CN112646862B - 一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用，新型自我链置换原理为引物以5’端茎环结构的探针为模板，聚合延伸产生双链DNA，产物存在末端双链杂交结构和解链形成两个茎环结构的平衡，本发明在模板引入损伤碱基，使引物延伸后形成含有错配结构的双链，使平衡向解链方向移动，此时解链形成的茎环结构在聚合酶延伸下发生自我链置换，产生原有模板的再生，和新聚合产物分离，此反应得以循环进行。本发明将该新型自我链置换原理应用于发展全新的多重链置换技术，新的链置换技术突破了原有多重链置换技术中因模板长度限制容易发生置换结束的缺点，真正实现了简便、理论“无终点”、非模板长度依赖的多重链置换技术。

Description

一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用。

背景技术

绝大多数的分子诊断基于简单而可靠的分子扩增反应，尽管聚合酶链反应(PCR)是应用最广泛的方法，但等温扩增方法由于避免了精确的温度循环和复杂的设备，在许多场景中(包括即时诊断)可能更易于处理。等温扩增方法涵盖了多种方法，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，单引物等温扩增(SPIA)，等温嵌合引物引发的扩增(ICAN)，链置换扩增(SDA)，解旋酶依赖性扩增(HDA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，等温靶标和信号探针扩增(iTPA)，滚环扩增(RCA)，环介导扩增(LAMP)和SmartAmp。总体而言，这些方法具有不需要温度循环的链入侵和/或引物结合机制，可产生类似于PCR的灵敏扩增。

上述大部分等温核酸扩增方法都应用了一个共同的机制，即聚合酶介导的链置换机制。聚合酶介导的核酸链置换反应是在核酸扩增反应中广泛应用的一种技术，也是生物体内核酸复制过程的模拟和变种反应。该过程主要包括引物在具有链置换活性的聚合酶作用下延伸和延伸产生的新的核酸序列置换下游原有核酸两个过程。聚合酶介导的链置换导致原有双链的解旋和新的双链生成，产生扩增反应，这种置换反应代替了传统变温反应中高温解旋的过程，可以在较宽的温度范围下进行，操作简单、方便。近年来，核酸链置换反应因其高特异性高灵敏度检测特性广泛应用于分子生物学的各个领域，在检测信号的放大和诊断生物传感检测中也受到了极大的关注。

为了使核酸扩增反应更加灵敏，聚合酶介导的链置换反应往往通过一条模板扩增产生多条产物，实现这一目标的方式总结起来大致分为三类：

第一类是切刻酶参与的链置换序列扩增。双链上存在切刻酶的切割位点，在切刻酶作用下，双链中的一条被切断，暴露出3’端，随后在聚合酶作用下延伸置换下游核酸。此过程循环进行，不断产生相同的单链DNA，实现序列扩增和信号放大。虽然此类的指数级链置换反应具有高的灵敏度，但是方法中引入了切刻酶，且聚合酶和切刻酶组合具有很高的背景反应，限制了此类方法的实际应用。

第二类是通过设计特殊结构的模板实现模板的循环利用。比如基于环状模板的滚环复制RCA反应，杂交在环上的引物的3’端通过不断重复序列的延长实现下游序列的置换扩增。LAMP反应也是基于特殊结构模板实现序列扩增的目的。

第三类是多重链置换反应。多重链置换反应是利用模板链上可以杂交多个短引物，多个自由3’端都可以延伸，前赴后继的链置换反应，产生多个扩增产物。虽然如此，多重链置换存在明显的缺点，即当靠近模板3’端的引物延伸会让模板失去循环能力，多个引物无法重复杂交，反应很快终止，如果想克服这一缺点必须靠延伸模板的3’端来创造新的引物结合位点。Cheng等人利用滚环扩增方法来不断延长模板链，通过加入引物实现了多重链置换反应。虽然理论上这种方法的延伸反应在底物耗尽前不会停止，但是一方面长DNA模板会自身形成各种结构不利于反应进行，另外聚合酶本身在延伸特别长的模板时效率也会下降，而且往往需要引入特殊的模板结构设计或者多种酶促反应。因此，此类多重链置换反应因技术难度限制了其广泛应用。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的目的在于提供建立一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应原理及其应用。

所述自我链置换原理如下：

体系探针由A和B两条探针组成，探针A的5’端是一个带有损伤位点的茎环结构，3’端是单链的DNA结构，探针B是与探针A的3’端单链区互补配对的一条单链DNA，当探针A和B在同一体系中时，它们会彼此杂交在一起，此时如果溶液中存在具有链置换活性的DNA聚合酶，探针B的3’端就会以探针A为模板被延伸，跨越损伤位点，探针A的5’端的茎环被打开，探针AB延伸形成了双链DNA，探针B延伸产物3’端形成茎环后，可以以自身为模板及进行聚合链置换反应把自己从双链上脱离下来，探针A“再生”，此反应得以循环进行。

所述新型的多重链置换反应原理如下：

在上述自我链置换反应原理设计的探针B不变，在探针A的3’端增加多个重复的可以与探针B杂交的序列，多个探针B能先后或者同时与探针A模板杂交发生链置换反应，当靠近模板3’端的引物B延伸覆盖模板无法进行多重链置换反应时，该设计可以通过自我链置换的方式让探针A再生以便进行新一轮的多重链置换，该设计是没有终点的多重链置换，有限的模板长度可以完成无限的多重链置换反应。

进一步的，所述自我链置换反应步骤如下：

配制含有1x的聚合反应缓冲液、10～200nM茎环探针、50～200nM单链引物、1～10UBst Large Fragment、1～10uM dNTP的反应体系，加水配至20uL，37～65℃反应30min-2h。使用2～5％琼脂糖凝胶电泳，观察并分析条带。

进一步的，所述多重链置换反应步骤如下：

配制含有1x的聚合反应缓冲液、10～200nM三重引物杂交发夹探针与单重引物杂交发夹探针、50～200nM单链引物、1～10U Bst Large Fragment、1～10μM dNTP的反应体系，加水配至20μL，37～65℃反应30min～2h，进行荧光检测。

相对于现有技术，本发明所述的一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用具有以下优势：

(1)本发明所述的一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用，是一种基于损伤碱基修复介导的新型自我链置换原理，并且将其应用于发展全新的多重链置换技术，新的链置换技术突破了原有多重链置换技术中因模板长度限制容易发生置换结束的缺点，真正实现了简便、理论“无终点”、非模板长度依赖的多重链置换技术；

(2)本发明所述的一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用，作为一个优越的操作简便、省时省力的检测平台，可以偶联多种检测目标和信号转换方式，广泛应用于分子生物学的各个领域，在检测信号的放大和诊断生物传感检测中具有广阔的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例所述的自我链置换原理示意图；

图2为本发明实施例所述的多重链置换反应示意图；

图3为本发明实施例所述的自我链置换原理的电泳验证图；

其中Lane1：Marker；

lane2：引物T-02，37℃反应；

lane3：TXA+引物T-02杂交，37℃反应；

Lane4：TXA+T-02+Bst杂交，37℃反应

Lane5：TTA+T-02+Bst，37℃反应；

Lane6：TXA+T-02+Bst，60℃反应；

Lane7：TTA+T-02+Bst，60℃反应；

Lane8：Marker。

图4为本发明实施例所述的三重链置换探针与单重探针的比较图；

其中a为加入三重循环探针Triple的链置换效果荧光图；

b为加入单重循环探针TXA的链置换效果荧光图；

c为引物T-02背景荧光图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

根据自我链置换反应原理，本发明自我链置换反应步骤如下：

设计如原理所述的探针A和探针B，具体序列见表1。

配制含有1x的聚合反应缓冲液、60nM茎环探针(TTA，TXA)、60nM单链引物、8U BstLarge Fragment、2.5μM dNTP的反应体系，加水配至20μL，37或60℃反应2h。使用3％琼脂糖凝胶电泳，观察并分析条带，条带结果见图3。

根据自我链置换反应原理及多重链置换原理，本发明多重链置换反应步骤如下：

配制含有1x的聚合反应缓冲液、6nM三重引物探针(triple)与单重引物探针(TXA)、100nM单链引物T-02、4U Bst Large Fragment、2.5μM dNTP的反应体系，加水配至20μL，60℃反应。收集荧光数据，绘制图表比较各个结构的性能。

表1核酸序列*

以上核酸序列均合成于生工生物工程(上海)股份有限公司

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津市疾病预防控制中心

<120> 一种新型的自我链置换原理及其多重链置换反应的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaattctt aagaattctt aaggagctgt cgttcgaggt 40

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaattcta agaattctta aggagctgtc gttcgaggt 39

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaattcta agaattctta aggagctgtc gttcgaggtg gagctgtcgt tcgaggtgga 60

gctgtcgttc gaggt 75

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acctcgaacg acagctcc 18

Claims (4)

1.一种非诊断目的的自我链置换方法，其特征在于：所述自我链置换方法如下：

体系探针由A和B两条探针组成，探针A的5’端是一个带有损伤位点的茎环结构，3’端是单链的DNA结构，探针B是与探针A的3’端单链区互补配对的一条单链DNA，当探针A和B在同一体系中时，它们会彼此杂交在一起，此时如果溶液中存在具有链置换活性的DNA聚合酶，探针B的3’端就会以探针A为模板被延伸，跨越损伤位点，探针A的5’端的茎环被打开，探针AB延伸形成了双链DNA，探针B延伸产物3’端形成茎环后，可以以自身为模板及进行聚合链置换反应把自己从双链上脱离下来，探针A“再生”，此反应得以循环进行。

2.一种非诊断目的的多重链置换方法，其特征在于：所述多重链置换方法如下：

在权利要求1所述的自我链置换方法设计的探针B不变，在探针A的3’端增加多个重复的可以与探针B杂交的序列，多个探针B能先后或者同时与探针A模板杂交发生链置换反应，当靠近模板3’端的引物B延伸覆盖模板无法进行多重链置换反应时，该设计可以通过自我链置换的方式让探针A再生以便进行新一轮的多重链置换，该设计是没有终点的多重链置换，有限的模板长度可以完成无限的多重链置换反应。

3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的自我链置换方法，所述自我链置换方法步骤如下：

配制含有1x的聚合反应缓冲液、10～200nM茎环探针、50～200nM单链引物、1～10U BstLarge Fragment、1～10uM dNTP的反应体系，加水配至20uL，37～65℃反应30min-2h，使用2～5%琼脂糖凝胶电泳，观察并分析条带。

4.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的多重链置换方法，所述多重链置换方法步骤如下：

配制含有1x的聚合反应缓冲液、10～200nM三重引物杂交发夹探针与单重引物杂交发夹探针、50～200nM单链引物、1～10U Bst Large Fragment、1～10μM dNTP的反应体系，加水配至20μL，37～65℃反应30min～2h，进行荧光检测。

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