CN113267555B - 以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，采用单溶酶体膜片钳技术获得细胞内单个溶酶体的内容物；对溶酶体的内容物进行质谱检测获得溶酶体内容物中代谢物的组成及含量；根据检测的结果，依据单个溶酶体内容物中代谢物组成和含量的差异，对溶酶体进行分类，得到五种不同亚群的溶酶体，其中包括已知的自噬溶酶体和内吞溶酶体。本发明实现对溶酶体更精细的分类，采用本发明的方法可以将溶酶体分为五类，各类溶酶体均具有明显的分类标志物。研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。

Description

以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法
技术领域
本发明涉及溶酶体分类领域，具体为一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法。
背景技术
溶酶体是细胞内主要的降解性细胞器，是细胞代谢的关键位点。溶酶体的功能异常与多种疾病密切相关，如溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肿瘤等，因此溶酶体也是疾病治疗和药物开发的重要靶点。此外，溶酶体也参与药物的细胞内转运、储存和代谢，与多种药物的耐药性直接相关。细胞中往往存在大量的溶酶体，这些溶酶体在大小、形态和功能等方面存在巨大的异质性，不同的溶酶体在疾病和药物代谢中往往也发挥不同的作用，因此对溶酶体进行分类，分别研究不同类型溶酶体的特点和差异，对疾病机制的研究和药物开发有重要的科学意义和广阔的应用前景。目前常根据溶酶体的成熟阶段或与其他细胞器的融合来对溶酶体进行分类，这些分类方式非常粗略，且缺少明显的分类标志物，尤其是无法根据溶酶体代谢的差异对其进行分类，导致目前对疾病中溶酶体的功能认识不足，也极大地限制了靶向溶酶体的药物开发。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，来解决现有技术对溶酶体分类精细度差的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，所述溶酶体分类包括以下步骤：
步骤一、采用单溶酶体膜片钳技术处理细胞，获得单溶酶体的内容物；
步骤二、对单溶酶体的内容物分别进行质谱检测；
步骤三、根据步骤二检测的结果，以内容物中的代谢物为对象，进行溶酶体的分类。溶酶体至少能分为五个亚群。
本发明通过将单溶酶体膜片钳取样技术与质谱检测技术进行有机结合，建立了单溶酶体质谱分析方法。实现了对单个溶酶体内容物进行质谱检测，从而对溶酶体内容物成分及含量进行分析，相对于传统的溶酶体匀浆的分析方法，单溶酶体质谱分析方法更能如实地反映溶酶体的代谢状态，也是本发明能够以溶酶体的代谢物为对象进行溶酶体分类的关键。基于上述方法，本发明实现了以代谢物的组成及含量为指标对溶酶体精细的分类，实验表明，采用本发明的方法可以将溶酶体分为五类，各类溶酶体均具有明显的分类标志物。为研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。
进一步，所述步骤一中的细胞为HEK-293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、膀胱癌细胞(T24)、人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞中的至少一种。
进一步，所述步骤一中的单溶酶体膜片钳技术采用的玻璃电极其电极尖端为5-10mm长，电极尖端开口直径为0.1-2μm。以防止样品被电极外液稀释；质谱取样的电极外液是模拟溶酶体所处的胞质离子环境。
如此，可以获得pL/min的喷雾速度并对物质的检测具有较高的重现性和灵敏度，对于赖氨酸(LYS)，组氨酸(HIS)以及精氨酸(ARG)的检测限分别是0.045μM，0.042μM和0.038μM。
进一步，所述步骤一采用的细胞为HEK-293T细胞；
第一亚群对应的标志性代谢物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等阳离子氨基酸，第二亚群对应的标志性代谢物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸等氨基酸衍生物，第三亚群对应的标志性代谢物包括甘油三酯、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯，第四亚群对应的标志性代谢物包括丁基肉碱，乙酰肉碱和马来酸均聚物，第五亚群对应的标志性代谢物包括磷脂酰肌醇双磷酸、双磷脂酰甘油、和甘油三酯。
优选地，所述五个亚群中存在一个亚群标记为内吞溶酶体，存在另一个亚群标记为自噬溶酶体。
优选地，在进行所述步骤一时，还获得单溶酶体的电生理信号。
如此，本发明实现了既能获得单个溶酶体的内容物成分信息，同时能获得单个溶酶体的电生理信号。
进一步，获得单溶酶体的电生理信号所使用的电极外液包括K-gluconate、NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES；电极内液包括NH4HCO3、NH4Cl。
进一步，填充电极内液的电极电阻为5-16MΩ。
进一步，本发明采用NH4Cl电极内液，与传统电极内液相比，提高了质谱检测的信噪比，可以同时获得电生理和质谱信号。
进一步，步骤一中，在采用单溶酶体膜片钳技术的玻璃电极对单溶酶体处理之前，进行溶酶体的增大处理。
由于细胞器(如溶酶体、内体)太小，用玻璃电极可能不容易直接取样，因此，对细胞器的增大处理，便于单细胞器质谱取样。
进一步，所述溶酶体的增大处理通过采用vacuolin-1对细胞进行处理。
本发明还公开一种单溶酶体代谢物信息的获取方法，包括以下步骤：
步骤一、培养细胞；
步骤二、将培养后的细胞进行转染；
步骤三、通过单溶酶体膜片钳技术获取细胞中单溶酶体的电生理信号并获得单溶酶体的内容物；
步骤四、通过质谱检测对内容物的成分进行定性定量分析，获取单溶酶体中代谢物信息。
本发明的优点在于：本发明通过将单溶酶体膜片钳取样技术与质谱检测技术进行有机结合，建立了单溶酶体质谱分析方法。实现了对单个溶酶体内容物进行质谱检测，从而对溶酶体内容物成分及含量进行分析，相对于传统的溶酶体匀浆的分析方法，单溶酶体质谱分析方法更能如实地反映溶酶体的代谢状态，也是本发明能够以溶酶体的代谢物为对象进行溶酶体分类的关键。基于上述方法，本发明实现了以代谢物的组成及含量为指标对溶酶体精细的分类，实验表示，采用本发明的方法可以将溶酶体分为五类。为研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。
附图说明
图1为本发明中HEK-293T细胞的t-SNE聚类分析图。
图2为本发明中各个玻璃电极其尖端形状的示意图。
图3为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的赖氨酸相对含量柱状图。
图4为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的组氨酸相对含量柱状图。
图5为本发明中不同形状的玻璃电极情况下检测的精氨酸相对含量柱状图。
图6为本发明中抽取的ALF的TIC与SIC的质谱峰图。其中，喷雾流速为3.2pL/min。SIC表示选择离子流；TIC表示总离子流。
图7为本发明中增大的细胞器在HEK-293T细胞中的分布图。
图8为本发明中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的2-Hydroxyatrazine的质谱峰图。
图9为本发明中HEK-293T细胞的内体和溶酶体中2-Hydroxyatrazine相对含量的统计图。
图10为本发明中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的Cytosine的质谱峰。
图11为本发明中HEK-293T细胞的内体和溶酶体中Cytosine相对含量的统计图。
图12为本发明中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的代谢物相对含量的示意图。
图13为本发明中被EGFP-Rab5A和Lamp1-mCherry转染的HEK-293T细胞内核内体和溶酶体的荧光图像。
图14为本发明中内体和溶酶体代谢组的t-SNE分析图。
图15为本发明中内体和五个溶酶体亚群之间的特征代谢物标记重叠的Circos图。
图16为本发明中Lamp2-EGFP和mCherry2-LC3转染HEK-293T细胞的自噬溶酶体和其他溶酶体的荧光图像。
图17为本发明中自噬溶酶体和其他溶酶体的t-SNE分析图。
图18为本发明中自噬溶酶体和五个溶酶体亚群之间的特征代谢物标记重叠的Circos图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例以离体HEK-293T细胞为例进行介绍，当然本发明也可以用于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、膀胱癌细胞(T24)、人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元和神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠皮肤成纤维细胞(MEF)等细胞。
本实施例公开一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，包括以下步骤：
步骤一、细胞的培养
HEK-293T细胞的培养
将用于传代的HEK-293T细胞培养在T25培养瓶中。将培养瓶中的培养基吸除，加1mL预热的胰蛋白酶润洗一遍，再加1mL胰蛋白酶，放于37℃二氧化碳培养箱消化2min；向培养瓶中加入4mL预热的培养基，终止消化，用1mL的移液枪吹打10下，将细胞吹散，形成细胞悬液；取一个新的T25培养瓶，加入5mL预热的培养基，再取250μL细胞悬液加入培养瓶中，倾斜摇晃培养瓶，将细胞混匀。细胞密度为5％的细胞一般三天可以长满，再传代。
其中，培养HEK-293T细胞的细胞培养基优选为是含10％胎牛血清(即胎牛血清与细胞培养基的体积比是1:10，来源于BiologicalIndustries)和1％青霉素-链霉素(即青霉素-链霉素双抗与细胞培养基的体积比是1:100，来源于Biosharp)的DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，来源于Gibco)培养基。细胞培养在37℃条件下，通入含5％二氧化碳(即CO2的体积为5％)培养箱中。
进一步，当细胞密度长至90％-98％时，可以在生物安全柜中进行传代。
步骤二、质粒的转染
对HEK-293T细胞的瞬时转染时，采用脂质体Lipofectamine2000进行转染的。质谱取样实验、电生理实验和成像实验中使用到的质粒有PQLC2-EGFP、Lamp1-mCherry、Lamp2-EGFP、mCherry2-LC3及EGFP-Rab5A等。当涉及共转染的，质粒质量比为1:1。
本实施例的细胞培养在35mm的培养皿中，当HEK-293T细胞长至密度70％时，使用Lipofectamine2000转染目的质粒。2μg质粒(共转染的话，两种质粒各取1μg)和7μLLipofectamine2000分别加入到150μLOpti-MEM Medium中稀释。
将稀释后的质粒和Lipofectamine2000混合至同一个EP管中，吹打混匀。室温条件下静置5min。逐滴加入到培养HEK-293T细胞的细胞培养基中，孵育12h，得到含有溶酶体被标记的细胞。
再用胰蛋白酶消化，以50％-70％细胞密度铺在成像的chamber中，用于共聚焦显微镜成像实验。或者铺在多聚赖氨酸处理过的12mm直径的圆形盖玻片上。用于电生理实验和质谱取样实验。
进一步，在本实施例中，用带mCherry标签的Lamp1(即Lamp1-mCherry)或Rab5A(即EGFP-Rab5A)质粒瞬时转染HEK-293T细胞，标记溶酶体。仅选择被荧光标记的溶酶体进行记录和采样。原代细胞是通过LysoTracker(Invitrogen)孵育以标记溶酶体。
步骤三、单溶酶体膜片钳技术，包括以下步骤：
1.盖玻片处理
12mm直径的圆形盖玻片(ISO9001)的处理方式：
1)在200mL烧杯中加150mL的自来水和两滴洗洁精，将500片玻片拨开放入水中，晃动5-10min。
2)用自来水流水冲洗玻片5-10min，再用超纯水冲洗30遍。
3)用100mL的盐酸(5.3mL体积百分比为36％-38％的浓盐酸定容到100mL)浸泡玻片2天，烧杯口用保鲜膜和锡箔纸封住。
4)再用超纯水冲洗玻片30遍。用分析纯无水乙醇浸没玻片洗3遍。然后再用100mL无水乙醇浸没玻片，并将烧杯口用保鲜膜和锡箔纸封住，室温条件下过夜放置。
5)将烧杯中浸泡玻片的无水乙醇倒掉，用锡箔纸盖住烧杯口，留一个小孔用于无水乙醇挥发，放置在60℃烘箱将玻片烘干。
6)显微镜下检查玻片是否处理干净，再用高压灭菌锅对玻片进行灭菌处理。
7)在细胞间生物安全柜中将灭菌后的玻片倒入10cm的玻璃皿中，室温条件下用0.1mg/mL的多聚赖氨酸(PLL)孵育12h。
8)回收PLL，用灭菌的超纯水洗涤玻片4遍，然后将玻片浸没在超纯水中置于生物安全柜内备用。
2.0.1％多聚赖氨酸溶液的配制
硼酸盐缓冲液的配制(100mL)：0.48g硼酸和0.25g硼酸钠溶于灭菌的超纯水中，定容至100mL。100mg多聚赖氨酸粉末溶于100mL硼酸盐缓冲液中，配制成0.1％多聚赖氨酸溶液。用0.22μm的滤器过滤后，存放在4℃冰箱。
进一步，使用前，用硼酸盐缓冲液将0.1％多聚赖氨酸溶液稀释10倍再使用。
3.溶酶体增大处理
将步骤二转染目的质粒后的含有溶酶体被标记的细胞铺在多聚赖氨酸处理过的12mm直径的玻片上培养12h。
待细胞充分贴壁后，使用1μM vacuolin-1过夜处理，使溶酶体增大。
vacuolin-1是脂溶性多环三嗪，能通过同型膜融合选择性地增加内体和溶酶体的大小。
4.采集电生理数据
使用硼硅酸盐电极进行单溶酶体的内容物取样。质谱取样的玻璃电极拉制比较严格，要求拉制出的电极尖端有5-10mm长、尖端开口直径为0.1-2μm，本实施例优选采用的电极尖端8mm长、尖端开口直径为0.5μm。细长的电极尖端可以减少样品被电极外液稀释的可能。玻璃电极采用两步拉制的方式获得。拉制过程中涉及的参数如表1所示。
表1质谱取样玻璃电极拉制得参数(Ramp＝532)
Figure BDA0003074389190000081
采集电生理数据具体包括以下步骤：
4.1)将vacuolin-1处理后的细胞转移至装有含140mM K-gluconate、4mMNaCl、2mMMgCl2、0.39mM CaCl2和10mM HEPES(用KOH调节的pH 7.2)的电极外液的槽中。
4.2)使用玻璃电极尖端切开细胞膜，手动从细胞中分离出涨大的细胞器(即溶酶体)。
电极内液成分包括：185mM NH4HCO3和80mM NH4Cl。填充电极内液的电极电阻为5-16MΩ。
4.3)形成千兆封接之后，通过ZAP脉冲(1V，0.5-2ms)使膜破裂。
4.4)进行单溶酶体电压钳记录。电压刺激是-70mV，2s；+70mV，2s。每个sweep 10s，电压holding在0mV。
进一步，本发明仅收集具有紧密封接(>1GΩ)的溶酶体进行分析，以确保管腔样品不会被电极外液污染。
5.获得单溶酶体的内容物
采集电生理数据后，通过施加负压来获得单溶酶体的内容物成分。通过观察单溶酶体的体积变化来确认采样是否成功。一旦将腔内成分吸入电极，单溶酶体的体积就会明显减少。
步骤四、质谱分析
将含有单溶酶体内容物的玻璃电极快速从浴液中移出，然后经质谱仪(MS质谱仪)检测对单溶酶体的内容物成分进行定性定量分析，完成单溶酶体质谱分析方法的建立。
步骤五、采用单溶酶体质谱分析方法检测HEK-293T细胞中的单溶酶体代谢物(即单溶酶体内容物中的代谢物)。
步骤六、多个单溶酶体代谢物通过t-SNE聚类分析，将HEK-293T细胞内的溶酶体分成五个亚群(Cluster)，即五类，如图1所示。
使用Thermo Scientific Q Exactive质谱仪获取单溶酶体中的代谢物数据信息，将数据信息导入至XCMS软件包中，设定峰检出(MSWParam)和峰合并(MzClustParam)参数，通过数据预处理可得到代谢物矩阵。然后使用Seurat软件包进行处理，采用基于共享最近邻(SNN)模块优化的聚类算法对溶酶体进行聚类并用t-SNE可视化，将溶酶体分为五个亚群。根据分类信息，对某一簇溶酶体和剩余其他的溶酶体进行Wilcoxon秩和检验，以变化倍数>2和p值<0.05的代谢物为特征代谢物。
图1中的c1、c2、c3、c4、c5分别表示各个亚群，分别为第一亚群Cluster1、第二亚群Cluster2、第三亚群Cluster3、第四亚群Cluster4、第五亚群Cluster5。
每个亚群的特征性代谢物可以作为特定溶酶体亚群的标志物(即标志性代谢物)。
其中，Cluster1的标志物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等阳离子氨基酸；Cluster2的标志物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸等氨基酸衍生物；Cluster3的标志物包括甘油三酯(68:8)、磷脂酰胆碱(30:2)、甘油三酯(62:10)、和甘油二酯(42:3)等脂类；Cluster4的标志物包括丁基肉碱、乙酰肉碱和马来酸均聚物；Cluster5的标志物包括磷脂酰肌醇双磷酸(38:3)、双磷脂酰甘油(72:10)和甘油三酯(31:0)等脂类。
其中，甘油三酯(68:8)中的(68:8)代表烷基链中碳原子的个数为68，双键当量即双键数为8。磷脂酰胆碱(30:2)中的(30:2)代表烷基链中碳原子的个数为30，双键当量即双键数为2。甘油三酯(62:10)中的(62:10)代表烷基链中碳原子的个数为62，双键当量即双键数为10。甘油二酯(42:3)中的(42:3)代表烷基链中碳原子的个数为42，双键当量即双键数为3。磷脂酰肌醇双磷酸(38:3)中的(38:3)代表烷基链中碳原子的个数为38，双键当量即双键数为3。双磷脂酰甘油(72:10)中的(72:10)代表烷基链中碳原子的个数为72，双键当量即双键数为10。甘油三酯(31:0)中的(31:0)代表烷基链中碳原子的个数为31，双键当量即双键数为0。
进一步，其中Cluster2标记为内吞溶酶体，Cluster3标记为自噬溶酶体。
进一步，本发明还公开电极内、外液的配置如下：
电极内液的配制：称取0.5218g NH4HCO3粉末加入到25mL超纯水里。再加入2mL HCl(1mol/L)，此过程会有大量气泡产生。用超声仪或涡旋仪除去反应产生的气泡再使用，以免影响记录的封接以及质谱检测。配制完成后，使用0.22μm的滤器过滤，并分装到EP管中，放置在-20℃冰箱保存。
电极外液的配制(500mL)：烧杯中加入超纯水，并加入16.3975g Kgluconate、400μL NaCl(5mol/L母液)、1mL MgCl2(1mol/L母液)、195μL CaCl2(1mol/L母液)和1.1915gHEPES。用KOH调节pH至7.2。最后再用超纯水定容至500mL。用渗透压仪检测溶液渗透压。将溶液倒入500mL蓝盖瓶，并将溶液的信息标记清楚。4℃冰箱存放，使用前需要过滤分装。
实施例2
Tip尖端(电极尖端)和形状举例
如图2-5所示，其中，图2的Tip1-Tip5中各个玻璃电极的尖端开口直径分别为272nm、340nm、298nm、288nm、310nm，玻璃电极的尖端长度选8mm。
使用具有相似尖端尺寸和形状的玻璃电极进行SLMS的重现性。图2为SLMS玻璃电极的几何特性，5个选定的玻璃移液管尖端的扫描电子显微镜下的图像。比例尺200μm。图3SLMS测量赖氨酸(LYS，相对标准偏差＝7.3％)，图4组氨酸(HIS，相对标准偏差＝8.1％)和图5精氨酸(ARG，相对标准偏差＝7.5％)的重现性。
在人工模拟溶酶体内液(ALF)中加入LYS为5ppm(34μM)，HIS为5ppm(32μM)，ARG为5ppm(28μM)的水平上进行了重复测量。ALF包含145mMNaCl、5mMKCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、10mM HEPES、10mM MES和10mM葡萄糖(用NaOH调节pH至4.6，用蔗糖调节渗透压至296mOsm/kg)。所有数据归一化到Tip1组。
采用本发明的电极尖端结构，可以获得pL/min的喷雾速度并对物质的检测具有较高的重现性和灵敏度，对于赖氨酸(LYS)，组氨酸(HIS)以及精氨酸(ARG)的检测限分别是0.045μM，0.042μM和0.038μM。
实施例3
本实施例中，采用上述实施例建立的单溶酶体质谱分析方法分别对溶酶体与内体的代谢产物进行分别进行检测，并利用特异性标记蛋白标记溶酶体及相关的溶酶体，即在进行转染时，用Rab5(即EGFP-Rab5A)标记内体，用Lamp1(即Lamp1-mCherry)/Lamp2(即Lamp2-EGFP)标记溶酶体。
图7中比例尺是10μm。如图7中的A所示，展示了增大的内体和溶酶体在HEK-293T细胞中的分布。如图7中的B所示，增大的自噬溶酶体和非自噬溶酶体在HEK-293T细胞中的分布，可以观察到同一细胞中既有自噬溶酶体又有非自噬溶酶体，说明同一细胞中的溶酶体也是异质性的。
如图7中的A：增大的溶酶体及内体在HEK-293T细胞中的分布情况。细胞瞬时转染Lamp1-mCherry(在图中用a标记)标记溶酶体，EGFP-Rab5A(在图中用b标记)标记内体。如图7中的B：增大的自噬溶酶体及非自噬溶酶体在HEK-293T细胞中的分布情况。细胞瞬时共转Lamp2-EGFP(在图中用c标记)及mCherry2-LC3(在图中用d标记)标记自噬溶酶体及非自噬溶酶体。Lamp2和LC3共标的是自噬溶酶体，Lamp2单标的是非自噬溶酶体。使用2μMvacuolin-1过夜处理HEK-293T细胞，增大溶酶体及内体。
如图8、9所示，2-Hydroxyatrazine(2-羟基苄去津)在溶酶体中的含量显著性低于在内体。如图10、11所示，Cytosine(胞嘧啶)在溶酶体中的含量显著性高于在内体中的含量。这些差异代谢物可以成为内体或溶酶体的标志物。
本发明柱状图内的数字代表检测的溶酶体数量。
在图12中，内体和溶酶体的代谢物相对含量的比较。图12中横向虚线上方的点代表显著性变化的特征代谢物。数据表示为平均值±标准误，其中*P<0.05，***P<0.001。
如图13-18所示，根据代谢物对溶酶体和内体进行t-SNE聚类分析，发现溶酶体和内体可以很好的分成两群。内体的特征代谢物与溶酶体亚群Cluster2的特征代谢物有很大一部分重叠的，所以溶酶体亚群Cluster2可以归至为内吞溶酶体(Endolysosome)。
根据代谢物对自噬溶酶体和非自噬溶酶体进行t-SNE聚类分析，发现自噬溶酶体和非自噬溶酶体可以分成两群。自噬溶酶体的特征代谢物与溶酶体亚群Cluster3的特征代谢物有很大一部分重叠的，所以溶酶体亚群Cluster3很可以归至为自噬溶酶体(Autolyso)。
如图15、18所示，特异性溶酶体亚群和自溶酶体通过指示相同特征代谢物标记的线连接。
其中，图13的中的比例尺：10μm，符号为1的箭头指向EGFP-Rab5A和Lamp1-mCherry转染的HEK-293T细胞溶酶体，符号为2的箭头指向EGFP-Rab5A和Lamp1-mCherry转染的HEK-293T细胞内核内体。图14中的14表示内体，15表示溶酶体。
图16的中的比例尺：10μm，符号为3的箭头指向Lamp2-EGFP和mCherry2-LC3转染的细胞的自噬溶酶体、符号为4的箭头指向Lamp2-EGFP和mCherry2-LC3转染的细胞的其他溶酶体。图17中位于左上方的类群中的16指向的点表示其他溶酶体，其他的点表示自溶酶体，图17中位于右下方的类群中的17指向的点表示自噬溶酶体，其他的点表示其他溶酶体(即非自噬溶酶体)。
单溶酶体代谢组分析，发现自噬溶酶体内很多物质的相对含量均高于非自噬溶酶体。如表2所示，列了指认出的部分物质。自噬溶酶体的活性比较高，进行活跃的降解活动，这是它的代谢物成分含量较高的原因。
表2自噬溶酶体相对于非自噬溶酶体显著性增多的物质(部分指认出的物质)
Figure BDA0003074389190000131
其中，Ceramide(38:1)中的(38:1)代表烷基链中碳原子的个数为38，双键当量即双键数为1。Trihexosylceramide(42:2)中的(42:2)代表烷基链中碳原子的个数为42，双键当量即双键数为2。PE-Nme(32:2)中的(32:2)代表烷基链中碳原子的个数为32，双键当量即双键数为2。CDP-DG(24:0)中的(24:0)代表烷基链中碳原子的个数为24，双键当量即双键数为0。
实施例4
本发明还公开了一种细胞的冻存和复苏方式。
HEK-293T细胞可以传代培养的细胞系一般会在液氮中冻存，使用时再进行细胞复苏。另外，培养的原代细胞一般不冻存。
细胞冻存和复苏
其中，HEK-293T细胞冻存包括以下步骤：
1)培养在T75培养瓶中的HEK-293T细胞，密度长至80％-90％时，可以冻存。
2)准备一个50mL离心管，加入900μL DMSO(Sigma)，再加入11.1mL的培养基(体积分数10％FBS，体积分数1％青霉素-链霉素和体积分数89％DMEM)，混匀备用。
3)将待冻存的HEK-293T细胞用胰蛋白酶消化下来。首先将T75培养瓶中的培养基吸除，用3mL预热的胰蛋白酶润洗一遍。然后，再加3mL胰蛋白酶，放在37℃二氧化碳培养箱中消化2min。最后，加3mL培养基终止消化，并吹打10下，将细胞吹散，形成细胞悬液。
4)用电动移液枪将6mL细胞悬液吸取，加入到上述准备的50mL离心管中。颠倒混匀。
5)分装到冻存管中，细胞悬液500μL/管，共分36管。然后将冻存管放入程序降温盒中，存放在-80℃冰箱中。第二天再转移到液氮中保存。
其中，HEK-293T细胞的复苏包括以下步骤：
1)准备一个T25培养瓶，加入5mL培养基(体积分数10％FBS，体积分数1％青霉素-链霉素和体积分数89％DMEM)，放入37℃二氧化碳培养箱中预热。
2)从液氮罐中取出1管HEK-293T细胞，放在37℃的水浴锅中快速融化。
3)将细胞悬液吸出，加入到前面准备的T25培养瓶中，倾斜摇晃培养瓶，将细胞混匀。放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
4)12h后，更换新的培养基继续培养即可。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用单溶酶体膜片钳技术处理细胞，获得单溶酶体的内容物；
步骤二、对单溶酶体的内容物进行质谱检测；
步骤三、根据步骤二检测的结果，以内容物中的代谢物为对象，进行溶酶体的分类；
所述步骤三中的溶酶体被分为五个亚群；
所述五个亚群分别为第一亚群、第二亚群、第三亚群、第四亚群、第五亚群；其中，
第一亚群对应的标志性代谢物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸阳离子氨基酸，第二亚群对应的标志性代谢物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸氨基酸衍生物，第三亚群对应的标志性代谢物包括甘油三酯、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯，第四亚群对应的标志性代谢物包括丁基肉碱，乙酰肉碱和马来酸均聚物，第五亚群对应的标志性代谢物包括磷脂酰肌醇双磷酸、双磷脂酰甘油、和甘油三酯；
所述第三亚群中的一个甘油三酯中烷基链中碳原子的个数为68，双键当量即双键数为8，所述第三亚群中的另一个甘油三酯中烷基链中碳原子的个数为62，双键当量即双键数为10，所述第五亚群中甘油三酯的烷基链中碳原子的个数为31，双键当量即双键数为0。
2.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述步骤一中的细胞为HEK-293T细胞、小鼠肺成纤维细胞、膀胱癌细胞、人膀胱上皮永生化细胞、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞的至少一种。
3.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述五个亚群中存在一个亚群标记为内吞溶酶体，存在另一个亚群标记为自噬溶酶体。
4.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述步骤一中的所述单溶酶体膜片钳技术采用的电极其电极尖端长度为5-10mm，电极尖端开口直径为0.1-2μm。
5.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，在进行所述步骤一时，还获得单溶酶体的电生理信号。
6.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，步骤一中，在采用单溶酶体膜片钳技术的玻璃电极对单溶酶体处理之前，进行溶酶体的增大处理。
7.一种单溶酶体代谢物信息的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养细胞；
步骤二、将培养后的细胞进行转染；
步骤三、通过单溶酶体膜片钳技术获取细胞中单溶酶体的电生理信号并获得单溶酶体的内容物；
步骤四、通过质谱检测对内容物的成分进行定性定量分析，获取单溶酶体中代谢物信息；
所述溶酶体分为五个亚群；
所述五个亚群分别为第一亚群、第二亚群、第三亚群、第四亚群、第五亚群；其中，
第一亚群对应的标志性代谢物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸阳离子氨基酸，第二亚群对应的标志性代谢物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸氨基酸衍生物，第三亚群对应的标志性代谢物包括甘油三酯、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯，第四亚群对应的标志性代谢物包括丁基肉碱，乙酰肉碱和马来酸均聚物，第五亚群对应的标志性代谢物包括磷脂酰肌醇双磷酸、双磷脂酰甘油、和甘油三酯；
所述第三亚群中的一个甘油三酯中烷基链中碳原子的个数为68，双键当量即双键数为8，所述第三亚群中的另一个甘油三酯中烷基链中碳原子的个数为62，双键当量即双键数为10，所述第五亚群中甘油三酯的烷基链中碳原子的个数为31，双键当量即双键数为0。
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