JP6035257B2 - 微生物検出法及び微生物検出キット - Google Patents
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Landscapes
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Description
ース阻害剤とを併用すること(特許文献2)により、100bp程度のターゲット領域であっても、生菌と死菌又は損傷菌との区別が可能なことが知られている。しかしながら、これらの方法は、工程または薬剤調製が煩雑である。
a)前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程、
を提供する。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記微生物が、細菌又はウイルスであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、PCR法、LAMP法、ICAN法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記PCR法が、リアルタイムPCR法により行われ、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。
1)イリジウム錯体、又は、
配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。
また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素(Cl、F、Br、I、At)、カルボキシレート(-CO-O-)基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれることを好ましい
形態としている。
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
a)前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、N−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
バクテリウム属;ストレプトバシラス属;赤痢菌等のシゲラ属、エルシニア属、エシェリヒア・コリなどエシェリヒア属、クレブシェラ属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、プレジオモナス属、プロテウス属、プロビデンシア属、モルガネラ属、セラチア属等の腸内細菌科;ビブリオ属;エロモナス属;バクテロイデス属;プレボテラ属;ポルフィロオナス属;フソバクテリウム属;レプトトリキア属;ベイヨネラ属;ブラキスピラ属;レプトスピラ属;トレポネーマ属;ブタ赤痢スピロヘータ;ボレリア属;マイコプラズマ;リケッチア;クラミジア等が挙げられる。
さらに、グラム陰性細菌の細胞壁外膜と同成分の最外殻エンベロープを有するウイルスについても、生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。また、エンベロープを有しない所謂ヌクレオカプシド(タンパク質膜)のみ保有するウイルスは、外膜を有さず、直接ペプチドグリカン層が外界と接触するグラム陽性細菌に比較的類似しているため、イリジウム錯体による生細胞と死細胞の識別が可能であると考えられる。尚、後述するように、本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。
PMAは元来、細菌の生細胞と死細胞の明瞭な識別を可能とする薬剤であるが(A. Nocker
et al., J. Microbiol. Methods. 67, 310-320, 2006)、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスでも明瞭な前記識別を可能としているので、イリジウム錯体も、PMAと同様に、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスにおいて(エンベロープを有するウイルスはグラム陰性細菌に形態学的に酷似しているため勿論含まれる)、明瞭に感染型・非感染型を判定できる可能性が高い。
胞」とは、哺乳動物細胞に感染できない状態をいう。
本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で、好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml又はCFU/ml(colony forming units / ml))で近似させることができる。
また、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光(波長600nm)の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml)で近似させることができる。
被検試料に、イリジウム錯体(以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。)を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
前記薬剤は、核酸(DNA又はRNA)に直接的に、又はタンパク質等を介して間接的に結合もしくは干渉して、ターゲット領域のPCR反応を阻害すると推定される。
ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)](Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]) C16H24Cl2Ir2
2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリド(2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride) C15H20Cl2IrNO
(アセチルアセトナト)ジカルボニルイリジウム(I)(Acetylacetonato)dicarbonyliridium(I)) C7H7IrO4
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
クロロビス(シクロオクテン)イリジウム(I)ダイマー(Chlorobis(cyclooctene)iridium(I)dimer) C32H56Cl2Ir2
クロロジヒドリド[ビス(2-ジイソプロピルホスフィノ)エチルアミン]イリジウム(III)(Chlorodihydrido[bis(2-diisopropylphosphino)ethylamine]iridium(III)) C16H39ClIrNP
2
クロロ(5-メトキシ-2-[1-[(4-メトキシフェニル)イミノ-N]エチル]フェニルl-C)(1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)(Chloro(5-methoxy-2-[1-[(4-methoxyphenyl)imino-N]ethyl]phenyl-C)(1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)) C26H31ClIrNO2
ジクロロテトラキス(2-(2-ピリジニル)フェニル)ジイリジウム(III)(Dichlorotetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)) C44H32Cl2Ir2N4
ジヨード(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ダイマー(Diiodo(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III) dimer) C20H30I4Ir2
イリジウム(III)ブロミド水和物(Iridium(III) bromide hydrate) Br3Ir・xH2O
イリジウム(IV)クロリド水和物(Iridium(IV) chloride hydrate) Cl4Ir・xH2O
ペンタアンミンクロロイリジウム(III)クロリド(Pentaamminechloroiridium(III) chloride) H15Cl3IrN5
テトライリジウムドデシルカルボニル(Tetrairidium dodecacarbonyl) C12Ir4O12
イリジウム(III)アセチルアセトナート(Iridium(III)acetylacetonate) C15H21IrO6
(1,5-シクロオクタジエン)-η5-インデニル)イリジウム(I)((1,5-cyclooctadiene)-η5-indenyl)iridium(I)) C17H18Ir
(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート((1,5-cyclooctadiene)bis(methyldiphenylphosphine)iridium(I)hexafluorophospate) C34H38F6IrP3
(1,5-シクロオクタジエン)(ピリジン)(トリシクロヘキシルホスフィン)-イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート((1,5-cyclooctadiene)(pyridine)(tricyclohexylphosphine)-iridium(I)hexafluorophosphate) C31H50F6IrNP2
(1,5-シクロオクタジエン)(ヘキサフルオロアセチルアセトナト)イリジウム(I)((1,5-cyclooctadiene)(hexafluoroacetylacetonato)iridium) C13H13F6IrO2
(1,5-シクロオクタジエン)(メトキシ)イリジウム(I)ダイマー((1,5-cyclooctadiene)(methoxy)iridium(I)dimer) C18H30Ir2O2
ビス(シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラキス(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)ボラート(bis(cyclooctadiene)iridium(I)tetrakis (3,5-bis(tryfluoromethyl)phenyl)borate) C48H36BF24Ir
ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラフルオロボラート(bis(1,5-cyclooctadiene)iridium(I)tetrafluoroborate) C16H24BF4Ir
ビス[1,2-ビス(ジフェニスホスフィノ)エタン]カルボニルクロロイリジウム(I)(bis[1,2-bis(diphenylphosphino)ethane]carbonylchloroiridium(I)) C53H48ClIrOP4
ペンタメチルシクロペンタジエニルイリジウム(III)クロリドダイマー(pentamethylcyclopentadienyliridium(III)chloride dimer) C20H30Cl4Ir2
クロロトリカルボニルイリジウム(Chlorotricarbonyliridium(I)) C3ClIrO3
カルボニルクロロビス(トリフェニルホスフィン)イリジウム(I)(Carbonylchlorobis(triphenylphosphine)iridium(I))C37H30ClIrOP2
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)](別名:ビス(1,5-シクロオクタジエン)ジイリジウム(I)ジクロリド(bis(1,5-cyclooctadiene)diiridium(I)dichloride))(化1、分子量(M.W.)又は式量(F.W.):671.70)
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride(化2、分子量(M.W.)又は式量(F.W.):493.45)
前記元素又は基としては、ハロゲン元素(Cl、F、Br、I、At)、OH-、NO3 -、CH3COO-、PO4 3-、RO-、CO3 2-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、RS-、CN-、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、H-、R-(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)等が挙げられる。
ン(diferrocenyl-phosphine)溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のようなイリジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、イリジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、イリジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するイリジウム錯体も、本発明に使用することができる。
イリジウム錯体は、二量体(1錯体に2個のイリジウム元素を有するダイマー)等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]が挙げられる。
09 132 583 A2, 1997; Lippert B., Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of Leading Anti-cancer Drugs, 1st Ed., John Wiley and sons, ltd., 1999に記載の方法に準拠して合成することもできる。
さらに、検出対象の微生物の生細胞、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
他のイリジウム錯体についても、これらのイリジウム錯体に準じて条件を設定することができる。また、細胞数が既知の試料を用いて、細胞を種々の条件でイリジウム錯体で処理して、試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅し、増幅産物を解析することによって、好適な条件を選択することができる。
また、EMA等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除け
ば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
その結果、薬剤は、体細胞の死細胞及び微生物の死細胞並びに損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、染色体DNA、又はRNAに直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、その結果、薬剤が結合したDNA、又はRNAは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなると推定される。
また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
また、薬剤処理した試料は、下記工程b)の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい(特許第4825313号、WO2011/010740参照)。
ン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤に追加して、界面活性剤、マグネシウム塩、又は有機酸塩又はリン酸塩を添加する場合は、これらのうち、いずれか一種を、又は任意の二種以上を組合わせて使用することができ、これらの全てを添加することが特に好ましい。
前記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、界面活性剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に添加してもよい。必要に応じ、核酸伸長酵素も通常のPCR法で使用している濃度の2倍〜10倍の濃度で添加してもよい。
特に、アルブミン、デキストラン、T4ジーン32プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
さらに、BSA、T4ジーン32プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤(proteinase inhibitor)はタンパク質分解酵素(proteinase)に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、BSA又はタンパク質分解酵素阻害剤(大豆トリプシンインヒビターやα2-マクログリブリン)の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている(前記Abu Al-Soudら)。
察される。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される(前記Abu Al-Soudら)。
TritonとしてはTriton X-100(ポリエチレングリコール tert−オクチルフェニルエーテル)等が,NonidetとしてはNonidet P-40(オクチルフェニル−ポリエチレングリコール)等が、TweenとしてはTween 20(ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート)、Tween 40(ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミタート)、Tween 60(ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート)、Tween 80(ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート)等が、BrijとしてはBrij56(ポリオキシエチレン(10) セチルエーテル)、Brij58(ポリオキシエチレン(20) セチルエーテル)等が挙げられる。
具体的には、SDSの場合は、例えば、通常0.0005〜0.01%、好ましくは0.001〜0.01%、より好ましくは0.001〜0.005%、より好ましくは0.001〜0.002%である。
具体的には、Nonidet P-40の場合は、通常、0.001〜1.5%の範囲であれば良く
、好ましくは0.002〜1.2%、より好ましくは0.9〜1.1%である。
Tween 20、Tween 40、Tween 60、又はTween 80の場合は、通常、0.001〜1.5%の範囲であれば良く、好ましくは0.002〜1.2%、より好ましくは0.9〜1.1%である。
Brij56又はBrij58の場合は、通常0.1〜1.5%の範囲であれば良く、好ましくは0.4〜1.2%、より好ましくは0.7〜1.1%である。
核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
Laboratory Press, 2001に記載されている。
Displacement Amplification:Edward L. Chan, et al.,Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000)、LCR法(Ligase Chain Reaction:Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991)、TMA法(Transcription-Mediated-Amplifi
cation:Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855 (2001))、TRC法(Transcription-Reverse Transcription-Concerted method:Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4284-4292 (2004))、HC法(Hybrid Capture:Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p.76-81, 2008)、SMAP法(Smart Amplification Process、Smart Amp法;Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007))、マイクロアレイ法(Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008)等がそれぞれ例示される。
は、通常50〜5000塩基、又は50〜3000塩基が挙げられる。
本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば400塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び/又は損傷細胞との識別が可能である。
核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程b)で採用する核酸増幅法に応じて、工程b)に続いて行われるか、又は、工程b)と同時に行われる。例えば、リアルタイムPCRの場合は、工程c)は工程b)と同時に行われ得る。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。
リアルタイムPCR法を採用する場合、一般に増幅サイクル数1〜10までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差SDを算出し、そのSD値に10を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るPCRサイクル数をサイクルスレッショールド値(Ct値)という。従って、PCR反応溶液に初期のDNA鋳型量が多い程、Ct値は小さな値となり、鋳型DNA量が少ない程、Ct値は大きな値となる。また、鋳型DNA量が同じでも、その鋳型内のPCRのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のPCR反応のCt値は大きな値となる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とDNA量又はRNA量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたDNA又はRNAを標準試料として用いることもできる。
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び/又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、イリジウム錯体を含む。
また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、N−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
本実施例では、イリジウム錯体を用いたE. coliの生細胞及び死細胞の識別を行った。イリジウム錯体としては、イリジウム錯体二量体(1錯体に2個のイリジウム元素を有するダイマー)であるDi-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]を用いた。
1−1)滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液(1.2 × 107 cfu/ml)を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、損傷細胞/死細胞けん濁液(1.2×107 cells/ml。以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞と表記する)を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)](Wako)3.92 mg(5.84 μmol)を精確に秤量し、116.7 μlのジメチルスルフォキシド(DMSO、D8418-50ML, Sigma)に溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100μM、250μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
前記の各イリジウム錯体溶液10μlを、上記生細胞けん濁液90μl又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理(4℃、15,000×G、5分)し、上清を除去した。沈殿物(ペレット)を1mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット(細胞けん濁液5μlに相当)をPCR増幅用試料とした。
細胞からの核酸の抽出を行わずにPCRを効率よく行うために必要な核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液(この溶液を、濃縮ダイレクトコンポーネント、cDBCと記載する)を調製した。
具体的には、ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma A7906)、クエン酸三ナトリウム2水和
物(TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京)、塩化マグネシウム6水和物(31404-15 ナカライテスク、京都)、卵白リゾチーム(126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪)、Brij58(P5884-100G; Sigma)の各ストック溶液を、表1に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。
例えば、PCR 200検体用として16.6% Brij58、4.8% BSA、333 mM TSC、1 M MgCl2、2.5 mg/ml lysozymeの各ストック溶液を、それぞれ250μl、200μl、15μl、15μl、20μlの容量にて混和すれば、表1に示す500μlのcDBC(10×DBC)を調製することができる。尚、後述するTaq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)を用いて、メーカーマニュアルに従ってリアルタイムPCRマスターミックス(qPCR)を調製すると、終濃度として2 mM相当のMgCl2が含まれていると推察されるため、合計のMgCl2は5 mM相当と推測された。
先に調製したPCR増幅用試料にダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを添加して、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。尚、以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。
1) 95℃, 20秒(1サイクル)
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分(40サイクル)
尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表3に示す。表3中、「No Agent」は陰性コントロールを示す。
のPCRを完全に抑制した薬剤濃度では、未処理生細胞のCt値と比較して3.6程度の上昇(増幅の遅れ)に留まり、当該イリジウム錯体100 μMにて明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
実施例1では、イリジウム錯体二量体を用いて、グラム陰性細菌の代表的菌種であるE.
coliの生細胞及び死細胞の明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体二量体により、グラム陽性細菌であるS. aureusの生細胞と死細胞を明瞭に識別できるかを検討した。
1−1)滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液(4.5 × 107 cfu/ml)を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水に3分浸漬し、死細胞懸濁液(4.5 × 107 cells/ml)を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90
μlを下記試験に供した。
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)] 4.45 mg(6.63 μmol)を精確に秤量し、132.5 μlのジメチルスルフォキシドに溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、250 μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理(4℃、15,
000 × G、5分)し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット(細胞けん濁液5 μlに相当)をPCR増幅用試料とした。
下記表4に示される組成にて、ダイレクト・リアルタイムPCR(DqPCR)マスターミックスを調製した。具体的には、SYBRPremix Ex TaqTM PCR Master Mix (2×)(Takara-Bio Co., Ltd, Otsu, Japan)をリアルタイムPCR用バッファーとして用い、PCR増幅用forward primer及びreverse primerとしてBacteria Screening PCR Kit (Takara-Bio)添付Primer Mix BS (5μM each)を使用した。尚、本プライマーミックスはスタフィロコッカス属及びバチラス属を共に検出可能とするプライマーであり、増幅遺伝子長は約380 bpである。リアルタイムPCRは2回実施した。
1) 95℃, 1分(1サイクル)
2) 95℃, 10秒; 59℃, 30秒; 72℃, 30秒(40サイクル)
尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表5に示す。
実施例1及び2にて、イリジウム錯体二量体を用いて、E. coli及びS. aureusというグラム陰性細菌、グラム陽性細菌の生細胞及び死細胞の明瞭な識別ができることが示された。本実施例では、イリジウム錯体単量体を用いてE. coliの生細胞と死細胞が識別できるかを検討した。
1−1)滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液(2.1 × 107 cfu/ml)を調製した。この生細胞懸濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液(2.1 × 107 cells/ml)を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride(関東化学(株)、東京)4.22 mg (8.55 μmol)を精確に秤量し、855.3 μlのジメチルスルフォキシド(Sigma)に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理(4℃、15,000 × G、5分)し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット(細胞けん濁液5 μlに相当)をPCR増幅用試料とした。
実施例1と全く同じ条件(すなわち、表2に示すダイレクト・リアルタイムPCRマスターミックス使用)にて、ダイレクト・リアルタイムPCR(DqPCR)を実施した。
リアルタイムPCRの結果を表6に示す。
胞と死細胞の識別が可能であった。
これにより、イリジウム錯体は二量体のみならず単量体においてもE. coliの明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。
実施例3においては、イリジウム錯体単量体によりE. coliの生細胞と死細胞の明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体単量体によりS. aureusの生細胞と死細胞を明瞭に識別できるかを検討した。
1−1)滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液(6.6 × 107 cfu/ml)を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液を調製したこれらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride(関東化学(株)、東京) 3.89 mg (7.88 μmol)を精確に秤量し、788.1 μlのジメチルスルフォキシド(Sigma)に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理(4℃、15,000 × G、5分)し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット(細胞けん濁液5 μlに相当)をPCR増幅用試料とした。
実施例2と同様にして、リアルタイムPCRを2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表7に示す。
Claims (26)
- 被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び/又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。 - 前記イリジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2-、NO2 -、N2、N3 -、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)からなる群から選ばれる配位子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
- 前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 前記イリジウム錯体が、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体である、請求項1に記載の方法。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項5に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項11に記載の方法。
- 前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌又はウイルスである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌である、請求項14に記載の方法。
- 前記核酸増幅法が、PCR法、LAMP法、ICAN法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR法が、リアルタイムPCR法により行われ、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び/又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット:
1)イリジウム錯体、又は、
配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。 - 前記イリジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2-、NO2 -、N2、N3 -、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)から選ばれる配位子を含む、請求項19に記載のキット。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる、請求項20に記載のキット。
- 前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項19に記載のキット。
- さらに、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒を含む、請求項19に記載のキット。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項23に記載のキット。
- さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載のキット。
- さらに界面活性剤を含む、請求項19〜25のいずれか一項に記載のキット。
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