JP5433821B1 - 微生物検出法及び微生物検出キット - Google Patents
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Abstract
a)前記被検試料に白金錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。
Description
しかしながら、白金錯体が微生物の生死判定に利用できることを示唆する従来技術は知られていない。
a)前記被検試料に白金錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程、
を提供する。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記微生物が、細菌、又はウイルスであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、PCR法、RT−PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記PCR法が、リアルタイムPCR法により行い、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。
1)白金錯体、又は、
配位子として白金に結合し得る有機溶媒、もしくは配位子として白金に結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、白金錯体を生成する白金化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。
前記本発明のキットは、さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含むことを好ましい形態としている。
また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、R3P、及びRNCからなる群から選ばれることを好ましい形態としている。
また、前記方法及びキットは、前記白金化合物が塩化白金(II)、塩化白金(IV)、又は塩化白金酸であることを好ましい形態としている。
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
a)前記被検試料に白金錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、N−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml(colony forming units / ml))で近似させることができる。また、損傷細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液のcfu/mlで近似させることができる。尚、損傷細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、50秒程度で損傷細胞を調製することができる。
さらに、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光(波長600nm)の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数(cfu/ml)で近似させることができる。
ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位(pfu又はPFU(plaque-forming units))で表される。
被検試料に、白金錯体(以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。)を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
後述するように、前記薬剤は、核酸(DNA又はRNA)に直接的に結合して、ターゲット領域のPCR反応を阻害すると推定される。したがって、本発明の薬剤は、核酸に結合する薬剤であり得る。本発明の薬剤とDNA又はRNAとの結合は、配位結合(共有結合)であり得る。
ハロゲン元素としては、Cl(塩素)が好ましい。
このように、白金に限ってソフトなルイス酸であるにも関わらず、中間のルイス塩基である核酸のAやGを配位結合の相手として一番好むので、ハード又はソフトなルイス塩基と白金を予め配位結合させた白金錯体は、細胞中で核酸のAやGに配位結合して安定化されると推定される。したがって、核酸との結合性の観点からは、本発明の薬剤は、ハード又はソフトなルイス塩基と白金が配位結合した化合物が好ましく、ハードなルイス塩基と白金が配位結合した化合物がより好ましい。
中間のルイス塩基(例えばNO2 -、Ar-NH2[Arは芳香環を始めとする不飽和有機基]、N2、SO3 2-、N3 -、又はイミダゾール環など)を配位子として含む白金錯体であっても、本発明に使用できるが、微生物の生死判定の感度又は精度の点からは、ハード又はソフトなルイス塩基と白金が配位結合した白金錯体が好ましい。
シスプラチン(cisplatin、cis-ジアンミン白金(II)ジクロリド、cis-diammineplatinum (II) dichloride、又はcis-dichlorodiammine platinum(II);cis-DDP)、
カルボプラチン(Carboplatin、cis-diammine(1,1-cyclobutanedicarboxylate)platinum)、
cis−ジアンミン(ピリジン)クロロ白金(II)クロリド(cis-diammine (pyridine) chloroplatium(II) chloride; cis-DPCP)、
ジクロロ(エチレンジアミン)白金(II)(dichloro(ethylenediamine)platinum(II))、
トランスプラチン(transplatin、trans-diamminedichloroplatinum(II))、
クロロ(2,2':6',2''-テルピリジン)白金(II)クロリド二水和物(chloro(2,2':6',2''-terpyridine)platinum(II) chloride dihydrate)、
ビス(アセチルアセトナト)白金(II)(bis(acetylacetonato)platinum(II))、
cis−ジクロロビス(ピリジン)白金(II)(cis-dichlorobis(pyridine)platinum(II))、
白金オクタエチルポルフィリン(platinum octaethylporphyrin)、
白金(II)アセチルアセトナト(platinum(II) acetylacetonate)、
テトラキス(トリフェニルホスフィン)白金(0)(tetrakis(triphenylphosphine)platinum(0))、
テトラキス(トリフェニルホスフィン)白金(II)(tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)、
ジクロロ(ジシクロペンタジエニル)白金(II)(dichloro(dicyclopentadienyl)platinum(II))、
[エチルイミノビス(ジフェニルシランジイル)]ビス(トリメチルホスホニオ)白金(IV)([ethyliminobis(diphenylsilanediyl)]bis(trimethylphosphonio)platinum(IV))、
ビス(メチルチオ)ジメチル白金(IV)(bis(methylthio)dimethylplatinum(IV))、
トリメチル(メチルシクロペンタジエニル)白金(IV)(trimethyl(methylcyclopentadienyl)platinum(IV))、
エチレンビス(トリフェニルホスフィン)白金(0)(ethylenebis(triphenylphosphine)platinum(0))、
ビス(トリ-tert-ブチルホスフィン)白金(0)(bis(tri-tert-butylphosphine)platinum(0))、
ジクロロ(1,5-シクロオクタジエン)白金(II)(dichloro(1,5-cyclooctadiene)platinum(II))、
ジクロロ(1,2-ジアミノシクロヘキサン)白金(II)(dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II))、
ジクロロ(1,10-フェナンスロリン)白金(II)(dichloro(1,10-phenanthroline)platinum(II))、
cis−ジクロロビス(トリエチルホスフィン)白金(II)(cis-dichlorobis(triethylphosphine)platinum(II))、
trans−ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)白金(II)(trans-dichlorobis(triphenylphosphine)platinum(II))、
trans−ジクロロビス(トリエチルホスフィン)白金(II)(trans-dichlorobis(triethylphosphine)platinum(II))、
cis−ジクロロビス(ジエチルスルフィド)白金(II)(cis-dichlorobis(diethyl sulfide)platinum(II))、
ジクロロ(2,2':6',2''-テルピリジン)白金(II)二水和物(dichloro(2,2':6',2''-terpyridine)platinum(II) dihydrate)、
(N,N,N'-トリメチルエチレンジアミン)白金(II)クロリド((N,N,N'-trimethylethylenediamine)platinum(II) chloride)、
ジクロロビス(ジメチルスルフィド)白金(II)(dichlorobis(dimethyl sulfide)platinum(II))、
ジクロロビス(エチレンジアミン)白金(II)(dichlorobis(ethylenediamine)platinum(II))、
オキサリプラチン(Oxaliplatin、[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O')platinum(II))、
ネダプラチン(Nedaplatin、glycolato-O,O')diammineplatinum(II)、
ヘキサクロロ白金(IV)酸カリウム、
アンモニウムヘキサクロロ白金酸(IV)(ammonium hexachloroplatinate(IV))、
アンモニウムテトラクロロ白金酸(II)(ammonium tetrachloroplatinate(II))、
ヘキサクロロ白金(IV)酸(hydrogen hexachloroplatinate(IV))、
ヘキサクロロ白金(IV)酸ナトリウム 六水和物、
テトラクロロ白金(II)酸カリウム、
テトラシアノ白金(II)酸カリウム 一水和物、
(2,2'-ビピリジン)ジクロロ白金(II)((2,2'-bipyridine)dichloroplatinum(II))、
(1,5-シクロオクタジエン)ジメチル白金(II)((1,5-cyclooctadiene)dimethylplatinum(II))、
cis-ビス(アセトニトリル)ジクロロ白金(II)(cis-bis(acetonitrile)dichloroplatinum(II))、
((+)-trans-ジクロロ(エチレン)α-メチルフェネチルアミン)白金(II)((+)-trans-dichloro(ethlene)(alpha-methylphenethylamine)platinum(II))、
cis-ビス(ベンゾニトリル)ジクロロ白金(II)(cis-bis(benzonitrile)dichloroplatinum(II))、
硝酸テトラアンミン白金(II)、
塩化白金酸(chloroplatinic acid)、
塩化白金酸 六水和物(chloroplatinic acid hexahydrate)、
二硝酸(エチレンジアミン)ヨウ化白金(II)ダイマー(ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrate)、
K2[Pt(CN)4]・H2O、
cis-ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)白金(II)、
テトラシアノ白金(II)酸セシウム(Cs2[Pt(CN)4])、
テトラシアノ白金(II)酸ナトリウム(Na2[Pt(CN)4])、
テトラシアノ白金(II)酸バリウム(四水和物)(Ba[Pt(CN)4]・4H2O)、
テトラシアノ白金(VI)酸ルビジウム(Rb2[Pt(CN)4])、
シアノ白金(Pt(CN)2)、
ジメチル白金、
水素化白金、
硫化白金。
シスプラチン(化1、分子量300.04)、
カルボプラチン(化2、分子量371.25)、
cis−ジアンミン(ピリジン)クロロ白金(II)クロリド(化3、分子量379.14)、
ジクロロ(エチレンジアミン)白金(II)(化4、分子量326.10)、
cis-ビス(ベンゾニトリル)ジクロロ白金(II)(化5、分子量472.23)、
テトラキス(トリフェニルホスフィン)白金(II)(化6、分子量1244.22)、
塩化白金酸 六水和物(分子量517.90)
二硝酸(エチレンジアミン)ヨウ化白金(II)ダイマー(ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrate)(化7、分子量888.17)。
前記元素又は基としては、ハロゲン元素(Cl、F、Br、I、At)、OH-、NO3 -、CH3COO-、PO4 3-、RO-、CO3 2-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、RS-、CN-、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、H-、R-(ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す)等が挙げられる。前記白金化合物として具体的には、塩化白金、臭化白金、フッ化白金、ヨウ化白金、水酸化白金、硝酸白金、炭酸白金、酢酸白金、ジメトキシ白金、メトキシリン酸白金、リン酸白金、塩化白金酸、ジスルフメチル白金、ジシアノ白金、ジチオシアネート白金、二水素化白金、及びメチル白金等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化白金、臭化白金、フッ化白金、及びヨウ化白金が挙げられ、特に好ましい化合物として塩化白金が挙げられる。塩化白金としては、塩化白金(II)(単量体の分子量265.99)、塩化白金(IV)(単量体の分子量336.89)が挙げられる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ベンゾニトリル(benzonitrile)等が挙げられる。塩化白金をDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス(ジメチルスルホキシド)白金(II)、及び、テトラキス(ジメチルスルホキシド)白金(II)が挙げられる。
白金錯体は、二量体等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、二硝酸(エチレンジアミン)ヨウ化白金(II)ダイマーが挙げられる。
カルボプラチンでは終濃度10〜3000μM、好ましくは250〜3000μM、4〜43℃、5分〜2時間が例示される。オキサリプラチン又はネダプラチンでは終濃度10〜3000μM、4〜43℃、5分〜2時間が例示される。
また、EMA等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除けば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
また、薬剤処理した試料は、下記工程b)の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい(特許第4825313号、WO2011/010740参照)。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらにマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、T4ジーン32プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
さらに、BSA、T4ジーン32プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤(proteinase inhibitor)はタンパク質分解酵素(proteinase)に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、BSA又はタンパク質分解酵素阻害剤(大豆トリプシンインヒビターやα2-マクログリブリン)の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている(前記Abu Al-Soudら)。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される(前記Abu Al-Soudら)。
核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば400塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別が可能である。
核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程b)で採用する核酸増幅法に応じて、工程b)に続いて行われるか、又は、工程b)と同時に行われる。例えば、リアルタイムPCRの場合は、工程c)は工程b)と同時に行われ得る。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にPCR法を用いた場合は、リアルタイムPCR法(Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036)を利用することが可能である。
リアルタイムPCR法を採用する場合、一般に増幅サイクル数1〜10までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差SDを算出し、そのSD値に10を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るPCRサイクル数をサイクルスレッショールド値(Ct値)という。従って、PCR反応溶液に初期のDNA鋳型量が多い程、Ct値は小さな値となり、鋳型DNA量が少ない程、Ct値は大きな値となる。また、鋳型DNA量が同じでも、その鋳型内のPCRのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のPCR反応のCt値は大きな値となる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、白金錯体を含む。
また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、N−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
尚、以下の実施例において、特記しない限り、各操作は非遮光下で行った。
大腸菌群(Coliform bacteria)として代表的なクロノバクター・サカザキ(Cronobacter sakazakii)(旧名、エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii))を対象として、シスプラチン及びカルボプラチンによるPCR増幅に対する抑制効果を検討した。
1−1)使用菌株及び培養方法
クロノバクター・サカザキ(Cronobacter sakazakii)ATCC29544を、ブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス(Brain Heart Infusion Broth)(BHIブロス:Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて、37℃、16時間培養した。同菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)から入手することができる。
シスプラチン(Sigma)6.06 mg (20.2μmol)を正確に秤量し、404μlのジメチルスルホキシド(DMSO、D8418-50ML, Sigma)に溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して5μM、50μM、200μM、500μM、1000μM、2mM、5mMのシスプラチン溶液を準備した。
また、カルボプラチン(Sigma、分子量371.25) 3.60mg (9.7μmol) を正確に秤量し、970μlの滅菌水(カルボプラチンはDMSOには不溶)に溶解し、10 mM水溶液を調製した。この溶液を滅菌水で希釈し、5μM、50μM、200μM、500μM、1000μM、2mM、5mMの各カルボプラチン水溶液を調製した。
まず、下記の表1に示すリアルタイムPCR用マスターミックスを調製した。PCR増幅には、Primer 16S forward: C. sakazakii 16S rRNA遺伝子検出用フォワードプライマー(5'-TAACAGGGAGCAGCTTGCTGCTCTG-3':配列番号1)、Primer 16S reverse: C. sakazakii 16S rRNA遺伝子検出用リバースプライマー(5'-CGGGTAACGTCAATTGCTGCGGT-3':配列番号2)をPCRプライマーとして使用した。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は426 bpであった。16S TaqMan probeとしては、配列番号3(5'-CCGCATAACGTCTACGGACCAAA-3')の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。尚、各プライマー及び16S TaqMan probeの塩基配列情報は、Kang, Eun Sil et al., J. Microbiol. Biotechnol. 17:516-519, 2007から入手した。リアルタイムPCR増幅は2回実施した。
1) 95℃, 20秒(1サイクル)
2) 95℃, 5秒; 55℃, 10秒; 72℃, 30秒(45サイクル)
尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表2に示す。表中、白金錯体濃度は、DNAの白金錯体処理時の終濃度である。
表2の結果より、0.45% NaCl水溶液下では、シスプラチンは25μMにてPCR増幅反応を完全に抑制した。一方、カルボプラチンは滅菌水中250μMにてPCR増幅反応を完全に抑制した。
なお、シスプラチンの立体異性体であるトランスプラチン、並びに、カルボプラチンに構造が類似している白金錯体であるネダプラチン及びオキサリプラチンも、シスプラチン及びカルボプラチンと同様の作用を示すと考えられる。
クロノバクター・サカザキを対象として、シスプラチンを用いて細菌の生細胞と死細胞との識別を明瞭とするための条件の検討を行った。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544をBHIブロスにより37℃、16時間培養した。
前記培養液1 mlを冷却遠心分離(4℃、3,000×G、10分間)し、上清除去後、ペレットに1 mlの生理食塩水を添加し、更にその一部を生理食塩水にて10倍希釈して、生細胞けん濁液(1.2×108 CFU/ml)を調製した。
前述の実施例1と同様にして調製したシスプラチンの50 mM溶液を、生理食塩水にて希釈し、7.5 mM、15 mM、20 mM、及び30 mMのシスプラチン生理食塩水溶液を調製した。
各シスプラチン生理食塩水溶液10μlを、上記生細胞けん濁液又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽(PERSONAL-11、TAITEC, Tokyo, Japan)にて37℃で30分間保持した。尚、この操作は室温でもよい(以下の各実施例でも同様)。その後、冷却遠心(4℃、10,000×G、5分)し、上清を除去し、そのペレットを150μlの滅菌水にけん濁させ、よく攪拌した後、同様の冷却遠心分離を行い、上清を除去した。得られたペレット(細胞けん濁液5μl相当)をPCR増幅用試料とした。
細胞からの核酸の抽出を行わずにPCRを効率よく行うために必要な核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液(この濃縮液を、濃縮ダイレクトバッファーコンポーネント、cDBCと記載する。)を調製した。
具体的には、ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma A7906)、クエン酸三ナトリウム2水和物(TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京)、塩化マグネシウム6水和物(31404-15 ナカライテスク、京都)、卵白リゾチーム(126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪)、Brij58(P5884-100G; Sigma)の各ストック溶液を、表3に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。
3) 95℃, 2分(1サイクル)
4) 95℃, 5秒; 55℃, 10秒; 72℃, 20秒(45サイクル)
リアルタイムPCRの結果を表5に示す。又、PCR最終増幅産物(cis-DDP濃度2000μM)の電気泳動の結果を、図1に示す。
シスプラチン濃度2000μM以上(3000μMを含む)では、生細胞のCt値が未処理のそれと比較して殆ど上がっておらず、かつ、死細胞のPCR増幅は完全に抑制された。この結果から、PCR増幅の前に被検試料をシスプラチンで処理することにより、生細胞を死細胞と区別することができることが明らかとなった。本方法は、光照射を必要としない。また、ターゲット領域が短くても(426 bp)、生細胞と死細胞の区別が可能であった。
前述の実施例2では、死細胞染色体にシスプラチンを効率よく結合させるために、Clイオンを含まず、かつ生細胞にとって好適環境であるLactose brothを用いて検討した(但し、Lactose brothで希釈した細胞けん濁液は、生理食塩水にけん濁されているため、生理食塩水に比べて1/10濃度のClイオンを含んでいる)。仮にシスプラチンが生細胞の細胞壁/細胞膜を一旦透過したとしても、その後、ATP依存性efflux ポンプを活性化させ各種トランスポーターより本薬剤を生細胞外へ排出することを意図したものであった。
そこで、本実施例3では、Lactose brothを生理食塩水に置き換えて検討を行った。
1−1)前述の実施例2と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液(6.4×107 CFU/ml)及び損傷細胞/死細胞けん濁液(6.4×107 cells/ml。以下、「死細胞けん濁液」と表記する。)を調製した。
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を生理食塩水にて10倍希釈し(6.4×106 cells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。
シスプラチン10.82 mg (36.1μmol)を正確に秤量し、722μlのDMSOに溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、1 mM、2 mM、及び4 mMのシスプラチン生理食塩水溶液を調製した。
前述の実施例2と同様にして、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
陽性コントロールとして前記C. sakazakiiの生細胞けん濁液(6.4×107 CFU/ml)5μlを鋳型として使用した。又、陰性コントロールとして滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表6に示す。
シスプラチン濃度1000μMで、生細胞を死細胞と区別できた。この結果から、Clイオン濃度が高くても、本発明の方法は実施可能であることが示された。
本実施例4では、滅菌水で調製したクロノバクター・サカザキ生細胞及び死細胞のけん濁液を用いて、各々の識別を行った。
1−1)前述の実施例2と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液(1.2×108 cfu/ml)及び死細胞けん濁液(1.2×108 cells/ml)を調製した。
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水で10倍希釈し(1.2×107 cells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。
シスプラチン9.10 mg (30.3μmol)を正確に秤量し、606μlのDMSOに溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、0.25、0.5、1、及び2.5 mMのシスプラチン生理食塩水溶液を調製した。
前述の実施例2と同様にして、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
陽性コントロールとして前記C. sakazakiiの生細胞けん濁液(1.2×108 cfu/ml)5μlを鋳型として使用した。又、陰性コントロールとして滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表7に示す。
シスプラチン濃度25μMで、生細胞を死細胞と区別できた。実施例2〜4の結果から、Clイオンは含んでいても含んでいなくても本発明の方法は実施可能であるが、シスプラチン処理におけるClイオン濃度がより低い方が、低濃度のシスプラチンで生細胞を死細胞の区別が可能であることが示された。
本実施例5では、最外殻に外膜を有さず、ペプチドグリカンを有するグラム陽性細菌として、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus;黄色ブドウ球菌)について、シスプラチンによる生細胞及び死細胞の識別を行った。
1−1)スタフィロコッカス・アウレウスATCC 6538P株を用いて、滅菌水にて1 ml生細胞けん濁液(9.4×107 cfu/ml)及び死細胞けん濁液(9.4×107 cells/ml)を調製した。
上記スタフィロコッカス・アウレウスの生細胞けん濁液(9.4×107 cfu/ml)、又は死細胞けん濁液(9.4×107 cells/ml)それぞれ50μlを下記試験に供した。
シスプラチン5.80 mg (19.3μmol)を正確に秤量し、386μlのDMSOに溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し0.5、1、2、3、及び5 mMのシスプラチン生理食塩水溶液を調製した。
下記表8に示される組成にて、ダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを調製した。
具体的には、SYBRPremix Ex TaqTM PCR Master Mix (2×)(Takara-Bio Co., Ltd, Otsu, Japan)をqPCRバッファーとして用い、PCR増幅用forward primer及びreverse primerとしてBacteria Screening PCR Kit (Takara-Bio)添付Primer Mix BS (5μM each)を使用した。尚、本プライマーミックスはスタフィロコッカス属及びバチラス属を共に検出可能とするプライマーであり、増幅遺伝子長は約380 bpである。リアルタイムPCRは2回実施した。
5) 95℃, 1分(1サイクル)
6) 95℃, 10秒; 59℃, 30秒; 72℃, 30秒(40サイクル)
リアルタイムPCRの結果を表9に示す。
グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスについても、シスプラチン処理により生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。
本実施例6では、シスプラチン以外の白金錯体として、cis−ジアンミン(ピリジン)クロロ白金(II)クロリド(cis-diammine (pyridine) chloroplatium (II) chloride; cis-DPCP)を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞及び死細胞の識別を行った。
1−1)前述の実施例3と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液(1.0×106 cfu/ml)及び死細胞けん濁液(1.0×106 cells/ml)を調製し、それぞれ90μlを、下記試験に供した。
cis-DPCP(Sigma)1.66 mg (4.4μmol)を正確に秤量し、438μlのDMSOに溶解し、10 mM溶液を調製した。その10 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、0.1 mM、0.25 mM、1 mM、2.5 mM、5 mM、及び10 mMのcis-DPCP生理食塩水溶液を調製した。
前述の実施例2と同様に、TaqManFast Universal PCR Master Mix (2×)(Applied Biosystems Pty Ltd.)をリアルタイムPCRバッファーとして用い、同バッファーにcDBC (10×DBC)を所定量添加して調製したダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを用いて、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。
陽性コントロールとしてC. sakazakiiの生細胞けん濁液(1.2×108 CFU/ml)5μlを鋳型として使用した。又、陰性コントロールとして滅菌水5μlを鋳型として使用した。
リアルタイムPCRの結果を表10に示す。
表10に示されるように、cis-DPCP濃度依存的に死細胞由来のCt値は遅れ、500μMでは死細胞由来のリアルタイムPCRを40サイクル実施しても増幅産物は生じなかった。一方、生細胞のCt値はcis-DPCP 250μMまでは殆ど影響されず、500μMにて僅かにCt値の遅れが観測される程度であった。このように、cis-DPCP 500μMの1回処理で、C. sakazakii生細胞と死細胞の明瞭な識別が可能であった。
本実施例7では、白金錯体としてDichloro(ethylenediamine)platinum (II)を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞・死細胞の識別を行った。
1−1)前述の実施例2と同様にして、生理食塩水を用いてクロノバクター・サカザキATCC29544の生細胞けん濁液(1.5×109 cfu/ml)及び損傷細胞/死細胞けん濁液(1.5×109 cells/ml。以下、包括して「死細胞けん濁液」と表記する。)を調製した。
上記クロノバクター・サカザキの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液を滅菌水にて100倍希釈し(1.5×107 cells/ml)、それぞれ90μlを、下記試験に供した。
Dichloro(ethylenediamine)platinum (II) 4.94 mg (15.15μmol)を正確に秤量し、303μlのDMSO(Sigma)に溶解し、50 mM溶液を調製した。その50 mM溶液を生理食塩水にて希釈し、250μM及び1mM溶液を調製した。
前記の実施例と同様にして、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表11に示す。
表11によれば、細菌をDichloro(ethylenediamine)platinum (II)で処理することによって、細胞から抽出したDNAをPCRの鋳型とした場合、及び、細胞からのDNA抽出を行わずに細胞を直接PCR反応に用いた場合のいずれにおいても、明瞭な生死判定が可能であった。
また、本薬剤作用後、細胞から抽出したDNAをPCRの鋳型とした場合、proteinase Kの処理の有無にかかわらず生細胞と死細胞の識別が可能であったことから、白金錯体と核酸との結合は直接的且つ不可逆的な結合であり、ヒストン様プロテインのような核酸バインデイングプロテインを介した遺伝子増幅抑制ではない、と推定される。
本実施例8では、白金錯体に代えて、共有結合による巨大分子として定義されている塩化白金を用いて、クロノバクター・サカザキの生細胞と死細胞の識別に関する検討を行った。
1−1)クロノバクター・サカザキATCC29544をBHIブロスを用いて、37℃、16時間培養した。
前記培養液1 mlを冷却遠心分離(4℃、3,000×G、10分間)し、上清除去後、ペレットに1 mlの滅菌水を添加し、更に滅菌水にて100倍希釈して、生細胞けん濁液(9.4×106 CFU/ml)を調製した。
また、上記生細胞けん濁液1 mlを、1.5 mlのマイクロチューブ(Eppendorf, Hamburg, Germany)に分取し、沸騰水に3分間浸漬処理し、その後、急冷した。沸騰水に浸漬処理した各けん濁液は、標準寒天培地(Eiken, Tokyo, Japan)によりコロニーを形成しないことを確認し、損傷細胞/死細胞けん濁液(9.4×106 cells/ml。以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞けん濁液と表記する。)を調製した。
塩化白金(II)6.98 mg (26.24 μmol)を1050μlの DMSO (Sigma)に溶解した。また、塩化白金(IV)5.78 mg (17.16 μmol)を686μlのDMSO(Sigma)に溶解した。このようにして、それぞれ25 mM溶液を調製した。これらの塩化白金(II)溶液及び塩化白金(IV)溶液を生理食塩水にて希釈し、各々100μM、1μM、及び10mMの溶液を調製した。
前記の実施例と同様に、上記の各PCR増幅用試料のリアルタイムPCR増幅を実施した。
リアルタイムPCRの結果を表12に示す。
表12に示されるように、10μMの塩化白金(II)又は塩化白金(IV)で細菌を処理することにより、死細胞ではPCR増幅が完全に抑制されたのに対し、生細胞ではCt値が生細胞未処理群のCt値と比較して1.8〜3.1程度の遅れで留まり、明瞭な生死判定が可能であった。
cis-bis(benzonitrile)dichloroplatinum(II)、tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)、chloroplatinic acid hexahydrate、及び(ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrateによる大腸菌(Escherichia. coli)の生細胞・死細胞の識別
1−1)E. coli JCM1649株を用いて、滅菌水にて生細胞けん濁液(2.1 × 107 CFU/ml)及び死細胞けん濁液(2.1 × 107 cells/ml;沸騰水2分浸漬)を調製し、それぞれ90 μlを下記試験に供した。JCM1649株は、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室(〒305-0074 茨城県つくば市高野台3−1−1)から入手することができる。
cis-bis(benzonitrile)dichloroplatinum(II))(Sigma)9.35 mg(19.80 μmol)を正確に秤量し、396 μlのジメチルスルフォキシド(DMSO、Sigma)に溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、250 μM、1000μM溶液を準備した。
下記表13に示される組成にて、ダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを調製した。具体的には、Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer(New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)をリアルタイムPCRバッファーとして用い、これにTaqポリメラーゼを通常使用の4倍量加え、同バッファーにcDBC(10 × DBC)を所定量添加してダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを調製した。
先に調製したPCR増幅用試料にダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを添加して、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。尚、以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。
尚、配列番号4及び5のプライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、配列番号6のENA-16S TaqMan probeの塩基配列は、各腸内細菌科菌群の16S rRNA遺伝子情報はthe GenBank database(http://www.ebi.ac.uk/genbank/)より腸内細菌科菌群内で相補的領域を選択した。
1) 95℃, 20秒(1サイクル)
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分(40サイクル)
リアルタイムPCRの結果を表14に示す。
表14によれば、4種類の白金錯体をE. coliの生細胞及び死細胞に作用させたとき、cis-bis(benzonitrile)dichloro platinum(II)、tetrakis(triphenylphosphine) platinum(II)に関しては100 μMの濃度にて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。
chloroplatinic acid hexahydrateに関しては、25 μMにて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された 。(ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrateに関しては、400 μMにて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。しかし、生細胞に関しては4種類の白金錯体に共通する現象として、前記死菌由来のPCR増幅を完全に抑制した薬剤濃度であっても、生菌への透過性には殆ど影響しなかった。
また、シスプラチンなどの白金錯体はタンパク質(システイン残基など硫黄を含むアミノ酸、もしくは、各アミノ酸も配位子として候補になり得る)を配位子とすることも既に示唆されているので、乳中の各種カゼイン、ホエイタンパク質にも白金錯体は一部配位する可能性もある(以上、ブリプラチン注10 mg、ブリプラチン注25 mg、ブリプラチン注50 mg BRIPLATIN INJECTION(シスプラチン注射液)製品情報概要」、ブリストール・マイヤーズ株式会社、2007年12月参照)。
そこで、殺菌した牛乳に含まれる生細胞と死細胞が、白金錯体を用いて識別可能かどうかを試験した。
1−1)生理食塩水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液(2.0 × 109 CFU/ml)を調製し、更に生理食塩水にて10倍、103倍、104倍希釈し生細胞けん濁液をを調製した。10倍希釈液の一部をマイクロチューブに分取し、沸騰水に3分浸漬し、その後急冷して、死細胞けん濁液(2.0 × 108 cells/ml)を調製した。
tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)(Sigma)7.92 mg(6.37 μmol)を正確に秤量し、212 μlのDMSOに溶解して30 mM溶液を調製した。この溶液をDMSOで希釈して、さらに15 mM、20 mM、25 mM溶液を準備した。
また、この殺菌ミルクに既知濃度のE. coli死細胞を接種し、薬剤処理をせずに後述のミルクから細菌を回収する工程のみを行い、その後、前述の実施例9と同様のダイレクト・リアルタイムPCRを行うことにより、検出されるE. coli死細胞が最大でも103 cells/mlであることを予備検討にて確認したものを試験材料として使用した。
尚、殺菌ミルクにおいて、比較的高濃度にて混在することが想定されるE. coliを始めとする大腸菌群(サルモネラを含めると腸内細菌科菌群)死細胞は、4.0 × 106 CFU/12 ml殺菌ミルクのレベルであるので、本方法において、その死細胞由来のPCR増幅は完全に抑制される必要がある。
回収した各乳ペレット(a)を10 mlのPBSで懸濁し、サビナーゼ(Savinase:Protease from Bacillus sp.; Sigma; ≧ 16 U/g)30 μlを添加した後、37℃のインキュベーター内にて、インテリミキサー(intelli-mixer PM-2M; ELMI Ltd.)を使用して、同ミキサーに付属のマニュアルに記載された攪拌様式「F6仕様」にて10分間攪拌した。
その後、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、デカンテーションにより上清を除去して各ペレット(b)を回収し、回収した各ペレット(b)に990 μlの滅菌水を添加してけん濁した。この各ペレット(b)けん濁液に、tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)の各濃度溶液(15 mM、20 mM、25 mM、30 mM溶液)をそれぞれ10 μl添加し、37℃のインキュベーター内にて、インテリミキサー(ELMI)を使用して、同ミキサーに付属のマニュアルに記載された攪拌様式「F7仕様」にて25分間攪拌した。その後10 mlのPBSを加え、さらによく攪拌した後、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、デカンテーションにより上清を除去して各ペレット(c)を回収した。
各回収したペレット(c)に100 μlの滅菌水を添加してけん濁し、この各ペレット(c)懸濁液をABI製100 μl容 PCRチューブに移し、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、ピペットにより上清を吸引して除去し、各ペレット(d)を回収した。回収した各ペレット(d)に150 μlの滅菌水を添加し、ピペッテイングによりけん濁させた後、冷却遠心分離(4℃、3,000 × G、5分)し、ピペットにより上清を吸引して除去し、各ペレット(e)を回収した。得られた各ペレット(e)(細胞けん濁液5 μlに相当)をPCR増幅用試料とした。
前述の実施例9の表13と同様のダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを用いて、先に調製したPCR増幅用試料にこのダイレクト・リアルタイムPCR用マスターミックスを添加し、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を2回実施した。
リアルタイムPCRの結果を表15に示す。
表15によれば、死細胞接種殺菌ミルクにおいて、薬剤処理を施さない場合(白金錯体未添加)のCt値が 23.7であったのに対し、薬剤処理を施した場合は、全ての薬剤濃度(150〜300 μM)において、PCR増幅は見られなかった。
一方、生細胞接種殺菌ミルク(3.3×102 CFU/ml)において、250 μM以上の薬剤処理ではPCR増幅は陰性(PCR増幅反応が抑制)となったが、150 μM、及び200 μMの薬剤濃度においては、Ct 値が34.7及び35.4となり、ターゲット遺伝子の増幅が認められた。また、生細胞接種殺菌ミルク(3.3×103 CFU/ml)の場合は、150〜300 μMのいずれの濃度においても、PCR増幅が認められた。
Claims (30)
- 被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)前記被検試料に白金錯体を添加する工程、
b)被検試料に含まれる微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
c)増幅産物を解析する工程。 - 前記白金錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、及びR-(ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す)からなる群から選ばれる配位子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、R3P、及びRNCからなる群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
- 前記白金錯体が、シスプラチン、カルボプラチン、cis-ジアンミン(ピリジン)クロロ白金(II)クロリド、ジクロロ(エチレンジアミン)白金(II)、cis-ビス(ベンゾニトリル)ジクロロ白金(II)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)白金(II)、二硝酸(エチレンジアミン)ヨウ化白金(II)ダイマー、オキサリプラチン、ネダプラチン、およびトランスプラチンからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 前記白金錯体が、白金化合物を、配位子として白金に結合し得る有機溶媒、又は配位子として白金に結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成する白金錯体である、請求項1に記載の方法。
- 前記白金化合物が、塩化白金、臭化白金、フッ化白金、ヨウ化白金、水酸化白金、硝酸白金、炭酸白金、酢酸白金、ジメトキシ白金、メトキシリン酸白金、リン酸白金、塩化白金酸、ジスルフメチル白金、ジシアノ白金、ジチオシアネート白金、二水素化白金、及びジメチル白金からなる群から選ばれる、請求項5に記載の方法。
- 前記白金化合物が、塩化白金又は塩化白金酸であって、塩化白金が塩化白金(II)又は塩化白金(IV)である、請求項6に記載の方法。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、50〜5000塩基のターゲット領域である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ターゲット領域が、被検試料のDNAの5S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、及びtRNA遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項13に記載の方法。
- 前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌、又はウイルスである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌である、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸増幅法が、PCR法、RT−PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法、TMA法、TRC法、HC法、SMAP法、又はマイクロアレイ法である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR法が、リアルタイムPCR法により行われ、PCRと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット:
1)白金錯体、又は、
配位子として白金に結合し得る有機溶媒、もしくは配位子として白金に結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、白金錯体を生成する白金化合物、
2)検出対象の微生物のDNA又はRNAのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。 - 前記白金錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO3 2-、OH-、NO3 -、ROH、N2H4、PO4 3-、R2O、RO-、ROPO3 2-、(RO)2PO2 -、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2 -、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、又はR-(ただし、「R」はいずれも飽和又は不飽和有機基を表す)から選ばれる配位子を含む、請求項21に記載のキット。
- 前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、R3P、及びRNCからなる群から選ばれる、請求項22に記載のキット。
- 前記白金錯体が、シスプラチン、カルボプラチン、cis-ジアンミン(ピリジン)クロロ白金(II)クロリド、ジクロロ(エチレンジアミン)白金(II)、cis-ビス(ベンゾニトリル)ジクロロ白金(II)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)白金(II)、二硝酸(エチレンジアミン)ヨウ化白金(II)ダイマー、オキサリプラチン、ネダプラチン、およびトランスプラチンからなる群から選ばれる、請求項21に記載のキット。
- 前記白金化合物が、塩化白金、臭化白金、フッ化白金、ヨウ化白金、水酸化白金、硝酸白金、炭酸白金、酢酸白金、ジメトキシ白金、メトキシリン酸白金、リン酸白金、塩化白金酸、ジスルフメチル白金、ジシアノ白金、ジチオシアネート白金、二水素化白金、及びジメチル白金からなる群から選ばれる、請求項21に記載のキット。
- 前記白金化合物が、塩化白金又は塩化白金酸であって、塩化白金が塩化白金(II)又は塩化白金(IV)である、請求項25に記載のキット。
- さらに、配位子として白金に結合し得る有機溶媒を含む、請求項21、25又は26に記載のキット。
- 前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項27に記載のキット。
- さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項21〜28のいずれか一項に記載のキット。
- さらに界面活性剤を含む、請求項21〜29のいずれか一項に記載のキット。
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