセンサ対が、エネルギー供与体と受容体の対である、上記［１］又は［２］に記載のループプライマー。
［４］前記第１のバイオセンサ対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である、上記［３］に記載のループプライマー。
［５］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーである、上記［３］に記載のループプライマー。
［６］前記第１のセンサ分子がＦＲＥＴクエンチャーであり、前記第２のセンサ分子がＦＲＥＴフルオロフォアである、上記［３］に記載のループプライマー。
［７］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［８］前記第１のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー受容体であり、前記第２のセンサ分子がＢＲＥＴエネルギー供与体である、上記［３］に記載のループプライマー。
［９］前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が、検出可能な光信号を生成する複合体を形成し得る、上記［１］に記載のループプライマー。
［１０］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が６０℃を超える、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１１］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が６５℃を超える、上記［１０］に記載のループプライマー。
［１２］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が７０℃を超える、上記［１１］に記載のループプライマー。
［１３］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が８０℃を超える、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１４］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が７０から８０℃である、上記［１２］に記載のループプライマー。
［１５］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が７２．５から７７．５℃である、上記［１３］に記載のループプライマー。
［１６］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が約７５℃である、上記［１４］に記載のループプライマー。
［１７］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が６０℃未満である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１８］前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）が６０から６５℃である、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［１９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から１０ヌクレオチド長である、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２０］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、３から７ヌクレオチド長である、上記［１９］に記載のループプライマー。
［２１］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、６ヌクレオチド長である、上記［２０］に記載のループプライマー。
［２２］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２３］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１０から２０ヌクレオチド長である、上記［２２］に記載のループプライマー。
［２４］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３から１８ヌクレオチド長である、上記［２３］に記載のループプライマー。
［２５］前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、１３ヌクレオチド長である、上記［２４］に記載のループプライマー。
［２６］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である、上記［１］～［２５］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［２７］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２０から３０ヌクレオチド長である、上記［２６］に記載のループプライマー。
［２８］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、２３から２８ヌクレオチド長である、上記［２７］に記載のループプライマー。
［２９］前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む、上記［１］～［２８］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３０］前記ループプライマーの５’末端に第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［２９］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３１］前記第１のセンサ分子と前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間に第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３２］前記第１又は第２のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、上記［３０］又は［３１］に記載のループプライマー。
［３３］前記標的配列が病原体ゲノムに特異的である、上記［１］～［３２］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［３４］前記標的配列がクラミジア・トラコマチスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３５］前記標的配列がｏｒｆ８又はｃｄｓ２に由来する、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３６］配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３４］に記載のループプライマー。
［３７］前記標的配列が、淋菌に特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［３８］前記標的配列が、ｐｏｒＡ又はｇｌｎＡに由来する、上記［３７］に記載のループプライマー。
［３９］配列番号５又は配列番号７のオリゴヌクレオチドを含む、上記［３７］に記載のループプライマー。
［４０］前記標的配列がウイルスに特異的である、上記［３３］に記載のループプライマー。
［４１］前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、上記［４０］に記載のループプライマー。
［４２］前記標的配列がホモサピエンスに特異的である、上記［１］～［３０］のいずれか一項に記載のループプライマー。
［４３］前記標的配列がｔｂｃ１ｄ３に由来する、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４４］配列番号２２のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４２］に記載のループプライマー。
［４５］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマーを含む、プライマー混合物。
［４６］（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３及び前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［４５］に記載のプライマー混合物。
［４７］（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［４６］に記載のプライマー混合物。
［４８］前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、又は前記ＬＢが前記標的配列上の前記第１の結合部位に結合する、上記［４５］～［４７］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［４９］前記ＦＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＦＩＰと前記ループプライマーの量の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５０］前記ＢＩＰが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＢＩＰと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５１］前記ＬＦが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＦと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５２］前記ＬＢが前記第１の結合部位に結合し、前記プライマー混合物中の前記ＬＢと前記ループプライマーの量の比が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、又は９：１である、上記［４８］に記載のプライマー混合物。
［５３］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５４］前記Ｆ３が配列番号１のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号３のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号６のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号８のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５５］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５６］前記Ｆ３が配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１１のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１２のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号１３のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号１４のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５７］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含む、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、又は前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５８］前記Ｆ３が配列番号１６のオリゴヌクレオチドを含み、前記Ｂ３が配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＦＩＰが配列番号１８のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＢＩＰが配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＬＦが配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含み、及び前記ＬＢが配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、上記［４６］～［５２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［５９］第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［５８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６０］前記第３のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［５９］に記載のプライマー混合物。
［６１］前記標的配列と前記第２の標的配列が同一である、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６２］前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、上記［５９］又は［６０］に記載のプライマー混合物。
［６３］（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６４］（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［５９］～［６０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６５］第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ _ｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、上記［４５］～［６４］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［６６］前記第５のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、上記［６５］に記載のプライマー混合物。
［６７］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が同一である、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６８］前記標的配列、前記第２の標的配列及び前記第３の標的配列が異なる、上記［６５］又は［６６］に記載のプライマー混合物。
［６９］（ｉ）第３のフォワードインナープライマー（ＴＦＩＰ）、（ｉｉ）第３のバックワードインナープライマー（ＴＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第３のフォワードプライマー（ＴＦ３）、及び（ｉｖ）第３のバックワードプライマー（ＴＢ３）をさらに含み、前記ＴＦＩＰ、前記ＴＢＩＰ、前記ＴＦ３、及び前記ＴＢ３が、前記第３の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６８］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７０］（ｉ）第３のループフォワードプライマー（ＴＬＦ）及び（ｉｉ）第３のループバックワードプライマー（ＴＬＢ）をさらに含み、前記ＴＬＦ及び前記ＴＬＢが、前記第３の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、上記［６５］～［６９］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７１］第４のループプライマーをさらに含む、上記［６５］～［７０］のいずれか一項に記載のプライマー混合物。
［７２］第５のループプライマーをさらに含む、上記［７１］に記載のプライマー混合物。
［７３］上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー又は上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物を凍結乾燥することによって得られる乾燥プライマー混合物。
［７４］標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、
上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のループプライマー、上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を含む、キット。
［７５］ポリメラーゼをさらに含み、前記ポリメラーゼが、任意選択で、バチルス・ステアロサーモフィルス・ポリメラーゼである、上記［７４］に記載のキット。
［７６］ｄＮＴＰ、ＭｇＳＯ _４及び緩衝液をさらに含む、上記［７４］～［７５］のいずれか一項に記載のキット。
［７７］逆転写酵素をさらに含む、上記［７４］～［７６］のいずれか一項に記載のキット。
［７８］ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［７４］～［７７］のいずれか一項に記載のキット。
［７９］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮａｓｅ阻害剤である、上記［７８］に記載のキット。
［８０］試料中の標的配列を検出する方法であって、
試料を用意する工程と、
（ｉ）上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のプライマー、（ｉｉ）上記［４５］～［７２］のいずれか一項に記載のプライマー混合物、又は（ｉｉｉ）上記［７３］に記載の乾燥プライマー混合物を再水和することによって得られた再構成プライマー混合物と、ポリメラーゼとを試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と
を含む、方法。
［８１］前記インキュベーションが５０～７０℃で行われる、上記［８０］に記載の方法。
［８２］前記インキュベーションが６０～６５℃で行われる、上記［８１］に記載の方法。
［８３］前記インキュベーションが６２～６５℃で行われる、上記［８２］に記載の方法。
［８４］前記ポリメラーゼがバチルス・ステアロサーモフィルスポリメラーゼである、上記［８０］～［８３］のいずれか一項に記載の方法。
［８５］前記反応混合物からの信号を検出する工程をさらに含む、上記［８０］～［８４］のいずれか一項に記載の方法。
［８６］前記信号が蛍光信号である、上記［８５］に記載の方法。
［８７］前記検出する工程が、前記インキュベーションの工程の間に行われる、上記［８５］～［８６］のいずれか一項に記載の方法。
［８８］前記試料中の前記標的配列の存在又は非存在を調べる工程をさらに含む、上記［８０］～［８７］のいずれか一項に記載の方法。
［８９］前記試料を調製する先行する工程をさらに含む、上記［８０］～［８８］のいずれか一項に記載の方法。
［９０］前記試料を調製する工程が、逆転写酵素とＲＮＡ分子を相互作用させることを含み、それにより、ＤＮＡ分子を含む前記試料を生成する、上記［８９］に記載の方法。
［９１］前記試料を調製する工程が、前記逆転写酵素と相互作用させる前又は前記逆転写酵素の間に前記ＲＮＡ分子を予熱する工程をさらに含む、上記［９０］に記載の方法。
［９２］前記反応混合物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、上記［８０］～［９１］のいずれか一項に記載の方法。
［９３］前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、ブタ又はマウスのＲＮＡ阻害剤である、上記［９２］に記載の方法。
［９４］前記試料が、精製ＲＮＡ、精製ＤＮＡ、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、全ヒト細胞、唾液若しくは鼻スワブ、又は鼻若しくは鼻咽頭スワブを含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。
［９５］前記試料が、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、全細菌又は膣スワブ由来の全ヒト細胞を含む、上記［８０］～［９３］のいずれか一項に記載の方法。

Claims

標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、
（ｉ）５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
前記標的配列と相補的ではないスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含むループプライマーであって、前記ループプライマーが、前記標的配列に結合した場合に、鎖置換ポリメラーゼにより増幅されるように構成されている、ループプライマーと、
（ｉｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｖ）フォワードプライマー（Ｆ３）及び（ｖ）バックワードプライマー（Ｂ３）、（ｖｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｖｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）とを含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合し、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３、前記Ｂ３、前記ＬＦ、及び前記ＬＢの少なくとも１つが、前記第１の結合部位に結合する、プライマー混合物。
第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項１に記載のプライマー混合物。
前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、請求項２に記載のプライマー混合物。
（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項２に記載のプライマー混合物。
（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項２に記載のプライマー混合物。
第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第３のプライマー配列と、
を含む、請求項２に記載のプライマー混合物。
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、
請求項１に記載のプライマー混合物と、ポリメラーゼとをさらに含み、前記ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、キット。
逆転写酵素をさらに含む、請求項７に記載のキット。
試料中の標的配列を検出する方法であって、
前記試料を用意する工程と、
（ｉ）請求項１に記載のプライマー混合物と、ポリメラーゼとを前記試料に添加し、それにより反応混合物を生成する工程と、
前記反応混合物を５０～８５℃でインキュベートする工程と
を含む、方法。
前記反応混合物からの蛍光信号を検出する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
標的配列のループ・デ・ループ増幅（ＬｄＬ）のためのループプライマーであって、５’から３’に向って、
第１のセンサ分子と、
第１のクランピングオリゴヌクレオチドと、
スペーシングオリゴヌクレオチドと、
第２のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第２のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のセンサ分子であって、
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が第１のバイオセンサ対である、第２のセンサ分子と、
前記標的配列上の第１の結合部位に相補的な第１のプライマー配列と、
を含み、
第１のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第１のさらなるオリゴヌクレオチドが、前記ループプライマーの５’末端にある、
ループプライマー。
前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドに相補的である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のバイオセンサ対が、エネルギー供与体と受容体の対である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のバイオセンサ対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のためのエネルギー供与体と受容体の対である、請求項１３に記載のループプライマー。
前記第１のセンサ分子及び前記第２のセンサ分子が、検出可能な光信号を生成する複合体を形成し得る、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が６０℃を超える、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が７０℃を超える、請求項１６に記載のループプライマー。
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が８０℃を超える、請求項１７に記載のループプライマー。
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が７０から８０℃である、請求項１６に記載のループプライマー。
前記第１及び第２のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が６０℃未満である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドの各々が、３から１０ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記スペーシングオリゴヌクレオチドが、５から３５ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド、及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、全体で、１５から３５ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のクランピングオリゴヌクレオチド、前記スペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第２のクランピングオリゴヌクレオチドが、（ｉ）アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルから選択される核酸塩基、（ｉｉ）ロックド核酸、（ｉｉｉ）２’Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、（ｉｖ）ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基、（ｖ）ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、（ｖｉ）ホスホロチオエート化２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、又は（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む、請求項１１に記載のループプライマー。
第２のさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第２のさらなるオリゴヌクレオチドが前記第１のセンサ分子と前記第１のクランピングオリゴヌクレオチドとの間にある、請求項１１に記載のループプライマー。
前記第１のさらなるオリゴヌクレオチドがバーコード配列である、請求項１１に記載のループプライマー。
前記標的配列が病原体ゲノムに特異的である、請求項１１に記載のループプライマー。
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのプライマー混合物であって、請求項１１に記載のループプライマーを含む、プライマー混合物。
（ｉ）フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、（ｉｉ）バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、（ｉｉｉ）フォワードプライマー（Ｆ３）及びバックワードプライマー（Ｂ３）をさらに含み、前記ＦＩＰ、前記ＢＩＰ、前記Ｆ３及び前記Ｂ３が、前記標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項２８に記載のプライマー混合物。
（ｉ）ループフォワードプライマー（ＬＦ）及び（ｉｉ）ループバックワードプライマー（ＬＢ）をさらに含み、前記ＬＦ及び前記ＬＢが、前記標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項２９に記載のプライマー混合物。
第２のループプライマーをさらに含み、前記第２のループプライマーが、
第３のセンサ分子と、
第３のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第２のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第４のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第３のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第２のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第４のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第３及び第４のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第４のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第４のセンサ分子であって、
前記第３のセンサ分子及び前記第４のセンサ分子が第２のバイオセンサ対であり、前記第２のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対とは異なる、第４のセンサ分子と、
第２の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項２８に記載のプライマー混合物。
前記標的配列と前記第２の標的配列が異なる、請求項３１に記載のプライマー混合物。
（ｉ）第２のフォワードインナープライマー（ＳＦＩＰ）、（ｉｉ）第２のバックワードインナープライマー（ＳＢＩＰ）、（ｉｉｉ）第２のフォワードプライマー（ＳＦ３）及び（ｉｖ）第２のバックワードプライマー（ＳＢ３）をさらに含み、前記ＳＦＩＰ、前記ＳＢＩＰ、前記ＳＦ３及び前記ＳＢ３が、前記第２の標的配列上の６つの異なる結合部位に結合する、請求項３１に記載のプライマー混合物。
（ｉ）第２のループフォワードプライマー（ＳＬＦ）及び（ｉｉ）第２のループバックワードプライマー（ＳＬＢ）をさらに含み、前記ＳＬＦ及び前記ＳＬＢが、前記第２の標的配列上の２つの異なる結合部位に結合する、請求項３１に記載のプライマー混合物。
第３のループプライマーをさらに含み、前記第３のループプライマーが、
第５のセンサ分子と、
第５のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第３のスペーシングオリゴヌクレオチドと、
第６のクランピングオリゴヌクレオチドであって、
前記第５のクランピングオリゴヌクレオチド、前記第３のスペーシングオリゴヌクレオチド及び前記第６のクランピングオリゴヌクレオチドが、前記第５及び第６のクランピングオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）より低い温度でヘアピン構造を形成することができる、第６のクランピングオリゴヌクレオチドと、
第６のセンサ分子であって、
前記第５のセンサ分子及び前記第６のセンサ分子が第３のバイオセンサ対であり、前記第３のバイオセンサ対が前記第１のバイオセンサ対及び第２のバイオセンサ対とは異なる、第６のセンサ分子と、
第３の標的配列上の第１の結合部位に相補的な第２のプライマー配列と、
を含む、請求項３１に記載のプライマー混合物。
標的配列のループ・デ・ループ増幅のためのキットであって、
請求項１１に記載のループプライマー及びポリメラーゼを含む、キット。
逆転写酵素をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
前記ポリメラーゼが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス・ポリメラーゼである、請求項３６に記載のキット。