CN115725751A - 一种pcr扩增引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种PCR扩增引物对及其应用，尤其适用于对耐热芽孢杆菌的检测。该PCR扩增引物对的上游引物包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物包含如SEQIDNO：2所示序列；该PCR扩增引物对在检测耐热芽孢杆菌时，特异性强，可以有效与耐热芽孢杆菌发生特异性扩增，不会出现假阳性；并且基于该PCR扩增引物对的实时荧光PCR扩增检测方法检测步骤简单，检测时间短，对耐热芽孢杆菌的检测限可以达到2.8CFU/mL，灵敏度高。

Description

一种PCR扩增引物对及其应用

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种PCR扩增引物对及其应用，尤其适用于对耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)的检测。

背景技术

芽孢杆菌是一类能形成芽孢的杆菌或球菌，芽孢杆菌根据菌种不同，其耐热性也不同，有的甚至能耐受100℃及以上的高温，一般来说能够耐受巴氏杀菌温度的芽孢杆菌为耐热芽孢杆菌。耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans(BSTD))就是一种典型的比较耐热的芽孢杆菌，是一类具有较高耐热性能的产内生孢子的细菌，该菌种是细菌界、厚壁菌门、杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属、BSTD种，该菌种的模型菌种编号为M215(DSMZ10599)。

1985年和1990年，在德国的超高温杀菌处理(ultraheattreated，UHT)的牛奶中发现BSTD，随后在欧洲的其他国家(如比利时、法国和西班牙等)也相继被发现。耐热芽孢杆菌在一些食品或环境中可能存活并繁殖；一些BSTD不会明显改变牛奶品质也不具有致病性，容易被忽视，虽然这些BSTD不具有致病性，也不会给产品带来显著的品质降低，但是其在环境和食品中广泛存在，特别是在乳制品的检出能够反映出产品的生产过程存在瑕疵，给食品安全带来潜在的风险；而且被忽略后很大可能造成企业生产线的全线污染，对企业造成极大的经济损失，且该菌被污染后很难被去除；除此之外，有些BSTD还可能会产生毒素而且具有致病性，给食品安全带来更大的隐患。所以，企业尤其是食品企业需要对BSTD有全面深入的认识，从而帮助企业建立更加完善的微生物控制体系。

目前，国内还没有系统的方法对BSTD进行检测，常用的检测方法有平板培养法以及PCR鉴定法；传统的固体平板需对该菌培养48-72h左右，随后通过肉眼进行观察；然而该菌在平板上的菌落形态极不明显，通过肉眼观察很大可能被忽略而造成企业生产线的全线污染；现有PCR鉴定通常使用细菌通用引物27F和1492R，特异性不强，准确性不高，灵敏度不强，测序结果可能出现假阳性。

因此，一种准确性高和灵敏度强的检测耐热芽孢杆菌方法是有必要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明目的之一在于提供了一种PCR扩增引物对，该PCR扩增引物对对耐热芽孢杆菌有很强的特异性，使用该PCR扩增引物对可以通过PCR扩增检测方法对耐热芽孢杆菌进行定性和定量分析。

为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供了一种PCR扩增引物对，其上游引物可以包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物可以包含如SEQIDNO：2所示序列。

本发明另一方面提供了一种检测试剂，可以包括上述的PCR扩增引物对。

本发明再一方面提供了一种检测试剂盒，可以包括上述的PCR扩增引物对或上述的检测试剂。

本发明再一方面提供了一种上述的PCR扩增引物对或上述的检测试剂或上述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。

本发明再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，包括：将待检测样品与上述的PCR扩增引物对混合进行PCR扩增得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，从而判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。

本发明再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，可以包括：将待检测样品与上述的检测试剂混合后进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，根据荧光信号判断待待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。

本发明有益效果至少包括：

(1)本发明提供的PCR扩增引物对在检测耐热芽孢杆菌时，特异性强，可以有效与耐热芽孢杆菌发生特异性扩增，不会出现假阳性；

(2)基于本发明提供的PCR扩增引物对的实时荧光PCR扩增检测方法检测步骤简单，检测时间短；而且对耐热芽孢杆菌的检测限可以达到2.8CFU/mL，灵敏度高；

附图说明

图1为耐热芽孢杆菌B1活化后镜检图；

图2为耐热芽孢杆菌B1系统发育树；

图3为实施例3中PCR扩增反应扩增曲线；

图4为实施例3中PCR扩增反应熔解曲线；

图5为实施例4中PCR扩增反应扩增曲线；

图6为实施例4中PCR扩增反应熔解曲线；

图7为实施例5中PCR扩增反应扩增曲线；

图8为实施例5中PCR扩增反应熔解曲线；

图9为实施例6中PCR扩增反应扩增曲线；

图10为实施例6中PCR扩增反应熔解曲线；

图11为实施例7中PCR扩增反应扩增曲线；

图12为实施例7中PCR扩增反应熔解曲线。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明一方面提供了一种PCR扩增引物对，在一些实施例中，上游引物可以包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物可以包含如SEQIDNO：2所示序列。

具体地，通过对耐热芽孢杆菌进行16srDNA测序，将序列和标准模式菌株M215的16srDNA进行比对，同源性达到100％；根据耐热芽孢杆菌的16srDNA序列和近源性芽孢杆菌属的序列，使用DNAMAN进行比对，找到该菌的高度保守区并确定V1-V9可变区，在可变区通过PrimerPremier6以及Oligo6设计特异性引物；从而得到本发明中的SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的PCR扩增引物对，其对耐热芽孢杆菌具有很强的特异性。

本发明另一方面提供了一种检测试剂，在一些实施例中，检测试剂至少包括上述的PCR扩增引物对。具体地，上述PCR扩增引物对可以与常规辅助试剂组合成用于检测耐热芽孢杆菌的检测试剂；常规辅助试剂为本领域所已知的，比如PCR扩增反应体系中的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶或dNTP等。以上，包括上述PCR扩增引物对的检测试剂可以使得耐热芽孢杆菌在该检测试剂中与上述PCR扩增引物对发生特异性扩增。

进一步地，上述检测试剂还可以包括标记试剂，标记试剂包括但不限于荧光染料或荧光探针。具体地，在上述检测试剂加入标记试剂可以进一步提高检测的效率和灵敏度，比如在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或荧光探针，荧光染料或荧光探针可以在PCR扩增形成双链的过程中，对合成的双链进行标记，可以通过一些外界设备，比如PCR荧光检测仪，监测荧光信号变化，从而实时检测PCR扩增的情况。

需要说明的是，荧光染料和荧光探针各有优缺点。荧光染料具有使用方便，不必设计复杂探针，价格相对便宜等优点，但是也存在无模板特异性，对引物特异性要求比较高，不能进行多重定量，灵敏度相对较低等缺陷；荧光探针具有高度特异性、重复性好、灵敏度高和可进行多重定量等优点，但是只适合一个特定的目标，价格相对比较高，不易找到本底低的探针等缺陷。在进行检测时，可以根据具体情况选择使用荧光染料或者荧光探针。

进一步地，荧光染料可以为本领域所已知的荧光染料，比如SYBRGreen；荧光探针可以根据本领域所已知的方法进行自行设计，也可以委托设计公司进行设计。

本发明再一方面提供了一种检测试剂盒，在一些实施例中，检测试剂盒可以包括上述的PCR扩增引物对或上述的检测试剂。具体地，检测试剂盒的组成为本领域所已知的常规形式，比如检测试剂盒会设置试剂盒说明书，比如会有盛装各种检测试剂的试剂瓶，比如会设置成若干小格子用来放置检测试剂瓶，比如会有滴管用来移取检测试剂等。同样地，基于该检测试剂盒中的上述PCR扩增引物对耐热芽孢杆菌的强特异性，该检测试剂盒也能有效对耐热芽孢杆菌进行定性和定量分析。

本发明再一方面提供了一种上述的PCR扩增引物对或上述的检测试剂或上述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。具体地，使用上述PCR扩增引物对或上述检测试剂对耐热芽孢杆菌进行扩增时，耐热芽孢杆菌能够进行特异性扩增；使用上述含有荧光试剂或荧光探针的检测试剂进行扩增时，扩增过程可以产生较强的荧光，有利于检测和分析。

需要说明的是，上述的PCR扩增引物或者上述的检测试剂还可以与微流控芯片结合应用在耐热芽孢杆菌的检测中，结合微流控芯片高效和便捷的特点，会给耐热芽孢杆菌的检测带来更大的便捷性。

本发明再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，在一些实施例中，可以包括：将待检测样品与上述的检测试剂(不包含标记试剂)混合进行PCR扩增得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，从而判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。需要说明的是，此处的待检测样品可以指的是携带或不携带耐热芽孢杆菌的样品，比如生乳、水或其他食品等；也可以指从生乳、水或其他食品等中分离提取的微生物DNA；即上述的耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，可以直接将生乳、水或其他食品等在PCR扩增反应体系中直接进行扩增反应，也可以是将生乳、水或其他食品等先分离出微生物并提取DNA后在PCR扩增反应体系中进行扩增反应；基于上述的PCR扩增引物对，不论是直接使用生乳、水或其他食品等进行PCR扩增检测，还是分离提取DNA后进行PCR扩增检测均具有良好的准确性与灵敏度。

具体地，上述耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法中，可以通过检测PCR扩增产物的情况对待检测样品中的耐热芽孢杆菌进行定性分析。一般选择使用凝胶电泳的方法对PCR扩增产物进行凝胶电泳，应当理解的是，PCR扩增产物的量为足以进行凝胶电泳的量，比如10个循环的扩增量足以进行凝胶电泳，就对10个循环后的扩增产物进行凝胶电泳，比如需要20个循环的扩增量才足以进行凝胶电泳，则对20个循环后的扩增产物进行凝胶电泳；需要说明的是，对PCR扩增后的产物进行凝胶电泳的方法选择本领域技术人员所已知的方法即可，比如，将电泳的目标条带的大小位置和marker对比，从而对待检测样品中的耐热芽孢杆菌进行定性分析；还可以使用imagej分析目标条带的相对含量，从而实现PCR扩增后产物的定量分析。本耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法基于上述PCR扩增引物对对耐热芽孢杆菌的强特异性，可以比较准确地判断出对待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。

本发明再一方面提供了一种耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，在一些实施例中，可以包括：将待检测样品与上述的检测试剂(含有标记试剂)混合后进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，根据荧光信号判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。需要说明的是，同上所述，此处的待检测样品可以指的是携带或不携带耐热芽孢杆菌的样品，比如生乳、水或其他食品等；也可以指从生乳、水或其他食品等中分离提取的微生物DNA。

具体地，除了使用上述的PCR扩增引物对进行常规的PCR扩增检测，然后使用凝胶电泳对PCR扩增的最终产物进行定量和定性分析的方法外，还可以使用上述的检测试剂进行荧光PCR扩增检测，即在PCR扩增中引入标记试剂在退火和延伸过程中对形成的DNA双链进行标记；如此，可以通过标记试剂发出的荧光信号实时监控PCR扩增过程并对待检测DNA模板进行定性和定量分析。需要说明的是，对待检测样品进行定性和定量分析的方法使用本领域所已知的方法即可，比如根据荧光标记的扩增曲线是否起线对待检测样品进行定性分析，起线则代表待检测样品中含有耐热芽孢杆菌；比如还可以设置阈值，然后得到CT值，根据CT值与标准曲线的关系得到待检测样品中耐热芽孢杆菌的含量。应当理解的是，标准曲线指的是通过已知拷贝数的标准品进行检测得出的曲线，属于本领域所已知的技术。同样地，基于上述PCR扩增引物对对耐热芽孢杆菌的强特异性，本耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法也可以准确地对待检测样品进行定性和定性分析。

需要说明的是，使用上述PCR扩增引物对进行PCR扩增检测和使用上述检测试剂(包含荧光试剂)进行PCR扩增检测存在不同。使用上述PCR扩增引物对进行PCR扩增检测需要进行凝胶电泳，而且可能还需要前增菌，整体检测时间会比较长，在48h-72h左右，过程比较繁琐；而且只能对最终PCR产物进行分析，分析的结果只能对待检测样品进行定性分析，不能对待检测样品进行定量分析；而使用上述检测试剂(包括上述PCR扩增引物对及上述标记试剂)进行PCR扩增检测，不需要凝胶电泳，检测时间相对比较短，一般检测时间在90min，远小于48h-72h；而且可以通过荧光信号可以实时监测PCR过程中的退火和延伸过程，可以整体把握PCR扩增过程的整体情况，更有利于研究；进一步地，还可以根据CT值和标准曲线判断待检测DNA模板中耐热芽孢杆菌的含量，还可以准确地对待检测DNA模板进行定性和定量分析。

进一步地，上述耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法中，PCR扩增反应程序包括：90℃-95℃进行预热和变性。需要说明的是，90℃-95℃是高温裂解法提取DNA的温度，也是PCR扩增过程中DNA双链的变性温度，所以，PCR扩增过程中，可以在90℃-95℃进行预热和变性，比如92℃、93℃或94℃等。还需要说明的是，本发明中的上述耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法。

还需要说明的是，耐热芽孢杆菌一般情况下存在于不同的介质中，比如生乳、水和其他食品等，现有的检测方法一般需要将介质中的微生物群分离出来，然后从微生物中提取DNA作为DNA模板进行检测；基于本发明的PCR扩增引物对(SEQIDNO：1和SEQIDNO：2)可以不用分离提取DNA便可对生乳、水和其他食品等中的耐热芽孢杆菌进行检测，实现了生乳、水和其他食品中的耐热芽孢杆菌快速检测的需要，而且操作简单，不繁琐，并且准确性和灵敏度高。

进一步地，上述耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法中，PCR扩增反应的退火温度可以为60℃-65℃。具体地，退火温度主要取决于引物的碱基组成、长度和浓度；而合适的退火温度对PCR扩增反应的特异性尤为关键。一般来说，退火温度的高低影响同时影响PCR反应的特异性和灵敏性(扩增效率)，且两者呈负相关，即较低的退火温度可提高PCR反应的灵敏性但其特异性较差，而较高的退火温度则可以提高反应的特异性但却降低了其扩增效率。本发明中退火温度设置在60℃-65℃，比如62℃、63℃或64℃，可以让上述的PCR扩增引物对在上述的PCR扩增反应中保持较高的特异性，也使得PCR扩增反应速率保持在较高的水平。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，BHI脑心浸出液液体培养基和LB肉汤培养基均来自北京陆桥技术股份有限公司。

以下实施例中，使用的单核增生李斯特氏菌ATCC19115，大肠埃希氏菌ATCC8739，蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303，枯草芽孢杆菌ATCC6633和弗氏柠檬酸菌ATCC43864均购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，BacillussporothermoduransM215(DSMZ10599)购自于德国微生物保藏中心(DSMZ)，耐热芽孢杆菌B1来自于牛乳中。

以下实施例中，涉及到PCR扩增反应的实施例中，PCR扩增反应体系如下表1所示，PCR扩增反应程序如下表2所示。

表1发明实施例PCR扩增反应体系

表2发明实施例PCR扩增反应程序

1	93.0℃for2:00
		2	93.0℃for0:10
3	Gradien62℃for0:30，+PlateRead
		4	GOTO2,40moretimes
5	MeltCurve60.0℃+PlateRead
		END

实施例1耐热芽孢杆菌B1的分离筛选及鉴定

(1)耐热芽孢杆菌的初步筛选：将样品首先在100℃条件下加热30min，然后倒入BHI脑心浸出液固体培养基中，在55℃的温度下培养48h-72h，然后挑取单菌落，纯化培养后的菌株存储在-80℃的冷冻冰箱内；

(2)菌种活化及鉴定：取甘油管接种于灭菌液体BHI脑心浸出液液体培养基中，37℃培养24h-48h，连续活化3次至镜检无杂菌后(镜检图如图1所示)，以2％接种量接入BHI脑心浸出液液体培养基中，取菌液送至上海生工生物工程进行测序；

(3)耐热芽孢杆菌的分离鉴定：将从样品中分离鉴定出来的耐热芽孢杆菌测序后在NCBI中进行Blast，发现该菌与模式菌株耐热芽孢杆菌M215高度同源，16srDNA序列同源性达100％，系统发育树如图2所示，说明该菌属于耐热芽孢杆菌属，将该菌命名为耐热芽孢杆菌B1，如图1所示。

实施例2荧光定量PCR引物的设计

(1)菌株的活化

将蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸菌接种于LB肉汤培养基中，37℃培养至对数期备用；将耐热芽孢杆菌B1和耐热芽孢杆菌M215接种于BHI脑心浸出液液体培养基中，37℃培养至对数期备用。

(2)引物的设计

根据耐热芽孢杆菌B1的16srDNA序列和近源性芽孢杆菌属的序列，使用DNAMAN进行比对，找到该菌的高度保守区并确定V1-V9可变区，在可变区通过PrimerPremier6以及Oligo6设计了3对引物对，B1-F：CGCATGAAGGAGAATTGAAAGACG(SEQIDNO：1)；B1-R：ATCGTCGCCTTGGTGAGCCG(SEQIDNO：2)；B2-F：ACAAGAGTGACAGGTGGTGC(SEQIDNO：3)；B2-R：GCCTACAATCCGAACTGAGAA(SEQIDNO：4)；B3-F：TCTGTAACTGACGCTGAGGC(SEQIDNO：5)；B3-R：AGCACTAAAGGGCGGAAA(SEQIDNO：6)；并通过计算Tm值以及NCBI中验证该引物的特异性，其中引物对B1-F和B1-R的特异性最好；最后将特异性比较好的引物序列送至上海生工生物工程进行合成。

实施例3耐热芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

(1)阳性对照耐热芽孢杆菌M215的DNA制备

将上述实施例2中培养至对数期的阳性对照耐热芽孢杆菌M215使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)进行DNA的提取，DNA提取后放置于-80℃保存备用作为PCR反应阳性对照模板，并采用NanoDropone超微量紫外分光光度计进行DNA浓度的检测，DNA浓度为135.4ng/μl；通过平板涂布计数后得知耐热芽孢杆菌M215培养至对数期的活菌数为1.5*10⁶CFU/ml。

(2)待检测菌株耐热芽孢杆菌B1的DNA制备

使用高温裂解法提取耐热芽孢杆菌B1的DNA：取培养至对数期的耐热芽孢杆菌B1菌液1mL置于无菌的1.5mLEppendorf离心管中，8000rpm4℃离心5min，吸出上清加入另一无菌的1.5mLEppendorf离心管中，8000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，于沸水浴中加热10min，立即放入液氮中，待其冷却后取出，8000rpm离心10min，取上清作为PCR反应的DNA模板；通过平板涂布计数后得知耐热芽孢杆菌B1培养至对数期的活菌数为2.1*10⁶CFU/ml。

(3)耐热芽孢杆菌M215和耐热芽孢杆菌B1的计数

将培养至对数期的耐热芽孢杆菌M215和耐热芽孢杆菌B1稀释成不同的浓度梯度后，进行平板涂布计数，每个梯度3个重复，将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h左右。

(4)荧光定量PCR方法的建立

将上述耐热芽孢杆菌M215提取后的DNA作为阳性对照模板，经过高温裂解法提取的耐热芽孢杆菌B1的DNA作为待测样品模板，ddH₂O作为阴性对照，按照上表1和表2所示的PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行荧光PCR扩增；

荧光PCR扩增反应情况如图3和图4所示，B1-F和B1-R引物对阳性对照M215和待测菌株B1均在18个Ct值左右开始起线，并呈典型的S型扩增曲线，且除了B1-F和B1-R，其余几对引物对和阴性对照均不起线，说明扩增效果较好；通过熔解曲线可知，M215和B1的熔解温度都在78.5℃，阴性对照无熔解温度；通过本发明实施例的扩增曲线和熔解曲线，可以得知本发明实施例方法可以快速的检测出样品中的耐热芽孢杆菌。

实施例4耐热芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的特异性评价

将蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸菌接种于LB肉汤培养基中，37℃培养至对数期备用；将耐热芽孢杆菌B1接种于BHI脑心浸出液液体培养基中，37℃培养至对数期备用。

将上述均采用高温裂解法提取各菌株基因组DNA，测定各菌株基因组的浓度与纯度，确定其纯度良好，并稀释各基因组浓度使所有菌株的基因组浓度相同，以这些基因组为模板进行SYBR实时荧光定量PCR反应，M215为阳性对照，ddH₂O为阴性对照；按照上表1和表2所示的PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行荧光PCR扩增。

荧光PCR扩增反应情况如图5和图6所示，通过对近源性的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以及多个食源性细菌进行测定显示，该引物(B1-F和B1-R)只对阳性对照M215和B1有良好的起线效果，且Ct值在18左右，具有典型的S型扩增曲线；对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸菌均不起线；起线表示在整个PCR过程中产物的累积，如果样品中特定的产物较多，则在较早的循环中观察到扩增，则Ct值小；如果产物较少，则在稍后的循环中观察到扩增，则Ct值大；Ct值越小表明检测效果越好；

且通过观察熔解曲线可知，阳性对照M215和B1的熔解曲线呈现单一的熔解峰，熔解温度均为为78.5℃，而其他几株菌没有明显的熔解峰，熔解曲线接近于阴性对照。即通过本实施例的特异性实验以及结合熔解曲线和熔解温度可知，该荧光定量PCR方法在检测耐热芽孢杆菌时的特异性良好。

实施例5耐热芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的灵敏度评价

将耐热芽孢杆菌B1接种于BHI脑心浸出液液体培养基中，37℃培养至对数期并计数；采用高温裂解法提取基因组DNA，测定菌株基因组的浓度与纯度，确定其纯度良好，然后将其进行10倍梯度稀释至10^-9，以此为模板进行SYBR实时荧光定量PCR反应，ddH₂O为阴性对照；通过对培养至对数期的耐热芽孢杆菌B1进行计数可知活菌数为2.8*10⁶CFU/mL；按照上表1和表2所示的PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行荧光PCR扩增。

荧光PCR扩增反应情况如图7和图8所示，显示了不同浓度基因组DNA模板的荧光定量PCR的扩增曲线结果和熔解曲线，从原液到稀释10^-6的7个不同浓度的扩增曲线均在35循环以内(Ct值≤35)起线，且S型明显，并且熔解曲线温度均在78.5℃；但更低浓度的扩增曲线以及阴性对照在40个循环内均没有起线，且熔解曲线均没有熔解温度，说明该方法的灵敏度可以检测到2.8CFU/mL。即若待测样品中每毫升含有2-3个耐热芽孢杆菌B1，利用本发明荧光PCR扩增检测即可将其检测出来。

实施例6人工污染样品检测

本发明实施例中的试剂情况：将蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸菌接种于LB肉汤培养基中，37℃培养至对数期备用；将耐热芽孢杆菌B1接种于BHI脑心浸出液液体培养基中，37℃培养至对数期备用。

(1)人工污染样品的制备

一组处理将培养至对数期的蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸菌和耐热芽孢杆菌B1各取20μL至1mL无菌超纯水中，另外一组处理将耐热芽孢杆菌B1取100μL至1mL无菌超纯水中；然后将上述两组处理使用涡旋振荡器涡旋1min使菌液分散均匀，每组处理取1μL作为荧光定量PCR的DNA模板。

(2)荧光定量PCR

以(1)中制备的荧光定量PCR模板为DNA模板，按照上表1和表2所示的PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行荧光PCR扩增；

荧光PCR扩增反应如图9和图10所示，由图可知，单菌污染的耐热芽孢杆菌B1大约在13个循环时开始起线，并呈现典型的S型曲线；混菌污染的扩增曲线在16个循环时开始起线，并呈现典型的S型曲线；结合熔解曲线的结果可知，阴性对照的熔解曲线没有熔解温度，单菌污染和混菌污染的样品熔解温度均在78.5℃；单菌污染的菌液浓度比混菌污染的菌液浓度高，所以单菌污染的扩增曲线比混菌污染的扩增曲线起线早几个循环。

该结果说明本发明检测方法不仅可检测耐热芽孢杆菌B1污染的样品，也可将蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸菌和耐热芽孢杆菌B1混合菌液中的耐热芽孢杆菌B1特异性检测出来。也就是说本发明检测方法不仅可以检测单菌污染的样品，同时也可以在多种杂菌污染的样品中将耐热芽孢杆菌B1特异性检测出来，这也极大的增加了本发明检测方法的应用范围。

实施例7对市面上不同乳制品产品测试

本发明实施例中，购买超市中9种不同品牌的UHT(超高温灭菌奶)牛奶，将其标记为1-9九个待测样品。

为使本发明检测操作步骤最简化，不对牛乳进行预处理，直接取1μL牛乳作为荧光定量PCR的DNA模板；ddH₂O作为阴性对照，耐热芽孢杆菌M215作为阳性对照，按照上表1和表2所示的PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行荧光PCR扩增。

荧光PCR扩增反应情况如图11和图12所示，通过对市面上9种不同品牌的UHT牛奶样品进行的测定结果如图11和图12所示，阳性对照在16个循环左右开始起线，且有一款产品在22个循环左右开始起线，由于牛奶中含有一些抑制PCR反应的物质，所以并不会呈现典型的S型曲线，但这并不影响检测结果的准确性；其余产品以及阴性对照均不起线，说明产品3中可能含有耐热芽孢杆菌；随后通过对产品3进行涂布平板得知，该产品中含有耐热芽孢杆菌；然后通过对样品3中的菌株进行分离鉴定以及16srDNA可知，产品3中的耐热芽孢杆菌与耐热芽孢杆菌B1的同源性高达99.6％。这也说明了本发明检测方法能准确鉴定出乳制品中的耐热芽孢杆菌，且不需要复杂的操作步骤。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (10)

1.一种PCR扩增引物对，其特征在于，上游引物包含如SEQ ID NO：1所示序列，下游引物包含如SEQ ID NO：2所示序列。

2.检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR扩增引物对。

3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，还包括标记试剂，标记试剂包括但不限于荧光染料或荧光探针。

4.检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中任一所述的检测试剂。

5.权利要求1所述的PCR扩增引物对或权利要求2至3中任一所述的检测试剂或权利要求4所述的检测试剂盒在检测耐热芽孢杆菌中的应用。

6.耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，包括：将待检测样品与权利要求2所述的检测试剂混合进行PCR扩增得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，从而判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。

7.耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，包括：将待检测样品与权利要求3所述的检测试剂混合后进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，根据荧光信号判断待检测样品中是否含有耐热芽孢杆菌。

8.根据权利要求7所述的耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，在PCR扩增过程中，根据CT值和标准曲线判断待检测样品中耐热芽孢杆菌的含量。

9.根据权利要求6、7或8所述的耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，PCR扩增反应程序包括：90℃-95℃进行预热和变性。

10.根据权利要求6、7或8所述的耐热芽孢杆菌的PCR扩增检测方法，其特征在于，PCR扩增反应的退火温度为60℃-65℃。

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