JP5433820B1 - 微生物検出法及び微生物検出キット - Google Patents
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Abstract
a)前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。
Description
a)前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程、
を提供する。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記微生物が、細菌、又はウイルスであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌、又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、PCR法、RT−PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記PCR法がリアルタイムPCR法により行われ、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。
1)パラジウム錯体、又は、
配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときにパラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。
前記本発明のキットは、さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含むことを好ましい形態としている。
また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNからなる群から選ばれることを好ましい態様としている。
また、前記方法及びキットは、前記パラジウム化合物が塩化パラジウム(II)、又は酢酸パラジウム(II)であることを好ましい形態としている。
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
a)前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml(colony forming units / ml))で近似させることができる。また、損傷細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液のcfu/mlで近似させることができる。尚、損傷細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、50秒程度で損傷細胞を調製することができる。
さらに、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光(波長600nm)の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml)で近似させることができる。
ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位(pfu又はPFU(plaque-forming units))で表される。
被検試料に、パラジウム錯体(以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。)を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
微生物細胞内では、前記薬剤は核酸には実質的に結合せず、DNA結合性タンパク質(例えばHUヒストン様タンパク質)やRNA結合性タンパク質(例えばSynaptotagmin−binding, cytoplasmic RNA−interacting protein「SYNCRIP」分子量66 kDa(特開2002-101890号公報)や核内RNA−タンパク質複合体・パラスペックル(paraspeckle)(Sasaki, Y. T. et. al., (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106 : 2525-2530)を形成するタンパク質、もしくはリボゾームタンパク質のようなタンパク質を介して、ターゲット領域のPCR反応を阻害すると推定される。従って、DNA結合性タンパク質もしくはリボゾームタンパク質のようなタンパク質と核酸が存在する細胞内では、主として同タンパク質に結合する薬剤であり得る。本発明の薬剤とタンパク質との結合は、配位結合(共有結合)であり得る。
ハロゲン元素としては、Cl(塩素)が好ましい。
このように、パラジウムは、ソフトなルイス塩基であるシステインやメチオニンを配位結合の相手として一番好むので、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムを予め配位結合させたパラジウム錯体は、細胞中でタンパク質中のアミノ酸に配位結合して安定化されると推定される。したがって、核酸結合性タンパク質を介した核酸増幅抑制能の観点からは、本発明の薬剤は、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物が好ましく、ハードなルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物がより好ましい。
尚、ソフトなルイス塩基、例えばR2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)を配位子として含むパラジウム錯体であっても、本発明に使用できる。
ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)、ジアンミンジクロロパラジウム(II)、ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(η2-P,C(-)トリス(2,4-ジ-tert-ブチルフェニル)ホスファイト)(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジ-μ-クロロ-ビス-[5-ヒドロキシ-2-[1-(ヒドロキシイミノ-κN)-エチル]-フェニル-κC]-パラジウム(II) ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ(トリ-tert-ブチルホスフィン)パラジウム(I) ダイマー、1,2-ビス(フェニルスルフィニル)エタン パラジウム(II) アセテート、クロロ[2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)-3,6-ジメトキシ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ-(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ[2-(ジ-tert-ブチルホスフィノ)-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、ビス[(ジシクロヘキシル)(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン] パラジウム(II) クロリド、ビス[ジ-(tert-ブチル)(4-トリフルオロメチルフェニル)ホスフィン]パラジウム(II) クロリド、2-(ジメチルアミノメチル)フェロセン-1-イル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン、1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン (1,4-ナフトキノン)パラジウム(0) ダイマー、サリチルアルデヒド チオセミカルバゾン パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(2,4-ジ-tert-ブチル-フェノキシ)ホスフィノキシ]-3,5-ジ(tert-ブチル)フェニル-パラジウム(II) クロリド ダイマー、ジ-μ-クロロビス[5-クロロ-2-[(4-クロロフェニル)(ヒドロキシイミノ-κN)メチル]フェニル-κC]パラジウム ダイマー、パラジウム(II) アセテート-S-Phos(Pd:P 1:2)、トリス[ジベンジリデンアセトン]ジパラジウム(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(ジメチルアミノ)-2-ビフェニリル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン コンプレックス、パラジウム ピバレート、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) トリフルオロアセテート、パラジウム(π-シンナミル) クロリド ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジアセテート、1,4-ビス(ジフェニルホスフィノ)ブタン-パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) シアニド、パラジウム(II) プロピオネート、(2-メチルアリル)パラジウム(II) クロリド ダイマー、[2,6-ビス[(ジ-1-ピペリジニルホスフィノ)アミノ]フェニル]パラジウム(II) クロリド、[1,2-ビス(ジシクロヘキシルホスフィノ)エタン]パラジウム(II) クロリド、トリフェニルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド ホスファアダマンタン エチル シリカ、ジクロロビス(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジクロロ(1,5-シクロオクタジエン)パラジウム(II)、(1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン)パラジウム(II) クロリド、1,1'-ビス(ジ-イソプロピルホスフィノ)フェロセン パラジウム ジクロリド、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ビス(3,5,3',5'-ジメトキシジベンジリデンアセトン)パラジウム(0)、ジクロロ(1,10-フェナンスロリン)パラジウム(II)、ジクロロビス(トリ-o-トリルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ベンジル(クロロ)ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、トリス(3,3',3''-ホスフィニジントリス(ベンゼンスルホナト)パラジウム(0) 九ナトリウム塩九水和物、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、trans-ビス(ジシクロヘキシルアミン)パラジウム(II) アセテート、(R)-1-[(SP)-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセニル]エチルジ-tert-ブチルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド、ジクロロ[2-(4,5-ジヒドロ-2-オキサゾリル)キノリン]パラジウム(II)、ポリマー修飾のビス[(ジフェニルホスファニル)メチル]アミン パラジウム(II) ジクロリド, trans-ジブロモビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ブロミド]ベンジルアルコール、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、[ビス[((R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、ジクロロビス(トリエチルホスフィン)パラジウム(II)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、ジアセトビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[ビス[((S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II) クロリド、クロロ[(1,2,5,6-η)-1,5-シクロオクタジエン](2,2-ジメチルプロピル)-パラジウム、クロロ[(トリシクロフェニルホスフィン)-2-(2'-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(トリフェニルホスフィン) [2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) ブロミド、クロロ[(トリ-tert-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)] パラジウム(II)、ジブロモ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)、ジブロモ(1,5-シクロオクタジエン)パラジウム(II)、ジクロロ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II) アセトン付加物、ジクロロ[8-(ジ-tert-ブチルホスフィノキシ)キノリン]パラジウム(II)、ジクロロ(クロロ-tert-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジ-t-ブチルホスフィン)パラジウム(ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロビス(クロロt-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム(ii)、ジクロロビス(クロロジ-tert-ブチルホスフィン) パラジウム (ii)、ジクロロビス(メチルジフェニルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ジブロモ[ビス(トリ-o-トリルホスフィン)]パラジウム(II)、トリス[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-ビス(4-メトキシフェニル)-1,4-ペンタジエン-3-オン]]ジ-パラジウム、[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロ[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、[1,3-ビス(2,6-ジ-イソプロピルフェニル)-4,5-ジヒドロイミダゾール-2-イリデン]クロロ)[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、ジクロロ[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ジクロロ-[1,3-ビス(ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ビス[トリス(4-(1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ[(2-(ヒドロキシ-κO)メチル)フェニルメチル-κC](トリフェニルホスフィン)パラジウム (II)、[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(ジ(1-アダマンチル)-ブチルホスフィン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、アリルクロロ[1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(ii)、ビス[トリス(4-(ヘプタデカフルオロオクチル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、クロロ[(1,3,5,7-テトラメチル-5-フェニル-2,4,8-トリオキサ-6-ホスファアダマンタン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(ジ(1-アダマンチル)-N-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(ソディウム-2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル-3'-スルホネート)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-N,N-ジメチル-1-[(R)-2-(ジフェニルホスフィノ)フェロセニル]エチルアミン]パラジウム(II)、ジクロロ[ビス(2-(ジフェニルホスフィノ)フェニル)ether]パラジウム(II)、ジクロロビス(3,7-ジアセチル-1,3,7-トリアザ-5-ホスファビシクロ[3.3.1]ノナン) パラジウム(II)、[(2-[ビス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ホスフィン]-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル )-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、クロロ[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ビス(N,N-ジメチルアミノ)-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、(1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン)(3-クロロピリジル)パラジウム(II)ジクロリド、2-(2'-ジ-tert-ブチルホスフィン)ビフェニルパラジウム(II) アセテート、テトラクロロパラジウム酸(II)ナトリウム、ビス(アセトニトリル)ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)アンモニウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)アンモニウム、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、ビス(ジ-tert-ブチル(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン)ジクロロパラジウム(II)、trans-ビス(アセタト)ビス[o-(ジ-o-トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(メシチル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、アリルパラジウム(II) クロリド ダイマー、[1,1'-
ビス(ジ-tert-ブチルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、(2-ブテニル)クロロパラジウム ダイマー
(英名:dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II)、bis(benzonitrile)dichloropalladium(II)、diamminedichloropalladium(II)、dichloro(ethylenediamine)palladium(II)、chloro(η2-P,C(-)tris(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphite)(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、di-μ-chloro-bis-[5-hydroxy-2-[1-(hydroxyimino-κN)-ethyl]-phenyl-κC]-palladium(II) dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride、bromo(tri-tert-butylphosphine)palladium(I) dimer、1,2-bis(phenylsulfinyl)ethane palladium(II) acetate、chloro[2-(dicyclohexylphosphino)-3,6-dimethoxy-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro-(2-Dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro[2-(di-tert-butylphosphino)-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、bis[(dicyclohexyl)(4-dimethylaminophenyl)phosphine] palladium(II) chloride、bis[di-(tert-butyl)(4-trifluoromethylphenyl)phosphine]palladium(II) chloride、2-(dimethylaminomethyl)ferrocen-1-yl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine、1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene (1,4-naphthoquinone)palladium(0) dimer、salicylaldehyde thiosemicarbazone palladium(II) chloride、2-[bis(2,4-di-tert-butyl-phenoxy)phosphinooxy]-3,5-di(tert-butyl)phenyl-palladium(II) chloride dimer、di-μ-chlorobis[5-chloro-2-[(4-chlorophenyl)(hydroxyimino-κN)methyl]phenyl-κC]palladium dimer、palladium(II) acetate-S-Phos(Pd:P 1:2)、tris[dibenzylideneacetone]dipalladium(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(dimethylamino)-2-biphenylyl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine complex、palladium pivalate、bis(benzonitrile)palladium(II) chloride、palladium(II) trifluoroacetate、palladium(π-cinnamyl) chloride dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) diacetate、1,4-bis(diphenylphosphino)butane-palladium(II) chloride、palladium(II) cyanide、palladium(II) propionate、(2-methylallyl)palladium(II) chloride dimer、[2,6-bis[(di-1-piperidinylphosphino)amino]phenyl]palladium(II) chloride、[1,2-bis(dicyclohexylphosphino)ethane]palladium(II) chloride、triphenylphosphine palladium(II) dichloride phosphaadamantane ethyl silica、dichlorobis(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、dichloro(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、(1,3-bis(diphenylphosphino)propane)palladium(II) chloride、1,1'-bis(di-isopropylphosphino)ferrocene palladium dichloride、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、bis(3,5,3',5'-dimethoxydibenzylideneacetone)palladium(0)、dichloro(1,10-phenanthroline)palladium(II)、dichlorobis(tri-o-tolylphosphine)palladium(II)、trans-benzyl(chloro)bis(triphenylphosphine)palladium(II)、tris(3,3',3''-phosphinidynetris(benzenesulfonato)palladium(0) nonasodium salt nonahydrate、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、trans-bis(dicyclohexylamine)palladium(II) acetate、(R)-1-[(SP)-2-(dicyclohexylphosphino)ferrocenyl]ethyldi-tert-butylphosphine palladium(II) dichloride、dichloro[2-(4,5-dihydro-2-oxazolyl)quinoline]palladium(II)、bis[(diphenylphosphanyl)methyl]amine palladium(II) dichloride, polymer-bound、trans-dibromobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、2-[bis(triphenylphosphine)palladium(II)bromide]benzyl alcohol、[(R)-(+)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、[bis[((R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、dichlorobis(triethylphosphine)palladium(II)、[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、diacetobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[bis[((S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、[(S)-(-)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、chloro[(1,2,5,6-η)-1,5-cyclooctadiene](2,2-dimethylpropyl)-palladium、chloro[(tricyclohexylphosphine)-2-(2'-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(triphenylphosphine) [2-(2′-amino-1,1′-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II)、bis(benzonitrile)palladium(II) bromide、chloro[(tri-tert-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)] palladium(II)、dibromo[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II)、dibromo(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、dichloro[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II) acetone adduct、dichloro[8-(di-tert-butylphosphinooxy)quinoline]palladium(II)、dichloro(chloro-tert-butylcyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichloro(chlorodi-t-butylphosphine)palladium(ii) dimer、dichloro(chlorodicyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichlorobis(chloro-t-butylcyclohexylphosphine)palladium(ii)、dichlorobis(chlorodi-tert-butylphosphine) palladium (ii)、dichlorobis(methyldiphenylphosphine)palladium(II)、trans-dibromo[bis(tri-o-tolylphosphine)]palladium(II)、Tris[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-bis(4-methoxyphenyl)-1,4-pentadien-3-one]]di-palladium、[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloro[3-phenylallyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、[1,3-bis(2,6-di-isopropylphenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-ylidene]chloro)[3-phenylallyl]palladium(II)、dichloro[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,3-dihydro-2H-imidazol-2-ylidene]palladium(II) dimer、dichloro-[1,3-bis(diisopropylphenyl)imidazoliden-2-ylidene]palladium(II) dimer、bis[tris(4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、bromo[(2-(hydroxy-κO)methyl)phenylmethyl-κC](triphenylphosphine)palladium (II)、[(2-di-cyclohexylphosphino-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(di(1-adamantyl)-butylphosphine)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、allylchloro[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene]palladium(ii)、bis[tris(4-(heptadecafluorooctyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、chloro[(1,3,5,7-tetramethyl-5-phenyl-2,4,8-trioxa-6-phosphaadamantane)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、chloro[(di(1-adamantyl)-N-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(sodium-2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl-3'-sulfonate)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-N,N-dimethyl-1-[(R)-2-(diphenylphosphino)ferrocenyl]ethylamine]palladium(II)、dichloro[bis(2-(diphenylphosphino)phenyl)ether]palladium(II)、dichlorobis(3,7-diacetyl-1,3,7-triaza-5-phosphabicyclo[3.3.1]nonane) palladium(II)、[(2-[bis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]phosphine]-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl )-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、chloro[(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-bis(N,N-dimethylamino)-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、(1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazolidene)(3-chloropyridyl)palladium(II)dichloride、2-(2'-di-tert-butylphosphine)biphenylpalladium(II) acetate、sodium tetrachloropalladate(II)、bis(acetonitrile)dichloropalladium(II)、ammonium tetrachloropalladate(II)、ammonium hexachloropalladate(IV)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、bis(di-tert-butyl(4-dimethylaminophenyl)phosphine)dichloropalladium(II)、trans-bis(acetato)bis[o-(di-o-tolylphosphino)benzyl]dipalladium(II)、allyl[1,3-bis(mesityl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、allylpalladium(II) chloride dimer、[1,1'-bis(di-tert-butylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、(2-butenyl)chloropalladium dimer)から選ばれるパラジウム錯体が挙げられる。
ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム(II)(dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II))(化1、分子量285.51)、
ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)(bis(benzonitrile)dichloropalladium(II))(化2、分子量383.57)、
ジアンミンジクロロパラジウム(II)(diamminedichloropalladium(II))(化3、分子量211.39)、
ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム(II)(dichloro(ethylenediamine)palladium(II))(化4、分子量237.41)、
ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジアセテート(bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate)(化5、分子量749.08)。
前記元素又は基としては、ハロゲン元素(Cl、F、Br、I、At)、OH-、NO3 -、CH3COO-、NO2 -、CO3 2-、PO4 3-、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)、SO3 2-、及びN3 -等が挙げられる。
パラジウム錯体は、二量体等の多量体であってもよい。
また、EMA等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除けば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
また、薬剤処理した試料は、下記工程b)の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい(特許第4825313号、WO2011/010740参照)。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらにマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、T4ジーン32プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
さらに、BSA、T4ジーン32プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤(proteinase inhibitor)はタンパク質分解酵素(proteinase)に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、BSA又はタンパク質分解酵素阻害剤(大豆トリプシンインヒビターやα2-マクログリブリン)の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている(前記Abu Al-Soudら)。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される(前記Abu Al-Soudら)。
核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば400塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び損傷菌との識別が可能である。
核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程b)で採用する核酸増幅法に応じて、工程b)に続いて行われるか、又は、工程b)と同時に行われる。例えば、リアルタイムPCRの場合は、工程c)は工程b)と同時に行われ得る。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にPCR法を用いた場合は、リアルタイムPCR法(Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036)を利用することが可能である。
リアルタイムPCR法を採用する場合、一般に増幅サイクル数1〜10までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差SDを算出し、そのSD値に10を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るPCRサイクル数をサイクルスレッショールド値(Ct値)という。従って、PCR反応溶液に初期のDNA鋳型量が多い程、Ct値は小さな値となり、鋳型DNA量が少ない程、Ct値は大きな値となる。また、鋳型DNA量が同じでも、その鋳型内のPCRのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のPCR反応のCt値は大きな値となる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、パラジウム錯体を含む。
本発明のキットは、前記本発明の方法を実施するために用いることができる。
また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、N−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
尚、以下の実施例において、特記しない限り、各操作は非遮光下で行った。
クロノバクター・サカザキを対象として、各パラジウム錯体を用いて細菌の生細胞と死細胞との識別を明瞭とするための条件の検討を行った。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544をBHIブロスを用いて、37℃、16時間培養した。
前記培養液1 mlを冷却遠心処理(4℃、3,000×G、10分間)し、上清除去後、ペレットに1 mlの滅菌水を添加し、更にその一部を滅菌水にて100倍希釈して、生細胞けん濁液(4.7×106〜1.0×107 CFU/ml)を調製した。
dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 3.11 mg (10.89μmol)を218μlのDMSO (D8418-50ML, Sigma)に溶解し 、50 mM溶液を調製した。また、bis(benzonitrile)dichloropalladium (II) 4.34 mg (11.31μmol)を226μlのDMSO (Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。これらの50 mMの各パラジウム錯体溶液を、生理食塩水にて希釈し、25μM、250μM、500μM、1mM、5mM、10mM、25mMの各錯体溶液を調製した。
細胞からの核酸の抽出を行わずにPCR増幅を効率よく行うために、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液(この濃縮液を、濃縮ダイレクトコンポーネント、cDBCと記載する。)を調製した。
具体的には、ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma A7906)、クエン酸三ナトリウム2水和物(TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京)、塩化マグネシウム6水和物(31404-15 ナカライテスク、京都)、卵白リゾチーム(126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪)、Brij58(P5884-100G; Sigma)の各ストック溶液を、表1に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。
PCR増幅には、Primer 16S forward: C. sakazakii検出用16Sフォワードプライマー(5'-TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTG-3':配列番号1)、Primer 16S reverse: C. sakazakii検出用リバースプライマー(5'-CGGGTAACGTCAATTGCTGCGGT-3':配列番号2)をPCR増幅用プライマーとして使用した。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は426 bpであった。16S TaqMan probeとしては、配列番号3(5'-CCGCATAACGTCTACGGACCAAA-3')の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。尚、各プライマー及び16S TaqMan probeの塩基配列情報は、Kang, Eun Sil et al., J. Microbiol. Biotechnol. 17:516-519, 2007から入手した。上記プライマーを用いて、前記PCR増幅用試料を鋳型として、PCR増幅を行った。リアルタイムPCR増幅は2回実施した。
3)95℃, 20秒(1サイクル)
4)95℃, 5秒; 55℃, 10秒; 72℃, 30秒(40サイクル)
リアルタイムPCRの結果を表3及び4に示す。
表3及び4に示されるように、dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 25μMでは、生細胞のCt値が未処理のそれと比較して殆ど上がっておらず、かつ、死細胞のPCR増幅は完全に抑制された。同様に、bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)、及び、diamminedichloropalladium (II) 10μMでは、生細胞のCt値が未処理と比較して殆ど上がっていないか、あるいは、僅かに上がっている程度であり、かつ、死細胞のPCR増幅は完全に抑制された。したがって、パラジウム錯体により、クロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞を区別することができることが明らかとなった。本方法は、光照射を必要としない。また、ターゲット領域が短くても(426 bp)、生細胞と死細胞の区別が可能であった。
本実施例2では、パラジウム錯体としてDichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞・死細胞の識別を行った。
1−1)実施例1と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液(1.5×109 CFU/ml)及び損傷細胞/死細胞けん濁液(1.5×109 cells/ml。以下、包括して「死細胞けん濁液」と表記する。)を調製した。
Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 6.28mg (22.0μmol)を正確に秤量し、440μlのDMSO (Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液(パラジウム錯体溶液)を調製した。
冷却遠心処理(15,000×G、10分、4℃)して上清を除去し、1000μlの70%冷エタノールでマイクロチューブ内を洗浄後、同様に冷却遠心処理した。上清を除去後、エタノールを真空乾燥(5分)にて除去し、沈澱物に20μlのTEバッファーを加え、37℃にて1時間静置した。その後、試料を穏やかに攪拌後、その5μlをPCR増幅用試料とした。
実施例1と同様にして、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表5に示す。
一方、細胞をパラジウム錯体で処理後、ガラスビーズで細胞を破砕した後、プロテイナーゼK処理して細胞内のタンパク質(DNA結合性タンパク質であるヒストン様プロテインも含む)を分解し、その後、フェノール/クロロホルム抽出・エタノール沈澱により、それらのタンパクを除去して抽出精製されたDNAを用いてリアルタイムPCR増幅を実施した場合は、パラジウム錯体の濃度、及びSDS存在の有無に関わらず、生細胞及び死細胞のCt値は、いずれも無処理と比較して有意な差異は観測されず、ほぼ一定の値であった。
表5に示されるように、パラジウム錯体処理後の細胞のペレットからDNAを抽出せずに、直接、リアルタイムPCR増幅を実施した場合は、生細胞と死細胞の区別が可能であったが、細胞を破砕後プロテアーゼK処理した場合は、生細胞と死細胞を識別できなかった。
前述のとおり、パラジウム錯体を微生物細胞に作用させた場合、ほとんどのパラジウム錯体はDNA結合性タンパク質に共有結合する可能性が高いことを示されたが、この可能性についてさらに検討を行った。
具体的には、死細胞にパラジウム錯体を作用させた後、ガラスビーズで細胞を破砕し、その後、プロテアーゼK処理せずにDNAを抽出した場合、パラジウム錯体結合・HUプロテインが死細胞染色体(DNA)に強固に結合した状態を維持しているかどうかを検討した。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544を用いて、実施例2と同様にして、生理食塩水を用いて1 mlの生細胞けん濁液(6.7×108 CFU/ml)及び損傷細胞/死細胞けん濁液(以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 6.7×108 cells/ml)を調製した。
Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II) 4.24mg (14.85μmol)を正確に秤量し、297μlのDMSO (Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液(パラジウム錯体溶液)を調製した。
その後、滅菌水1 mlを加え、冷却遠心処理(4℃、3,000×G、5分)し、上清を除去し、そのペレットに細胞破砕用ガラスビーズ(10個)を入れ、30秒ボルテックスミキサーにより激しく攪拌し、細菌細胞を破砕した。その後、TEバッファーを200μl加え、緩やかに攪拌後、冷却遠心処理(3,000×G、5分、4℃)し、上清(およそ200μl相当)を新しい1.5 mlマイクロチューブに移した。
実施例2と同様にして、上記の各PCR増幅用試料を用いてリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表6に示す。
さらに、エタノール沈殿の前にフェノール/クロロホルム抽出を行った場合でも、パラジウム錯体25μMで明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
本実施例3(表6)と前述実施例2(表5)の大きな違いは、ガラスビーズで細胞を破砕した後のプロテアーゼK処理の有無である。本実施例3では、プロテアーゼK処理を行っていない。
すなわち、プロテアーゼK処理を行った実施例2では、精製した死細胞DNAを用いたリアルタイムPCR増幅では生細胞と死細胞を識別できなかったのに対して、プロテアーゼK処理を行っていない本実施例3では生細胞と死細胞の識別が可能であった。
パラジウム錯体として、Dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium (II)に代えて、Dichloro(ethylenediamine)palladium (II)を用いて、C. sakazakii死細胞に対する作用を検討した。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544を用いて、実施例1と同様にして、滅菌水にて1 mlの生細胞けん濁液(6.1×108 CFU/ml)及び損傷細胞/死細胞けん濁液(以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 6.1×108 cells/ml)を調製した 。
上記のクロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水にて10倍希釈し(6.1×107 CFU/ml、又はcells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。
Dichloro(ethylenediamine)palladium (II) 3.60 mg (15.16μmol)を正確に秤量し、303μlのDMSO (Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1 mM溶液(パラジウム錯体溶液)を調製した。
前記の実施例と同様にして、各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表7に示す。
3.考察
本実施例5では、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)について、パラジウム錯体による生細胞と死細胞との識別が可能であるかどうかを検討した。
1−1)Staphylococcus aureus(スタフィロコッカス・アウレウス)ATCC 6538P株を用いて、実施例1と同様にして、滅菌水にて1 ml生細胞けん濁液(2.1×107 CFU/ml)及び死細胞けん濁液(2.1×107 cells/ml)を調製した。
上記スタフィロコッカス・アウレウスの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ50μlを、下記試験に供した。
diamminedichloropalladium(II) 1.70 mgを秤量し、804μl DMSO (Sigma)に溶解し10 mM溶液を調製した。その10 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、及び100μMの各溶液を調製した。
前記実施例と同様にして、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表8に示す。
上記のとおり、パラジウム錯体を用いることにより、S. aureusでも生細胞と死細胞の明瞭な識別が可能となることが明らかとなった。以上の実施例により、パラジウム錯体により、グラム陰性細菌、及び形態学的にグラム陰性細菌の外膜と同一組成をエンベロープとして含むインフルエンザウイルス等のウイルスのみならず、外膜を有さず形態学的にグラム陰性細菌やインフルエンザウイルスと異なるグラム陽性細菌においても、生細胞と死細胞の明瞭な識別も可能であることが判明した。したがって、パラジウム錯体は、微生物全般の生細胞と死細胞の識別が可能と考えられる。
本実施例6では、共有結合による巨大分子として定義されている塩化パラジウム(II)(PdCl2 (II))をDMSOに溶解して得られるパラジウム錯体を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞の識別に関する検討を行った。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544を、BHIブロスを用いて、37℃、16時間培養を行った。
前記培養液1 mlを冷却遠心処理(4℃、3,000×G、10分間)し、上清除去後、ペレットに1 mlの滅菌水を添加し、更に滅菌水にて100倍希釈して、生細胞けん濁液(9.4×106 CFU/ml)を調製した。また、上記生細胞けん濁液1 mlを、1.5 mlのマイクロチューブ(Eppendorf, Hamburg, Germany)に分取し、沸騰水に3分間浸漬処理し、その後、急冷した。沸騰水に浸漬処理した各けん濁液は、標準寒天培地(Eiken, Tokyo, Japan)によりコロニーを形成しないことを確認し、損傷細胞/死細胞けん濁液(以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記; 9.4×106 cells/ml)を得た。
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ50μlを、下記試験に供した。
塩化パラジウム(II)4.9 mg (27.63μmol)を、1104μl DMSO (Sigma)に溶解し 25 mM溶液を調製した。その25 mMの各塩化パラジウム(II)溶液を生理食塩水にて100μM、1mM、及び10mMの各溶液を準備した。
上記塩化パラジウム(II)溶液10μlをクロノバクター・サカザキ生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理(4℃、3,000×G、5分)し、上清を除去し、そのペレットを150μlの滅菌水にけん濁させ、よく攪拌した後、同様の冷却遠心処理を行い、上清を除去した。得られたペレット(5μl相当)をPCR増幅用試料とした。
前記の実施例と同様にして、各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を実施した。
リアルタイムPCRの結果を表9に示す。
表9に示されるように、塩化パラジウム(II)20μM にてクロノバクター・サカザキの生細胞のリアルタイムPCRのCt値は未処理に比較して7.2上昇した程度に留まったのに対して、死細胞処理群では未処理と比較して15.7程度上昇し、更に30μMで、クロノバクター・サカザキの生細胞のリアルタイムPCRのCt値は未処理に比較して10.2上昇した程度に留まったのに対し、死細胞ではターゲット遺伝子の増幅が完全に抑制され、生細胞と死細胞の生死判定の可能性が示唆された。
従って、生細胞と死細胞を明瞭に識別するパラジウム錯体には、本実施例6にて開示されたような、他の元素もしくは基との共有結合により巨大分子として定義されているパラジウム化合物を有機溶媒に溶解して得られるパラジウム錯体も含まれると考えられる。
本実施例7では、ハードなルイス塩基であるカルボキシレート基を配位子とするパラジウム錯体bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate、及び、palladium(II)acetateをDMSOに溶解して生成させたパラジウム錯体を用いて、生細胞・死細胞の識別を行った。
1−1)滅菌水を用いてE. coli JCM1649株を用いて、滅菌水にて生細胞けん濁液(2.2 × 107 CFU/ml)及び死細胞けん濁液(2.2 × 107 cells/ml;沸騰水2分浸漬)を調製し、それぞれ90 μlを下記試験に供した。JCM1649株は、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室(〒305-0074 茨城県つくば市高野台3−1−1)から入手することができる。
bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate (II)(Sigma)3.11 mg(14.15 μmol)を正確に秤量し、415.2 μlのジメチルスルフォキシド(DMSO、Sigma)に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、500 μM、1000 μM溶液を準備した。
同様に、palladium(II)acetate(Palladium(II)Acetate Recrystallized、Aldrich)4.02 mg(17.9 μmol)を正確に秤量し、1790.0 μlのDMSOに溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して10 μM、20 μM、250 μM、及び500 μM溶液を準備した。
下記表10に示す組成にてダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを調製した。具体的には、Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)をリアルタイムPCRバッファーとして用い、Taqポリメラーゼを通常使用の4倍量加え、同バッファーにcDBC(10 × DBC)を所定量添加した。ダイレクト・リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。
尚、配列番号4及び5のプライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、配列番号6のENA-16S TaqMan probeの塩基配列は、各腸内細菌科菌群の16S rRNA遺伝子情報はthe GenBank database(http://www.ebi.ac.uk/genbank/)より腸内細菌科菌群内で相補的領域を選択した。
1) 95℃, 20秒(1サイクル)
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分(40サイクル)
尚、陰性コントロール(Negative Control)として、滅菌水5μlを鋳型として使用した。リアルタイムPCRは2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表11に示す。
表11によれば、bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetateをE. coliの生細胞及び死細胞に作用させた時、死細胞のターゲット遺伝子増幅は50 μM以上で完全に抑制されていた。生細胞の場合、本薬剤の濃度依存的にCt値が上昇する傾向が観測されたが、50 μMの濃度にて明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
また、palladium(II)acetateのDMSO溶液は、1 μMの濃度にて死細胞由来のターゲット遺伝子増幅が完全に抑制され、生細胞に関しては、2 μMまでの濃度であれば無処理と比較してもCt値が若干上昇する程度で抑制されており、明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
以上により、途中経過を問わず最終的に生成したパラジウム錯体は、配位子がハードなルイス塩基、中間のルイス塩基、ソフトなルイス塩基何れであっても、良好な生細胞と損傷細胞・死細胞の識別が可能である。
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)を用いた牛乳中のE. coliの生細胞・死細胞の識別
また、パラジウム錯体はタンパク質(又は、システイン残基など硫黄を含むアミノ酸、もしくは、他のアミノ酸)を配位子とすることも既に示唆されているので、乳中の各種カゼイン、ホエイタンパク質にも、パラジウム錯体は一部配位する可能性もある(Lippardら(生物無機化学 Lippard, S.J. and Berg, J.M.著;松本和子監修 21-23頁“生物無機化学の研究における配位化学の原理))。
そこで、殺菌した牛乳に含まれる生細胞と死細胞が、パラジウム錯体を用いて識別可能かどうかを試験した。
1−1)生理食塩水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液(8.2 × 108 CFU/ml)及び死細胞けん濁液(8.2 × 108 cells/ml)(生細胞けん濁液を沸騰水にて3分ボイル後急冷)を調製し、更にそれらを生理食塩水にて10倍希釈し、生細胞けん濁液及び死細胞けん濁液を調製した。
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) (Sigma)3.01 mg(10.54 μmol)、及び、Diamminedichloropalladium (II)(Wako)2.48 mg(11.73 μmol)を正確に秤量し、前者は211 μl、後者は1173 μlのDMSOに溶解して、各々50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して、さらに100 μM、500 μM、1 mM、5 mM、10 mM溶液を準備した。
尚、試験に用いた市販の牛乳(殺菌ミルク)は、E. coli生細胞は検出限界以下(<1 CFU/2.22 ml)であることを培養法により確認した。
また、この殺菌ミルクに既知濃度のE. coli死細胞を接種し、薬剤処理をせずに後述のミルクから細菌を回収する工程のみを行い、その後、前述の実施例7と同様のダイレクト・リアルタイムPCRを行うことにより、検出されるE. coli死細胞が最大でも103 cells/mlであることを予備検討にて確認したものを試験材料として使用した。
従って、E. coli死細胞を1.6 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクとなる濃度にて接種した死細胞接種殺菌ミルクは、元来含まれているE. coli死細胞は無視できるレベルである。
尚、殺菌ミルクにおいて、比較的高濃度にて混在することが想定されるE. coliを始めとする大腸菌群(サルモネラを含めると腸内細菌科菌群)死細胞は、1.6 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクのレベルが充分想定されるので、本方法において、その死細胞由来のPCRは完全に抑制される必要がある。
回収した各乳ペレット(a)にPBS10 mlを加えよく攪拌し、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)後、デカンテーションにより上清を除去して各ペレット(b)を回収した。回収した各ペレット(b) に990 μl滅菌水を添加してけん濁した。この各ペレット(b)けん濁液に、前記100 μM、500 μM、1 mM、5 mM、10 mM、又は50 mM Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)溶液を10 μl添加し、37℃の恒温槽にて30分間攪拌(恒温水槽PERSONAL-11; TAITEC恒温槽 60 rpm)しながら保持した。
また、これとは別に、Diamminedichloropalladium (II)溶液を用いて、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)と同様の希釈系列にて試験を実施した。
その後、各々の試料に10 ml PBSを加え、よく攪拌後、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、デカンテーションにより上清を除去して、各ペレット(c)を得た。さらに同様の工程を再び実施した。各ペレット(c) に100 μlの滅菌水を添加してけん濁させ、ABI製100 μl容 PCRチューブに移し、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、ピペットにより上清を除去して各ペレット(d)を回収した。回収した各ペレット(d) (5 μl相当)をPCR増幅用試料とした。
前述の実施例7の表10と同様のダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを用いて、ダイレクト・リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表12に示す。
表12によれば、死細胞接種殺菌ミルクでは、薬剤処理を施さない場合(パラジウム錯体未添加)のCt値が 30.9であったのに対し、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)で処理した場合は10〜500 μMにて、Diamminedichloropalladium (II)で処理した場合は50〜500 μMにて、PCR増幅は見られなかった。
一方、生細胞接種殺菌ミルクの場合は、Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II)では0〜100 μMにて、またDiamminedichloropalladium (II)では0〜50 μMにて、PCR増幅が観測され、パラジウム錯体未添加の場合のCt値と比較しても殆ど差がなかった。
すなわち、2種類のパラジウム錯体を用いて、殺菌ミルク中における生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。
本実施例9では、殺菌ミルク中のE. coli生菌の特異的識別の検出限界を調べた。
1−1)生理食塩水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液(1.5 × 109 CFU/ml)を調製し、更に生理食塩水にて10、100、1000、及び104倍希釈し、生細胞けん濁液を調製した。
Dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) (Sigma)3.01 mg(10.54 μmol)を正確に秤量し、211 μlのDMSOに溶解して50 mM溶液を調製した。これを生理食塩水にて希釈し、5 mM溶液を調製した。
尚、試験に用いた市販の牛乳(殺菌ミルク)は、E. coli生細胞は検出限界以下(<1 CFU/2.22 ml)であることを培養法により確認した。
また、この殺菌ミルクに既知濃度のE. coli死細胞を接種し、薬剤処理をせずに後述のミルクから細菌を回収する工程のみを行い、その後、前述の実施例7と同様のダイレクト・リアルタイムPCRを行うことにより、検出されるE. coli死細胞が最大でも103 cells/mlであることを予備検討にて確認したものを試験材料として使用した。
その後、PBSを10 ml加えて、よく攪拌した後、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、デカンテーションにより上清を除去してペレット(c)を得た。さらに同様の工程を再び実施した。ペレット(c)を100 μlの滅菌水にけん濁させ、ABI製100 μl容 PCRチューブに移し、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、ピペットにより上清を除去してペレット(d)を回収した。回収したペレット(d)(5 μl相当)をPCR増幅用試料とした。
前述の実施例7の表10と同様のダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを用いて、PCR増幅(40 cycles)を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表13に示す。
表13によれば、dichloro(η-cycloocta-1,5,-diene)palladium (II) 50 μMにて、殺菌ミルク中のE. coli生細胞(1.5 × 104 CFU/12 mlミルク=1.3 × 103 CFU/ml)からのターゲット遺伝子増幅を確認した。
Claims (30)
- 被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)前記被検試料にパラジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。 - 前記パラジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-(ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す)、NO2 -、Ar-NH2、Ar-CN(Arは不飽和有機基)、N2、SO3 2-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3 -から選ばれる配位子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNからなる群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
- 前記パラジウム錯体が、ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム (II)、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム (II)、及び、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジアセテートからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 前記パラジウム錯体が、パラジウム化合物を、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するパラジウム錯体である、請求項1に記載の方法。
- 前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム(II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれる、請求項5に記載の方法。
- 前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム又は酢酸パラジウムであって、塩化パラジウムが塩化パラジウム(II)であり、酢酸パラジウムが酢酸パラジウム(II)である、請求項6に記載の方法。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項13に記載の方法。
- 前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌、又はウイルスである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌、又はグラム陽性細菌である、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸増幅法が、PCR法、RT−PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR法がリアルタイムPCR法により行われ、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット:
1)パラジウム錯体、又は、
配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときにパラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。 - 前記パラジウム錯体が、NH3、NH2、ハロゲン元素(Cl、F、Br、I、At)、カルボキシレート基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-(ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す)、NO2 -、Ar-NH2(Arは不飽和有機基)、N2、SO3 2-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3 -から選ばれる配位子を含む、請求項21に記載のキット。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNからなる群から選ばれる、請求項22に記載のキット。
- 前記パラジウム錯体が、ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム (II)、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム (II)、及び、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム (II) ジアセテートからなる群から選ばれる、請求項21に記載のキット。
- 前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム (II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれる、請求項21に記載のキット。
- 前記パラジウム化合物が、塩化パラジウム又は酢酸パラジウムであって、塩化パラジウムが塩化パラジウム(II)であり、酢酸パラジウムが酢酸パラジウム(II)である、請求項25に記載のキット。
- さらに、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒を含む、請求項21、25又は26に記載のキット。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項27に記載のキット。
- さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項21〜28のいずれか一項に記載のキット。
- さらに界面活性剤を含む、請求項21〜29のいずれか一項に記載のキット。
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