WO2012147933A1 - リソソーム病治療用医薬組成物 - Google Patents

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恵一 大薗
孝信 大友
規夫 酒井
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国立大学法人大阪大学
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    • C12Y302/01051—Alpha-L-fucosidase (3.2.1.51)
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    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/14—Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases (3.4.14)
    • C12Y304/14001—Dipeptidyl-peptidase I (3.4.14.1), i.e. cathepsin-C
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/16—Serine-type carboxypeptidases (3.4.16)
    • C12Y304/16005—Carboxypeptidase C (3.4.16.5), i.e. carboxypeptidase Y
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22001—Cathepsin B (3.4.22.1)
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22038—Cathepsin K (3.4.22.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23005—Cathepsin D (3.4.23.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23034—Cathepsin E (3.4.23.34)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating lysosomal disease.
  • the lysosome is one of the organelles in the cell and decomposes various substances (foreign substances, unnecessary substances, etc.) in the cell by the action of lysosomal enzymes existing in the lysosome. Lysosomal enzymes are said to be more than 50 types and have an optimum pH in an acidic environment. When a lysosomal enzyme is deficient due to a genetic defect, the substrate accumulates in the cell, causing a series of lysosomal diseases. Currently, over 40 types of such congenital lysosomal diseases are known, but no fundamental treatment has been found.
  • Lysosomal disease is treated by supplementing the missing enzyme, and enzyme replacement therapy, bone marrow transplantation and gene therapy are being tried. To date, many lysosomal enzymes have been identified and associated with lysosomal diseases.
  • Recombinant enzymes produced using cell lines that strongly express one specific type of lysosomal enzyme have been developed for enzyme replacement therapy. To date, such a single recombinant lysosomal enzyme has been used.
  • Types of enzyme preparations Gaucher's disease therapeutic agent Selezyme (registered trademark) (imiglucerase recombinant enzyme preparation), Fabry disease therapeutic agent Fabrazyme (registered trademark) (Agalsidase beta recombinant enzyme preparation), Fabry disease therapeutic agent Ripregal (registered trademark) ) (Agarsidase alpha recombinant enzyme preparation), Mucopolysaccharidosis type I therapeutic agent Audrazyme (registered trademark) (Lalonidase recombinant enzyme preparation), Mucopolysaccharidosis type II therapeutic agent Myozyme (registered trademark) (alglucosidase alpha recombinant enzyme preparation), Elaplace (registered trademark) for treatment of mucopoly
  • ML-II mucolipidosis type II
  • ML-III mucolipidosis type III
  • GlcNAc-phosphotransferase that adds a mannose 6-phosphate residue to a lysosomal enzyme synthesized in a cell.
  • ML-II and ML-III mannose 6-phosphate residues are not added to lysosomal enzymes synthesized in cells due to abnormalities in GlcNAc-phosphotransferase, so lysosomal enzymes are not recognized by mannose 6-phosphate receptors. , Not transported to lysosomes. Therefore, ML-II and ML-III patients are deficient in almost all of the lysosomal enzymes in the lysosome. Therefore, the treatment of ML-II and ML-III is ineffective with the administration of a single enzyme preparation as described above, and theoretically, it is considered necessary to replace all of the deficient lysosomal enzymes.
  • An object of the present invention is to easily and inexpensively provide a pharmaceutical composition containing a plurality of lysosomal enzymes, which is effective for the treatment of lysosomal diseases caused by a plurality of lysosomal enzyme deficiencies.
  • the present inventors have added a specific reagent such as ammonium chloride to a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease and cultured, and recovered the culture supernatant. Then, it was found that, by purification, many types of lysosomal enzymes can be obtained at a time in a state modified with mannose 6-phosphate residues. In addition, the inventors have found that various types of lysosomal enzymes obtained can be used as therapeutic agents for lysosomal diseases, and have completed the present invention.
  • a specific reagent such as ammonium chloride
  • the present invention (1) A pharmaceutical composition for treating lysosomal disease comprising, as an active ingredient, a lysosomal enzyme group obtained by culturing cells, (2) The pharmaceutical composition according to the above (1), wherein the cell has a function of adding a mannose 6-phosphate residue to a lysosomal enzyme, (3) The pharmaceutical composition according to the above (1), wherein the cell is a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease, (4)
  • the lysosomal enzyme group has the following steps: Culturing the cells with one or more reagents selected from the group consisting of amphipathic amines, lysosome-directed amines, ionophores, and V-ATPase inhibitors; Collect the culture supernatant, Purifying and / or concentrating the resulting culture supernatant;
  • any one of (1) to (5) above, wherein the cells are selected from the group consisting of normal skin fibroblasts, COS-1 cells, NIH3T3 cells, HEK293 cells, HeLa cells, and CHO cells.
  • the present invention adds a reagent selected from the group consisting of an amphipathic amine, a lysosome-directed amine, an ionophore, and a V-ATPase inhibitor to the cells and cultures, and recovers the culture supernatant
  • a method for preparing a group of lysosomal enzymes provides the use of a group of lysosomal enzymes obtained by culturing cells for the treatment of lysosomal disease.
  • the present invention provides a method for treating lysosomal disease, comprising administering to a patient a group of lysosomal enzymes obtained by culturing cells.
  • the present invention provides the use of a lysosomal enzyme group obtained by culturing cells for the production of a pharmaceutical composition for treating lysosomal disease.
  • a pharmaceutical composition containing a plurality of lysosomal enzymes which is effective for the treatment of lysosomal diseases caused by a deficiency or decreased activity of a plurality of lysosomal enzymes.
  • Normal is normal cells
  • ML-II is cells derived from ML-II patients
  • ML-II + tERT is derived from ML-II patients treated with total enzyme replacement therapy (hereinafter referred to as tERT) Cells are shown.
  • the unit of enzyme activity is “nmol / h / mg protein”. It is a graph which shows intracellular uptake
  • the unit of enzyme activity is “nmol / h / mg protein”.
  • the horizontal axis indicates the number of days before and after the addition of lysosomal enzyme.
  • the left vertical axis shows the enzyme activities of ⁇ -mannosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, and galactocerebrosidase.
  • the right vertical axis shows the enzyme activities of total ⁇ -hexosaminidase and ⁇ -hexosaminidase A. It is a graph which shows the result of the competitive inhibition test with a lysosomal enzyme and mannose 6-phosphate. The unit of enzyme activity is “nmol / h / mg protein”. It is a graph which shows the result of the competitive inhibition test with a lysosomal enzyme and mannose 6-phosphate. The unit of enzyme activity is “nmol / h / mg protein”.
  • “ML-II + tERT” indicates a cell derived from a ML-II patient treated with tERT. The phospholipid accumulated in the cells (FIG. 7a) and the amount of cholesterol (FIG. 7b) are shown. “Normal” indicates normal cells, “ML-II” indicates ML-II patient-derived cells, and “ML-II + tERT” indicates tERT-treated ML-II patient-derived cells. It is a photograph which shows the result of Western blotting of LC3. “Normal” indicates normal cells, “Non” indicates cells derived from ML-II patients not subjected to tERT treatment, and “tERT” indicates cells derived from ML-II patients treated by tERT.
  • Normal is a normal cell
  • Krabe is a cell derived from a Krabbe disease patient
  • Krabe + tERT is a cell derived from a Krabbe disease patient treated with tERT
  • Tiy-Sachs is a cell derived from a Tay-Sachs disease
  • Tiay-Sachs + tERT Indicates a cell derived from a Tay-Sachs disease patient treated with tERT.
  • the unit of enzyme activity is “nmol / h / mg protein”.
  • one type of cell may be cultured to obtain a lysosomal enzyme group, or a plurality of types of cells may be cultured to obtain a lysosomal enzyme group.
  • a cell used in the present invention a cell having a function of adding a mannose 6-phosphate residue to a lysosomal enzyme or a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease is preferably used.
  • the “cell having a function of adding a mannose 6-phosphate residue” includes, for example, a cell derived from a subject not suffering from a disease caused by abnormality of GlcNAc-phosphotransferase, and normal GlcNAc-phosphotransferase The cell which has is mentioned.
  • a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease means a normal cell derived from a healthy subject and a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease but suffering from another disease.
  • the subject is a mammalian subject, such as a human, monkey, cow, dog, cat, mouse, rat, hamster, rabbit, marmoset, sheep, goat, etc., preferably a human.
  • the cells used in the present invention may be mutant cells or non-mutant cells.
  • the “mutant” includes natural mutants and artificial gene recombinants.
  • Examples of mutant cells include cells in which TFEB (Science 325, 473-477, 2009) has been introduced by gene recombination techniques to increase the expression level of lysosomal enzymes.
  • the cell used in the present invention may be a commercially available cell or a cell directly collected from the subject. Alternatively, it may be a publicly available cultured cell such as an established cell line or deposited strain.
  • Examples of cells used in the present invention include, but are not limited to, cells derived from skin, kidney, embryo, ovary, uterus, etc., preferably skin fibroblasts, kidney fibroblasts, embryonic cells Fibroblasts and the like, more preferably normal skin fibroblasts, COS-1 cells, NIH3T3 cells, HEK293 cells, HeLa cells, CHO cells and the like, and more preferably normal human fibroblasts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, a lysosomal enzyme group obtained from the above cultured cells (hereinafter referred to as “the lysosomal enzyme group of the present invention”).
  • the lysosomal enzyme group of the present invention is an enzyme mixture composed of two or more types of lysosomal enzymes obtained by culturing the cells, and includes a lysosomal enzyme having a mannose 6-phosphate residue.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention is, for example, 5 or more, 8 or more, or 12 or more, preferably 20 or more, more preferably 30 or more, still more preferably 40 or more, and most preferably 50 or more. Of lysosomal enzymes.
  • the lysosomal enzyme of the lysosomal enzyme group of the present invention is preferably a wild-type enzyme, not a recombinant enzyme.
  • “recombinant enzyme” refers to an enzyme produced by incorporating a gene encoding an enzyme into a host cell by a genetic recombination technique.
  • the “wild type enzyme” refers to an enzyme that the cell originally has. When the lysosomal enzyme is wild type, administration of the lysosomal enzyme group to the human body is safer.
  • lysosomal enzymes included in the group of lysosomal enzymes of the present invention include ⁇ -mannosidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -hexosaminidase (for example, ⁇ -hexosaminidase) -Hexosaminidase A, ⁇ -hexosaminidase B, ⁇ -hexosaminidase S), ⁇ -glucuronidase, galactocerebrosidase, cathepsin (eg cathepsin A, cathepsin B, cathepsin C, cathepsin D, cathepsin E , Cathepsin K, etc.), ⁇ -L-iduronidase, arylsulfatase, N-acety
  • the lysosomal enzyme group of the present invention preferably contains at least ⁇ -mannosidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -hexosaminidase, ⁇ -glucuronidase, galactocerebrobromide.
  • the group of lysosomal enzymes of the present invention includes all types of lysosomal enzymes contained in lysosomes of normal cells.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention can be obtained from the cultured cells using known means / methods.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention is cultured by adding an appropriate reagent such as ammonium chloride (hereinafter referred to as “enzyme extraction reagent”) to the cells, and culturing the resulting culture supernatant using known means, It can be obtained by purification and / or concentration using methods.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention can be obtained, for example, by culturing a cell derived from a subject not suffering from lysosomal disease and extracting the obtained cell using a known means / method.
  • a step of adding an appropriate enzyme extraction reagent to cells derived from a subject not suffering from lysosomal disease, culturing, collecting the culture supernatant, and purifying and / or concentrating the obtained culture supernatant Obtained by a method comprising:
  • the culture conditions such as medium composition, medium temperature, and culture time for the cell culture can be appropriately selected according to the type and amount of cells used.
  • Any suitable enzyme extraction reagent to be added to the cell may be any reagent that can drain the lysosomal enzyme contained in the lysosome of the cell into the culture supernatant.
  • an amphiphilic agent such as ammonium chloride.
  • examples thereof include lysosome-directed amines such as amine and chloroquine, ionophores such as monensin or nigericin, and V-ATPase inhibitors such as bafilomycin A1.
  • One or more types of enzyme extraction reagents may be added to the cells.
  • one or more reagents selected from the group consisting of ammonium chloride, chloroquine, monesin, nigericin, and bafilomycin A1 are added to the cells. More preferably, one or more reagents selected from the group consisting of ammonium chloride, chloroquine, and bafilomycin A1 are added to the cells.
  • the present invention is the first attempt to use a lysosome group obtained by adding a reagent as described above to a cell and culturing the same for the treatment of lysosomal disease.
  • the amount of the enzyme extraction reagent is not particularly limited as long as the lysosomal enzyme can be discharged from the lysosome.
  • ammonium chloride for example, it may be used at a concentration of 15 mM or more in the culture medium, for example, about 20 mM in the culture medium.
  • chloroquine for example, it may be used at a concentration of 15 ⁇ M or more in the culture medium, for example, about 20 ⁇ M in the culture medium.
  • bafilomycin A1 for example, it may be used at a concentration of 15 nM or more in the culture medium, for example, about 20 nM in the culture medium.
  • the cells are cultured to obtain a culture supernatant.
  • the culture period after addition of the reagent is not particularly limited as long as a sufficient amount of lysosomal enzyme is excreted in the culture supernatant, but usually several days or longer, for example, 3 days, 5 days, Cells are cultured for a period of 7 days, 10 days, 14 days or longer.
  • the culture supernatant can be collected by a conventional method, and examples thereof include a filtration method and a centrifugation method. After recovering the culture supernatant, the reagent for enzyme extraction and impurities are removed from the culture supernatant by purification.
  • the culture supernatant can be purified by a conventional method, for example, solvent extraction, precipitation with an organic solvent, filtration such as ultrafiltration, affinity chromatography using mannose 6-phosphate receptor column or mannose 6-phosphate antibody. And chromatography methods such as affinity chromatography such as chromatography, hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography, and salting out methods.
  • the culture supernatant may be concentrated by a conventional method, and examples thereof include ultrafiltration and salting out.
  • the culture supernatant may be appropriately purified and concentrated to a desired level.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention thus obtained contains many kinds of enzymes contained in the lysosome of cultured cells, and preferably contains all kinds of lysosomal enzymes. Moreover, since the lysosomal enzyme group is obtained by discharging normal lysosomal enzymes already present in the lysosome, it can contain a lysosomal enzyme modified with a mannose 6-phosphate residue. Therefore, according to the present invention, many kinds of lysosomal enzymes having mannose 6-phosphate residues can be obtained at one time without the need for adding a mannose 6-phosphate residue, and thus the lysosomal disease can be easily treated. Can be used for treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be the lysosomal enzyme group of the present invention itself, or a pharmaceutically acceptable carrier, stabilizer, buffer, extender, binder, disintegrant, Together with additives or excipients such as flavoring agents, coloring agents, and flavoring agents, it can be made into appropriate dosage forms such as injections, tablets, capsules, granules, fine granules, powders and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include physiological saline, dextrose, glycerol, animal oil, vegetable oil and the like. In particular, water, physiological saline, dextrose, and glycerol are preferably used for injections. Used as a carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, orally or parenterally, for example, by intravenous injection, intraventricular injection, intrathecal injection, intramuscular injection, or the like, or transdermally. it can.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined depending on the age, weight, symptoms, route of administration, etc. of the patient.
  • lysosomal enzymes included in the lysosomal enzyme group of the present invention are modified with a mannose 6-phosphate residue, they are taken into the cells and lysosomes of the subject after administration to the subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is effective for the treatment of lysosomal diseases caused by a single or multiple lysosomal enzyme deficiency or decreased activity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is effective for the treatment of mucolipidosis type II and mucolipidosis type III.
  • lysosomal diseases to be treated by the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, for example, aspartylglucosamineuria, Fabry disease, infantile batten disease (CNL1), classical late-onset infant type Batten disease (CNL2), Farber disease, fucosidosis, Galactosialidosis ants dough cis, Gaucher disease type 1, type 2 and type 3, G M1 - gangliosidosis, Hunter syndrome, Hurler syndrome, Hurler-Scheie syndrome, Scheie syndrome, Krabbe's disease, ⁇ -mannosidosis, ⁇ -mannosidosis, Maroto Lamy syndrome, metachromatic leukodystrophy, Morquio syndrome type A, Morquio syndrome type B, mucolipidosis type II / III, Niemann-Pick disease type A and type B , Pompe disease, Sandhoff disease, San Filippo syndrome type A, San Filippo Symptom group type B, Sanfilippo syndrome type C, Sanfilippo syndrome type D, Schindler
  • the lysosomal enzyme group of the present invention can be used for the production of a single enzyme preparation by further purification.
  • the lysosomal enzyme group of the present invention can also be used as a lysosomal enzyme reagent for research.
  • Lysosomal Enzyme Group DMEM medium (hereinafter “Standard”) containing 10% FBS (fetal bovine serum) and recommended amount of antibiotic / antibacterial agent (Gibco® Antibiotic-Americytic, Life Technologies) in a 10 cm culture dish.
  • Ammonium chloride was added to normal skin fibroblasts cultured to a confluent state in a culture medium) to a concentration of 20 mM in the medium and cultured. After 7 days in culture, the supernatant was collected and filtered through a 0.2 ⁇ m sterile filter to remove large cell debris and viable cells.
  • the lysosomal enzyme activity in the supernatant after filtration was measured by the following method.
  • the culture supernatant was centrifuged at 0 ° C. with a spin column of a molecular weight filter (Vivaspin 15R, Sartorius Stedim Biotech GmbH) with a molecular weight cut off of 5000 to remove ammonium chloride.
  • the obtained lysosomal enzyme group was finally diluted with serum-free DMEM so that the ⁇ -mannosidase activity was 600 nmol / h / ⁇ L, and used as a sample in the following examples.
  • the enzyme activity during use in the sample was as follows: ⁇ -mannosidase 364.6 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -fucosidase 38.4 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -galactosidase 5.6 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -glucosidase 10.3 nmol / H / ⁇ L, ⁇ -galactosidase 35.0 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -glucosidase 25.9 nmol / h / ⁇ L, total ⁇ -hexosaminidase 2650.4 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -hexosaminidase A 522 0.9 nmol / h / ⁇ L, ⁇ -glucuronidase 14.3 nmol / h / ⁇ L, and galactocerebrosidase 0.57 n
  • the measuring method of enzyme activity follows the following.
  • the tERT in the following examples was performed by adding the sample to the medium and culturing the cells for 7 days. Then, each assay was performed within 24 hours by replacing the culture medium with a normal standard culture medium.
  • lysosomal enzyme activity was measured using the culture supernatant after the above ammonium chloride addition culture.
  • ML-II cells normal dermal fibroblast culture supernatant without ammonium chloride and ML-II patient-derived skin fibroblasts without addition of ammonium chloride.
  • the lysosomal enzyme activity in the culture supernatant was measured.
  • the activity of lysosomal enzymes was measured by standard methods using a synthetic 4-methylumbelliferyl substrate.
  • the culture supernatant of normal skin fibroblasts supplemented with ammonium chloride contained at least 10 lysosomal enzymes ( ⁇ -mannosidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ - Galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ -hexosaminidase B, ⁇ -glucuronidase, and galactocerebrosidase).
  • the enzyme activity pattern in the culture supernatant was similar to the enzyme activity pattern in the culture supernatant of ML-II cells.
  • ML-II since the mannose 6-phosphate residue is not added to the lysosomal enzyme, the lysosomal enzyme is not recognized by the mannose 6-phosphate receptor and is not transported to the lysosome, so that the lysosomal enzyme is depleted in the lysosome, The lysosomal enzyme to which mannose 6-phosphate residue is not added overflows outside the cell. Therefore, many types of lysosomal enzymes are contained in the culture supernatant of ML-II cells. This agrees with the enzyme activity measurement result of the culture supernatant of ML-II cells.
  • Example 1 Confirmation of intracellular uptake of lysosomal enzyme group
  • the lysosomal enzyme group obtained in Example 1 is administered to ML-II cells and tERT is performed to confirm that the lysosomal enzyme is incorporated into the cell in an active state. Therefore, intracellular lysosomal enzyme activity was measured.
  • the lysosomal enzyme group sample obtained in Example 1 was added to the culture medium of ML-II cells. After culturing for a predetermined period, the cells were isolated from the culture medium and sonicated in water containing a protease inhibitor. The protein concentration of the resulting suspension was measured by a conventional method. The lysosomal enzyme activity was measured by the method described in Example 1 using the obtained suspension.
  • Enzyme activity was calculated as nmol / h / mg protein.
  • normal skin fibroblasts and ML-II cells not treated with tERT were used. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 2, since tERT increased intracellular lysosomal enzyme activity, it was confirmed that the lysosomal enzyme was taken into the cell.
  • FIG. 3 shows the uptake of lysosomal enzymes into ML-II cells over time. The lysosomal enzyme was taken up into the cell continuously for at least 7 days. Since intracellular enzyme activity continued to rise for 7 days, the above evaluation of this example was performed using cells collected 7 days after tERT treatment. Also in Examples 4 to 9 below, cells 7 days after the tERT treatment were used.
  • Mannose 6-phosphate competitive inhibition test In order to confirm that lysosomal enzymes are incorporated into cells via mannose 6-phosphate receptors on the cell surface, mannose 6-phosphate is co-administered to inhibit intracellular uptake. Were tested. The lysosomal enzyme group sample obtained in Example 1 was added to the culture medium of ML-II cells, and at the same time, mannose 6-phosphate was not added (0 mM), or mannose 6-phosphate was added to 5 mM or 10 mM. did. After culturing the cells for a predetermined time, intracellular enzyme activity was measured by the same method as in Example 1 and Example 2. The results are shown in FIG. Uptake of lysosomal enzymes into cells was competitively inhibited by mannose 6-phosphate in a concentration-dependent manner.
  • ML-II cells were treated with tERT as described in Example 1 and fluorescently stained by the following method. As controls, normal skin fibroblasts and ML-II cells not treated with tERT were used. Cells were fixed with 3.7% formaldehyde for 1 hour, then permeabilized with 0.1% Triton-X100 for 15 minutes, and blocked with 1% bovine serum albumin for 1 hour at room temperature.
  • monoclonal anti-Lamp-2 antibody H4B4
  • polyclonal anti-cathepsin B antibody S-12
  • polyclonal anti-cathepsin D antibody H-75
  • polyclonal anti- ⁇ -glucosidase antibody H-300
  • the secondary antibody Alexa Fluor 488 or 555, Invitrogen
  • LysoTracker Red DND-99 was used at a concentration of 0.2 ⁇ M and treated at 37 ° C.
  • ⁇ -glucosidase In the case of ⁇ -glucosidase, there was no difference in immunostaining results between normal cells, ML-II cells, and tERT-treated ML-II cells. Furthermore, it was confirmed that ⁇ -glucosidase was normal in the enzyme activity test (see FIG. 2) and was not affected in the mannose 6-phosphate competitive inhibition test (see FIG. 4). Among lysosomal enzymes, ⁇ -glucosidase has been proven to be transported to lysosomes by a protein called LIMP-2, rather than a mannose 6-phosphate-dependent transport system (Reczek D, et al., Cell). 2007; 131 (4): 770-83). Therefore, ML-II cells are not deficient in ⁇ -glucosidase. This previous finding is consistent with the experimental results.
  • tERT effect on autophagy and mitochondrial abnormalities
  • normal cells and ML-II cells not treated with tERT were used.
  • ML-II cells were treated with tERT as described in Example 1 and the amount of LC3-II was measured by Western blotting.
  • primary antibodies polyclonal anti-LC3 antibody (PM036) and polyclonal anti- ⁇ -actin HRP DirecT antibody (PM053-7) (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japan) were used. The results are shown in FIG. tERT decreased the amount of LC3-II.
  • fluorescent immunostaining was performed as described in Example 4.
  • MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes Inc. # 7512) was used as a mitochondrial marker for 1 hour at 37 ° C. at a concentration of 200 nM.
  • Polyclonal anti-LC3 antibody (PM036) (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japan) was used as an autophagy marker. Observation with a fluorescence microscope confirmed that tERT reduced LC3 vesicles and clearly improved mitochondrial morphology.
  • ML-II lysosome number and morphology
  • Inclusion bodies are caused by accumulation of lysosomal substrates that cannot be decomposed due to abnormal lysosomal enzymes, and at the same time, the number of lysosomes increases significantly.
  • the effect of tERT on these phenomena was evaluated by the following method. As controls, normal cells and ML-II cells not treated with tERT were used. ML-II cells were treated with tERT as described in Example 1 and cells were harvested using trypsin by standard methods and placed in small tubes.
  • the cell pellet was resuspended in standard culture medium containing both LysoTracker Red DND-99 (1 ⁇ M) and DAPI (1 ⁇ g / ml) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the cells were collected by centrifugation, rinsed once with PBS, and then resuspended in PBS. Using a microplate reader (Vorona Fluorescence Microplate Reader MTP810Lab), the fluorescence intensity of the cell suspension was measured using an excitation wavelength of 530 nm / emission wavelength of 590 nm (in the case of LysoTracker) and excitation wavelength of 365 nm / emission wavelength of 450 nm (in the case of DAPI).
  • BODIPY-Cer Fluorescently labeled ceramide
  • Mannose 6-phosphate receptor uptake test Using antibodies against mannose 6-phosphate receptor, the intracellular transport of the antibody incorporated through the receptor on the cell surface was evaluated.
  • Cells were incubated in standard culture medium containing mannose 6-phosphate receptor antibody [monoclonal anti-mannose 6-phosphate receptor antibody (2G11) (Abcam)] at a concentration of 1:75.
  • mannose 6-phosphate receptor antibody monoclonal anti-mannose 6-phosphate receptor antibody (2G11) (Abcam)
  • 2G11 monoclonal anti-mannose 6-phosphate receptor antibody
  • ⁇ -Gal is ⁇ -galactosidase
  • total ⁇ -Hex is total ⁇ -hexosaminidase
  • ⁇ -Hex A is ⁇ -hexosaminidase A
  • ⁇ -Gluc is ⁇ -glucosidase.
  • ⁇ -Man is ⁇ -mannosidase
  • ⁇ -Fuc is ⁇ -fucosidase
  • ⁇ -Gluc is ⁇ -glucosidase
  • ⁇ -Gal is ⁇ -galactosidase
  • ⁇ -Glucuro is ⁇ -glucuronidase
  • ⁇ -Iduro is ⁇ -L-iduronidase
  • GALC indicates galactocerebrosidase.
  • SCM indicates a standard culture medium without any reagent added.
  • CQ represents chloroquine and Bafilo represents bafilomycin A1.
  • Enzyme activity is expressed in nmol / h / ⁇ L.
  • ⁇ -Gal is ⁇ -galactosidase
  • total ⁇ -Hex is total ⁇ -hexosaminidase
  • ⁇ -Hex A is ⁇ -hexosaminidase A
  • ⁇ -Gluc is ⁇ -glucosidase
  • ⁇ - Man is ⁇ -mannosidase
  • ⁇ -Fuc is ⁇ -fucosidase
  • ⁇ -Gluc is ⁇ -glucosidase
  • ⁇ -Gal is ⁇ -galactosidase
  • ⁇ -Glucuro is ⁇ -glucuronidase
  • ⁇ -Iduro is ⁇ -L-iduronidase
  • GALC is Galactocerebrosidase is shown.
  • NH 4 Cl ( ⁇ ) indicates a culture supernatant when ammonium chloride is not added
  • NH 4 Cl (+) indicates a culture supernatant when ammonium chloride is added.
  • Enzyme activity is expressed in nmol / h / ⁇ L.
  • the lysosomal enzyme group sample obtained in Example 1 was used as skin fibroblasts from patients with Krabbe disease and Tay-Sachs disease (hereinafter referred to as “Krabbe disease cells” and “ Was added to the culture medium of “Tay-Sachs disease cells” and cultured for 7 days.
  • the cells were isolated from the culture medium, sonicated in water containing a protease inhibitor, and the protein concentration of the resulting suspension was measured by a conventional method.
  • the lysosomal enzyme activity was measured by the method described in Example 1 using the obtained suspension. Enzyme activity was calculated as nmol / h / mg protein.

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Abstract

　本発明は、複数のリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することを目的とし、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞から得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物を提供する。

Description

リソソーム病治療用医薬組成物
　本発明は、リソソーム病治療用医薬組成物に関する。
　リソソームは、細胞内小器官の１つであり、リソソーム内に存在するリソソーム酵素の働きにより細胞内の様々な物質（異物や不要物等）を分解している。リソソーム酵素は、５０種類以上あると言われ、酸性環境に最適ｐＨを有する。遺伝的欠陥によりリソソーム酵素が欠損すると、細胞内に基質が蓄積し、一連のリソソーム病を引き起こす。このような先天性のリソソーム病は、現在４０種類以上知られているが、根本的な治療法は見出されていない。
　リソソーム病は、欠損した酵素を補うことによって治療され、酵素補充療法、骨髄移植および遺伝子治療が試みられている。今までに多くのリソソーム酵素が同定され、リソソーム病と関連付けられている。
　酵素補充療法のために、特定の一種類のリソソーム酵素を強発現する細胞株を用いて生産した組み換え酵素が開発されており、現在までに、このような単一の組み換えリソソーム酵素を用いた７種類の酵素製剤、すなわち、ゴーシェ病治療剤セレザイム（登録商標）（イミグルセラーゼ組み換え酵素製剤）、ファブリー病治療剤ファブラザイム（登録商標）（アガルシダーゼベータ組み換え酵素製剤）、ファブリー病治療剤リプレガル（登録商標）（アガルシダーゼアルファ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症Ｉ型治療剤アウドラザイム（登録商標）（ラロニダーゼ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症ＩＩ型治療剤マイオザイム（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症ＩＩ型治療剤エラプレース（登録商標）（イデュルスルファーゼ組み換え酵素製剤）、およびムコ多糖症ＶＩ型治療剤ナグラザイム（登録商標）（ガルスルファーゼ組み換え酵素製剤）が販売されている。
　しかしながら、いずれも、単一のリソソーム酵素の欠損が原因のリソソーム病の治療を目的としており、複数のリソソーム酵素が欠損しているリソソーム病に対して有効ではない。さらに、現在販売されている上記治療剤は非常に高価であり、安価な治療剤の開発が求められる。
　細胞内で合成されたリソソーム酵素は、マンノース６リン酸残基を付加されることにより、マンノース６リン酸受容体を介してリソソームに輸送されることが知られている。
　この事実に基づき、リソソーム病の酵素補充療法において欠損酵素を効果的にリソソーム中に送達させるために、高リン酸化されたリソソーム酵素を得る研究が進められている。例えば、単離したリソソーム酵素をマンノース６リン酸残基で修飾する方法や（特許文献１参照）、特殊な細胞系を用いて高リン酸化された組み換えリソソーム酵素を作製する方法（特許文献２参照）が報告されている。しかしながら、これらの技術では、多種類のリソソーム酵素を一度に且つ安価に製造することは難しい。
　複数のリソソーム酵素が欠損しているリソソーム病の例として、ムコリピドーシスＩＩ型（以下、「ＭＬ－ＩＩ」という）およびその軽症型であるムコリピドーシスＩＩＩ型（以下、「ＭＬ－ＩＩＩ」という）が挙げられる。これらのリソソーム病は、細胞内で合成されたリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する酵素ＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼの異常が原因の疾患である。ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ－ＩＩＩでは、ＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼの異常により、細胞内で合成されたリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基が付加されないため、リソソーム酵素がマンノース６リン酸受容体に認識されず、リソソームへ運搬されない。そのため、ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ－ＩＩＩ患者は、リソソーム中においてリソソーム酵素のほとんど全てが欠損している。
　したがって、ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ－ＩＩＩの治療には、上記したような単一酵素製剤の投与では効果がなく、理論上、欠損したリソソーム酵素の全てを補充する必要があると考えられる。しかしながら、ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ－ＩＩＩにおいて欠損した５０種類以上もの酵素の全てを個々に単離・精製することは非常に困難である。また、上記したような組み換えリソソーム酵素製剤は非常に高価なので、このような高価な酵素製剤を数十種類用いることは、経済的にも困難である。
　このような情況から、ＭＬ－ＩＩおよびＭＬ－ＩＩＩのようなリソソーム病には、従来の単一組み換えリソソーム酵素を用いた酵素製剤は適用できず、新たな有用な治療剤が求められている。
特表２００３－５０９０４３号 特表２００７－５２３６４８号
　本発明は、複数のリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞に塩化アンモニウム等の特定の試薬を添加して培養し、培養上清を回収し、精製することにより、多種類のリソソーム酵素をマンノース６リン酸残基で修飾された状態で、一度に得ることができることを見出した。また、得られた多種類のリソソーム酵素がリソソーム病の治療剤として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本願発明は、
（１）細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物、
（２）細胞がリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞である、上記（１）記載の医薬組成物、
（３）細胞がリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞である、上記（１）記載の医薬組成物、
（４）リソソーム酵素群が下記工程：
　　細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ－ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
　　培養上清を回収し、
　　得られた培養上清を精製および／または濃縮する、
ことを含む方法により得られたものである、上記（１）～（３）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（５）試薬が、塩化アンモニウム、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、上記（４）記載の医薬組成物、
（６）細胞が正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択されるものである、上記（１）～（５）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（７）リソソーム酵素が組み換え酵素ではない、上記（１）～（６）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（８）リソソーム酵素群がマンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含むものである、上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の医薬組成物、および
（９）ムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型の治療用である、上記（１）～（８）のいずれか１つに記載の医薬組成物
を提供する。
　さらなる態様として、本発明は、細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ－ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される試薬を添加して培養し、培養上清を回収することを含む、リソソーム酵素群の調製方法を提供する。
　また別の態様として、本発明は、リソソーム病の治療のための、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群の使用を提供する。
　また別の態様として、本発明は、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を患者に投与することを含む、リソソーム病の治療方法を提供する。
　また別の態様として、本発明は、リソソーム病治療用医薬組成物の製造のための、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群の使用を提供する。
　本願発明によれば、複数のリソソーム酵素の欠損または活性低下に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することができる。
細胞培養上清中の各リソソーム酵素の活性を示すグラフである。各酵素活性は、正常細胞の培養上清中の酵素活性に対する比率（倍）で表す。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞培養上清、「Ｎｏｒｍａｌ＋ＮＨ４Ｃｌ」は塩化アンモニウムを添加した正常細胞培養上清、「ＭＬ－ＩＩ」はＭＬ－ＩＩ患者由来細胞の培養上清を示す。 細胞内のリソソーム酵素活性を示すグラフである。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「ＭＬ－ＩＩ」はＭＬ－ＩＩ患者由来細胞、「ＭＬ－ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は全酵素補充療法（ｔｏｔａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔｈｅｒａｐｙ）（以下、ｔＥＲＴという）で処理したＭＬ－ＩＩ患者由来細胞を示す。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ」である。 リソソーム酵素の経時的な細胞内取り込みを示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ」である。横軸は、リソソーム酵素添加前および添加後の日数を示す。左縦軸は、α－マンノシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼの酵素活性を示す。右縦軸は、総β－へキソサミニダーゼ、およびβ－ヘキソサミニダーゼＡの酵素活性を示す。 リソソーム酵素とマンノース６リン酸との競合阻害試験の結果を示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ」である。 リソソーム酵素とマンノース６リン酸との競合阻害試験の結果を示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ」である。 リソソーム酵素の細胞内分布を示す蛍光顕微鏡写真である。「Ｌａｍｐ－２」はリソソームマーカーを示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、カテプシンＢとＬａｍｐ－２の画像を重ねた画像である。「ＭＬ－ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は、ｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ患者由来細胞を示す。 リソソーム酵素の細胞内分布を示す蛍光顕微鏡写真である。「Ｌａｍｐ－２」はリソソームマーカーを示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、カテプシンＤとＬａｍｐ－２の画像を重ねた画像である。「ＭＬ－ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は、ｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ患者由来細胞を示す。 細胞中に蓄積したリン脂質（図７ａ）およびコレステロール量（図７ｂ）を示す。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「ＭＬ－ＩＩ」はＭＬ－ＩＩ患者由来細胞、「ＭＬ－ＩＩ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ患者由来細胞を示す。 ＬＣ３のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「Ｎｏｎ」はｔＥＲＴ処理していないＭＬ－ＩＩ患者由来細胞、「ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ患者由来細胞を示す。 ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ／ＤＡＰＩの蛍光強度比率を示すグラフである。 ＭＬ－ＩＩ患者由来細胞（「ＭＬ－ＩＩ」）およびｔＥＲＴ処理後のＭＬ－ＩＩ患者由来細胞（「ＭＬ－ＩＩ＋ｔＥＲＴ」）の光学顕微鏡写真である。 クラッベ病患者由来細胞およびテイ・サックス病患者由来細胞におけるｔＥＲＴの効果を示すグラフである。「正常」は正常細胞、「Ｋｒａｂｂｅ」はクラッベ病患者由来細胞、「Ｋｒａｂｂｅ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴで処理したクラッベ病患者由来細胞、「Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ」はテイ・サックス病患者由来細胞、「Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴで処理したテイ・サックス病患者由来細胞を示す。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ」である。
　本発明において、１種類の細胞を培養してリソソーム酵素群を得てもよく、あるいは複数種類の細胞を培養してリソソーム酵素群を得てもよい。特に本発明においては、１種類の細胞を培養した場合にも、多種類のリソソーム酵素を十分に得ることができる。
　本発明に用いる細胞として、好ましくは、リソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞またはリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞が用いられる。
　本発明において「マンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞」としては、例えば、ＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼの異常が原因の疾患に罹患していない対象由来の細胞、および正常なＧｌｃＮＡｃ－ホスホトランスフェラーゼを有する細胞が挙げられる。
　本発明において「リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞」とは、健康な対象由来の正常細胞、およびリソソーム病に罹患していないが他の疾病に罹患している対象由来の細胞を意味する。
　該対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、マーモセット、ヒツジ、ヤギ等であり、好ましくは、ヒトである。
　本発明に用いる細胞としては、変異体細胞であってもよく、または変異体ではない細胞であってもよい。本発明において「変異体」には、自然変異体、および人為的な遺伝子組み換え体が包含される。変異体細胞としては、例えば、遺伝子組み換え技術によりＴＦＥＢ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２５，４７３－４７７，２００９）を導入してリソソーム酵素の発現量を増加させた細胞が挙げられる。
　本発明に用いる細胞は、市販の細胞であってもよく、または、上記対象から直接採取した細胞であってもよい。または、確立された細胞株や寄託株等の公に入手可能な培養細胞であってもよい。
　本発明に用いる細胞としては、限定するものではないが、例えば、皮膚、腎臓、胚、卵巣、子宮等に由来する細胞が挙げられ、好ましくは、皮膚線維芽細胞、腎線維芽細胞、胚性線維芽細胞等、さらに好ましくは、正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等、またさらに好ましくは、正常ヒト線維芽細胞が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、上記培養細胞から得られたリソソーム酵素群（以下、「本発明のリソソーム酵素群」という）を含む。
　本発明のリソソーム酵素群は、上記細胞を培養することにより得られる２種類以上のリソソーム酵素からなる酵素混合物であって、マンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含む。
　本発明のリソソーム酵素群は、例えば、５種類以上、８種類以上、または１２種類以上、好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは３０種類以上、またさらに好ましくは４０種類以上、最も好ましくは５０種類以上のリソソーム酵素からなる。
　本発明のリソソーム酵素群のリソソーム酵素は、好ましくは、組み換え酵素ではなく、野生型酵素である。本発明において「組み換え酵素」とは、遺伝子組み換え技術によって、酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に組み込んで産生させた酵素をいう。本発明において「野生型酵素」とは、その細胞が元来有する酵素をいう。リソソーム酵素が野生型である場合、リソソーム酵素群の人体への投与がより安全となる。
　本発明のリソソーム酵素群に含まれるリソソーム酵素の例としては、α－マンノシダーゼ、α－フコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ（例えば、β－ヘキソサミニダーゼＡ、β－ヘキソサミニダーゼＢ、β－ヘキソサミニダーゼＳ）、β－グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、カテプシン（例えば、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ等）、α－Ｌ－イデュロニダーゼ、アリールスルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、イズロン酸２－スルファターゼ、ヘパラン Ｎ－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ－α－グルコサミニド Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６―スルファターゼ、ガラクトースー６－スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、ＢおよびＣ、アリールスルファターゼＡセレブロシド、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、α－ニューラミダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、β－マンノシダーゼ、等から選ばれる２種類以上の酵素が挙げられる。
　本発明のリソソーム酵素群は、好ましくは、少なくとも、α－マンノシダーゼ、α－フコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼおよびカテプシンを含み、さらに好ましくは、少なくとも、α－マンノシダーゼ、α－フコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼＡ、β－ヘキソサミニダーゼＢ、β－グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、カテプシンＢおよびカテプシンＤを含む。最も好ましくは、本発明のリソソーム酵素群は、正常細胞のリソソーム中に含まれる全種類のリソソーム酵素を含む。
　本発明のリソソーム酵素群は、培養した上記細胞から公知の手段・方法を用いて得ることができる。好ましくは、本発明のリソソーム酵素群は、上記細胞に塩化アンモニウム等の適当な試薬（以下、「酵素抽出用試薬」という）を添加して培養し、得られた培養上清を公知の手段・方法を用いて精製および／または濃縮することによって得ることができる。
　本発明のリソソーム酵素群は、例えば、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞を培養し、得られた細胞から公知の手段・方法を用いて抽出することにより得ることができる。好ましくは、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞に、適当な酵素抽出用試薬を添加して培養し、培養上清を回収し、得られた培養上清を精製および／または濃縮する工程を含む方法によって得られる。
　上記細胞培養のための培地組成、培地温度、培養時間等の培養条件は、使用する細胞の種類や量に応じて、適宜選択しうる。
　細胞に添加する適当な酵素抽出用試薬としては、細胞のリソソーム中に含まれるリソソーム酵素を培養上清中に排出させることができる試薬であればいずれでもよく、例えば、塩化アンモニウム等の両親媒性アミン、クロロキン等のリソソーム指向性アミン、モネンシン（ｍｏｎｅｎｃｉｎ）またはニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）等のイオノフォア、バフィロマイシンＡ１（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１）等のＶ－ＡＴＰａｓｅ阻害薬が挙げられる。１種または複数の種類の酵素抽出用試薬を細胞に添加してもよい。好ましくは、塩化アンモニウム、クロロキン、モネシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群から選択される１または複数の試薬を細胞に添加する。さらに好ましくは、塩化アンモニウム、クロロキン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群から選択される１または複数の試薬を細胞に添加する。
　細胞に上記のような試薬を添加して培養することにより得られたリソソーム群をリソソーム病の治療に用いる試みは、本発明が初めてである。
　該酵素抽出用試薬の量は、リソソーム酵素をリソソーム中から排出させることが可能な量であれば特に限定されない。例えば塩化アンモニウムの場合、例えば、培養培地中において１５ｍＭ以上、例えば、培養培地中において２０ｍＭ程度の濃度で使用してもよい。例えばクロロキンの場合、例えば、培養培地中において１５μＭ以上、例えば、培養培地中において２０μＭ程度の濃度で使用してもよい。例えばバフィロマイシンＡ１の場合、例えば、培養培地中において１５ｎＭ以上、例えば、培養培地中において２０ｎＭ程度の濃度で使用してもよい。
　該試薬の添加後、細胞を培養して培養上清を得る。該試薬の添加後の培養期間は、培養上清中に十分な量のリソソーム酵素が排出される期間であれば特に限定されないが、通常、数日間またはそれ以上、例えば、３日間、５日間、７日間、１０日間、１４日間、またはそれ以上の期間細胞を培養する。
　培養上清の回収は、常法により行えばよく、例えば、ろ過法および遠心分離法が挙げられる。培養上清を回収後、精製により、酵素抽出用試薬および不純物を培養上清中から除去する。
　培養上清の精製は、常法により行えばよく、例えば、溶媒抽出法、有機溶媒による沈澱法、限外ろ過等のろ過法、マンノース６リン酸レセプターカラムやマンノース６リン酸抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、塩析法等が挙げられる。
　培養上清の濃縮は、常法により行えばよく、例えば、限外ろ過、塩析法等が挙げられる。
　培養上清は、適宜所望の程度まで精製・濃縮すればよい。
　このようにして得られた本発明のリソソーム酵素群は、培養した細胞のリソソーム中に含まれる多種類の酵素を含み、好ましくは、全種類のリソソーム酵素を含む。
　また、該リソソーム酵素群は、リソソーム中にすでに存在する正常なリソソーム酵素を排出させることにより得られるので、マンノース６リン酸残基で修飾された状態のリソソーム酵素を含むことができる。
　したがって、本発明によれば、マンノース６リン酸残基を付加する工程を必要とせずに、マンノース６リン酸残基を有する多種類のリソソーム酵素を一度に得ることができ、容易にリソソーム病の治療に用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のリソソーム酵素群そのものであってもよく、または常法により、医薬上許容される担体、安定化剤、緩衝剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等の添加剤または賦形剤と共に、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の適当な剤形にすることができる。医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、動物性油、植物性油等が挙げられ、特に、水、生理食塩水、デキストロース、およびグリセロールは、好ましくは注射剤用の担体として用いられる。
　本発明の医薬組成物は、例えば、経口的に、または非経口的に、例えば、静脈内注射、脳室内注射、髄腔内注射、筋肉内注射等によって、もしくは経皮的に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路等によって適宜決定することができる。
　本発明のリソソーム酵素群に含まれるリソソーム酵素は、マンノース６リン酸残基で修飾されているので、対象に投与後、該対象の細胞およびリソソーム中に取り込まれる。
　本発明のリソソーム酵素群は、多種類のリソソーム酵素を含むので、本発明の医薬組成物は、単一または複数のリソソーム酵素の欠損または活性低下が原因のリソソーム病の治療に有効である。特に、本発明の医薬組成物は、ムコリピドーシスＩＩ型およびムコリピドーシスＩＩＩ型の治療に有効である。
　本発明の医薬組成物の治療対象となるリソソーム病の例としては、限定するものではないが、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー病、乳児型バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的遅発乳児型バッテン病（ＣＮＬ２）、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、２型および３型、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、シャイエ症候群、クラッベ病、α－マンノシドーシス、β－マンノシドーシス、マロトー・ラミー症候群、異染性白質ジストロフィー、モルキオ症候群Ａ型、モルキオ症候群Ｂ型、ムコ脂質症ＩＩ／ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ａ型、サンフィリッポ症候群Ｂ型、サンフィリッポ症候群Ｃ型、サンフィリッポ症候群Ｄ型、シンドラー病、シンドラー神崎病、シアリドーシス、スライ症候群、テイ・サックス病、ウォルマン病、ムコ多糖症ＩＸ型、マルチプルサルファターゼ欠損症、ダノン病、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、ムコリピドーシスＩＩ型、およびムコリピドーシスＩＩＩ型の治療に用いられる。
　本発明のリソソーム酵素群は、さらに精製することにより、単一酵素製剤の製造のために利用することもできる。
　本発明のリソソーム酵素群は、また、研究用のリソソーム酵素試薬として利用することもできる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　リソソーム酵素群の調製
　１０ｃｍ培養皿において、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および推奨量の抗生剤／抗菌剤（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｍｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＤＭＥＭ培地（以下、「標準培養培地」という）中でコンフルエントな状態まで培養した正常皮膚線維芽細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウムを添加し、培養した。培養７日後、上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を下記の方法によって測定した。
　次いで、培養上清を０℃にて、分画分子量５０００の分子量フィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ　１５Ｒ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｓｔｅｄｉｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ）のスピンカラムで遠心分離して塩化アンモニウムを除去した。得られたリソソーム酵素群を最終的に、α－マンノシダーゼ活性が６００ｎｍｏｌ／ｈ／μＬとなるように無血清ＤＭＥＭを用いて希釈し、下記の実施例においてサンプルとして用いた。該サンプル中の使用時の酵素活性は、α－マンノシダーゼ ３６４．６ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α－フコシダーゼ ３８．４ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α－ガラクトシダーゼ ５．６ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α－グルコシダーゼ １０．３ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β－ガラクトシダーゼ ３５．０ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β－グルコシダーゼ ２５．９ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、総β－ヘキソサミニダーゼ ２６５０．４ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β－ヘキソサミニダーゼＡ ５２２．９ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β－グルクロニダーゼ １４．３ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、およびガラクトセレブロシダーゼ ０．５７ｎｍｏｌ／ｈ／μＬであった。なお、酵素活性の測定方法は下記にしたがう。
　下記の実施例におけるｔＥＲＴは、該サンプルを培地に添加して細胞を７日間培養して行った。その後、培養液を通常の標準培養培地に置き換えて２４時間以内に各アッセイを行った。
　リソソーム酵素群中の酵素活性の測定
　得られたリソソーム酵素群中にリソソーム酵素が含まれることを確認するために、上記の塩化アンモニウム添加培養後の培養上清を用いて、リソソーム酵素活性を測定した。対照として、塩化アンモニウムを添加していない正常皮膚線維芽細胞の培養上清、および塩化アンモニウムを添加していないＭＬ－ＩＩ患者由来の皮膚線維芽細胞（以下、「ＭＬ－ＩＩ細胞」という）の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
　リソソーム酵素の活性は、合成４－メチルウンベリフェリル基質を用いる標準的な方法で測定した。簡単に言えば、試料を酸性リン酸またはクエン酸バッファー中において３７℃で１時間、該合成基質と共にインキュベートし、３６５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長にてマイクロプレートリーダーで蛍光を測定した。ガラクトセレブロシダーゼの場合、６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリル　β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｓｌａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｈ　Ｌｔｄ．）を基質として用い、３８５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長にて蛍光を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬとして計算した。
　結果を図１に示す。図１において、各酵素活性は、正常細胞の培養上清中の酵素活性に対する比率（倍）で表す。
　結果
　図１から明らかなように、塩化アンモニウムを添加した正常皮膚線維芽細胞の培養上清は、少なくとも１０種類のリソソーム酵素（α－マンノシダーゼ、α－フコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼＡ、β－ヘキソサミニダーゼＢ、β－グルクロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼ）を含んでいた。また、該培養上清中の酵素活性パターンは、ＭＬ－ＩＩ細胞の培養上清中の酵素活性パターンと類似していた。
　ＭＬ－ＩＩでは、リソソーム酵素にマンノース６リン酸残基が付加されていないため、リソソーム酵素がマンノース６リン酸受容体に認識されず、リソソームへ運搬されないので、リソソーム中においてリソソーム酵素が枯渇し、細胞外にマンノース６リン酸残基が付加されていないリソソーム酵素が溢れ出ている。したがって、ＭＬ－ＩＩ細胞の培養上清中には多種類のリソソーム酵素が含まれる。このことは、ＭＬ－ＩＩ細胞の培養上清の酵素活性測定結果と一致する。
　リソソーム酵素群の細胞内取り込の確認
　実施例１で得られたリソソーム酵素群をＭＬ－ＩＩ細胞に投与してｔＥＲＴを行い、リソソーム酵素が活性な状態で該細胞内に取り込まれることを確認するために、細胞内リソソーム酵素活性を測定した。
　実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルをＭＬ－ＩＩ細胞の培養培地に添加し、所定の期間培養後、細胞を培養培地から単離し、プロテアーゼ阻害剤を含有する水中でソニケーションし、得られた懸濁液のタンパク質濃度を常法により測定した。得られた懸濁液を用いて、実施例１に記載の方法により、リソソーム酵素活性を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎとして計算した。対照として、正常皮膚線維芽細胞、およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ－ＩＩ細胞を用いた。
　結果を図２に示す。
　図２から明らかなように、ｔＥＲＴによって、細胞内のリソソーム酵素活性が上昇したことから、リソソーム酵素が細胞内に取り込まれたことが確認できた。
　さらに、経時的なリソソーム酵素のＭＬ－ＩＩ細胞内取り込みを図３に示す。
　リソソーム酵素は少なくとも７日間、持続的に細胞内に取り込まれた。細胞内酵素活性は７日間上昇し続けたので、本実施例の上記の評価は、ｔＥＲＴ処理の７日後に回収した細胞を用いて行った。また、下記の実施例４～９においても、ｔＥＲＴ処理の７日後の細胞を用いた。
　マンノース６リン酸競合阻害試験
　リソソーム酵素群が細胞表面のマンノース６リン酸受容体を介して細胞内に取り込まれていることを確認するために、マンノース６リン酸を同時投与し、細胞内取り込み阻害について試験した。
　実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルをＭＬ－ＩＩ細胞の培養培地に添加し、同時に、マンノース６リン酸を添加しない（０ｍＭ）、あるいはマンノース６リン酸を５ｍＭまたは１０ｍＭとなるように添加した。細胞を所定時間培養後、実施例１および実施例２と同様の方法により、細胞内酵素活性を測定した。
　結果を図４に示す。
　リソソーム酵素の細胞内への取り込みは、マンノース６リン酸により、濃度依存的に競合的に阻害された。
　リソソーム酵素群のリソソーム中への運搬の確認
　細胞内に取り込まれたリソソーム酵素がリソソームまで運搬されているか確認するために、細胞の免疫染色を行った。
　実施例１に記載のようにＭＬ－ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、下記の方法により蛍光染色した。対照として、正常皮膚線維芽細胞およびｔＥＲＴ処理しないＭＬ－ＩＩ細胞を用いた。
　細胞を３．７％ホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１５分間透過処理し、室温にて１時間、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。一次抗体として、モノクローナル抗Ｌａｍｐ－２抗体（Ｈ４Ｂ４）、ポリクローナル抗カテプシンＢ抗体（Ｓ－１２）、ポリクローナル抗カテプシンＤ抗体（Ｈ－７５）、およびポリクローナル抗β－グルコシダーゼ抗体（Ｈ－３００）（全て、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡから入手）を１：１００濃度で用いて、室温で１時間処理した。次いで、二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８または５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１０００希釈で用いて、室温で１時間処理した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ．＃７５２８）は０．２μＭ濃度で用いて、３７℃で１時間処理した。全ての蛍光画像は、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）または共焦点レーザー走査顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ－２，Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。リソソームマーカーとしてＬａｍｐ－２およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを用いた。
　結果を図５および図６に示す。
　図５および図６に示されるように、ＭＬ－ＩＩ細胞ではカテプシンＢおよびカテプシンＤが確認できなかった。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞では、カテプシンＢおよびカテプシンＤの画像がリソソーム（Ｌａｍｐ－２）の画像と重なったことから、細胞に投与されたリソソーム酵素混合物からリソソーム酵素がリソソームに運搬されたことが確認できた。
　β－グルコシダーゼの場合、正常細胞、ＭＬ－ＩＩ細胞、およびｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞との間で免疫染色結果に差がなかった。さらに、β－グルコシダーゼについて、酵素活性試験（図２参照）において正常であることが確認でき、マンノース６リン酸競合阻害試験（図４参照）においても影響を受けないことが示された。
　リソソーム酵素のなかでも、β－グルコシダーゼは、マンノース６リン酸依存性の運搬システムではなく、ＬＩＭＰ－２というタンパク質でリソソームに運搬されていることが証明されている（Ｒｅｃｚｅｋ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　２００７；１３１（４）：７７０－８３）。したがって、ＭＬ－ＩＩ細胞は、β－グルコシダーゼを欠損していない。この以前の知見は、上記実験結果と一致する。
　ｔＥＲＴの蓄積物質に対する効果
　ＭＬ－ＩＩでは、リン脂質およびコレステロールが蓄積する。したがって、細胞中のリン脂質およびコレステロール量を測定することにより、ＭＬ－ＩＩに対するｔＥＲＴの効果を評価した。
　実施例１に記載のようにＭＬ－ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、市販の測定キットを用い、製造者の指示書にしたがって、細胞中のリン脂質およびコレステロール量を測定した（リン脂質：Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ　Ｃ－ｔｅｓｔ，Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏ．、およびコレステロール：Ａｍｐｌｅｓ　Ｒｅｄ　Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ａ１２２１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。対照として、正常皮膚線維芽細胞およびｔＥＲＴ処理しないＭＬ－ＩＩ細胞を用いた。
　結果を図７ａおよび図７ｂに示す。
　リン脂質およびコレステロールは、正常細胞に比べてＭＬ－ＩＩ細胞において蓄積しているが、ｔＥＲＴによって蓄積量が減少した。
　オートファジー異常およびミトコンドリア異常に対する効果
　ＭＬ－ＩＩにおけるオートファジー異常およびミトコンドリア異常に対するｔＥＲＴの効果を評価した。対照として、正常細胞およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ－ＩＩ細胞を用いた。
　実施例１に記載のようにＭＬ－ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、ウェスタンブロッティングによりＬＣ３－ＩＩの量を測定した。一次抗体として、ポリクローナル抗ＬＣ３抗体（ＰＭ０３６）およびポリクローナル抗β－アクチンＨＲＰ　ＤｉｒｅｃＴ抗体（ＰＭ０５３－７）（ＭＢＬ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
　結果を図８に示す。ｔＥＲＴにより、ＬＣ３－ＩＩの量が減少した。
　また、蛍光免疫染色を実施例４の記載と同様に行った。ミトコンドリアのマーカーとしてＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ．＃７５１２）を３７℃で１時間、２００ｎＭ濃度で用いた。オートファジーのマーカーとして、ポリクローナル抗ＬＣ３抗体（ＰＭ０３６）（ＭＢＬ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
　蛍光顕微鏡で観察したところ、ｔＥＲＴにより、ＬＣ３の小胞が減少し、ミトコンドリアの形態も明らかに改善を示したことが確認された。
　リソソーム数および形態の測定
　ＭＬ－ＩＩは、皮膚線維芽細胞における封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）の存在によって特徴付けられる。封入体は、リソソーム酵素の異常により分解できない基質がリソソームに蓄積することが原因であり、同時に、リソソームの数も顕著に増加する。ｔＥＲＴのこれらの現象に対する効果を下記の方法によって評価した。対照として、正常細胞およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ－ＩＩ細胞を用いた。
　実施例１に記載のようにＭＬ－ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、トリプシンを用いて細胞を標準的な方法で回収し、小型のチューブに入れた。該細胞のペレットを、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９（１μＭ）およびＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）の両方を含有する標準培養培地中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により該細胞を回収し、ＰＢＳで１回リンスした後、該細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。該細胞懸濁液の蛍光強度をマイクロプレートリーダー（Ｖｏｒｏｎａ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＭＴＰ８１０Ｌａｂ）を用いて、励起波長５３０ｎｍ／発光波長５９０ｎｍ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの場合）および、励起波長３６５ｎｍ／発光波長４５０ｎｍ（ＤＡＰＩの場合）で測定した。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。該蛍光染色の結果、ｔＥＲＴによりリソソームの染色が減少したことが分かった。
　さらに、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ／ＤＡＰＩの蛍光強度比率を算出し、各細胞あたりのリソソーム量（数および大きさ）を評価した。
　結果を図９示す。ｔＥＲＴにより、各細胞あたりのリソソーム量が減少した。
　さらに、光学顕微鏡写真観察では、ｔＥＲＴにより、封入体の減少が確認された（図１０）。また、電子顕微鏡写真観察では、ｔＥＲＴにより、均質な小胞の蓄積が解消されたことが確認された。
　エンドサイトーシスに対する効果
　蛍光標識したセラミド（ＢＯＤＩＰＹ－Ｃｅｒ）を用いて、正常細胞、ＭＬ－ＩＩ細胞およびｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞におけるエンドサイトーシスによって取り込まれた物質の細胞内輸送を評価した。
　ガラス底皿中で皮膚線維芽細胞を調整した。ＢＳＡに複合体化したＢＯＤＩＰＹ ＦＬＣ５－セラミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　＃Ｂ２２６５０）を入手し、標準培養培地中２．５ｎＭ濃度に希釈した。該培地中で３０分間、細胞を培養した。培養後、該細胞をＰＢＳで１回洗浄し、実施例４に記載の共焦点顕微鏡で直接観察した。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。
　蛍光画像を解析したところ、正常細胞ではセラミドはゴルジ体に運ばれたが、ＭＬ－ＩＩでは細胞質内の小胞に閉じこめられていた。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞では、セラミドは、細胞質内の小胞に多少残っているものの、ゴルジ体へ運搬されるようになった。
　また、氷冷培地中において、原形質膜に対するＢＯＤＩＰＹ－Ｃｅｒの接着について試験した結果、正常細胞、ＭＬ－ＩＩ細胞およびｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞間に違いはなかった。
　マンノース６リン酸受容体取り込み試験
　マンノース６リン酸受容体に対する抗体を用いて、細胞表面の該受容体を介して取り込まれた該抗体の細胞内輸送を評価した。
　マンノース６リン酸受容体抗体［モノクローナル抗マンノース６リン酸受容体抗体（２Ｇ１１）（Ａｂｃａｍ）］を１：７５濃度で含有する標準培養培地中で細胞をインキュベートした。３０分間の取り込み試験の場合、該抗体含有培地で細胞を３０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷ＰＢＳで洗浄し、すぐに３．７％ホルムアルデヒド中で固定した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で１５分間透過性処理し、室温で１時間、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、細胞を二次抗体で処理した。１時間の取り込みおよび２時間のインキュベーション試験の場合、該抗体含有培地で細胞を１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、抗体を含有しない標準培養培地中で培養した。その後の工程は、上記の３０分取り込み試験と同様である。二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８標識抗体（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ．）を用いた。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。
　蛍光画像を解析したところ、正常細胞では、小胞に留まっていたが、ＭＬ－ＩＩ細胞ではゴルジ体に留まっていた。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ－ＩＩ細胞では、正常細胞と同じ小胞のパターンを示した。
　様々な試薬を用いたリソソーム酵素群の調製
　１０ｃｍ培養皿において、標準培養培地中でコンフルエントな状態まで培養した正常皮膚線維芽細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウム、培地中２０μＭ濃度となるようにクロロキン、または培地中２０ｎＭ濃度となるようにバフィロマイシンＡ１を添加し、培養した。培養５日後および７日後に上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を実施例１の記載と同じ方法で測定した。対照として、いずれの試薬も添加していない標準培養培地中で培養した正常皮膚線維芽細胞の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
　結果を表１および２に示す。なお、表１および表２中、β－Ｇａｌはβ－ガラクトシダーゼ、ｔｏｔａｌ β－Ｈｅｘは総β－ヘキソサミニダーゼ、β－Ｈｅｘ Ａはβ－ヘキソサミニダーゼＡ、β－Ｇｌｕｃはβ－グルコシダーゼ、α－Ｍａｎはα－マンノシダーゼ、α－Ｆｕｃはα－フコシダーゼ、α－Ｇｌｕｃはα－グルコシダーゼ、α－Ｇａｌはα－ガラクトシダーゼ、β－Ｇｌｕｃｕｒｏはβ－グルクロニダーゼ、α－Ｉｄｕｒｏはα－Ｌ－イデュロニダーゼ、ＧＡＬＣはガラクトセレブロシダーゼを示す。ＳＣＭは、いずれの試薬も添加していない標準培養培地（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）を示す。ＣＱはクロロキンを示し、ＢａｆｉｌｏはバフィロマイシンＡ１を示す。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬで示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１および表２から明らかなように、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１を用いた場合も、塩化アンモニウムを用いた場合と同様に、これらの試薬を加えない場合と比べて、多くのリソソーム酵素群を培養上清中に排出させることができた。
　ＣＯＳ－１細胞を用いたリソソーム酵素の調製
　１０ｃｍ培養皿において、標準培養培地中でコンフルエントな状態まで培養したＣＯＳ－１細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウムを添加し、培養した。培養３日後に上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を実施例１の記載と同じ方法で測定した。対照として、塩化アンモニウムを添加していない標準培養培地中で培養したＣＯＳ－１細胞の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
　結果を表３に示す。なお、表３中、β－Ｇａｌはβ－ガラクトシダーゼ、ｔｏｔａｌ β－Ｈｅｘは総β－ヘキソサミニダーゼ、β－Ｈｅｘ Ａはβ－ヘキソサミニダーゼＡ、β－Ｇｌｕｃはβ－グルコシダーゼ、α－Ｍａｎはα－マンノシダーゼ、α－Ｆｕｃはα－フコシダーゼ、α－Ｇｌｕｃはα－グルコシダーゼ、α－Ｇａｌはα－ガラクトシダーゼ、β－Ｇｌｕｃｕｒｏはβ－グルクロニダーゼ、α－Ｉｄｕｒｏはα－Ｌ－イデュロニダーゼ、ＧＡＬＣはガラクトセレブロシダーゼを示す。ＮＨ４Ｃｌ（－）は、塩化アンモニウムを加えない場合の培養上清を示し、ＮＨ４Ｃｌ（＋）は、塩化アンモニウムを加えた場合の培養上清を示す。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬで示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、ＣＯＳ－１細胞を用いた場合も、塩化アンモニウムの添加により、塩化アンモニウムを添加しない場合と比べて、多くのリソソーム酵素群を培養上清中に排出させることができた。
　クラッベ病およびテイ・サックス病に対するｔＥＲＴ試験
　実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルを、クラッベ病およびテイ・サックス病の患者由来の皮膚線維芽細胞（以下、各々、「クラッベ病細胞」および「テイ・サックス病細胞」という）の培養培地に添加し、７日間培養した。細胞を培養培地から単離し、プロテアーゼ阻害剤を含有する水中でソニケーションし、得られた懸濁液のタンパク質濃度を常法により測定した。得られた懸濁液を用いて、実施例１に記載の方法により、リソソーム酵素活性を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎとして計算した。対照として、正常皮膚線維芽細胞、およびｔＥＲＴ処理していないクラッベ病細胞またはｔＥＲＴ処理していないテイ・サックス病細胞を用いた。
　結果を図１１に示す。
　図１１に示されるように、本発明のリソソーム酵素群を用いるｔＥＲＴによって、クラッベ病およびテイ・サックス病でそれぞれ欠損しているリソソーム酵素（クラッベ病についてガラクトセレブロシダーゼ、テイ・サックス病についてβ－ヘキソサミニダーゼＡ）の細胞内酵素活性が上昇した。

Claims (9)

  1. 　細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物。
  2. 　細胞がリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　細胞がリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
  4. 　リソソーム酵素群が下記工程：
    　　細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ－ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
    　　培養上清を回収し、
    　　得られた培養上清を精製および／または濃縮する、
    ことを含む方法により得られたものである、請求項１～３のいずれか１項記載の医薬組成物。
  5. 　試薬が、塩化アンモニウム、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、請求項４記載の医薬組成物。
  6. 　細胞が正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択されるものである、請求項１～５のいずれか１項記載の医薬組成物。
  7. 　リソソーム酵素が組み換え酵素ではない、請求項１～６のいずれか１記載の医薬組成物。
  8. 　リソソーム酵素群がマンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含むものである、請求項１～７のいずれか１項記載の医薬組成物。
  9. 　ムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型の治療用である、請求項１～８のいずれか１項記載の医薬組成物。
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