CN109701040B - 一种用于诊治mtc的纳米pamam靶向多肽放射性核素制剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于诊治甲状腺髓样癌（MTC）的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂，所述多肽放射性核素制剂为基于马来酰亚胺修饰的不小于5代的聚合物聚酰胺‑胺PAMAM（G），与功能标记多肽R9等结合后被放射性核素131I标记的，可靶向肿瘤的PAMAM多肽放射性核素制剂。通过前体药物核素标记、靶向肽链的合成、纯化等工序制得多肽放射性核素制剂。本发明放射性核素131I纳米探针平台，使得其具有较高靶向性。131I衰变时发射的β射线，可用于内照射治疗，发射的γ射线可进行显像研究，在诊断的同时达到治疗目的。本发明对纳米制剂进行表面修饰，改变微粒的表面性质，可靶向MTC及延长其在肿瘤的驻留时间，以期为进一步的放射诊疗奠定理论基础，有望应用于甲状腺髓样癌的碘‑131靶向诊治及预后评估。

Description

一种用于诊治MTC的纳米PAMAM靶向多肽放射性核素制剂及制 备方法
技术领域
本发明属于放射性医疗技术领域，具体涉及一种用于诊治MTC的靶向多肽放射性核素制剂及制备方法。
背景技术
甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma， MTC）属中等恶性肿瘤，复发率和早期转移率较高，预后较差。MTC来源于不表达钠-碘共同转运体的甲状腺滤泡旁细胞（C细胞），可分泌降钙素（calcitonin， CT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）等多种生物活性物质。CT及CEA与肿瘤负荷密切相关，应用其对MTC诊断易出现假阴性。MTC可见甲状腺乳头状癌的超声特征，甚至多达1/3的MTC具有“非恶性”超声表现。美国甲状腺协会（American Thyroid Association， ATA）2015版指南及Pierpaolo Trimboli等的meta分析显示，细针穿刺细胞学对MTC诊断的准确性不到50%。显然，寻找定位更准确且无创的方法以达到MTC早期诊断乃至治疗性的制剂尤为重要。PAMAM（G5.0）具有稳定性好、无免疫原性、无毒性、较好的生物相容性等优点，其表面的氨基有增进癌细胞吸收的作用，已应用于包括药物、DNA及小干扰RNA （siRNA）的递送及MRI探针的研究。研究发现多肽SR（丝氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸-脯氨酸-组氨酸-脯氨酸）连接在腺病毒上可以特定靶向和杀伤MTC细胞，并且能选择性结合到MTC细胞上。多项研究显示，多肽GP（甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸）与脂质体结合能靶向易于新血管形成的肿瘤组织，因其能与肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞上过表达的特异性肿瘤血管标志物Ⅰ型基质金属蛋白酶结合，并且DPP-CNDAC/GP（5´-O-dipalmitoylphosphatidyl 2´-C-cyano-2´-deoxy-1-β- D -arabino-pentofuranosyl- cytosine/GPLPLR）比DPP-CNDAC具有更强的抗肿瘤生长作用。MTC属于中度恶性肿瘤，肿瘤新生血管丰富，因此研究设计了靶向MTC肿瘤细胞的131I-PAMAM（G5.0）-SR， 靶向肿瘤新生血管的131I-PAMAM（G5.0）-GP的诊断治疗探针。通过前期研究显示，131I通过常规氯胺T法及功能标记肽链KYKYC(KY)介导标记PAMAM（G5.0），制剂反应体系复杂，参与氧化还原反应相关试剂及反应时间难于把控，导致制剂标记率及体内外稳定性不理想，操作复杂，从而影响了制剂诊断治疗效果，更难以进一步推进用于临床治疗应用。因此，进一步研究并寻求更好的标记方法与靶向性多肽放射性核素制剂，这可能成为诊断与治疗甲状腺髓样癌的一种重要手段与途径。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于诊治甲状腺髓样癌的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂。
本发明的另一目的在于提供一种用于诊治甲状腺髓样癌的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂的制备方法。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的放射性核素多肽制剂为基于马来酰亚胺修饰的不小于5代聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与标记多肽R9结合后被放射性核素131I标记的，可靶向肿瘤的PAMAM多肽放射性核素制剂。
本发明的另一目的是这样实现的，所述的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂的制备通过前体药物核素标记、靶向肽链的合成、纯化工序制得放射性核素多肽制剂，具体工序包括：
A、前体药物核素标记：R9与表面为氨基的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM连接，通过氨基端位反应再连接肽链CG、GP和SR，得到目标纳米前体药物R9-PAMAM， R9-PAMAM-CG 、R9-PAMAM-SR、R9-PAMAM-GP、R9-PAMAM- CG / SR、R9-PAMAM- GP / SR；通过离子交换、离心洗涤分别装载标记131I到前体药物得到131I-R9-G，131I-R9-G-CG、 131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G-GP、 131I-R9-G- CG / SR、 131I-R9-G- GP / SR等靶向放射性核素制剂。
B、多肽制剂合成：用固相肽链合成法合成靶向性肽链CG、SR、GP与功能标记肽链R9，包括树脂的预处理、Fmoc保护的氨基酸活化及逐一连接两个氨基酸、脱Fmoc保护基团、切割肽链工序即合成所要的靶向肽链CG、SR、GP以及功能肽链R9；
C、多肽制剂纯化：所得的肽链CG、SR、GP与R9进一步用高效液相色谱（HPLC）纯化、分离和分析并用质谱表征；
D、多肽制剂分装与保存：分别称取2mg的多肽，加入1.98ml双篜水定容至2ml，即得10μg/10μl多肽溶液，用细胞冻存管将其分装成10ul、20ul，40ul三种规格，置于-70℃冰箱中待用；多肽制剂可制成冻干粉保存于-20℃冰箱中。
本发明基于放射性核素131I、高代级聚酰胺-胺PAMAM及多肽链的结合形成靶向作用的纳米探针平台，使得其具有较高MTC靶向性。同时，131I衰变时发射的β射线，可用于内照射治疗，发射的γ射线可进行显像研究，在诊断疾病的同时达到治疗目的。本发明开创了功能标记肽链R9介导131I标记的离子交换法，考察了PAMAM(G5.0)多肽放射性核素131I-R9-G5.0，131I-R9-G5.0-CG、 131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G5.0-GP、 131I-R9-G5.0- CG / SR、 131I-R9-G5.0- GP / SR，以及更高代级聚酰胺-胺多肽放射性核素对MTC裸鼠肿瘤模型的靶向性，从而创建了131I诊断和治疗MTC方法。放射性核素在肿瘤诊断乃至治疗方面取得了非常好的效果。因此，高代级聚酰胺-胺-R9+多肽131I制剂有望应用于MTC的靶向诊治及预后评估。本发明对纳米药物进行表面修饰，改变微粒的表面性质，可延长其在体内的循环时间，以期为进一步的放射治疗奠定基础。
附图说明
图1为 MTC 131I 靶向性多肽诊断治疗制剂系统示意图；
图2为本发明放射性核素纳米靶向多肽物质分子结构关系图；
图3为本发明制备多肽方法工艺流程图；
图4为靶向肽链CG的HPLC检测图；
图5为DLS检测G5.0多肽修饰前后纳米粒径大小对比图
图6为131I- R9-G5.0-CG制剂的HPLC检测图；
图7为 MTC动物模型SPECT/CT 131I显像及活体分布图；
图8 131I- R9-G5.0-CG制剂不同时间MTC SPECT/CT显像；
图9为131I- R9-G5.0-CG制剂不同时间MTC活体分布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
如图1~2所示，本发明一种用于诊治甲状腺髓样癌的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂，所述的放射性核素多肽制剂为基于马来酰亚胺修饰的不小于5代聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与标记多肽R9结合后被放射性核素131I标记的，可靶向肿瘤的PAMAM多肽放射性核素制剂。
所述的多肽放射性核素制剂为结合标记功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺，与靶向多肽SR，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向肿瘤细胞的PAMAM多肽放射性核素制剂。
所述的放射性核素多肽制剂为结合标记多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与GP合成的靶向多肽结合，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向MTC肿瘤新生血管的放射性核素多肽制剂。
所述的放射性核素多肽制剂为结合标记多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与CG合成的靶向多肽结合，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向MTC肿瘤新生血管的放射性核素多肽制剂。
所述的放射性核素多肽制剂为结合标记多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与GP和SR结合，并被放射性核素131I标记的，可双靶向MTC肿瘤细胞及新生血管的放射性核素多肽制剂。
所述的放射性核素多肽制剂为结合标记多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与CG和SR结合，并被放射性核素131I标记的，可双靶向MTC肿瘤细胞及新生血管的放射性核素多肽制剂。
所述的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM为第5~12代聚合物聚酰胺-胺PAMAM。
如图3所述，本发明所述的用于诊治甲状腺髓样癌的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂的制备方法，通过前体药物核素标记、靶向肽链的合成、纯化工序制得PAMAM放射性核素多肽制剂，具体工序包括：
A、前体药物核素标记：R9与表面为氨基的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM连接，通过氨基端位反应再连接肽链CG、GP和SR，得到目标纳米前体药物R9-PAMAM， R9-PAMAM-CG 、R9-PAMAM-SR、R9-PAMAM-GP、R9-PAMAM- CG / SR、R9-PAMAM- GP / SR；通过离子交换、离心洗涤分别装载标记131I到前体药物得到131I-R9-G，131I-R9-G-CG、 131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G-GP、 131I-R9-G- CG / SR、 131I-R9-G- GP / SR等靶向放射性核素制剂。
B、多肽制剂合成：用固相肽链合成法合成靶向性肽链CG、SR、GP与功能标记肽链R9，包括树脂的预处理、Fmoc保护的氨基酸活化及逐一连接两个氨基酸、脱Fmoc保护基团、切割肽链工序即合成所要的靶向肽链CG、SR、GP以及功能肽链R9；
C、多肽制剂纯化：所得的肽链CG、SR、GP与R9进一步用高效液相色谱（HPLC）纯化、分离和分析并用质谱表征；
D、多肽制剂分装与保存：分别称取2mg的多肽，加入1.98ml双篜水定容至2ml，即得10μg/10μl多肽溶液，用细胞冻存管将其分装成10ul、20ul，40ul三种规格，置于-70℃冰箱中待用；多肽制剂可制成冻干粉保存于-20℃冰箱中。
所述的聚合物聚酰胺-胺PAMAM为第5代的PAMAM（G5.0）采用发散合成法获得，即以乙二胺为中心分子，进行交替的Michael加成反应和酰胺化反应，从而形成高度有序而且可以控制的逐层分子代构建，PAMAM表面活性基团逐代翻倍，得到棒状或球状三围空间结构的第5代PAMAM（G5.0），其表面有128个氨基酸（AA），粒径为5.7nm，分子重量有28826Da，PAMAM（G5.0）表面的氨基有增进癌细胞吸收的作用。
所述的功能肽链R9与表面为氨基的第5代聚合物聚酰胺-胺PAMAM（G5.0）连接，通过氨基端位反应连接靶向肽链CG、SR、GP到PAMAM（G5.0），得到所需的纳米前体药物；装载标记131I到前体药物，离心洗涤就可以得到每一个纳米平台携带1152个131I的131I-R9- G5.0-Peptides核素纳米靶向性多肽制剂，即该系统分别由131I-R9-G5.0，131I-R9-G5.0-CG、131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G5.0-GP、131I-R9-G5.0- CG/SR、 131I-R9-G5.0- GP/SR组成，标记反应结束后，将各标记混合物用葡聚糖凝胶HPLC进行分离纯化，收集产品过滤除菌备用。
所述的SR即丝氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸-脯氨酸-组氨酸-脯氨酸Resin-Pro-Hist-Pro-Ser-Glu-Arg-Ser，其缩写为SRESPHP；所述的GP即甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸Gly-Pro-Leu-Pro-Leu -Arg-Resin，其缩写为GPLPLR；所述的CG即为半胱氨酸-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸Cys-Gly-Lys-Arg-Lys，其缩写为CGKRK; 以及R9即为天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，缩写为RRRRRRRRR。
下面以第5代聚酰胺-胺PAMAM（G5.0）为例，说明本发明制剂及其制备方法，更高代级的聚酰胺-胺PAMAM（G6.0~GN.0）也能实现本发明的目的。
所述的A步骤关于肽前体G5.0-R9合成与靶向性肽修饰之基本流程
1、首先合成的前体有：
（1）G5.0-R9(50%)；
（2）G5.0-R9(50%)+CG(25%, 50%)；
（3）G5.0-R9(50%)+GP(25%, 50% )；
（4）G5.0-R9(50%)+SR(25%, 50%)；
（5）G5.0-R9(50%)+CG(25%)+SR(25%);
（6）G5.0-R9(50%)+GP(25%)+SR(25%)。
2、具体合成步骤分别为：
（1）G5.0-R9(50%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)混合液待处理；
（2）G5.0-R9(50%)+CG(25%, 50%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，2.5mg CG，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)+CG(25%)混合液待处理；
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，5mg CG，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h G5.0-R9(50%)+CG(50%)混合液待处理；
（3）G5.0-R9(50%)+GP(25%, 50%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，2.5mg GP，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)+GP(25%)混合液待处理；
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，5mgGP，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)+GP(50%)混合液待处理;
（4）G5.0-R9(50%)+SR(25%, 50%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，3mg SR，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)+SR(25%)混合液待处理;
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，6mg SR，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h合成G5.0-R9(50%)+SR(50%)混合液待处理;（5）G5.0-R9(50%)+CG(25%)+SR(25%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，2.5mgGP，3mg(3.5mg)SR，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h 合成G5.0-R9(50%)+CG(25%)+SR(25%)混合液待处理；
（6）G5.0-R9(50%)+GP(25%)+SR(25%)前体合成：
于收集瓶中称取20mg G5.0-maleimide，10mg R9，2.5mgGP，3mg SR，溶于2mL PBS缓冲液中，于室温搅拌24h，合成G5.0-R9(50%)+GP(25%)+SR(25%)混合液待处理。
3、上述混合液分别置于-20度冰箱固化，最后用冻干机冻干备用。
所述的A步骤前体的131I标记，具体步骤如下（附图2）：
1、合成探针131I-R9-G5.0:
称取G5.0-R9 1mg +2.8mCi 131I ，并用 105uL PBS溶解，合成标记物131I-R9-G5.0,记为探针131I-R9-G5.0（L）
称取G5.0-R9 4mg +2.8mCi 131I ，并用 405uL PBS溶解，合成标记物131I-R9-G5.0,记为探针131I-R9-G5.0（H）；
2、合成探针131I-R9-G5.0- CG (25%, 50%):
称取G5.0-R9+CG(25%) 1mg+2.8mCi 131I，并用105uLPBS溶解，合成标记物, 131I-R9-G5.0- CG(25%)（L）;
称取G5.0-R9+CG(25%) 4mg+2.8mCi 131I，并用405uLPBS溶解，合成标记物, 131I-R9-G5.0- CG(25%)（H）;
称取G5.0-R9+CG(50%) 1mg+2.8mCi 131I，并用105uLPBS溶解，合成标记物, 131I-R9-G5.0- CG(50%)（L）;
称取G5.0-R9+CG(50%) 4mg+2.8mCi 131I，并用405uLPBS溶解，合成标记物, 131I-R9-G5.0- CG(50%)（H）;同理分别标记合成131I-R9-G5.0-SR（25%）（L）、131I-R9-G5.0-SR（25%）（H），131I-R9-G5.0-SR（50%）（L）、131I-R9-G5.0-SR（50%）（H）；131I-R9-G5.0-GP（25%）（L）、131I-R9-G5.0-GP（25%）（H）, 131I-R9-G5.0-GP（50%）（L）、131I-R9-G5.0-GP（50%）（H）; 131I-R9-G5.0-CG/ SR(L) 、131I-R9-G5.0- CG/ SR(H), 131I-R9-G5.0- GP /SR(L)、131I-R9-G5.0- GP /SR(H)等探针。
以上所有反应在室温下振荡24小时后，用超滤管将游离的131I分离开（4000rpm/min，离心15min)后即得所需探针。
所述的步骤B关于多肽化学合成方法（附图3），即肽链的合成采用固相肽链合成法，具体包括以下各步：
（1）树脂的预处理：准确称量树脂放于反应器中，加入适量二氯甲烷浸泡树脂20分钟，使得树脂变蓬松，从而反应物可以达到内部的反应基团；
（2）Fmoc保护的氨基酸经过HBTU活化后，与预先担载在树脂上的氨基酸反应，形成由两个氨基酸构成的肽链。
（3）脱Fmoc保护基团，依据肽链的氨基酸顺序，依次加入所需的氨基酸，增长肽链；
⑷ 切割肽链。当肽链合成完成后，用TFA/TIPS/H2O溶液将肽链于树脂分离，以上所得的肽链将进一步用高效液相色谱纯化（附图4）并用质谱表征（附图5）。
本发明制备并获得了标记率及放化纯度均较好的131I-R9-G5.0，131I-R9- G5.0-CG、 131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G5.0-GP、 131I-R9-G5.0- CG / SR、 131I-R9-G5.0- GP / SR纳米靶向制剂，在体外具有很好的稳定性。
SPECT/CT显像显示以上不同制剂在MTC肿瘤模型影像学特征不同。放射性核素Na131I只能聚积于高度表达钠-碘共同转运体的正常甲状腺滤泡细胞或分化较高的乳头状甲状腺癌（PTC）和滤泡状甲状腺癌（FTC）。
由附图6可见，单纯应用Na131I进行MTC肿瘤模型显像，结果可见：Na131I完全浓聚于颈前正常甲状腺组织，MTC肿瘤及全身其它组织器官均未见显影（附图6）。由此充分说明要突破和实现MTC放射性核素如Na131I或其它核素诊断治疗，要根据MTC肿瘤的生物学性能即MTC细胞表达的特异性受体，引入131I标记的相应靶向多肽，通过“多肽-受体”的特异性结合有利于携带131I聚积于MTC。
实施例1
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G5.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素（附图7），通过活体MTC肿瘤即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）可见于注射131I-R9-G5.0-CG制剂后8h达高峰（附图8）。通过实施例1说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G5.0，131I-R9-G5.0-CG、131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G5.0-GP、131I-R9-G5.0- CG/SR、 131I-R9-G5.0- GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗，有望应用于MTC患者的靶向诊治及预后评估。
实施例2
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G6.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G6.0-CG制剂后7h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G6.0，131I-R9-G6.0-CG、131I-R9-G6.0-SR、131I-R9-G6.0-GP、131I-R9-G6.0- CG/SR、131I-R9-G6.0- GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗，同样有望应用于MTC患者的靶向诊治及预后评估。
实施例3
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G7.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G7.0-CG制剂后6h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G7.0，131I-R9-G7.0-CG、131I-R9-G7.0-SR、131I-R9-G7.0-GP、131I-R9-G7.0- CG/SR、131I-R9-G7.0- GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗及预后评估。
实施例4
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G8.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G8.0-CG制剂后5h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G8.0，131I-R9-G8.0-CG、131I-R9-G8.0-SR、131I-R9-G8.0-GP、131I-R9-G8.0- CG/SR、131I-R9-G8.0- GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗及预后评估。
实施例5
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G9.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G9.0-CG制剂后4h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G9.0，131I-R9-G9.0-CG、131I-R9-G9.0-SR、131I-R9-G9.0-GP、131I-R9-G9.0- CG/SR、131I-R9-G9.0- GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗及预后评估。
实施例6
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G10.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G10.0-CG制剂后3h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G10.0，131I-R9-G10.0-CG、131I-R9-G10.0-SR、131I-R9-G10.0-GP、131I-R9-G10.0- CG/SR、131I-R9-G10.0-GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗及预后评估。
实施例7
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G11.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G11.0-CG制剂后3h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G11.0，131I-R9-G11.0-CG、131I-R9-G11.0-SR、131I-R9-G11.0-GP、131I-R9-G11.0- CG/SR、131I-R9-G11.0-GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断治疗及预后评估，特别是131I-R9-G11.0-CG达高峰时间较短，有利于SPECT/CT显像诊断MTC及进行预后评估。
实施例8
MTC肿瘤模型引入创新的131I-R9-G12.0-CG靶向放射性核素多肽制剂SPECT/CT显像可见：靶向MTC肿瘤新生血管的CG多肽，携带131I靶向定位于MTC肿瘤使病灶于不同时间异常浓聚放射性核素，通过活体肿瘤MTC即靶（T）与非肿瘤组织即非靶(NT)比较（靶/非靶, T/NT）注射131I-R9-G12.0-CG制剂后3h达高峰。说明本发明之多肽核素制剂131I-R9-G12.0，131I-R9-G12.0-CG、131I-R9-G12.0-SR、131I-R9-G12.0-GP、131I-R9-G12.0- CG/SR、131I-R9-G12.0-GP/SR能够实现MTC肿瘤的131I诊断、治疗及预后评估，特别是131I-R9-G12.0-CG达高峰时间较短，有利于SPECT/CT显像诊断MTC及进行预后评估。

Claims (9)

1.一种用于诊治MTC的靶向PAMAM多肽放射性核素制剂的制备方法，所述多肽放射性核素制剂为基于马来酰亚胺修饰的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与功能多肽R9结合后被放射性核素131I标记的，可靶向肿瘤的PAMAM多肽放射性核素制剂；功能多肽R9为九聚天冬氨酸，缩写为RRRRRRRRR；其特征在于，通过前体药物核素标记、靶向肽链和功能标记肽链的合成、纯化工序制得PAMAM多肽放射性核素制剂，具体工序包括：
A、前体药物核素标记：功能多肽R9与表面为氨基的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM连接，通过氨基端位反应再连接靶向性肽链CG、GP、SR，得到目标纳米前体药物R9-PAMAM、R9-PAMAM-CG、R9-PAMAM-SR、R9-PAMAM-GP、R9-PAMAM-CG/SR、R9-PAMAM-GP/SR；通过离子交换、离心洗涤分别装载标记131I到前体药物得到131I-R9-G、131I-R9-G-CG、131I-R9-G-SR、131I-R9-G-GP、131I-R9-G- CG/SR、131I-R9-G- GP/SR靶向放射性核素制剂；靶向性肽链CG为Cys-Gly-Lys-Arg-Lys，缩写为CGKRK；靶向性肽链GP为Gly-Pro-Leu-Pro-Leu -Arg-Resin，缩写为GPLPLR；靶向性肽链SR为Resin-Pro-Hist-Pro-Ser-Glu-Arg-Ser，缩写为SRESPHP；
B、多肽制剂合成：用固相肽链合成法合成靶向性肽链CG、SR、GP与功能多肽R9，包括树脂的预处理、Fmoc保护的氨基酸活化及逐一连接两个氨基酸、脱Fmoc保护基团、切割肽链工序即合成所要的靶向性肽链CG、SR、GP以及功能多肽R9；
C、多肽制剂纯化：所得的靶向性肽链CG、SR、GP与功能多肽R9进一步用高效液相色谱纯化、分离和分析并用质谱表征；
D、多肽制剂分装与保存：分别称取2mg的多肽，加入1.98ml双蒸水定容至2ml，即得10μg/10μl多肽溶液，用细胞冻存管将其分装成10μl、20μl，40μl三种规格，置于-70℃冰箱中待用；多肽制剂可制成冻干粉保存于-20℃冰箱中。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽放射性核素制剂为结合了功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与靶向性肽链SR，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向肿瘤细胞的PAMAM多肽放射性核素制剂。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽放射性核素制剂为结合了功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与靶向性肽链GP结合，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向MTC肿瘤新生血管的PAMAM多肽放射性核素制剂。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽放射性核素制剂为结合了功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与靶向性肽链CG结合，并被放射性核素131I高效标记的，可靶向MTC肿瘤新生血管的PAMAM多肽放射性核素制剂。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽放射性核素制剂为结合了功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与靶向性肽链GP、SR结合，并被放射性核素131I标记的，可双靶向MTC肿瘤新生血管及肿瘤细胞的PAMAM多肽放射性核素制剂。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽放射性核素制剂为结合了功能多肽R9的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM，与靶向性肽链CG、SR结合，并被放射性核素131I标记的，可双靶向MTC肿瘤新生血管及肿瘤细胞的PAMAM多肽放射性核素制剂。
7.如权利要求1~6任一所述的制备方法，其特征在于，所述的不小于5代的聚合物聚酰胺-胺PAMAM为第5~12代聚合物聚酰胺-胺PAMAM。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的聚合物聚酰胺-胺PAMAM为第5代的PAMAM G5.0，采用发散合成法获得，即以乙二胺为中心分子，进行交替的Michael加成反应和酰胺化反应，从而形成高度有序而且可以控制的逐层分子代构建，PAMAM表面活性基团逐代翻倍，得到棒状或球状三围空间结构的第5代PAMAM G5.0，其表面有128个氨基酸（AA），粒径为5.7nm，分子重量有28826Da，PAMAM G5.0表面的氨基有增进癌细胞吸收的作用。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的功能多肽R9与表面为氨基的第5代聚合物聚酰胺-胺PAMAM G5.0连接，通过氨基端位反应连接靶向性肽链CG、SR、GP到PAMAMG5.0，得到所需的纳米前体药物；装载标记131I到前体药物，离心洗涤就可以得到每一个纳米平台携带1152个131I的131I-R9-G5.0-Peptides多肽放射性核素制剂，即该制剂分别由131I-R9-G5.0、131I-R9-G5.0-CG、131I-R9-G5.0-SR、131I-R9-G5.0-GP、131I-R9-G5.0-CG/SR、131I-R9-G5.0-GP/SR组成，标记反应结束后，将各标记混合物用葡聚糖凝胶HPLC进行分离纯化，收集产品过滤除菌备用。
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