JP2018532748A - アミロイドーシス治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

アミロイドーシスを治療または予防するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を投与することを含む。そのような方法及び組成物を用いて、リソソーム内及び／または細胞外で、アミロイド形成の低下、抑制、分解及び／または排除を行ってよい。【選択図】図４Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，７１３号に対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、アミロイドーシスの予防または治療に好適な組成物及び方法に関する。例えば、アミロイド形成の低下、抑制、または排除のため分解酵素を提供する。

電子的に提出したテキストファイルの詳細
本明細書と共に電子的に提出したテキストファイル、すなわち、コンピュータで読み取り可能なフォーマットの配列表のコピー（ファイル名：ＵＬＰＩ＿０３４＿０１ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１６年１０月２１日、ファイルサイズ：１４６キロバイト）の記載内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

アミロイドは、特定の構造的特性、例えば、ベータシートを共有する、不溶性の線維状タンパク質凝集体である。これらは、普通に体内に存在するタンパク質及びポリペプチドの、少なくとも１８の不適切に折り畳まれた型が原因で生じる。これらの間違った折り畳み構造により本来の適切な立体構造が変化するため、それらのタンパク質及びポリペプチド同士、または他の細胞構成要素との間で誤った相互作用をして、不溶性のアミロイド線維が形成される。これにより、２０種以上の重篤なヒト疾患病理がもたらされている。これらのアミロイド線維の臓器内異常蓄積は、アミロイドーシスをもたらす場合があるほか、各種の神経変性疾患ならびに他の障害において関与している。

これらの線維の形成にはリソソームの通過が関与しており、そこでは、その酸性環境によりタンパク質凝集体の形成を可能にしている。アミロイドは、リソソーム通過後、エキソサイトーシスまたは細胞溶解によって細胞から放出される。

アミロイドーシスに関する研究の重要課題として特定線維を排除する試みがなされているが成功していない。現在のアミロイドーシス治療では化学療法剤、またはメルファラン及びデキサメタゾンのようなステロイド剤を使用する。しかしながら、そのような治療はどの患者にも適切というわけではなく、その特異性ゆえ有効でない場合が多い。したがって、アミロイドーシスに関連する疾患を安全かつ有効に予防または治療できる代替治療が強く求められている。

本発明は、体内で非常に有害な作用のある過剰アミロイド形成をいかにして防ぎ停止させるかという問題を解決する。本発明はまた特異性という問題も解決し、これは異なるアミロイド源に適用可能であり、ある特定の疾患に限定されるものではない。本発明はまた、エンドサイトーシスを介した線維消化がより機能的かつ容易に行われるようリソソームを維持することによって既に形成された線維の分解を助ける。

本発明は、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分解酵素は、リソソーム内部で、すなわち、リソソーム内（ｉｎｔｒａｌｙｓｏｍａｌｌｙ）でアミロイドの形成抑制及び／または分解を行うよう作用する。他の実施形態では、分解酵素は、細胞の外部、すなわち、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ）でアミロイドの形成抑制及び／または分解を行うよう作用する。

いくつかの実施形態では、分解酵素は、ＰＰＣＡポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡポリペプチドは、配列番号２、４３、もしくは４５に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡポリペプチドは、配列番号２、４３、もしくは４５のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ベクターを含む組成物を投与することを含み、ここで、かかるベクターは、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、分解酵素はＰＰＣＡまたはその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡ分解酵素の投与は、配列番号１、４２、または４４に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列をコードするベクターの投与を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、４２、または４４を含む。

いくつかの実施形態では、分解酵素は、ＮＥＵ１ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＵ１ポリペプチドは、配列番号４に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態ではＮＥＵ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＥＵ１分解酵素の投与は、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列をコードするベクターの投与を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３を含む。

いくつかの実施形態では、分解酵素は、ＴＰＰ１ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１分解酵素の投与は、配列番号５に対して少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列をコードするベクターの投与を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号５を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも２種の分解酵素を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される。

いくつかの実施形態では、少なくとも２種の分解酵素はＰＰＣＡ及びＮＥＵ１を含む。

いくつかの実施形態では、分解酵素は細胞リソソームを標的とする。他の実施形態では、分解酵素は、細胞の外部に留まるよう改変され、すなわち、かかる酵素は細胞外で作用するよう改変される。

いくつかの実施形態では、分解酵素は、細胞リソソーム内のアミロイドの蓄積抑制及び／または分解を行う。他の実施形態では、分解酵素は、細胞の外部、すなわち、細胞外でアミロイドの蓄積抑制及び／または分解を行う。

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種の分解酵素を含む組成物を提供し、ここで、かかる組成物は、細胞リソソームを標的とする少なくとも１種の分解酵素及び細胞の外部に留まる少なくとも１種の分解酵素を含む。いくつかの実施形態では、分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される。例示的な一実施形態では、本発明は、少なくとも２種の分解酵素を含む組成物を提供し、ここで、かかる組成物は、細胞リソソームを標的とするＰＰＣＡ分解酵素及び細胞の外部に留まるＰＰＣＡ分解酵素を含む。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、アミロイドーシスを治療または予防するための１つ以上のさらなる薬物の投与を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる薬物（複数可）は、メルファラン、デキサメタゾン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、レナリドミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びシクロホスファミドから選択される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、リソソームを酸性化する１つ以上の薬物の投与を含む。いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、酸性ナノ粒子、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬、アデノシン受容体作動薬、ドーパミン受容体作動薬、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の活性化薬、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ｃＡＭＰ類似体、及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤から選択される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、リソソームを調節する１つ以上の薬物の投与を含む。例示的な一実施形態では、薬物は、Ｚ−フェニルアラニル−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ａｌａｎｙｌ−ｄｉａｚｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）（ＰＡＤＫ）もしくはＰＡＤＫ類似体、またはその薬理学的に許容される塩もしくはエステルである。いくつかの実施形態では、ＰＡＤＫ類似体は、Ｚ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ＰｄＡＤＫ）、Ｚ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｄＰＡＤＫ）、及びＺ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｄ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｄＰｄＡＤＫ）から選択される。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、オートファジーを促進する１つ以上の薬物の投与を含む。例示的な一実施形態では、薬物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ１−α（ＰＧＣ−１α）の活性化薬、リシン（Ｋ）特異的脱メチル化酵素１Ａ（ＬＳＤ１）の阻害剤、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）の作動薬、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）の活性化薬、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤、及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）の阻害剤から選択される。

いくつかの実施形態では、対象をさらに幹細胞移植で治療する。

いくつかの実施形態では、投与は非経口投与である。いくつかの実施形態では、投与は筋肉内投与、腹腔内投与、または静脈内投与である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物及び薬物のいずれも、薬理学的に許容される担体を含む。

いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである。

いくつかの実施形態では、ＡＬアミロイドーシスは、心臓、腎臓、神経系、及び胃腸管から選択される１つ以上の臓器に影響を与える。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスはアミロイド−ベータ（Ａβ）アミロイドーシスである。

いくつかの実施形態では、Ａβアミロイドーシスは、脳、神経系から選択される１つ以上の臓器に影響を与え、かつ／またはさまざまな筋肉、例えば、腕及び脚の筋肉に影響を与える。いくつかの実施形態では、Ａβアミロイドーシスはアルツハイマー病に関連する。いくつかの実施形態では、Ａβアミロイドーシスは脳アミロイドアンギオパチーに関連する。いくつかの実施形態では、Ａβアミロイドーシスはレビー小体認知症に関連する。いくつかの実施形態では、Ａβアミロイドーシスは封入体筋炎に関連する。

図１Ａは、チオフラビンＴ（ＴＨＴ）によって監視したＡβ４２合成ペプチド及びＡβ１５−３６ペプチド（陰性対照）の凝集を示す。図は、生理条件における凝集である。 図１Ｂは、チオフラビンＴ（ＴＨＴ）によって監視したＡβ４２合成ペプチド及びＡβ１５−３６ペプチド（陰性対照）の凝集を示す。図は、酸性ｐＨにおける凝集である。 図２Ａは、ウェスタンブロットで検出した、２４時間のインビトロでのＡβ４２合成ペプチドの凝集を示す。１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、還元条件、６Ｅ１０によるプローブ（ベータアミロイドのアミノ酸残基１〜１６に対し反応性のある抗β−アミロイド抗体の市販精製抗体）を用いた。 図２Ｂは、ウェスタンブロットで検出した、２４時間のインビトロでのＡβ４２合成ペプチドの凝集を示す。１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル、還元条件、６Ｅ１０によるプローブを用いた。 カテプシンＡ（本明細書ではＣａｔｈ ＡまたはＰＰＣＡと同義）はＡβ４２アミロイド種の凝集を抑制することを示す。図は、カテプシンＬによる９０ｎｇカテプシンＡの活性化（中塗り黒円）である。 カテプシンＡ（本明細書ではＣａｔｈ ＡまたはＰＰＣＡと同義）はＡβ４２アミロイド種の凝集を抑制することを示す。図は、カテプシンＬによる４５０ｎｇカテプシンＡの活性化である。 カテプシンＡ（本明細書ではＣａｔｈ ＡまたはＰＰＣＡと同義）はＡβ４２アミロイド種の凝集を抑制することを示す。図は、Ａβ４２凝集に対する９０ｎｇＰＰＣＡの抑制作用及びセリンプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）によるＰＰＣＡ阻害である。 カテプシンＡ（本明細書ではＣａｔｈ ＡまたはＰＰＣＡと同義）はＡβ４２アミロイド種の凝集を抑制することを示す。Ａβ４２凝集に対する４５０ｎｇＰＰＣＡの抑制作用を示す。Ａβ４２ペプチドを単体で凝集させた場合（中抜き円）、ならびに２種の濃度のＣａｔｈ Ａ（中抜き四角形）と凝集させた場合、及びＣａｔｈ Ａ＋阻害剤ＰＭＳＦの組み合わせ（中抜き三角形）と凝集させた場合を示す。Ｃａｔｈ Ａ単体（中塗り四角形）及び阻害剤ＰＭＳＦ単体（中塗り三角形）をそれぞれＴＨＴ試薬と共にインキュベートし、陰性対照として使用した。 Ｃａｔｈ Ａ（すなわち、ＰＰＣＡ）は、Ａβ４２アミロイド種の凝集を用量依存的に抑制することを示す。ＰＰＣＡの濃度をさまざまに変えて（７ｎｇ〜９００ｎｇ）ＴＨＴによって測定した、ｐＨ５、３７℃における２時間のＡβ４２凝集を示すグラフである。Ａβ４２凝集を単体の場合及びＰＰＣＡ系列希釈を用いた場合で測定した。見やすくするため線を引いている。 Ｃａｔｈ Ａ（すなわち、ＰＰＣＡ）は、Ａβ４２アミロイド種の凝集を用量依存的に抑制することを示す。エンドポイント（２時間）のＡβ４２凝集を示す棒グラフである。 Ｃａｔｈ Ａ（すなわち、ＰＰＣＡ）は、Ａβ４２アミロイドの高分子種と低分子種の両方の凝集を抑制することを示す。１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で還元条件下、２時間にわたり６Ｅ１０でプローブした場合のＰＰＣＡ（５００ｎｇ）処理したＡβ４２単量体（０．９μｇ）を示す。 カテプシンＢ（Ｃａｔｈ Ｂ）はＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。９０ｎｇのカテプシンＢの活性化及びプロテアーゼ阻害薬Ｅ６４によるカテプシンＢ阻害である。 カテプシンＢ（Ｃａｔｈ Ｂ）はＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。４５０ｎｇのカテプシンＢの活性化及びＥ６４によるカテプシンＢ阻害である。 カテプシンＢ（Ｃａｔｈ Ｂ）はＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。Ａβ４２凝集に対する９０ｎｇのカテプシンＢの抑制作用及びＥ６４の阻害欠如を示す。 カテプシンＢ（Ｃａｔｈ Ｂ）はＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。Ａβ４２凝集に対する４５０ｎｇのカテプシンＢの抑制作用及びＥ６４の阻害欠如を示す。Ａβ４２ペプチドを単体で凝集させた場合（中抜き円）、ならびに２種の濃度のＣａｔｈ Ｂ（中抜き四角形）と凝集させた場合及びＣａｔｈ Ｂ＋阻害剤Ｅ６４の組み合わせと凝集させた場合（中抜き三角形）を示す。Ｃａｔｈ Ｂ単体（中塗り四角形）及び阻害剤Ｅ６４単体（中塗り三角形）をそれぞれＴＨＴ試薬と共にインキュベートし、陰性対照として使用した。 カテプシンＢは、Ａβ４２アミロイド種の凝集を用量依存的に中程度に抑制することを示す。カテプシンＢの濃度をさまざまに変えて（７ｎｇ〜９００ｎｇ）ＴＨＴによって測定した、ｐＨ５、３７℃における２時間のＡβ４２凝集を示すグラフである。Ａβ４２凝集を単体の場合及びカテプシンＢ系列希釈を用いた場合で測定した。 カテプシンＢは、Ａβ４２アミロイド種の凝集を用量依存的に中程度に抑制することを示す。エンドポイント（２時間）のＡβ４２凝集を示す棒グラフである。 カテプシンＢは、Ａβ４２アミロイドの両低分子種の凝集を抑制し、Ａβ４２を時間依存的に分解することを示す。１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で還元条件下、２時間にわたり６Ｅ１０でプローブした場合のカテプシンＢ（２００ｎｇ）処理したＡβ４２単量体（０．９μｇ）を示す。 ＴＨＴによって監視した、カテプシンＤのＡβ４２アミロイド凝集抑制を示す。２時間のＡβ４２ペプチド単体の凝集（中抜き円）及びカテプシンＤ（中抜き四角形）を用いた場合の凝集を示す。カテプシンＤ単体（三角形）をＴＨＴ試薬と共にインキュベートし、陰性対照として使用した。 ＰＰＣＡ、カテプシンＢ、ＰＰＣＡとカテプシンＢ、及びカテプシンＤは、Ａβ４２アミロイドの高分子量オリゴマー／線維を分解することを実証するウェスタンブロットを示す。カテプシンＤは低分子オリゴマーを分解し、かつＡβ４２単量体を完全に消失させる。 オリゴマー特異的Ａ１１抗体を使用したＡβ４２オリゴマー及び線維の検出の比較を示すウェスタンブロットを示す。Ａβ４２ペプチドを、オリゴマー及び線維に特異的な７日間凝集プロトコルに供した。線維形成におけるオリゴマー形態の減少（ライン９）は、オリゴマーの線維形態への移行を指し、これはオリゴマー特異的Ａ１１抗体では検出されない。 オリゴマー及び線維に特異的なＥ６１０抗体を使用したＡβ４２オリゴマー及び線維の検出の比較を示すウェスタンブロットを示す。Ａβ４２ペプチドを、オリゴマー及び線維に特異的な７日間凝集プロトコルに供した。オリゴマー特異的プロトコル７日目（ライン４）では線維形成は検出されなかった。線維形成プロトコルでは、オリゴマー形態の減少及び線維形態の出現（ライン９のなすりつけたように尾を引くバンド）が検出された。 オリゴマー特異的Ａ１１抗体でプローブした、Ａβ４２オリゴマーの酵素分解を示すウェスタンブロットを示す。ライン１〜６には、９日目のｐＨ７．０、２５℃で凝集したオリゴマーが含有されており、さらに特定ｐＨの酵素で３７℃にて一晩処理した。ライン１〜３は酵素処理をしていない。ライン４〜６はそれぞれ、９０ｎｇのカテプシンＡ、Ｂ、及びＤを用いて処理したものを表す。ライン８には、９日目のｐＨ７．０、２５℃で凝集したオリゴマーが含有されている。ライン９には、単量体がｐＨ７．０で含有されている。ライン４には、９０ｎｇのカテプシンＡによるオリゴマー分解が示されている。各ラインに２μｇの材料を装填した。 オリゴマー及び線維に特異的な抗体Ｅ６１０でプローブした、Ａβ４２線維の酵素分解を示すウェスタンブロットを示す。ライン１〜６には、９日目のｐＨ７．０、２５℃で凝集した線維が含有されており、さらに特定ｐＨの酵素で３７℃にて一晩処理した。ライン１〜３は酵素処理をしていない。ライン４〜６はそれぞれ、９０ｎｇのカテプシンＡ、Ｂ、及びＤを用いて処理したものを表す。ライン８には、９日目のｐＨ７．０、２５℃で凝集した繊維が含有されている。ライン９には、単量体がｐＨ７．０で含有されている。ライン４には、９０ｎｇのカテプシンＡによる繊維及びオリゴマーの分解が示されている。ライン５には、９０ｎｇのカテプシンＢによる繊維分解が示されている。各ラインに２μｇの材料を装填した。 ヒトＡβ４２特異的ＥＬＩＳＡを使用して監視した、カテプシンＡでのＡβ４２単量体分解を示す。９０ｎｇのカテプシンＡで処理したＡβ４２単量体（斜線入り棒）は、さまざまな測定ポイント（０分、１０分、３０分、６０分、１２０分）においてＣ末端からの分解を示したが、これは、捕捉抗体によるＣ末端での捕捉がないこと、及び蛍光シグナル消失という効果に反映されている。対照的に、カテプシンＡ未処理のＡβ４２単量体は、Ｃ末端での分解がないことを示した（中塗り棒）が、これは抗体による効率的捕捉及び強い蛍光シグナルに反映されている。いずれの場合にも、ＥＬＩＳＡにおいてＣ末端抗体捕捉に影響を与え得るペプチド凝集を抑制するため、アミロイド凝集阻害物質であるフェノールレッドを使用した。 図１６Ａは、ＴＨＴアッセイにより測定したＡβ４０及びＡβ４２の凝集を示す。Ａβ４０、Ａβ４２、及びＡβ１６をＴｈＴと共に３７℃で２時間共インキュベートし、凝集動態を測定した。Ａβ４２はＡβ４０よりも効率的かつ速く凝集する。Ａβペプチドの凝集を単一スケールで表示するグラフである。 図１６Ｂは、ＴＨＴアッセイにより測定したＡβ４０及びＡβ４２の凝集を示す。Ａβ４０、Ａβ４２、及びＡβ１６をＴｈＴと共に３７℃で２時間共インキュベートし、凝集動態を測定した。Ａβ４２はＡβ４０よりも効率的かつ速く凝集する。Ａβ４０の凝集をスケールを区切って表示するグラフである。 図１７Ａは、Ａβ４０、Ｃａｔｈ Ａ、及びＴＨＴの同時インキュベーションにおいてＡβ４０凝集に変化が見られないことを示す。１５μＭ Ａβ４０及び２ｍＭ ＴｈＴと共に漸増濃度のＣａｔｈ Ａを３７℃で２時間共インキュベートし、Ｃａｔｈ ＡがＡβ４０凝集の動態に与える影響を測定した。９００ｎｇのＣａｔｈ ＡをＡβ４０及びＴＨＴと共に共インキュベートした場合を示す。 図１７Ｂは、Ａβ４０、Ｃａｔｈ Ａ、及びＴＨＴの同時インキュベーションにおいてＡβ４０凝集に変化が見られないことを示す。１５μＭ Ａβ４０及び２ｍＭ ＴｈＴと共に漸増濃度のＣａｔｈ Ａを３７℃で２時間共インキュベートし、Ｃａｔｈ ＡがＡβ４０凝集の動態に与える影響を測定した。１０００ｎｇのＣａｔｈ ＡをＡβ４０及びＴＨＴと共に共インキュベートした場合を示す。 図１７Ｃは、Ａβ４０、Ｃａｔｈ Ａ、及びＴＨＴの同時インキュベーションにおいてＡβ４０凝集に変化が見られないことを示す。１５μＭ Ａβ４０及び２ｍＭ ＴｈＴと共に漸増濃度のＣａｔｈ Ａを３７℃で２時間共インキュベートし、Ｃａｔｈ ＡがＡβ４０凝集の動態に与える影響を測定した。２２５０ｎｇのＣａｔｈ ＡをＡβ４０及びＴＨＴと共に共インキュベートした場合を示す。 図１８Ａ〜Ｃは、ＴＨＴ蛍光の消失によって示されるように、Ａβ４０とＣａｔｈ Ａとの予備インキュベートはその凝集能の消失をもたらすことを示す。最初にＡβ４０と２５００ｎｇのＣａｔｈ Ａを３７℃で３０分、１時間、及び２時間インキュベートした（それぞれ、図１８Ａ、１８Ｂ、及び１８Ｃ）。その後、反応物をＴｈＴと共に３７℃で２時間の共インキュベートに供し、Ｃａｔｈ ＡがＡβ４０凝集の動態に与える影響を測定した。 図１９Ａは、Ｃ末端捕捉抗体を使用したＡβ４０のＣ末端開裂の検出を示す。Ａβ４０ペプチドを、異なる濃度のＣａｔｈ Ａと共にｐＨ５、３７℃で２時間インキュベートした。反応物を、Ｃ末端捕捉抗体でプレコートしたＥＬＩＳＡプレートに移し、Ｎ末端検出抗体と共に４℃で一晩共インキュベートした。エラーバーは、ＯＤ値の標準偏差を示す。図は、漸増濃度のＣａｔｈ Ａで処理した試料中の未消化Ａβ４０の回収率である。 図１９Ｂは、Ｃ末端捕捉抗体を使用したＡβ４０のＣ末端開裂の検出を示す。Ａβ４０ペプチドを、異なる濃度のＣａｔｈ Ａと共にｐＨ５、３７℃で２時間インキュベートした。反応物を、Ｃ末端捕捉抗体でプレコートしたＥＬＩＳＡプレートに移し、Ｎ末端検出抗体と共に４℃で一晩共インキュベートした。エラーバーは、ＯＤ値の標準偏差を示す。図は、漸増濃度のＣａｔｈ Ａで処理したＥＬＩＳＡウェルの試料４５０ｎｍ中の平均吸光度である。 図２０Ａ〜Ｃは、ウェスタンブロットにより測定した、Ａβ４０アミロイドの凝集及び分解を示す。図２０Ａでは、凝集してアミロイド種になっていることを示す。Ａβ４０を、線維バッファーまたはオリゴマーバッファー中で室温にて０〜９日間インキュベートした。１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルにレーンあたり２μｇのＡβ４０を装填し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウェスタンブロットを抗Ａβ４０Ｃ末端一次抗体（Ｇ２−１０）を用いてプローブした。線維形成中にＣａｔｈ Ａと共にインキュベートしたＡβ４０は凝集を抑制する。Ａβ４０を線維バッファー中でＣａｔｈ Ａと共に室温で０〜９日間共インキュベートした。高分子量のバンドを観察するため図２０Ｂのゲルは７．５％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで実施し、低分子量バンドを見るため図２０Ｃのゲルは１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで実施した。各レーンに２μｇのＡβ４０を装填した。それぞれのゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ａβ４０Ｃ末端一次抗体（Ｇ２−１０）を用いてプローブした。

本明細書で示されるように、本願発明者らは、さまざまな分解酵素を使用して、各種のアミロイドオリゴマー及びアミロイド線維の形成抑制及び／または分解が可能であることを発見した。これらのオリゴマー及び線維は、さまざまなアミロイド関連の疾患及び障害の発症に寄与し得るため、本発明は、対象のアミロイドーシスを治療または予防するための方法及び組成物を提供する。

アミロイドは、特定の構造特性を共有する不溶性の線維状タンパク質凝集体である。通常、可溶性のタンパク質が沈着してこの不溶性形態になると、細胞死及び組織変性をもたらし得る。現在までのところ、疾患関連のアミロイド沈着において１８種の異なるタンパク質及びポリペプチドが同定されている。参照によりその全体が組み込まれるＷｅｓｔｅｒｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ａｕｇｕｓｔ ８−９，１９９８．Ｐａｒｔ１．”Ａｍｙｌｏｉｄ．１９９９ Ｍａｒ；６（１）：６３−６．）を参照のこと。アミロイド線維は、直径約４０〜１２０Åの長い直線状の非分岐フィラメントであり、コンゴーレッド及びチオフラビンＴなどの生理的色素に結合し、プロテアーゼによる消化に対し耐性である。

本明細書で使用する場合、アミロイドーシスは、アミロイドの蓄積によって生じる疾患を指す。そのような疾患で本発明による治療または予防の対象となるものには、全身性ＡＬアミロイドーシス、アルツハイマー病、２型真性糖尿病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症（例えば、ウシ海綿状脳症）、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、甲状腺髄様癌、不整脈、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチノーマ、家族性アミロイドポリニューロパチー、遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、透析アミロイドーシス、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、脳アミロイドアンギオパチー、脳アミロイドアンギオパチー（アイスランド型）、孤発性封入体筋炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病のようなプリオン関連脳症または海綿状脳症、レビー小体型認知症、パーキンソン症状を伴う前頭側頭型認知症、脊髄小脳失調症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、非神経障害性限局性疾患、例えば、ＩＩ型真性糖尿病、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、遺伝性アミロイド性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射部位限局性アミロイドーシス、大動脈中膜アミロイドーシス、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、腱毛乱生に関連した角膜アミロイドーシス、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、封入体筋炎、皮膚苔癬アミロイドーシス、ならびに非神経障害性全身性アミロイドーシス、例えば、ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、家族性地中海熱、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、血液透析アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、フィンランド型遺伝性アミロイドーシス、リゾチーム・アミロイドーシス、フィブリノゲン・アミロイドーシス、アイスランド型遺伝性脳アミロイドアンギオパチー、家族性アミロイドーシス、ならびに複数の組織に生じる全身性アミロイドーシス、例えば、軽鎖アミロイドーシス、ならびに他のさまざまな神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的な実施形態では、アミロイドーシスは軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである。さらなる例示的実施形態では、ＡＬアミロイドーシスは、心臓、腎臓、神経系、及び胃腸管から選択される１つ以上の臓器に影響を与える。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象のアミロイドーシスに関連する疾患を治療または予防するための方法及び組成物を提供し、ここで、かかる疾患はアミロイド−ベータ（ＡβまたはＡベータ）ペプチドの形成に関連する。これらのペプチドはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生じ、アミロイド前駆体タンパク質がベータセクレターゼ及びガンマセクレターゼによって切断されてアミロイド−ベータができる。いくつかの実施形態では、アミロイド−ベータ形成に関連する疾患は、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、レビー小体認知症、及び封入体筋炎から選択される。

代替的実施形態では、本発明は、対象のアミロイドーシスに関連する疾患を治療または予防するための方法及び組成物を提供し、ここで、かかる疾患はアミロイドベータ形成に関連しない、すなわち、かかる疾患は、アミロイドベータ形成に関連する疾患以外の疾患、例えば、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、レビー小体認知症、及び封入体筋炎以外の疾患である。

一実施形態では、アミロイドーシスに関連する疾患は軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである。別の実施形態では、アミロイドーシスに関連する疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、関節リウマチ、及びプリオン関連疾患から選択される。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは全身性アミロイドーシスである。全身性アミロイドーシスには、進行性の臓器損傷をもたらすミスフォールドタンパク質の組織沈着を原因とする疾患の複合群が包含される。

上記のように、いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシス（原発性全身性アミロイドーシス（ＰＳＡ）または原発性アミロイドーシスとしても知られる、すなわち、かかる別名もある）である。ＡＬアミロイドーシスは、対象の抗体産生細胞が適切に機能せず、軽鎖と呼ばれる抗体成分で構成される異常なタンパク質繊維を産生する場合に生じる状態を指す。いくつかの実施形態では、そのような軽鎖は１つ以上の異なる臓器でアミロイド沈着を形成し、これらの臓器を損傷し得る、または既に損傷を起こしている。いくつかの実施形態では、異常な軽鎖は血液中及び／または尿中にある。いくつかの実施形態では、異常な軽鎖は「ベンス−ジョーンズ蛋白」である。いくつかの実施形態では、ＡＬアミロイドーシスは心臓、末梢神経系、胃腸管、血液、肺及び／または皮膚に影響を与える。ＡＬアミロイドーシスの臨床像には一群の症状及び臓器機能不全も含まれ得、それらには心機能不全、腎機能不全、肝機能不全、消化管障害、神経障害及び巨舌症を挙げることができる。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスはＡＡアミロイドーシス（別名、続発性アミロイドーシス、ＡＡ）であり、血清アミロイドＡ蛋白（ＳＡＡ）と呼ばれる沈着したタンパク質によって生じる。いくつかの実施形態では、ＳＡＡタンパク質は主に肝臓、脾臓及び／または腎臓に沈着している。いくつかの実施形態では、ＡＡアミロイドーシスはネフローゼ症候群をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＡアミロイドーシスは、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、強直性脊椎炎、またはクローン病及び潰瘍性大腸炎）、慢性感染症（例えば、結核、気管支拡張症、または慢性骨髄炎）、自己炎症性疾患（例えば、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、マックル−ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、癌（例えば、ホジキンリンパ腫、腎細胞腫）、及び／または慢性異物反応（例えば、シリコーンによる肉芽腫性反応）によって生じる。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは家族性アミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、家族性アミロイドーシスは、ＡＴＴＲアミロイドーシス（別名、または老人性全身性アミロイドーシス）であり、異常なトランスサイレチンタンパク質を産生するトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子変異など、１つ以上の遺伝性アミロイドーシスが原因である。いくつかの実施形態では、家族性アミロイドーシスは、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、フィブリノゲン（ＡＦｉｂ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、及び／またはＬｅｃｔ２の１つ以上の変異によって生じる。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスはベータ−２ミクログロブリンアミロイドーシス（Ａベータ２ｍ）である。ベータ−２ミクログロブリンアミロイドーシスは慢性腎不全によって生じ、長年にわたり透析を受けている患者に生じることが多い。アミロイド沈着は、腎不全のため腎臓からの排泄が行えない場合に組織、特に関節周辺に蓄積したベータ−２ミクログロブリン蛋白で構成されている。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは限局性アミロイドーシス（ＡＬｏｃ）である。いくつかの実施形態では、限局性アミロイドは、気道（気管または気管支）、目、または膀胱に沈着する。いくつかの実施形態では、ＡＬｏｃは、骨髄由来ではない免疫グロブリン軽鎖の局所的産生によって生じる。いくつかの実施形態では、ＡＬｏｃは、内分泌タンパク質、または皮膚、心臓、及び他の部位で産生されるタンパク質に関連している。これらは通常、全身性とはならない。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、対象の腎臓に生じる。いくつかの実施形態では、腎アミロイドーシスはＡＡアミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、ＡＡアミロイドーシスはネフローゼ症候群をもたらす。いくつかの実施形態では、腎アミロイドーシスはＡＬアミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、ＡＬアミロイドーシスに関連した腎疾患及び腎不全の症状としては、体液貯留、腫脹、及び息切れが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、対象の心臓に生じる。いくつかの実施形態では、心アミロイドーシスはＡＬアミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、心アミロイドーシスは心不全及び／または不整脈をもたらす。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、対象の胃腸管に生じる。いくつかの実施形態では、ＧＩアミロイドーシスの症状として、食道逆流、便秘、悪心、腹痛、下痢、体重減少、及び早期満腹感が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、十二指腸、胃、大腸、及び／または食道に生じる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療方法により、アミロイドーシスに関連した症状の１つ以上の軽減、重症度低下、または発生率低下が提供される。そのような症状には、軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシス（原発性全身性アミロイドーシス）及び／またはＡＡアミロイドーシス（続発性アミロイドーシス）に関連した症状が含まれる。いくつかの実施形態では、症状には、体液貯留、腫脹、息切れ、疲労、不整脈、手足のしびれ感、発疹、息切れ、嚥下困難、手足の腫脹、食道逆流、便秘、悪心、腹痛、下痢、早期満腹感、脳卒中、胃腸障害、肝腫大、脾機能低下、副腎及び他の内分泌腺の機能低下、皮膚の色の変化または腫瘍、肺の問題、出血及び挫傷の問題、疲労及び体重減少、尿量減少、下痢、嗄声または声の変化、関節痛、ならびに脱力が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、症状は、アミロイド−ベータ（Ａβ）アミロイドーシスに関連した症状である。いくつかの実施形態では、症状には、記憶喪失、錯乱、視覚イメージと空間的関係の理解障害、及び会話または書字の問題を含む、アルツハイマー病の一般的症状が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の方法による「対象」という用語には、疾患または病態に罹患している、罹患が疑われる、または罹患のリスクがある、任意の対象が含まれる。好適な対象（または患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、家畜、及び飼育動物またはペット（例えば、ネコ、イヌ）などの哺乳類が含まれる。非ヒト霊長類及びヒト患者も含まれる。「リスクがある」対象は、検出可能な疾患に罹患していても罹患していなくてもよく、本明細書に記載の予防または治療の方法より以前に、検出可能な疾患が認められていても認められていなくてもよい。「リスクがある」とは、対象がいわゆる危険因子を１つ以上有していることを意味し、それらの危険因子は、本明細書に記載する疾患、障害、病態、または症状のいずれか１つと相関する測定可能なパラメータである。これらの危険因子を１つ以上有する対象は、これらの危険因子（複数可）がない対象よりも、本明細書に記載する疾患、障害、病態、または症状のいずれか１つを発症する確率が高い。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイドーシスに罹患しているか、またはアミロイドーシスに起因もしくは関連する疾患／症状があると診断されたヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイドーシスが疑われるヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイドーシスを発症するリスクが高いヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載する疾患／病態／症状の１つ以上が見られるアミロイドーシス患者である。

本明細書で使用する「治療すること」及び「治療」という用語は、臨床結果を含め、有益であるかまたは所望される結果を得るための方法を指し、それには、治療される疾患または病態の測定可能マーカーの１つ以上における変化または改善がたとえ最小限であっても含まれ得る。治療は通常、病態、疾患、障害、傷害または損傷の少なくとも１つの症状の軽減に有効である。臨床的改善の例示的マーカーは当業者には明らかであろう。例としては、疾患により生じる１つ以上の症状の重症度及び／もしくは頻度の低下、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患悪化の予防または遅延）、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善、疾患の治療に要する他剤の１つ以上の用量減少、ならびに／または生活の質の向上などのうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

「予防投与」、「予防治療」、「予防」、または「予防的治療」は、１つ以上の症状及び／もしくはその基礎原因の発生または重症度を予防するかまたは低下させること、例えば、疾患または病態を発症しやすい対象（例えば、遺伝的素因、環境因子、素因となる疾患または障害等の結果として、リスクが高い対象）の疾患または病態の予防を指す。

本発明は、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象における少なくとも１種の分解酵素の発現、活性、及び／または濃度を高めることを含む。所与の分解酵素の発現、活性、及び／または濃度の増加は、ゲノムＤＮＡレベル、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベル、及び／または翻訳後レベルで達成してよく、それらには、遺伝子コピー数、ｍＲＮＡ転写速度、ｍＲＮＡ存在量、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質翻訳速度、タンパク質安定性、タンパク質修飾、タンパク質活性、タンパク質複合体活性などを高めることが挙げられるが、これらに限定されるものではない。所与の分解酵素の濃度上昇はさらに、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することによって達成され得る。本明細書で使用する場合、分解酵素という用語は、酵素の天然型だけではなく、天然酵素の任意の精製変異型、単離変異型、合成変異型、組換え変異型、及び機能性変異型、断片、キメラ、ならびに変異体も指す。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬからなる非限定的な群から選択される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、ＰＰＣＡ（別名、保護タンパク質カテプシンＡ、ＰＰＧＢ、カルボキシペプチダーゼＣ、ＥＣ３．４．１６．５、ＧＳＬ、ＧＬＢ２、カルボキシペプチダーゼＹ様キニナーゼ、ＮＧＢＥ、カルボキシペプチダーゼ−Ｌ、ベータ−ガラクトシダーゼの保護タンパク質（ガラクトシアリドーシス）、デアミダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リソソームカルボキシペプチダーゼＡ、ベータ−ガラクトシダーゼ保護タンパク質、リソソーム保護タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼの保護タンパク質、尿キニナーゼ、ＥＣ３．４．１６８、またはカルボキシペプチダーゼＬ）であり、カテプシン及びカルボキシペプチダーゼの両方に分類される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、ＰＰＣＡである。ＰＰＣＡは糖タンパク質であり、リソソーム酵素のベータガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼと会合して高分子多量体の複合体を形成する。この複合体の形成は、安定性及び活性にとって保護機能を果たす。これは、β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼにとっての保護となる。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡポリペプチドは、配列番号２、４３、または４５に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＰＣＡポリペプチドは、配列番号２、４３、または４５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１、別名、シアリダーゼ１、リソソームシアリダーゼ、ＥＣ３．２．１．１８、アセチルノイラミニルヒドロラーゼ、ＳＩＡＬ１、リソソームシアリダーゼ、エキソ−アルファ−シアリダーゼ、ＮＡＮＨ、シアリダーゼ−１、またはＧ９シアリダーゼ）であり、リソソーム性ノイラミニダーゼ酵素である。ＮＥＵ１は、糖タンパク質及び糖脂質などの基質から末端シアル酸残基を切断する酵素である。いくつかの実施形態では、ＮＥＵ１は、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＥＵ１ポリペプチドは、配列番号４に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態ではＮＥＵ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１、脊髄小脳失調症、常染色体劣性７、ＣＬＮ２、ＳＣＡＲ７、増殖抑制タンパク質１、細胞増殖抑制遺伝子１タンパク質、リソソームのペプスタチン非感受性プロテアーゼ、トリペプチジルアミノペプチダーゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼ１、ＬＰＩＣ、リソソームのペプスタチン−非感受性プロテアーゼ、またはＥＣ３．４．１４．９）である。ＴＰＰ１は、基質からＮ末端トリペプチドを切断する酵素であり、エンドペプチダーゼ活性が弱い。いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１は、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号６に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、カテプシンＢ（別名、ＥＣ３．４．２２．１、ＣＰＳＢ、アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼ、システインプロテアーゼ、ＡＰＰＳ、ＡＰＰセクレターゼ、またはＥＣ３．４．２２）である。カテプシンＢは、単一のタンパク質前駆体から産生された重鎖と軽鎖がジスルフィド結合した二量体で構成される、リソソームのシステインプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、カテプシンＢは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＢポリペプチドは、配列番号８、４７、４９、５１、５３、５５、または５７に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＢポリペプチドは、配列番号８、４７、４９、５１、５３、５５、または５７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、カテプシンＤ（別名、ＥＣ３．４．２３．５、ＣＴＳＤ）である。カテプシンＤは、細胞内のタンパク質分解において活性な、リソソームの酸性プロテアーゼを指す。いくつかの実施形態では、カテプシンＤは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＤポリペプチドは、配列番号６８に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＤポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＤポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列に対して１つ以上の修飾を有する。ある実施形態では、カテプシンＤポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、ここで、かかるポリペプチドは、位置５８（ＡをＶに）、位置２２９（ＦをＩに）、位置２８２（ＧをＲに）、及び位置３８３（ＷをＣに）から選択されるアミノ酸位置での修飾を有する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、カテプシンＥ（別名、ＥＣ３．４．２３．３４、ＣＴＳＥ）である。カテプシンＥはリソソームのアスパルチルプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、カテプシンＥは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＥポリペプチドは、配列番号６９、７０、または７１に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＥポリペプチドは、配列番号６９、７０、または７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＥポリペプチドは、配列番号６９、７０、または７１のアミノ酸配列に対して１つ以上の修飾を有する。ある実施形態では、カテプシンＥポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ここで、かかるポリペプチドは、位置８２（ＩをＶに）及び位置３２９（ＴをＩに）から選択されるアミノ酸位置での修飾を有する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、カテプシンＫ（別名、ＥＣ３．４．２２．３８、ＣＴＳＯ、濃化異骨症、ＰＹＣＤ、カテプシス（Ｃａｔｈｅｐｓｉｓ）Ｏ、ＰＫＮＤ、カテプシンＸ）である。カテプシンＫは、骨リモデリング及び骨吸収に関与する、リソソームのシステインプロテアーゼであり、そのキニンに対する高特異性で定義される。いくつかの実施形態では、カテプシンＫは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＫポリペプチドは、配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＫポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素は、カテプシンＬ（別名、ＭＥＰ、ＣＴＳＬ、ＥＣ３．４．２２．１５、ＣＡＴＬ、主要排泄タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｅｘｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））である。カテプシンＬは、リソソームのエンドペプチダーゼ酵素であり、タンパク質分解開始に関与している。その基質には、コラーゲン及びエラスチン、ならびに好中球エラスターゼ活性の主要制御エレメントであるアルファ−１プロテアーゼ阻害因子が挙げられる。いくつかの実施形態では、カテプシンＬは、天然、合成、または組換え型のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＬポリペプチドは、配列番号１２、５９、６１、６３、６５、または６７に対する配列同一性が少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシンＬポリペプチドは、配列番号１２、５９、６１、６３、６５、または６７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列の投与を含む。

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、「ヌクレオチド配列」、及び「単離された核酸断片」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。これらの用語にはヌクレオチド配列等が包含される。ポリヌクレオチドは、任意選択で、合成、非天然型または改変型のヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってよい。ＤＮＡのポリマー形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはその混合の１つ以上のセグメントで構成されてよい。ヌクレオチド（通常はその５′−一リン酸型で見られる）は、一文字表記によって言及され、すなわち、「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡの場合）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、及び「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。

本明細書で使用する場合、核酸配列またはタンパク質配列の記載における「キメラ」または「組換え型」という用語は、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一高分子にするか、または少なくとも１つの天然の核酸もしくはタンパク質の配列のエレメント１つ以上を再構成する、核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換え型」は、配列の本来別々になっている２つのセグメントを、例えば、化学合成、または遺伝子工学技術で単離された核酸セグメントの操作を手段として、人工的に組み合わせることを指し得る。

本明細書で使用する場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に生じることが既知ではないかまたは天然には生じないヌクレオチド配列である。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列には、天然に生じる他の任意のヌクレオチド配列と比較した場合にヌクレオチドの相違が少なくとも１つ含まれることになる。本発明の遺伝子調節エレメントは合成ヌクレオチド配列を含むと認識される。いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、天然配列に対する伸長相同性をほとんど、または全く共有しない。この場合の伸長相同性とは、一般に、約２５ヌクレオチドの連続配列を超えて伸長する１００％配列同一性を指す。本発明の合成の遺伝子調節エレメントは合成ヌクレオチド配列を含む。

本明細書で使用する場合、「単離された」または「精製された」核酸分子もしくはポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性な部分は、その天然に生じる環境において通常は核酸分子もしくはポリヌクレオチドとの付随または相互作用が見られる成分を実質的または本質的に含まない。したがって、単離または精製された核酸分子もしくはポリヌクレオチドは、組換え技術で作製した場合に他の細胞物質もしくは培地を実質的に含まないか、または化学的に合成した場合に化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、方法は、発現ベクター（本明細書ではベクターと同じ意味で言及される）を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、かかるベクターは、少なくとも１種の分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、コード遺伝子の発現カセットを含む少なくとも１つの発現ベクターを含む組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象に対し、少なくとも１種の分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのウイルスベクターを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、発現カセット、発現ベクター、またはウイルスベクターはさらに、シグナルペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはリソソーム内局在ペプチドである。

少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｏｌｌａｎｄにより記載されているような（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＳＢＮ：９７８−０−８２４７−４２３５−５，２００３）任意の好適な送達システムを介して対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、送達システムはウイルスシステム、物理的システム、及び／または化学的システムである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を送達するための送達システムはウイルスシステムである。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する（Ｔｈｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｘ−ＳＣＩＤ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｏｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００６；４４３（７１０９）：Ｅ５−Ｅ６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１３；１０（５）：６０７−６１６．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、アデノ関連ベクターを使用する（Ｔｅｒａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌａｎｃｅｔ．２０００；３５５（９２１８）：１９１１−１９１２，Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｖｅｓｔｉｂｕｌｅ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｏｔｏｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．２０１２；３３（４）：６５５−６５９．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターを使用する（Ａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ−ｗｈａｔ ａｒｅ ｔｈｅ ｒｉｓｋｓ？ Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ．２００４；２（１）：９．；Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｄ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７；１１７（８）：２０８３−２０８６．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する（Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ ｉｎ ｒａｔ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１；８（７）：５５１−５５６．；Ｒｅａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；９１（６）：１５８１−９１．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスベクターを使用する（Ｌａｃｈｍａｎｎ ＲＨ，Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ Ｓ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ．１９９７；３（９）：４０４−４１１；Ｌｉｕ Ｓ，Ｄａｉ Ｍ，Ｙｏｕ Ｌ，Ｚｈａｏ Ｙ．Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１３；５６（４）：２９８−３０５．を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスベクターを使用する（Ｍｏｓｓ Ｂ．Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３；３１（３９）：４２２０−４２２２．を参照のこと）。参考文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を送達するための送達システムは、物理的システムである。いくつかの実施形態では、物理的システムには、ジェット注射、微粒子銃、電気穿孔法、ハイドロダイナミック法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、及び超音波が挙げられるが、これらに限定されるものではない（Ｓｉｒｓｉ ｅｔ ａｌ．．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１２；２（１２）：１２０８−１２２２．；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７２（５２５９）：２６３−２６７；Ｐａｎｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｖｅｒｓｕｓ ｎｅｕｔｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｏｓｅ ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１２；２（１１）：１０７８−１０９１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２（１０）：７１０−７２２；Ｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｖｏｌｔａｇｅ ａｎｄ ｌｏｗ−ｖｏｌｔａｇｅ ｐｕｌｓｅｓ．Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１２；２４５（１０）：６６１−６６６を参照のこと）。参考文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を送達するための送達システムは、化学的システムである。化学的システムには、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム及びポリマー担体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、化学的システムは、ＤＮＡを封入するリン酸カルシウムナノコンポジット粒子などのリン酸カルシウム沈殿に基づいている（Ｎｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄ（ＳＢＦ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２０１２；４３４（１−２）：１９９−２０８；Ｂｈａｋｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｓ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；５（１）：１０６−１１４を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を送達するための化学的システムは、リポソームに基づいている。いくつかの実施形態では、リポソームはナノサイズである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびに／またはリガンド及びペプチドなどの他の分子と結合させたリポソームを使用できる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｎｕｃｌｅｏｌｉｐｉｄｓ ａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１；１（９）：２９１−２９６．を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種の分解酵素をコードするヌクレオチド配列を送達するための化学的システムは、ポリマー担体に基づいている。いくつかの実施形態では、送達すべき遺伝子にポリマー担体を結合させる。いくつかの実施形態では、ポリマー担体には、キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミノエステル、ポリアミドアミンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、及びＰＬＬ、例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＰＡＭＡＭ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００４；３（９９）：４４５−４５６；Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ−ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）：ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ）ｍｉｃｒｏ− ａｎｄ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ：ＤＮＡ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２００５；３０４（１−２）：２１０−２１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒｓ）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５；３（１１）：４２６−４３４；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００１；２（１２）：２８０−２９０；Ｋｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎｓ ａｓ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００５；３（１０３）：６４３−６５３に記載のようなものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、分解酵素の投与は、本発明の少なくとも１種の分解酵素のポリペプチドまたはその断片の投与を含む。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書では同じ意味で使用される。

本発明はまた、本明細書に記載するリソソーム内分解酵素の機能性変異型または機能性断片の使用を想定し、かつ包含する。本明細書で使用する場合、タンパク質に関して「生物学的に活性な変異型」または「機能性変異型」という語句は、参照配列に関して１つ以上のアミノ酸が改変されているが、参照配列の実質的な生物学的活性は依然として維持されているアミノ酸配列を指す。変異型は、「保存的」変更を有してよく、ここで、置換アミノ酸は、例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換のように、構造上または化学的な特性が類似している。以下の表は、例示的な保存的アミノ酸置換を示す。

別法として、変異型は、「非保存的」変更、例えば、グリシンのトリプトファンへの置換を有してよい。同様の軽微な変更には、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方も含まれ得る。生物学的または免疫学的な活性を消失させずに置換、挿入、または欠失が可能なアミノ酸残基を決定する際の指針は、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して見出すことができる。ポリヌクレオチドの場合、変異型は、５’及び／もしくは３’末端での欠失（すなわち、切断）を有するポリヌクレオチド；参照ポリヌクレオチド内部の１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失及び／もしくは付加を有するポリヌクレオチド；ならびに／または参照ポリヌクレオチドの１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、「参照」ポリヌクレオチドは、本明細書に開示の方法で作成したヌクレオチド配列を含む。変異型ポリヌクレオチドには、例えば、部位特異的変異の導入を使用して作製されてはいるが、遺伝子調節エレメント活性を依然として含んでいる、合成によるポリヌクレオチドも含まれる。一般に、特定のポリヌクレオチドもしくは核酸分子の変異型、または本発明のポリペプチドは、配列アラインメントプログラム及び本明細書の他の箇所に記載のパラメータによって決定した場合に、その特定のポリヌクレオチド／ポリペプチドに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上の配列同一性を有することになる。

いくつかの実施形態では、本発明の分解酵素をコードする核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な遺伝子を使用できる。「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリッドの安定性に影響を与えるハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度等を指す。これらの条件を経験的に最適化して、プライマーまたはプローブとその標的核酸配列との特異的結合を最大化し、かつ非特異的結合を最小化する。これらの用語の使用には、プローブまたはプライマーが、検出可能なほどの高い程度で（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）その標的配列とハイブリダイズするような条件への言及が含まれる。ストリンジェントな条件は配列に依存し、さまざまな状況によって異なってくる。長い配列は特に高温でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度とｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度とｐＨにおいて）である。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のＮａ^＋イオン、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃である条件となろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加して達成してもよい。例示的な低ストリンジェントな条件または「低ストリンジェンシーの条件」には、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液と３７℃でのハイブリダイゼーション、及び４０℃、２×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳで３７℃でのハイブリダイゼーション、及び６０℃、０．１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーションの手順は当技術分野において周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）により記載されている。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件は、１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム、例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％を含有している０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファー（ｐＨ７．２）中で４５℃にてハイブリダイゼーションし、その後、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム含有５×ＳＳＣで５５℃〜６５℃にて洗浄する。

各分解酵素の定義には、本明細書で言及される特定の分解酵素の核酸配列及び／またはポリペプチド配列に対する類似性または同一性が高い配列が含まれる。本明細書で使用する場合、２つの核酸配列もしくはポリペプチド配列における「配列同一性」または「同一性」には、特定の比較枠にわたり最大一致度についてアラインメントを行った場合に同一である、２つの配列の残基への言及が含まれる。タンパク質に関して配列同一性パーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多いと認識される。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は、化学特性（例えば、電荷または疎水性）が類似した他のアミノ酸残基に置換され、そのため、その分子の機能特性が変化することはない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、上方調節を行ってその置換の保存的性質について補正してよい。そのような保存的置換によって異なっている配列の場合、「配列類似性」または「類似性」と言う。この調節を行う手段は当業者に周知である。その場合、典型的には、保存的置換を完全ミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとしてスコアリングし、これにより配列同一性パーセンテージを高める。したがって、例えば、同一なアミノ酸に１のスコアを、また非保存的置換にゼロのスコアを与える場合、保存的置換にはゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。

本発明には、本明細書に記載する分解酵素の生物学的に活性な断片も含まれる。これらの生物学的に活性な断片は、少なくとも１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、またはそれ以上のアミノ酸残基を含んでよく、また本明細書に記載する分解酵素に関連した１つ以上の活性を保持してよい。そのような断片は、欠失変異により、または当技術分野で常套的かつ周知の組換え技術により得てもよいし、または多数ある周知のタンパク質分解酵素の任意のものを使用して、関心対象の分解酵素（複数可）を酵素的に消化させることにより得てもよい。本発明にはさらに、上記の変異酵素及び酵素断片をコードする核酸分子が含まれる。

いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、治療的有効量もしくは予防的有効量の少なくとも１種の分解酵素を含む組成物を投与することを含む。本明細書で使用する「治療的有効量」という用語は、アミロイドーシスの治療、または傷害もしくは損傷の軽減もしくは予防に必要な１種以上の分解酵素のレベルまたは量を指し、任意選択で、重大な負の副作用または有害な副作用を生じさせない。「予防的有効量」は、アミロイドーシスもしくはアミロイドーシスに関連する病態に罹患しやすく、かつ／またはかかる病態を発症し得る対象に投与した場合に、将来的にアミロイドーシス関連の疾患もしくは病態に罹患した際の重症度を抑えるかまたは低下させるために十分な分解酵素の量を指す。

いくつかの実施形態では、方法は、本発明の分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列の投与の代わりまたは追加として、本発明の分解酵素もしくはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドを含む組成物を、必要としている対象に直接投与することを含む。

いくつかの実施形態では、分解酵素はリソソーム内空間を標的とする。いくつかの実施形態では、投与されるべき分解酵素は、ポリペプチドをリソソームへ選別するのを助ける１つ以上のシグナルを含む。いくつかの実施形態では、シグナルは、リソソーム局在シグナルポリペプチド、単糖（誘導体を含む）、多糖、またはその組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態では、シグナルはマンノース−６リン酸である。マンノース−６リン酸を含む分解酵素は、マンノース−６リン酸受容体の助けによりリソソームを標的とすることができる。

いくつかの実施形態では、シグナルはマンノース−６リン酸に依存しない。いくつかの実施形態では、シグナルはシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、投与されるべきリソソーム内分解酵素のＮ末端、Ｃ末端、または他の箇所に位置する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドには、ＤＸＸＬＬ型（配列番号１３）、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］型（配列番号１４）、及びＹＸＸＯ型（配列番号１５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。各々が参照によりその全体が組み込まれるＢｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（２００３）３９５−４４７；及びＢｒｕａｌｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７９３（２００９）６０５−６１４）を参照のこと。

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＰＲ３００／ＣＩ−ＭＰＲ（ＳＦＨＤＤＳＤＥＤＬＬ、配列番号１６）、ＭＰＲ４６／ＣＤ−ＭＰＲ（ＥＥＳＥＥＲＤＤＨＬＬ、配列番号１７）、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ（ＧＹＨＤＤＳＤＥＤＬＬ、配列番号１８）、ＳｏｒＬＡ／ＳＯＲＬ１（ＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶ、配列番号１９）、ＧＧＡ１（１）（ＡＳＶＳＬＬＤＤＥＬＭ、配列番号２０）、ＧＧＡ１（２）（ＡＳＳＧＬＤＤＬＤＬＬ、配列番号２１）、ＧＧＡ２（ＶＱＮＰＳＡＤＲＮＬＬ、配列番号２２）、及びＧＧＡ３（ＮＡＬＳＷＬＤＥＥＬＬ、配列番号２３）において識別されるようなＤＸＸＬＬ型に属する。

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＬＩＭＰ−ＩＩ（ＤＥＲＡＰＬＩ、配列番号２４）、ＮＰＣ１（ＴＥＲＥＲＬＬ、配列番号２５）、Ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ−１（ＳＥＴＥＲＬＬ、配列番号２６）、Ｓｉａｌｉｎ（ＴＤＲＴＰＬＬ、配列番号２７）、ＧＬＵＴ８（ＥＥＴＱＰＬＬ、配列番号２８）、インバリアント鎖（Ｉｉ）（１）（ＤＤＱＲＤＬＩ、配列番号２９）、及びインバリアント鎖（Ｉｉ）（２）（ＮＥＱＬＰＭＬ、配列番号３０）において識別されるような［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］型に属する。

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＬＡＭＰ−１（ＧＹＱＴＩ、配列番号３１）、ＬＡＭＰ−２Ａ（ＧＹＥＱＦ、配列番号３２）、ＬＡＭＰ−２Ｂ（ＧＹＱＴＬ、配列番号３３）、ＬＡＭＰ−２Ｃ（ＧＹＱＳＶ、配列番号３４）、ＣＤ６３（ＧＹＥＶＭ、配列番号３５）、ＣＤ６８（ＡＹＱＡＬ、配列番号３６）、エンドリン（Ｅｎｄｏｌｙｎ）（ＮＹＨＴＬ、配列番号３７）、ＤＣ−ランプ（ＧＹＱＲＩ、配列番号３８）、シスチノシン（ＧＹＤＱＬ、配列番号３９）、糖リン酸交換体２（ＧＹＫＥＩ、配列番号４０）、及び酸性ホスファターゼ（ＧＹＲＨＶ、配列番号４１）において識別されるようなＹＸＸＯ型に属する。

いくつかの実施形態では、分解酵素は細胞の外部に留まるよう標的化され、すなわち、酵素は細胞外で作用するよう改変される。いくつかの実施形態では、投与されるべき分解酵素は、本来ポリペプチドをリソソームに指向させるはずの１つ以上のシグナルを欠く。いくつかの実施形態では、分解酵素は、１つ以上のマンノース−６リン酸（すなわち、Ｍ６Ｐ）シグナルを欠き、これにより分解酵素の細胞内侵入を不可能にする。いくつかの実施形態では、分解酵素を組換えにより操作して１つ以上のマンノース−６リン酸シグナルを欠失させる。いかなる理論にも拘束されることなく、Ｍ６Ｐ含有量を少なくすることにより、組換え型酵素のＭ６Ｐ受容体に対する結合親和性が下がり、その細胞内への取り込みが抑制され、これにより酵素は細胞外部に留まることが可能になることは、当該技術分野において一般に理解されている。

組換えタンパク質、例えば、分解酵素のＭ６Ｐ含有量を少なくする方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，１０５号を参照のこと。いくつかの実施形態では、細胞培養条件を、細胞が産生する糖タンパク質のマンノース含有量が低くなるよう操作することによって組換え型分解酵素のマンノース含有量を少なくしてよい。本明細書で使用する場合、「低マンノース含有量」という用語は、マンノース残基を４つ以上有する（すなわち、Ｍ５またはそれ以上の種）酵素が組成物中に約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約８％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、もしくは上記範囲の間にある任意の値、または０％である分解酵素組成物を指す。

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種の分解酵素を含む組成物を提供し、ここで、かかる組成物は、細胞リソソームを標的とする少なくとも１種の分解酵素及び細胞の外部に留まる少なくとも１種の分解酵素を含む。いくつかの実施形態では、分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される。例示的な一実施形態では、本発明は、少なくとも２種の分解酵素を含む組成物を提供し、ここで、かかる組成物は、細胞リソソームを標的とするＰＰＣＡ分解酵素及び細胞の外部に留まるＰＰＣＡ分解酵素を含む。いくつかの実施形態では、組成物内のリソソーム内分解酵素と細胞外分解酵素との百分率による比は少なくとも５％：９５％である。さらなる実施形態では、組成物内のリソソーム内分解酵素と細胞外分解酵素との百分率による比は少なくとも１０％：９０％、少なくとも１５％：８５％、少なくとも２０％：８０％、少なくとも２５％：７５％、少なくとも３０％：７０％、少なくとも３５％：６５％、少なくとも４０％：６０％、少なくとも４５％：５５％、少なくとも５０％：５０％、少なくとも５５％：４５％、少なくとも６０％：４０％、少なくとも６５％：３５％、少なくとも７０％：３０％、少なくとも７５％：２５％、少なくとも８０％：２０％、少なくとも８５％：１５％、少なくとも９０％：１０％、または少なくとも９５％：５％である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも２種、３種、またはそれ以上の分解酵素を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象において、少なくとも２種、３種、もしくはそれ以上の分解酵素の発現、活性、及び／または濃度を高めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、少なくとも２種、３種、またはそれ以上の分解酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、少なくとも２種、３種またはそれ以上の分解酵素をコードする少なくとも２つ、３つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の発現カセットを投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に対し、治療的有効量の第１の分解酵素と、第２の分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットとを投与することを含む。いくつかの実施形態では、２種以上の分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の分解酵素はＰＰＣＡ及びＮＥＵ１である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、アミロイド形成を抑制する。他の実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、既に形成されているアミロイドを分解する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、１つ以上のアミロイドオリゴマーの形成を抑制する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、１つ以上のアミロイド線維の形成を抑制する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、１つ以上のアミロイドオリゴマーを、それらが既に形成された後に分解する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素の投与を使用して、１つ以上のアミロイド線維を、それらが既に形成された後に分解する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する本発明の方法はさらに、少なくとも１種の分解酵素またはその断片を、少なくとも１つのさらなるアミロイドーシスの治療もしくは予防用の薬物と共に含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物はステロイド剤である。いくつかの実施形態では、ステロイド剤は、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンまたはその任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物は非ステロイド剤である。いくつかの実施形態では、そのような非ステロイド剤は、ジクロフェナク、フルフェナム酸、フルルビプロフェン、ジフルニサル、デトプロフェン（ｄｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメアート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍｅａｔｅ）、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメオン（ｎａｂｕｍｅｏｎｅ）、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アスピリン、サリチル酸コリン、サルサルト（ｓａｌｓａｌｔｅ）、ならびにナトリウム及びマグネシウムのサリチル酸塩またはその任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミド（例えば、シトキサン、ネオサール）及びメルファラン（例えば、アルケラン）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、対象に炎症症状がある場合、少なくとも１つのさらなる薬物は抗炎症薬剤である。

いくつかの実施形態では、対象に感染症状がある場合、少なくとも１つのさらなる薬物は抗生物質である。いくつかの実施形態では、感染は慢性感染である。いくつかの実施形態では、感染は微生物感染である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物は、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）酵素（例えば、ＣＡ−Ｉ、ＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＩＩ、ＣＡ−ＩＶ、ＣＡ−Ｖ、ＣＡ−ＶＩ、及びＣＡ−ＶＩＩ）及び／または対象のカルボニックアンヒドラーゼ酵素の活性を高めることができる薬剤である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）である。いくつかの実施形態では、ＤＭＡＲＤは、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、Ｄ−ペニシラミン、ミノサイクリン、金、またはその任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる薬物は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質はエンブレル（登録商標）（エタネルセプト、可溶性ＴＮＦ受容体）またはレミケード（登録商標）（インフリキシマブ、キメラ型抗ＴＮＦモノクローナル抗体）である。

いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる薬物（複数可）は、メルファラン、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、レナリドミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド及びポマリドミドから選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、リソソームを酸性化する１つ以上の薬物の投与を含む。本明細書で使用する場合、リソソームを酸性化する薬物は、標的細胞のリソソームのｐＨを下げることのできる薬物である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法を提供し、ここで、かかる対象は、リソソームを酸性化する１つ以上の薬物の投与も受ける。本明細書に記載のように、併用療法を実施する場合、それら２つ以上の薬物（例えば、分解酵素またはその生物学的に活性な断片及びリソソームを酸性化する薬物）を同時投与することも、または順次、任意の順序で投与することもできる。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、酸性ナノ粒子、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬、アデノシン受容体作動薬、ドーパミン受容体作動薬、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の活性化薬、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ｃＡＭＰ類似体、及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤から選択される。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、酸性ナノ粒子である。酸性ナノ粒子は、リソソームに局在化してリソソームのｐＨを低下させることが示されている。共に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｌｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰｌｏＳ ＯＮＥ ７（１２）：ｅ４９６３５、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（９）：１４３０−４４を参照のこと。いくつかの実施形態では、酸性ナノ粒子は高分子酸性ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、高分子酸性ナノ粒子は、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）酸性ナノ粒子である。特定の実施形態では、ＰＬＧＡ酸性ナノ粒子は、ＰＬＧＡレソマーＲＧ５０３Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡ酸性ナノ粒子は、ＰＬＧＡレソマーＲＧ５０２Ｈを含む。他の実施形態では、高分子酸性ナノ粒子は、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＡ）酸性ナノ粒子である。特定の実施形態では、ＰＬＡ酸性ナノ粒子は、ＰＬＡレソマーＲ２０３Ｓを含む。いくつかの実施形態では、酸性ナノ粒子の酸価は、約０．５ｍｇ ＫＯＨ／ｇ〜約８ｍｇ ＫＯＨ／ｇである。いくつかの実施形態では、酸性ナノ粒子の酸価は、約１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ〜約６ｍｇ ＫＯＨ／ｇである。いくつかの実施形態では、酸性ナノ粒子の酸価は、約１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、約２ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、約３ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、約４ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、約５ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、または約６ｍｇ ＫＯＨ／ｇから選択される。特定の実施形態では、酸性ナノ粒子の酸価は、約３ｍｇ ＫＯＨ／ｇである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子径は約５０ｎｍ〜約８００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子径は約１００ｎｍ〜約６００ｎｍである。特定の実施形態では、ナノ粒子径は約３５０ｎｍ〜約５５０ｎｍである。さらなる特定の実施形態では、ナノ粒子径は約３７５ｎｍ〜約４００ｎｍである。例示的な一実施形態では、酸性ナノ粒子は球状である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脳の特定の輸送プロセスを標的とし、これにより、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬物輸送を向上させる。いくつかの実施形態では、そのような輸送プロセスとして、（１）ナノ粒子により内皮細胞間のＴＪ（タイトジャンクション）を開口させるかまたは局所的毒性作用を誘導してＢＢＢを局所的に透過性にし、それにより遊離形態薬物またはナノ粒子結合薬物の透過を可能にする、（２）ナノ粒子を、経細胞輸送によって内皮細胞を通過させる、（３）ナノ粒子を、エンドサイトーシスによって内皮細胞を通って輸送させ、そこで、その含有物を細胞の細胞質内に放出させ、その後、内皮の反管腔側で細胞外輸送させる、及び（４）各種機序のいくつかの組み合わせという各種プロセスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の標的となる受容体は、トランスフェリン及び低比重リポタンパク質受容体である。いくつかの実施形態では、標的指向は、物理的及び／または化学的にナノ粒子に固定化が可能な、ペプチド、タンパク質、または抗体によって達成可能である。いくつかの実施形態では、アポリポタンパク質ＡＩＩ、Ｂ、ＣＩＩ、Ｅ、及び／またはＪなど、１つ以上のアポリポタンパク質でナノ粒子をコートする（Ｋｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２，ＤＯＩ：１０．１０８０／１０６１１８６０２９００３１８７７を参照のこと）。ナノ粒子介在性の脳薬物送達の組成物及び方法の詳細については、Ｓａｒａｉｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１６，２３５：３４−３７）を参照のこと。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、カテコールアミンである。カテコールアミンはリソソームのｐＨを低下させることが示されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４９（２）：７７２−７８０を参照のこと。いくつかの実施形態では、カテコールアミンは、エピネフリン、メタネフリン、シネフリン、ノルエピネフィリン、ノルメタネフリン、オクトパミンまたはノルフェネフリン、ドーパミン、及びドーパから選択される。例示的な実施形態では、カテコールアミンは、エピネフリン、ノルエピネフィリン、及びドーパミンから選択される。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、β−アドレナリン受容体作動薬である。β−アドレナリン受容体作動薬は、リソソームのｐＨを低下させることが示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４９（２）：７７２−７８０を参照のこと。β−アドレナリン受容体作動薬の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０３２９８７９号に見出され得る。いくつかの実施形態では、β−アドレナリン受容体作動薬は、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ホルモテロール、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、フェノテロール、及びビランテロールから選択される。例示的な一実施形態では、β−アドレナリン受容体作動薬はイソプロテレノールである。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、アデノシン受容体作動薬である。アデノシン受容体作動薬は、リソソームのｐＨを低下させることが示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４９（２）：７７２−７８０を参照のこと。例示的な一実施形態では、アデノシン受容体作動薬は、非特定のアデノシン受容体作動薬またはＡ_２Ａアデノシン受容体作動薬である。Ａ_２Ａアデノシン受容体作動薬の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１３０４８１号に見出され得る。いくつかの実施形態では、アデノシン受容体作動薬は、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）、ＣＧＳ２１６８０、２−フェニルアミノアデノシン、２−［パラ−（２カルボキシエチル）フェニル］アミノ−５’Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、ＳＲＡ−０８２、５’−Ｎ−シクロプロピルカルボキサミドアデノシン、５’Ｎ−メチルカルボキサミドアデノシン及びＰＤ−１２５９４４から選択される。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、ドーパミン受容体作動薬である。ドーパミン受容体作動薬は、リソソームのｐＨを低下させることが示されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｕｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．８０１：１０５−１１１を参照のこと。いくつかの実施形態では、ドーパミン受容体作動薬は、Ａ６８９３０、Ａ７７６３６、Ａ８６９２９、ＳＫＦ８１２９７、ＳＫＦ８２９５８、ＳＫＦ３８３９３、ＳＫＦ８９１４５、ＳＫＦ８９６２６、ジヒドレキシジン、ジナプソリン、ジノキシリン（ｄｉｎｏｘｙｌｉｎｅ）、ドキサントリン（ｄｏｘａｎｔｈｒｉｎｅ）、フェノルドパム、６−Ｂｒ−ＡＰＢ、ステホリジン、ＣＹ−２０８２４３、７、８−ジヒドロキシ−５−フェニル−オクタヒドロベンゾ［ｈ］イソキノリン、カベルゴリン、及びペルゴリドから選択される。例示的な一実施形態では、ドーパミン受容体作動薬は、Ａ６８９３０、Ａ７７６３６、及びＳＫＦ８１２９７から選択される。さらなる例示的な実施形態では、ドーパミン受容体作動薬はＳＫＦ８１２９７であり、６−クロロ−１−フェニル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−３−ベンザゼピン−７，８−ジオールとしても知られる。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の活性化薬である。ＣＦＴＲの活性化薬は、リソソームのｐＨを低下させることが示されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０３：Ｃ１６０−９を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ活性化薬は、ＣＦＴＲ_Ａｃｔ０１〜ＣＦＴＲ_Ａｃｔ１７から選択される。Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：３７２３５−３７２４１を参照のこと。例示的な一実施形態では、ＣＦＴＲ活性化薬は、以下の構造を有するＣＦＴＲ_Ａｃｔ１１及びＣＦＴＲ_Ａｃｔ１６
ＣＦＴＲ_Ａｃｔ１１：

ＣＦＴＲ_Ａｃｔ１６：

から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ活性化薬をフォルスコリンと共に同時投与する。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰ類似体である。ｃＡＭＰ及び／またはｃＡＭＰ類似体は、リソソームのｐＨを低下させることが示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４９（２）：７７２−７８０を参照のこと。例えば、細胞透過性類似体クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ）及び８−ブロモ−ｃＡＭＰは、細胞でリソソームのｐＨを下げる能力がある。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ及び／または、ｃＡＭＰ類似体は、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）とフォルスコリンとを含むカクテルにして投与してよい。例えば、一実施形態では、リソソームを酸性化するためにＩＢＭＸ、フォルスコリン、及びｃｐｔ−ｃＡＭＰを含むカクテルを投与してよい。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ類似体は、９−ｐＣＰＴ−２−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰ、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ、８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰ、Ｎ６−モノブチリルアデノシン（ｍｏｎｏｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）３’，５’−サイクリック一リン酸、及びＰＤＥ阻害剤から選択される。

いくつかの実施形態では、リソソームを酸性化する薬物は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤である。ＧＳＫ−３阻害剤は、リソソームのｐＨ低下に有効であることが示されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｖｒａｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｏｍｍｕｎ Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ ６（５）：ｅ２５１７９を参照のこと。例えば、競合的ＧＳＫ−３阻害剤であるＬ８０３−ｍｔｓは、リソソームの酸性化を損なわせるよう作用するＧＳＫ−３の活性を阻害することによってリソソーム酸性化を促進することが示されている。したがって、一実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、細胞透過性ペプチドＬ８０３−ｍｔｓ（配列番号７２）である。好適なＧＳＫ−３阻害剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３／０３０３４４１号及び第２０１５／０００４２５５号に見出され得る。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）、ＮＰ−１０３、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール、Ｌ８０３、Ｌ８０３−ｍｔｓ、及びＧＦ−１０９２０３Ｘ（２−［１−（３−ジメチルアミノプロピル）インドール−３−イル］−３−（インドール−３−イル）マレイミド）ならびにその薬理学的に許容される塩及び混合物から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、オートファジーを促進する１つ以上の薬物の投与を含む。本明細書で使用する場合、オートファジーを促進する薬物は、細胞質成分をリソソームに送達する細胞内分解系を促進することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法、及びオートファジーを促進する１つ以上の薬物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法を提供し、ここで、かかる対象は、リソソーム及び／もしくはエンドソームを酸性化する１つ以上の薬物、ならびにオートファジーを促進する１つ以上の薬物の投与も受ける。いくつかの実施形態では、リソソーム及び／またはエンドソームを酸性化する薬物、及びオートファジーを促進する薬物は、同一の薬物であっても、または異なる薬物であってもよい。本明細書に記載のように、併用療法を実施する場合、それらの薬物（例えば、分解酵素もしくはその生物学的に活性な断片、リソソーム及び／もしくはエンドソームを酸性化する薬物、ならびに／または、オートファジーを促進する薬物）を同時投与することも、または順次、任意の順序で投与することもできる。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、リソソーム及び／もしくはエンドソームの酸性化を引き起こすことのできる薬剤ならびに／またはオートファジーを促進することのできる薬剤を用いて治療用分解酵素またはその生物学的に活性な断片を処理することにより、酵素によるタンパク質分解の至適条件までｐＨを低下させ、かつリソソームのタンパク質分解能を改善することができる。

いくつかの実施形態では、オートファジー促進試薬には、ＴＦＥＢアクチベーター、ＰＰＡＲ作動薬、ＰＧＣ−１αアクチベーター、ＬＳＤ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤等のような直接または間接的にオートファジーを促進する試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、薬物は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）経路の活性化を介してオートファジーを促進する。ＴＦＥＢはリソソーム生合成のマスター遺伝子である。これは、リソソームの加水分解酵素、膜タンパク質及びオートファジーに関与する遺伝子の発現を協調させる転写因子をコードする。培養細胞でＴＦＥＢを過剰発現させるとリソソームの生合成が誘導され、複合体分子の分解が高まった。ＴＦＥＢはＰＧＣ−１αにより活性化され、ｈｔｔ凝集と神経毒性の低下を促進する。

いくつかの実施形態では、ＴＦＥＢ経路の活性化を介してオートファジーを促進する薬物はＴＦＥＢの活性化薬である。いくつかの実施形態では、そのようなＴＦＥＢ活性化薬には、Ｃ１（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，１２（８）：１３７２−１３８９）、及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２０８１９）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＴＦＥＢ経路の活性化を介してオートファジーを促進する薬物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ１−α（ＰＧＣ−１α）を活性化させることができる薬剤である。いくつかの実施形態では、そのようなＰＧＣ−１αアクチベーターには、ピロロキノリンキノン、レスベラトロール、Ｒ−α−リポ酸（ＡＬＡ）、ＡＬＡ／アセチル−Ｌ−カルニチン（ＡＬＣ）、フラボノイド、イソフラボン及び誘導体（例えば、クエルセチン、ダイゼイン、ゲニステイン、ビオカニンＡ、及びホルモノネチン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｄａｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ ２０１５（ＣＮＳ＆Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ − Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１５，１４，１０２４−１０３０）を参照のこと。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、薬物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ１−α（ＰＧＣ−１α）及び／またはＦｏｒｅｈｅａｄ ｂｏｘ Ｏ３（ＦＯＸＯ３）の活性化を介してオートファジーを促進する。ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア生合成のマスター調節因子である。ＰＧＣ−１αは核内受容体ＰＰＡＲ−γと相互作用し、これにより、このタンパク質と複数の転写因子との相互作用を可能にしている。このタンパク質は、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）及び核呼吸因子（ＮＲＦ）と相互作用し、かつそれらの活性調節を行うことができる。これにより、外部の生理刺激とミトコンドリア生合成調節との直接的な繋がりが提供されるほか、筋線維型を決定する主要因子となっている。ＦＯＸＯ３は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路においてＡｋｔ／ＰＫＢなどのタンパク質によるリン酸化を受けると、抑制され、核外に移送され得る転写因子である。

いくつかの実施形態では、ＰＧＣ−１α及び／またはＦＯＸＯ３の活性化を介してオートファジーを促進する薬物は、リシン（Ｋ）特異的脱メチル化酵素１Ａ（ＬＳＤ１）の阻害剤である。ＬＳＤ１はフラビン依存性のモノアミン酸化酵素であり、メチル化リシン及びジメチル化リシンを脱メチル化させることができる。ＬＳＤ１は胚形成及び組織特異的分化において重要な役割を担っている。いくつかの実施形態では、そのようなＬＳＤ１阻害剤には、１−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−［［（１Ｒ^＊，２Ｓ^＊）−２−［４−フェニルメトキシ）フェニル］シクロプロピル］アミノ］エタノン二塩酸塩（ＲＮ−１；Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｂｌｏｏｄ ２０１５ １２６：３８６−３９６）、ＣＢＢ１００１〜１００９（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｄｅｃ １；７１（２３）：７２３８−７２４９．）、ＴＣＰ、パルギリン、ＣＧＣ−１１０４７、及びＮａｍｏｌｏｎｅ（Ｐｉｅｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２（２０１５）３７７ｅ３８６）、フェネルジン類似体（Ｐｒｕｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９，１２８４−１２９３）、ならびに参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５１５６４１７に記載のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、１つ以上のＬＳＤ１阻害剤を使用する。いくつかの実施形態では、ＲＮ−１及びＷＯ２０１５１５６４１７に記載のＬＳＤ１阻害剤の両方を使用する。ＷＯ２０１５１５６４１７には、式

で表されるＬＳＤ１阻害剤が記載されており、
式中、Ａは、任意選択で置換された複素環基、または任意選択で置換された炭化水素基であり、Ｂは、
（１）任意選択で置換された５員環もしくは６員環と任意選択で縮合した、５員または６員の芳香族複素環、及び
（２）任意選択で置換された５員環または６員環と縮合したベンゼン環から選択される環であり、
ここで、Ｂで表される環は、任意選択で置換され、また、原子１個を挟んで隣接する２個の炭素原子を介して、式

で表される基、及び式

で表される基
［Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、任意選択で置換された炭化水素基、または任意選択で置換された複素環基であり、
ＡとＲ^１は任意選択で互いに結合しており、隣接する窒素原子と共に、任意選択で置換された環状基を形成し、
Ｒ^２とＲ^３は任意選択で互いに結合しており、隣接する窒素原子と共に、任意選択で置換された環状基、またはその塩を形成する］
と結合する。そのようなＬＳＤ１阻害剤は、より特異的で副作用が少なく、血液脳関門の透過が良好である。

いくつかの実施形態では、ＬＳＤ１阻害剤は、以下の化合物（化合物１〜３０）、及び塩、立体異性体、幾何異性体、互変異性体、酸窒化物、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、ラセミ体、プロドラッグ、溶媒和物、代謝物、エステル、ならびにその混合物からなる群から選択される。

一実施形態では、本発明の分解酵素またはその生物学的に活性な断片と共に同時投与されるＬＳＤ１阻害剤は、化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはその任意の混合物である。

いくつかの実施形態では、薬物は、ＰＧＣ−１αの調節因子またはコアクチベーターの活性を修飾することができる。ＰＧＣ−１αのそのような調節因子またはコアクチベーターには、限定されることなく、パーキン相互作用基質（Ｐａｒｋｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（ＰＡＲＩＳ）、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）１（ＳＩＲＴ１）、５’ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、アミノ酸合成一般制御タンパク質（Ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）５（ＧＣＮ５）、核呼吸因子１、２（ＮＲＦ−１、２）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−α、β／δ、γ（ＰＰＡＲ−α、β／δ、γ）、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、エストロゲン関連受容体（ＥＲＲ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）、及び甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）が挙げられ、Ｄａｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ（ＣＮＳ＆Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ − Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１５，１４，１０２４−１０３０）を参照のこと。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、オートファジーを促進する薬物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬である。ＰＰＡＲは、遺伝子発現を調節する転写因子として機能する核内受容体タンパク質である。それらは、細胞の分化、発達、ならびに代謝及び腫瘍形成の制御に重要である。

いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、及びＰＰＡＲγから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬はＰＰＡＲα作動薬であり、それには、両親媒性カルボン酸（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、及びフェノフィブラート）、フィブラート、ウレイドフィブラート（ｕｒｅｉｄｏｆｉｂｒａｔｅ）、オキシベンジルグリシン（ｏｘｙｂｅｎｚｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、トリアゾロン（ｔｒｉａｚｏｌｏｎｅ）、２，４−ジヒド−３Ｈ−１，２，４トリアゾール−３−オン（トリアゾロン（ｔｒｉａｚｏｌｏｎｅ））の核を含有する作動薬（例えば、ＬＹ５１８６７４）、ＢＭＳ−６８７４５３、Ｗｙ−１４６４３、ＧＷ２３３１、ＧＷ９５７９８、ＬＹ５１８６７４、及びＧＷ５９０７３５が含まれるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬はＰＰＡＲβ／δ作動薬であり、それには、ＧＷ５０１５１６（Ｂｒｕｎｍａｉｒ；ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４９（１１）：２７１３−２２）、Ｌ−１６５０４１、化合物７（Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２００６，１８（１），９−２０．）、チアゾール、ビスアリール置換チアゾール、非ＴＺＤ系化合物（例えば、Ｌ−１６５０４１）、Ｌ−１６５０４１、化合物７（Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２００６，１８（１），９−２０）、３８ｃ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９７，６３（１−３），１−８）、及びオキサゾールが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬はＰＰＡＲγ作動薬であり、それには、チアゾリジンジオン系（ＴＺＤまたはグリタゾン）、グリタザル、インデノン、ＮＳＡＩＤ、ジヒドロシンナマート、β−カルボキシエチルローダミン（β−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、及びＣｏｒｏｎａ ａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎ，２０１６（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｊｕｎｅ ２３，２０１６）に記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲγ作動薬は内因性または天然のアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲγ作動薬は合成作動薬である。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲγ作動薬は、エイコサノイドプロスタグランジン−Ａ１、シクロペンテノンプロスタグランジン１５−デオキシ−Δ^{１２，１４}−プロスタグランジンＪ２（１５Ｄ−ＰＧＪ２）、不飽和脂肪酸、例えばリノール酸及びドコサヘキサエン酸（ｓｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）など、ニトロアルケン、例えばニトロ化したオレイン酸及びリノール酸など、酸化リン脂質、例えばヘキサデシルアゼラオイルホスファチジルコリン（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ａｚｅｌａｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びリゾホスファチジン酸など、非ステロイド性抗炎症薬、例えばフルフェナム酸、イブプロフェン、フェノプロフェン、及びインドメタシンなど、ピオグリタゾン、ＧＷ００７２、シグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、イソグリタゾン（ｉｓｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ＮＣ−２１００（Ｌｏｉｏｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１１，１１（７）：８１９−３９）、ＳＢ−２３６６３６、テサグリタザル、ファルグリタザル、ＧＷ１９２９、化合物１４ｃ（Ｈａｉｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９９，７（５）：８２１−３０）、ＳＰ１８１８、ラガグリタザル、メタグリダセン、バラグリタゾン、ならびにＩＮＴ１３１からなる群から選択される。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、及びＰＰＡＲγ、例えば、ベザフィブラート、ＬＹ４６５６０８、インデグリタザル、ＴＩＰＰ−２０４、ＧＷ６９３０８５、ＴＩＰＰ−４０１、及びＴＩＰＰ−７０３などに結合する。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ、例えば、ファルグリタザル、ムラグリタザル、テサグリタザル、ＧＷ４０９５４４、アレグリタザル、ＭＫ−７６７、ＴＡＫ−５５９、化合物１８（Ｋｏｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２００３，９３（３），３４７−５５）、化合物６８、７０、７２、７６（Ｆｅｌｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００８，５１（１６），４９１１−９．），メタグリダセン、及びＳ−２／Ｓ−４（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００８，５１（２０），６３１８−３３．）などに結合する。いくつかの実施形態では、ＰＰＡＲ作動薬は、ＰＰＡＲβ及びＰＰＡＲγ、例えば化合物２３（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００９，５２（２１），６８３５−５０）に結合する。さらなるＰＰＡＲ作動薬は、Ｎｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，１８，５５９８−５６２３）に記載されている。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、オートファジーを促進する薬物は、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤である。ｍＴＯＲは、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）のファミリーに属するセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，８２（５）：１２４５−１２６６）を参照のこと。ｍＴＯＲは、インスリン、成長因子（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２など）、及びアミノ酸など、上流経路からのインプットを取り込むほか、細胞の栄養、酸素、及びエネルギーのレベルの感知も行う。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤には、ｍＴＯＲの抗体、ラパマイシンとその類似体（例えば、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダホロリムス（ＡＰ−２３５７３）、シロリムス、デホロリムス）、クルクミン（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ）、クルクミン類似体（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，１２（８）：１３７２−１３８９）、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ二重阻害剤（ダクトリシブ、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７等）、ｄｅｐｔｏｒ（Ｍａｉｅｓｅ，Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１６；１１（３）：３７２−３８５．）、及びｍＴＯＲＣ１／ｍＴＯＲＣ２二重阻害剤（ＴＯＲＣｄＩ、例えばｓａｐａｎｉｓｅｒｔｉｂ（別名、ＩＮＫ１２８）、ＡＺＤ８０５５、及びＡＺＤ２０１４など）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、オートファジーを促進する薬物は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害剤である。ＧＳＫ３は、セリン及びスレオニンの両アミノ酸残基へのリン酸分子付加を仲介するセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＡＴＰ競合的である。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＡＴＰ非競合的である。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤には、ＧＳＫ３の抗体、金属陽イオン（例えば、ベリリウム、銅、リチウム、水銀、及びタングステン）、海洋生物由来の薬物（例えば、６−ＢＩＯ、ジブロモカンタレリン（ｄｉｂｒｏｍｏｃａｎｔｈａｒｅｌｌｉｎｅ）、ヒメニアルデシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｅｓｉｎｅ）、インジルビン、メリジアニン、マンザミンＡ、パリヌリン、トリカンチン（ｔｒｉｃａｎｔｉｎｅ））、アミノピリミジン（例えば、ＣＴ９８０１４、ＣＴ９８０２３、ＣＴ９９０２１、及びＴＷＳ１１９）、ケタミン、アリールインドリルマレイミド（ａｒｙｌｉｎｄｏｌｅｍａｌｅｉｍｉｄｅ）（例えば、ＳＢ−２１６７６３及びＳＢ−４１５２８）、チアゾール（例えば、ＡＲ−Ａ０１４４１８及びＡＺＤ−１０８０）、パウロン（例えば、アルステルパウロン、カズパウロン（Ｃａｚｐａｕｌｌｏｎｅ）、ケンパウロン）、チアジアゾリジンジオン（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｄｉｏｎｅ）（例えば、ＴＤＺＤ−８、ＮＰ００１１１、ＮＰ０３１１１５、及びチデグルシブ）、ハロメチルケトン（例えば、ＨＭＫ−３２）、特定のペプチド（Ｌ８０３−ｍｔｓ）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３、及びＣＴ９９０２１（Ｓｔｒｅｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１５）４７０，２０７−２２１；Ｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９０（９）：５５９２−５６０５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で言及される参考文献の各々は参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、リソソームを調節する１つ以上の薬物の投与を含む。いくつかの実施形態では、リソソームを調節する薬物は、初期エンドソームのマーカーであるＲａｂ５ａのレベルを低下させる能力があり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法を提供し、ここで、かかる対象はリソソームを調節する１つ以上の薬物の投与も受ける。本明細書に記載のように、併用療法を実施する場合、それら２つ以上の薬物（例えば、分解酵素またはその生物学的に活性な断片及びリソソームを調節する薬物）を同時投与することも、または順次、任意の順序で投与することもできる。

いくつかの実施形態では、リソソームを調節する薬物は、Ｚ−フェニルアラニル−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ａｌａｎｙｌ−ｄｉａｚｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）（ＰＡＤＫ）もしくはＰＡＤＫ類似体、またはその薬理学的に許容される塩もしくはエステルである。いくつかの実施形態では、ＰＡＤＫ類似体は、Ｚ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ＰｄＡＤＫ）、Ｚ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｄＰＡＤＫ）、及びＺ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｄ−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｄＰｄＡＤＫ）から選択される。いくつかの実施形態では、リソソームを調節する薬物は、Ｚ−フェニルアラニル−フェニルアラニル−ジアゾメチルケトン（ＰＰＤＫ）もしくはＰＰＤＫ類似体、またはその薬理学的に許容される塩もしくはエステルである。好適なリソソーム調節因子の例示的な一覧は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１６／０１３６２２９号に見出され得る。

いくつかの実施形態では、併用療法を実施する場合、それら２つ以上の薬物を同時投与することも、または順次、任意の順序で投与することもできる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの薬物を順次投与する場合、かかる２投与間の時間は、約１分、５分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、またはそれ以上であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、対象に実施される手術を含む。いくつかの実施形態では、手術は幹細胞移植及び／または臓器移植である。いくつかの実施形態では、幹細胞移植は自家移植（例えば、対象由来の幹細胞）である。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象への支持療法の提供を含む。いくつかの実施形態では、対象の心臓または腎臓が侵されている場合、方法は、利尿薬の摂取（水分排泄丸剤）、食事の塩分量の制限、ならびに／または腫脹の量を少なくさせるため弾性ストッキングの着用及び脚を高く上げることを含む。いくつかの実施形態では、胃腸管に障害がある場合、食事の変更及び特定の薬物治療によって、下痢及び胃の膨満感といった症状軽減を試みることができる。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の好適な方法で患者に投与が可能である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与は、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内滴下、移植、腔内もしくは膀胱内への注入、眼内投与、動脈内投与、病変内投与、経皮投与、エアロゾル（例えば、吸入）または粘膜への塗布によって行ってよい。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物はさらに、薬理学的に許容される担体を含む。医薬担体または添加物に言及して「薬理学的に許容される」という用語を使用する場合、かかる用語には、その担体または添加物が、毒性試験及び製造試験の必要基準を満たしていること、または米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が作成した不活性成分ガイドライン（Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ）に収載されていることが含意される。

経口使用が意図される組成物は、固形または液体のいずれの単位剤形で調製してもよい。液体単位剤形は、医薬組成物製造について当技術分野で公知の手順に従って調製可能であり、そのような組成物は、薬理学的に上品で口当たりのよい調製物を提供するため、甘味剤、香味剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有してよい。エリキシル剤は、糖及びサッカリンなどの好適な甘味料を含んだ含水アルコール（例えば、エタノール）ビヒクルを、芳香香味剤と共に使用して調製される。懸濁液は、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース等のような懸濁剤を用いて水溶性ビヒクルで調製することができる。

錠剤などの固形製剤には、有効成分は、錠剤の製造に好適な非毒性の薬理学的に許容される添加物との混合物として含有される。これらの添加物は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムといった不活性希釈剤：造粒剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸：結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、及び滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクならびに他の従来成分、例えば、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、乳糖、メチルセルロース、及び機能的に類似の物質などであってよい。錠剤は、コーティングしなくてもよく、または公知の技術でコーティングして胃腸管での崩壊と吸収を遅延させ、それにより長期にわたり持続作用を提供してよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いてよい。

経口用製剤は、不活性固体希釈、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどと有効成分を混合した硬ゼラチンカプセルとして提示してもよく、水または油媒体、例えば、ピーナツ油、流動パラフィンもしくはオリブ油などと有効成分を混合した軟ゼラチンカプセルとして提示してもよい。軟ゼラチンカプセルは、化合物のスラリと、許容される植物油、軽質流動ワセリンもしくは他の不活性油とを機械でカプセル充填することにより調製される。

水性懸濁液には、活性物質は、水性懸濁液の製造に好適な添加物との混和物として含有される。そのような添加物は、懸濁剤、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム及びアラビアゴムなどであり、分散剤または湿潤剤は、天然に生じるリン脂質、例えばレシチンであっても、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアリン酸エステルであっても、または酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えば、ヘプタ−デカエチレンオキシセタノール（ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）であっても、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）のような、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物であっても、または脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）であってもよい。水性懸濁液は、例えば、安息香酸エチル、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルなどの１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、またはショ糖もしくはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤も含有してよい。

油性懸濁液は、例えば、ピーナツ油、オリブ油、ゴマ油またはヤシ油など植物油、または流動パラフィンなどの鉱油に有効成分を懸濁させて処方してよい。油性懸濁液は、濃稠化剤、例えば、ミツロウ、パラフィンワックスまたはセチルアルコールなどを含有してよい。口当たりのよい経口調製物を提供するため上掲のような甘味剤及び香味剤を添加してよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加して保存してよい。

水の添加によって水性懸濁液を調製する場合に好適な、分散可能な粉末及び顆粒では、有効成分は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の防腐剤との混合物として提供される。好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤は既に上記で例示されている。さらなる添加物、例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤が含まれていてもよい。

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリブ油もしくはピーナツ油など、または鉱油、例えば、流動パラフィンなど、またはこれらの混合物であってよい。好適な乳化剤は、天然に生じるゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガントゴムなどであっても、天然に生じるリン脂質、例えば、大豆、レシチンなどであっても、脂肪酸とヘキシトール、無水物に由来するエステルもしくは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレアートであっても、前記部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってもよい。エマルジョンは、甘味剤及び香味剤を含有してもよい。

医薬組成物は、水性または油脂性の注射可能な滅菌懸濁液の形態であってよい。この懸濁液は、上記で言及されている好適な分散剤もしくは湿潤剤及び懸濁剤を使用する公知の技術に従って処方してよい。注射可能な滅菌調製物は、非経口的に許容される非毒性の希釈液もしくは溶媒に溶解させた、注射可能な滅菌液または滅菌懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。用いてよい許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム液がある。さらに、無菌不揮発性油は従来より溶媒または懸濁媒として用いられている。このような用途の場合、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなど、任意の無刺激不揮発性油を使用してよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射剤調製に利用される。局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などのアジュバントも注射液または懸濁液に含めることができる。

いくつかの実施形態では、好適な送達システムには、時間放出型、遅延放出型、持続放出型、または放出制御型の送達システムが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、徐放性マトリックスなどの放出制御システムで送達可能である。非限定的な徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５）による記載にあるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，前掲）、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体とリュープロリド酢酸塩（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）とで構成される注射可能なミクロ粒子）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体が含まれる。いくつかの実施形態では、静脈内注入、埋込み型浸透圧ポンプ、経皮吸収パッチ、リポソーム、または他の投与方法を使用して組成物を投与してよい。一実施形態では、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態では、高分子材料を使用できる。さらに別の実施形態では、放出制御システムを治療標的、例えば、肝臓などに近接させて留置でき、そのため、全身用量は少量ですむ（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。他の放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）による概説で考察されている。いくつかの実施形態では、皮下注射により組成物を投与してよい。

いくつかの実施形態では、組成物は急激に放出される。急激に放出されるシステムの例には、例えば、ポリマーマトリックスに封入されたリポソーム内に組成物が内包（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）されており、かかるリポソームが特定の刺激、例えば、温度、ｐＨ、光または、分解酵素に対して感受性であるシステム、及びマイクロカプセルコア分解酵素を有するイオンコートしたマイクロカプセルにより組成物が封入されているシステムが含まれる。

いくつかの実施形態では、組成物の放出は段階的／継続的である。阻害剤の放出が段階的かつ継続的であるシステムの例には、例えば、組成物がマトリックス内部に入った形態で含有されている侵食性システム、及び組成物が、制御された速度で、例えば、ポリマーを介して放出される浸出性（ｅｆｆｕｓｉｏｎａｌ）システムが含まれる。そのような持続放出システムは、例えば、ペレット形態、またはカプセルであり得る。

本発明に従って投与される組成物の他の実施形態には、非経口、肺、鼻及び経口といったさまざまな投与経路用の微粒子形態、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、または浸透促進剤が組み込まれる。他の医薬組成物及び医薬組成物調製方法は、当技術分野で公知であり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（旧称”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２０００）に記載されている。いくつかの実施形態では、医薬組成物にはさらに薬理学的に許容される希釈剤、添加物、担体、またはアジュバントが含まれてよい。

いくつかの実施形態では、投与されるべき用量には明確な制限があるわけではないが、通常は、有効量、または治療的／薬理学的に有効な量となる。用語「有効量」は、所望の治療転帰を与える１つ以上の化合物の量を指す。有効量は、１つ以上の用量内で構成されてよく、すなわち、所望の治療エンドポイント達成のため１回量または複数用量を要する場合がある。本明細書で使用する「治療的／薬理学的に有効な量」という用語は、病態の治療、または傷害もしくは損傷の低減もしくは予防に必要とされ、任意選択で重大な負の副作用もしくは有害な副作用を生じさせない、１つ以上の薬剤のレベルまたは量を指す。通常は、活性遊離薬物の代謝放出時に処方製剤から生成されて、その所望の薬理学的かつ生理的な効果を達成する、薬理学的に活性な遊離形態のモル基準当量ということになる。いくつかの実施形態では、組成物を単位剤形で製剤化してよい。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の哺乳類に対する単位用量として好適な物理的個別単位を指し、各単位に、所望の治療効果を与えるよう計算された所定量の活性物質が、好適な医薬品添加物と共に含有されている。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の投与レジメンには、何ら制限されることなく、投与あたりの量、投与回数、例えば、１日あたり、１週間あたり、もしくは１か月あたりの回数など、投与サイクルあたりの総量、投与間隔、投与サイクルあたりの投与の変動、パターンもしくは変更、最大蓄積投与量、または漸増的ウォームアップ投与量（ｗａｒｍ ｕｐ ｄｏｓｉｎｇ）、またはその任意の組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、投与レジメンには、投与あたりの所定量または一定量と、かかる用量の投与回数の組み合わせが含まれる。例えば、投与レジメンには、対象に投与される、投与あたりの一定量とそのような用量の投与回数の組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の分解酵素（例えば、ＰＰＣＡ、ＮＥＵ１、ＴＰＰ１、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬ）を約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇで連日、毎週、隔週、毎月、または隔月投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリソソーム内分解酵素を、約０．２〜１５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜１２ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約２〜８ｍｇ／ｋｇ、または約４〜６ｍｇ／ｋｇで連日、週、隔週、毎月、または隔月投与する。

好適用量に基づき、かかる少なくとも１種の分解酵素はさまざまな好適な単位用量で提供され得る。例えば、分解酵素は、１日１回もしくは複数回で週に１〜７日、または１か月に１〜３１回という投与単位用量に含まれ得る。そのような単位用量は、１日分、１週分及び／または１か月分の投与として提供され得る。

当業者に理解されるように、治療方法の継続期間は、治療されるアミロイドーシスの種類、アミロイドーシスに関連する任意の基礎疾患、対象の年齢と病態、対象の治療応答の様子などに依存する。

いくつかの実施形態では、アミロイドーシス発症のリスクがある（例えば、遺伝的素因を有する、または以前にアミロイドーシスもしくは関連疾患に罹患している）患者は、アミロイドーシス及び／もしくは関連疾患の発症を阻害するかまたは遅延させるために、本発明の予防治療も受けることができる。

本発明の医薬組成物により、アミロイドーシスに関連した症状の１つ以上の軽減、重症度低下、または発生率低下も可能である。いくつかの実施形態では、症状は、軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシス（原発性全身性アミロイドーシス）及び／またはＡＡアミロイドーシス（続発性アミロイドーシス）に関連した症状である。いくつかの実施形態では、症状には、体液貯留、腫脹、息切れ、疲労、不整脈、手足のしびれ感、発疹、息切れ、嚥下困難、手足の腫脹、食道逆流、便秘、悪心、腹痛、下痢、早期満腹感、脳卒中、胃腸障害、肝腫大、脾機能低下、副腎及び他の内分泌腺の機能低下、皮膚の色の変化または腫瘍、肺の問題、出血及び挫傷の問題、尿量減少、下痢、嗄声または声の変化、関節痛、ならびに脱力が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、症状は、アミロイド−ベータ（Ａβ）アミロイドーシスに関連した症状である。いくつかの実施形態では、症状には、記憶喪失、錯乱、視覚イメージと空間的関係の理解障害、及び会話または書字の問題を含む、アルツハイマー病の一般的症状が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、過量投与による重篤かつ／または致命的な免疫介在性有害反応を回避するため、投与後、対象の応答を監視することを含む。いくつかの実施形態では、患者に有害反応の持続が見られる場合、本発明の医薬組成物の投与の変更、例えば、減量、休薬または中止などを行う。いくつかの実施形態では、初回投与量の投与から約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間またはそれ以上期間以内に患者が反応しない場合は用量を変更する。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する１つ以上の病態もしくは関連症状を、臨床的に意義のある様式、統計学的に有意な様式かつ／または持続的な様式で改善、治療、及び／または予防することができる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の投与により、アミロイドーシスの１つ以上の症状を改善する、治療する、及び／または予防する統計学的に有意な治療効果が提供される。一実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、米国または他の国々の１つ以上の規制当局、例えば、ＦＤＡにより提供されている１つ以上の規格または基準に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、規制当局承認の臨床試験の設定及び／または手順から得た結果に基づいて決定される。

いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、少なくとも５０人、１００人、２００人、３００人、４００人、５００人、６００人、７００人、８００人、９００人、１０００人、またはそれ以上の患者母集団に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、無作為化二重盲検臨床試験設定から得られたデータに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、ｐ値が約０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１以下であるデータに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、信頼区間が９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるデータに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、本発明が提供する方法の第ＩＩＩ相臨床試験の、例えば米国ＦＤＡによる承認に基づいて決定される。

いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、本発明の医薬組成物を用いるが他剤を併用しない治療を受ける、少なくとも５０人、１００人、２００人、３００人または３５０人の患者母集団の無作為二重盲検臨床試験によって決定される。いくつかの実施形態では、統計学的に有意な治療効果は、アミロイドーシス症状の評価について一般に認められている任意の基準を使用する、少なくとも５０人、１００人、２００人、３００人または３５０人の患者母集団の無作為臨床試験によって決定される。

一般に、統計解析には、規制当局、例えば、米国または中国のＦＤＡ、または他国の規制当局によって許可されている任意の好適な方法を含めることができる。いくつかの実施形態では、統計解析には、非層別解析、ログランク検定、例えば、カプラン・マイヤー法、ヤコブソン−トルアックス（Ｊａｃｏｂｓｏｎ−Ｔｒｕａｘ）、グリケン−ロード−ノビック（Ｇｕｌｌｉｋｅｎ−Ｌｏｒｄ−Ｎｏｖｉｃｋ）、エドワーズ−ナンナリー（Ｅｄｗａｒｄｓ−Ｎｕｎｎａｌｌｙ）、ヘイゲマン−アリンデル（Ｈａｇｅｍａｎ−Ａｒｒｉｎｄｅｌ）及び階層的線形モデル（ＨＬＭ）など、ならびにＣｏｘ回帰分析が含まれる。

本発明はまた、包装された医薬組成物またはキットを提供する。いくつかの実施形態では、包装された医薬組成物またはキットには、治療的有効量のリソソーム内分解酵素もしくは本明細書に記載する本発明のリソソーム内分解酵素を含む製剤が含まれる。いくつかの実施形態では、化合物または製剤は、対象に組成物を投与した場合に、かかる対象において少なくとも１つのリソソーム内分解酵素の発現、活性、及び／または濃度を高めることができる。いくつかの実施形態では、包装された医薬組成物またはキットはさらに、医薬化合物もしくは製剤と、アミロイドーシスを治療または予防する本明細書に記載の第２の薬剤とを併用投与する推奨事項を記載したラベルまたは添付文書を組み合わせて含む。

いくつかの実施形態では、包装された医薬組成物またはキットはさらに、本明細書に記載する治療的有効量の第２の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、包装された医薬組成物またはキットは、第２の薬剤と、リソソーム内分解酵素もしくはリソソーム内分解酵素を含む製剤、または対象において少なくとも１つのリソソーム内分解酵素の発現、活性、及び／または濃度を高めることができる化合物もしくは製剤とを併用投与する推奨事項を記載したラベルまたは添付文書と組み合わせて包装される。

本明細書で使用する場合、「ラベルまたは添付文書」という用語には、本発明の組成物の投与に関し、対象または対象のケアの実質的責任者との書面、電子形式、または口頭によるあらゆる連絡通知が含まれるが、これらに限定されるものではない。添付文書にはさらに、本発明の組成物と他の化合物もしくは組成物との同時投与に関する情報が含まれ得る。さらに、添付文書には、本発明の組成物の投与に関し、食前、食事中、もしくは食後、または食物と一緒／食物なしという指示が含まれ得る。

以下の実施例で本発明のさまざまな態様を例示する。当然のことながら、各実施例は、本発明の特定の実施形態のみを例示しているにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されるべきである。

実施例１：合成アミロイド種に対するリソソーム内分解酵素の分解作用
本実施例では、ＰＰＣＡ（すなわち、カテプシンＡ）、カテプシンＢ、カテプシンＤなどのリソソーム内酵素、及び／または２種以上のリソソーム内酵素のカクテル混合物をアミロイドーシス治療に使用できることを例証するため、インビトロ試験を実施する。理論に拘束されることなく、ＰＰＣＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、及び他のリソソーム内酵素をリソソームへ送達することにより、異常に蓄積したアミロイド種、例えば、Ａβ−アミロイド種を、それらがエキソサイトーシスによって細胞外間隙へ輸送されてアミロイドプラークとして沈着しないうちに分解するのを補助できるという仮説が立てられる。

このインビトロ試験では、試験管内の合成Ａβ−アミロイド種に対するＰＰＣＡ、カテプシンＢ、及びカテプシンＤの分解作用を示す。

第１に、合成Ａβ−ペプチドを使用するＡβ−アミロイド種のインビトロ凝集アッセイを、チオフラビンＴ（ＴＨＴ）アッセイ及びウェスタンブロットにより実施する。図１は、生理的条件（図１Ａ）または酸性ｐＨ（図１Ｂ）にてチオフラビンＴ（ＴＨＴ）で監視した、Ａβ４２合成ペプチド及びＡβ１５−３６ペプチド（陰性対照）の凝集を示す。図２は、ウェスタンブロットで検出されたＡβ４２アミロイド種の２４時間の経時的凝集を示す。

第２に、ＰＰＣＡ、カテプシンＢ、及びカテプシンＤを使用したタンパク質分解による合成Ａβ−アミロイド種の凝集抑制を、チオフラビンＴ（ＴＨＴ）アッセイ及びウェスタンブロットにより試験する。図３は、カテプシンＡ（すなわち、ＰＰＣＡ）がＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。図４は、ＰＰＣＡがＡβ４２アミロイドの凝集を用量依存的に抑制することを示す。図５は、ＰＰＣＡが、Ａβ４２アミロイドの高分子種と低分子種の両方の凝集を抑制することを示す。図６は、カテプシンＢがＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。図７は、カテプシンＢがＡβ４２アミロイドの凝集を用量依存的に中程度に抑制することを示す。図８は、カテプシンＢが時間依存的に、Ａβ４２アミロイド低分子種の凝集を抑制し、かつＡβ４２単量体を分解することを示す。図９は、カテプシンＢがＡβ４２アミロイドの凝集を抑制することを示す。

最後に、ＰＰＣＡ、カテプシンＢ、及びカテプシンＤが、予め形成されている合成Ａβ−アミロイド種を分解する能力を試験した。図１０は、ＰＰＣＡ、カテプシンＢ、ＰＰＣＡとカテプシンＢ、及びカテプシンＤは、Ａβ４２アミロイドの高分子量オリゴマー／線維を分解することを示す。カテプシンＤは低分子オリゴマーを分解し、かつＡβ４２単量体を完全に消失させる。

実施例１の概要：
（１）選択したリソソーム内分解酵素は、Ａβアミロイド種の凝集／形成を抑制できるか否か（いわゆる、抑制）及び（２）選択したリソソーム内分解酵素は、既形成されているＡβアミロイド種を分解できるか否か（いわゆる、分解）を決定するため、実施例１の実験を設計した。実施例１の実験では、合成Ａβ４２ペプチドを使用したインビトロにおいてＡβ４２アミロイド種は凝集し得ること、及びこのプロセスを、ＴＨＴアッセイ（図１）及び／またはウエスタンブロット法（図２）によって監視できることが示された。ＴＨＴアッセイにより、分解酵素で処理した際のＡβ４２凝集における動的変化のモニタリングが可能になる。

実施例１の実験から得られたデータは、ＰＰＣＡが、ＴＨＴアッセイ（図３、図４）及びウェスタンブロット（図５）で示されるように、Ａβ４２アミロイド種の形成を効率的に抑制できると共に、既形成されているアミロイド種を効率的に分解できる（図１０）ことを明らかにしている。ＰＰＣＡによるアミロイド形成の抑制及び分解は効率的かつ再現可能なものであり、濃度依存的な動態（図４）を示した。カテプシンＢを用いた実験から得られたデータは、ＴＨＴで測定したアミロイド種形成が中程度に低下したことを示した（図６）。ウエスタンブロット法により、カテプシンＢはＡβ４２低分子種の凝集を抑制し、Ａβ４２単量体を時間依存的に分解する（図８）ことが明らかになった。カテプシンＤを使用した実験では、ＴＨＴで測定した場合、Ａβ４２種の凝集の強力な抑制が明らかになった（図９）。カテプシンＤはまた、予め凝集させたアミロイド種の低分子オリゴマーの分解及びＡβ４２単量体の完全消失も示した（図１０）。

実施例２：カテプシンＡ、Ｂ、及びＤによるＡβ４２オリゴマーと線維の分解
本実施例では、カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、カテプシンＢ及びカテプシンＤによって分解可能なＡβ４２種の形態を調べるため、オリゴマー及び線維を形成させる特定の２つのプロトコルを適用してアミロイド材料を凝集させた。その後、凝集したオリゴマー及び線維を酵素処理に供した後、ウエスタンブロット解析を行った。

初めに、オリゴマー及び線維を７日間凝集させ、異なる測定ポイント（０日目、１日目、３日目及び７日目）で採取した材料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、その後、ウエスタンブロット法を行った。図１１では、Ａβ４２オリゴマー及びＡβ４２線維をオリゴマー特異的抗体（Ａ１１）でプローブした。この抗体は、単量体Ａβ４２種及び線維Ａβ４２種を認識しない。オリゴマー形成及び線維形成の各プロトコルを使用して凝集させた材料を装填したウェスタンブロットで、さまざまな形態のオリゴマーが良好に検出された。線維形成手順７日目にオリゴマー形態の有意な減少が観察され（図１１、ライン９）、オリゴマーから、Ａ１１抗体では検出不可能な線維形態へと時間依存的に移行していることを示している。図１２では、図１１の場合に示した材料と同一の材料をＥ６１０抗体でプローブした。この抗体はＡβ４２のオリゴマーと線維の両方に特異的である。オリゴマー形成プロトコルを適用した場合、７日目に線維の欠失が観察され（図１２、ライン４）、線維形成プロトコルを適用した場合、７日目に線維が強く出現した。

オリゴマー種の酵素分解を調べるため、Ａβ４２オリゴマーを最初にｐＨ７．０で２５℃にて９日間凝集させ、その後、試験で使用する酵素それぞれに至適な各種ｐＨ（ｐＨ５．０カテプシンＡ、Ｂ及びｐＨ３．５カテプシンＤ）の酵素を加えた場合と加えない場合で、３７℃にてさらに一晩インキュベートした。オリゴマー特異的Ａ１１抗体でウェスタンブロットをプローブした（図１３）。対照ライン９（２５℃で９日間インキュベーション）と比較すると、分子量の高いオリゴマーの存在により指されるように（ライン１、２、４、及び５）、さらなる一晩の間にｐＨ５．０にてオリゴマーの凝集が観察された。対照的に、ｐＨ３．５で一晩インキュベートしたオリゴマーではこの凝集は観察されなかった。オリゴマーを９０ｎｇのカテプシンＡを用いてｐＨ５．０、３７℃にて一晩処理したところ、最下部のオリゴマーバンドの分解がもたらされた（ライン４）。９０ｎｇのカテプシンＢ及びＤで処理した各オリゴマーではオリゴマーバンドの強さまたはサイズに変化はなかった（ライン５、６）。

線維種の酵素分解を調べるため、Ａβ４２線維を最初にｐＨ７．０で２５℃にて９日間凝集させ、その後、試験で使用する酵素それぞれに至適な各種ｐＨ（ｐＨ５．０カテプシンＡ、Ｂ及びｐＨ３．５カテプシンＤ）の酵素を加えた場合と加えない場合で、３７Ｃにてさらに一晩インキュベートした。オリゴマー特異的Ｅ６１０抗体でウェスタンブロットをプローブした（図１４）。対照ライン９（２５℃で９日間インキュベーション）と比較すると、より強い／濃いなすりつけたように尾を引くバンドの存在により指されるように（ライン１、２、３）、さらなる一晩の間に適用ｐＨすべてにおいて線維の凝集が観察された。線維を、９０ｎｇのカテプシンＡを用いてｐＨ５．０、３７℃にて一晩処理したところ、線維のなすりつけたように尾を引くバンドの減少／分解ならびにオリゴマー種の分解がもたらされた（ライン４をライン１と比較）。線維を、９０ｎｇのカテプシンＢを用いてｐＨ５．０、３７℃にて一晩処理したところ、線維のなすりつけたように尾を引くバンドのわずかな減少／分解がもたらされた（ライン５をライン２と比較）。線維を、９０ｎｇのカテプシンＤを用いてｐＨ３．５、３７℃にて一晩処理したところ、線維のなすりつけたように尾を引くバンドまたはオリゴマーバンドには目視可能な減少／分解はもたらされなかった。

実施例３：ＥＬＩＳＡで監視したカテプシンＡによるＡβ４２単量体分解
本実施例の目的は、カテプシンＡがＡβ４２ペプチド（単量体）を分解できるか否かを評価することである。

本実施例では、９０ｎｇのカテプシンＡを用いたペプチドの酵素処理をｐＨ５．０、３７℃で０〜２時間行った。同一の実験を、カテプシンＡ無添加で並行して実施した。いずれの場合にも、ペプチドが凝集してアミロイド高分子種にならないようフェノールレッド、Ａβ凝集阻害剤を使用した。市販のＥＬＩＳＡ（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）抗ヒトβ−アミロイド（１−４２）定量的ＥＬＩＳＡ、比色法）を使用して、Ａβ４２単量体に対するカテプシンＡの添加または欠失による影響をさまざまな測定ポイント（０分、１０分、３０分、６０分、１２０分）で測定した。Ｓｅｎｓｏｌｉｔｅ ＥＬＩＳＡは、２つの抗体、すなわち、ヒトＡβ４２ペプチドを特異的に認識するがＡβ４０もＡβ４１も認識しないＣ末端捕捉抗体、及びＮ末端検出抗体で構成される。カテプシンＡはカルボキシルペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）であるため、Ａβ４２単量体は、分解されるとすればそのＣ末端から分解されることになる。この分解が起こればＣ末端アミノ酸４２の欠失となり、そのためＣ末端特異的抗体の捕捉は起こらないと考えられ、ＥＬＩＳＡの蛍光シグナルの消失としてこれを目視できるはずである。カテプシンＡで処理した試料をＥＬＩＳＡで読み取ったところ、処理後１０分以内に既に蛍光シグナルの消失が認められ、これは、カテプシンＡによるＣ末端からのＡβ４２単量体分解を示している（図１５）。カテプシンＡ無添加試料はＥＬＩＳＡで強い蛍光シグナルを示し、これは、酵素非存在下ではＣ末端の分解がなく、そのためＡβ４２単量体がＣ末端抗体により効率的に捕捉されたことを示している。

実施例４：Ｃａｔｈ ＡによるＡβ４０アミロイド種の分解
凝集実験から、Ａβ４０アミロイド種は合成Ａβ４０ペプチドを使用したインビトロで凝集可能であること、及びこのプロセスをＴＨＴアッセイで監視できることが示された（図１６）。Ａβ４２ペプチドの凝集と比較すると、Ａβ４０は凝集速度がはるかに遅く効率が悪いことが示された（図１６Ａ）。

ＴＨＴアッセイを使用して、Ｃａｔｈ Ａ分解酵素で処理した際のＡβ４２＆Ａβ４０凝集の動的変化を監視するさらなる実験を実施した（図１７）。初回実験では、Ａβ４２＆Ａβ４０両ペプチドの凝集に対するＣａｔｈ Ａ処理の影響をリアルタイムで測定することを目的とした。この目的を達成するため、Ｃａｔｈ Ａを対応するペプチドと同時にインキュベートし、ＴＨＴ試薬はＣａｔｈ Ａタンパク質分解の至適条件で別々に反応させた。上記の実験から、Ａβ４２（図１７Ａ）とは対照的に、Ａβ４０アミロイドの凝集は、適用した実験設定において高濃度の酵素を使用した場合でもＣａｔｈ Ａによる影響を受けない（図１７Ｂ、Ｃ）ことが明らかになった。初回実験の結果がＣａｔｈ ＡによるＡβ４０タンパク質分解がなかったことによるものなのか、またはそのようなタンパク質分解の速度がＡβ４０の凝集速度よりも遅かったことによりＴＨＴ蛍光に変化が観察されなかったのかを調べるため、第２の実験を行った。この実験では、Ａβ４０ペプチドを最初にＣａｔｈ Ａと共に、Ｃａｔｈ Ａタンパク質分解の至適条件で最高で２時間インキュベートし、その後、ＴＨＴとインキュベーションを行って凝集を測定した。得られたデータから、Ａβ４０ペプチドは、Ｃａｔｈ Ａとプレインキュベーションを行った後では凝集しなかったことが明らかになり、Ｃａｔｈ Ａのタンパク質分解を証明している（図１８）。

Ａβ４０ペプチドの凝集が観察されなかったのは、Ｃａｔｈ Ａのカルボキシペプチダーゼ活性によるものであることを証明するため、Ｃａｔｈ Ａ濃度をさまざまに変えてＡβ４０ペプチドをｐＨ５、３７℃で２時間インキュベートした。その後、反応物を、Ａβ４０ペプチドにのみ特異的なＣ末端捕捉抗体でプレコートしたＥＬＩＳＡプレートに移し、Ｎ末端検出抗体と共に４℃で一晩共インキュベートした。結果は、Ｃａｔｈ Ａの濃度上昇に伴い、Ｃ末端捕捉抗体に対するＡβ４０ペプチドの結合が徐々に低下することを示した（図１９）。これは、Ａβ４０ペプチドのＣ末端がＣａｔｈ Ａのカルボキシ末端での作用によって除去されたことを証明する。

Ａβ４０ペプチドからアミロイド種への凝集もウェスタンブロット法を使用して監視した（図２０Ａ）。我々は、最高９日を要する凝集プロセスを使用し、Ａβ４０を凝集させて高分子量線維にすることはできたが、オリゴマー形態にすることはできなかった。Ａβ４０を、線維形成プロセスの間、最高９日間Ｃａｔｈ Ａと同時にインキュベートする実験を行った。得られた結果から、Ｃａｔｈ Ａは、Ａβ４０アミロイドに対するそのタンパク質分解作用により高分子量線維の形成を有意に抑制することが明らかになった（図２０Ｂ）。この実験では、単量体Ａβ４０形態のレベル低下も観察された（図２０Ｃ）。

特に明記しないかぎり、本明細書のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似または同等である、いかなる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用できるが、その好ましい方法及び物質が本明細書に記載されている。引用されているすべての刊行物、特許、及び特許公開は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書で論じる刊行物は、あくまでも本出願の出願日以前のそれらの開示について提供されるものである。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由として、かかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。

本発明をその具体的な実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる変更が可能であり、その適用には、一般に、本発明の原則に従った本発明のいかなる変形、使用、または適応も包含されることが意図され、それには、本開示から発展させたもの、例えば、本発明が属する技術分野の範囲内で既知または慣習的な実施に入るもの、および記載され、かつ添付の特許請求の範囲で後述される本質的な特徴に該当し得るものが含まれることを理解されるであろう。

Claims (49)

1. 対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法であって、前記対象に対し、治療的有効量の少なくとも１種の分解酵素またはその生物学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
2. 前記分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記分解酵素は、ＰＰＣＡ、またはその生物学的に活性な断片である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＰＰＣＡポリペプチドは、配列番号２、４３、もしくは４５に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＰＰＣＡポリペプチドの投与は、配列番号１、４２、または４４に対する同一性が少なくとも８５％であるヌクレオチド配列を含むウイルスベクターの投与を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記分解酵素は、ＮＥＵ１、またはその生物学的に活性な断片である、請求項２に記載の方法。
7. 前記ＮＥＵ１ポリペプチドは、配列番号４に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＮＥＵ１ポリペプチドの投与は、配列番号３に対する同一性が少なくとも８５％であるヌクレオチド配列を含むウイルスベクターの投与を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記分解酵素は、ＴＰＰ１、またはその生物学的に活性な断片である、請求項２に記載の方法。
10. 前記ＴＰＰ１ポリペプチドは、配列番号６に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＴＰＰ１ポリペプチドの投与は、配列番号５に対する同一性が少なくとも８５％であるヌクレオチド配列を含むウイルスベクターの投与を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記分解酵素は、カテプシンＤ、またはその生物学的に活性な断片である、請求項２に記載の方法。
13. 前記カテプシンＤポリペプチドは、配列番号６８に対する配列同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 少なくとも２種の分解酵素を投与する、請求項１に記載の方法。
15. 前記分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記分解酵素は、ＰＰＣＡ及びＮＥＵ１である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記分解酵素は、ＰＰＣＡ及びカテプシンＤである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記分解酵素は、リソソーム内部でアミロイドの形成抑制及び／または分解を行うよう作用する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
19. 前記分解酵素は、細胞リソソームを標的とする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
20. 前記分解酵素は、細胞外部でアミロイドの蓄積抑制及び／または分解を行うよう作用する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
21. 前記分解酵素は、細胞の外部に留まるよう標的化される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記分解酵素は、本来前記ポリペプチドをリソソームに指向させるはずの１つ以上のシグナルを欠く、請求項２１に記載の方法。
23. 前記分解酵素は、１つ以上のマンノース−６リン酸シグナルを欠く、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象は哺乳類である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
25. 前記対象はヒトである、請求項１８に記載の方法。
26. 前記分解酵素は、非経口的に投与される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
27. 前記分解酵素は、筋肉内、腹腔内、または静脈内の経路を介して投与される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記組成物は、薬理学的に許容される担体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
29. 前記アミロイドーシスは軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
30. 前記ＡＬアミロイドーシスは、心臓、腎臓、神経系、及び胃腸管から選択される１つ以上の臓器に影響を与える、請求項２９に記載の方法。
31. 前記アミロイドーシスはアミロイド−ベータ（Ａβ）アミロイドーシスである、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
32. 前記Ａβアミロイドーシスは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、レビー小体認知症、及び封入体筋炎から選択される１つ以上の疾患に関連する、請求項３１に記載の方法。
33. アミロイドーシスを治療または予防するための１つ以上のさらなる薬物の投与をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
34. 前記１つ以上のさらなる薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、レナリドミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びシクロホスファミドから選択される、請求項３３に記載の方法。
35. リソソームを酸性化する１つ以上の薬物の投与をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
36. リソソームを酸性化する前記薬物は、酸性ナノ粒子、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬、アデノシン受容体作動薬、ドーパミン受容体作動薬、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）の活性化薬、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ｃＡＭＰ類似体、及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤から選択される、請求項３５に記載の方法。
37. リソソームを調節する１つ以上の薬物の投与をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
38. リソソームを調節する前記薬物は、Ｚ−フェニルアラニル−アラニル−ジアゾメチルケトン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ａｌａｎｙｌ−ｄｉａｚｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）（ＰＡＤＫ）もしくはＰＡＤＫ類似体、またはその薬理学的に許容される塩もしくはエステルである、請求項３７に記載の方法。
39. リソソームを調節する前記薬物は、Ｚ−フェニルアラニル−フェニルアラニル−ジアゾメチルケトン（ＰＰＤＫ）もしくはＰＰＤＫ類似体、またはその薬理学的に許容される塩もしくはエステルである、請求項３６に記載の方法。
40. オートファジーを促進する１つ以上の薬物の投与をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
41. オートファジーを促進する前記薬物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ１−α（ＰＧＣ−１α）の活性化薬、リシン（Ｋ）特異的脱メチル化酵素１Ａ（ＬＳＤ１）の阻害剤、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）の作動薬、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）の活性化薬、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤、及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）の阻害剤から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. オートファジーを促進する前記薬物は、リソソーム及び／またはエンドソームを酸性化することもできる、請求項４０に記載の方法。
43. 前記対象をさらに幹細胞移植で治療する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
44. 少なくとも２種の分解酵素を含む組成物であって、細胞リソソームを標的とする少なくとも１種の分解酵素及び細胞の外部に留まる少なくとも１種の分解酵素を含む、組成物。
45. 前記分解酵素は、保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、及びカテプシンＬから選択される、請求項４４に記載の組成物。
46. 対象のアミロイドーシスを治療または予防する方法であって、請求項４４または請求項４５に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
47. 前記アミロイドーシスは軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスである、請求項４６に記載の方法。
48. 前記アミロイドーシスはアミロイド−ベータ（Ａβ）アミロイドーシスである、請求項４６に記載の方法。
49. 前記Ａβアミロイドーシスは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、レビー小体認知症、及び封入体筋炎から選択される１つ以上の疾患に関連する、請求項４８に記載の方法。