CN114099719A - 一种树枝状大分子包裹的纳米金颗粒复合材料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树枝状大分子包裹的纳米金颗粒复合材料及其制备和应用，以第五代聚酰胺‑胺树状大分子为载体，在其表面修饰螯合和靶向分子，然后经过原位还原合成法包裹金纳米颗粒，最终负载CpG，即得。本发明制备工艺周期短，材料在使用剂量下毒性小，生物相容性好，不仅可以实现PET/CT双模态成像，还可以起到抗肿瘤免疫反应，具有潜在临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于功能性纳米材料领域，特别涉及一种树枝状大分子包裹的纳米金颗粒复合材料及其制备和应用。
背景技术
现如今，癌症已成为威胁人类健康的主要因素之一。据统计，癌症的发病率逐年增加,而且癌症患者的死亡率也一直居高不下。鉴于恶性肿瘤的局部浸润性和远端转移特性，使得癌症的治疗效果和治疗费用与发现癌症的时期密切相关。及早发现、及早治疗是减少癌症死亡率最为切实可行的方法。近几十年来，随着纳米科学与技术的发展，各种纳米体系已经开始着手于癌症的早期诊断与治疗。
在临床诊断的过程中，分子影像学发挥着举足轻重的作用，分子影像手段主要包括：X-射线计算机断层成像技术(CT)、磁共振成像(MR)、正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层成像(SPECT)等。PET显像设备能接收放射性核素发出的射线，能清楚的观察到造影剂参与生物体内各种生理生化及代谢方面的功能信号，获得定性、定量及定位的临床疾病诊断结果。这种显像方式与传统的形态学成像方式相比，可以反映脏器或组织的血流变化、受体密度及活性改变、代谢及功能变化，成为临床诊断疾病的最先进技术之一。同时，PET成像也存在空间分辨率低和不能明确定位影像解剖学位置的缺点。PET/CT双模态成像技术能同时获得体内PET的功能代谢信息和CT的解剖诊断信息的图像融合与诊断效能倍增。因此，与单独的PET或CT相比，PET/CT在诊断疾病以及评价预后等方面都更加具有临床应用意义。
传统的癌症治疗方法主要是手术治疗，化疗和放疗。由于肿瘤组织异质性高，肿瘤免疫逃逸及靶向效果差等原因，传统癌症治疗常常无法完全治愈癌症，在一段时间内出现肿瘤的复发或转移。随着免疫学的发展，肿瘤免疫治疗已成为一种潜在的有效的肿瘤治疗方法。免疫治疗是通过激活患者自身免疫系统，增强患者自身抵抗力从而杀死肿瘤细胞的一种方法。
检索国内外文献和专利，尚未发现关于靶向分子修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG纳米复合物的制备方法及在PET/CT成像与肿瘤免疫治疗方面上的应用。
发明内容
针对上述技术空白，本发明所要解决的技术问题是提供一种树枝状大分子包裹的纳米金颗粒复合材料及其制备和应用。
本发明的一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：
(1)将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2和螯合剂DOTA-NHS分别溶于溶剂中，混匀后，于室温下搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥后，得到螯合剂修饰的第五代聚酰胺-胺树状大分子，即G5-DOTA；
(2)一端为羧基另一端为马来酰亚胺基团的聚乙二醇分子COOH-PEG-MAL和氨基葡萄糖DG分别溶解在超纯水中，混合均匀后，然后在催化剂条件下，搅拌反应12-24h，冷冻干燥，得到DG修饰的聚乙二醇分子DG-PEG-COOH；
(3)将DG-PEG-COOH溶于水中，加入EDC、NHS活化，得到活化后的DG-PEG-COOH，然后同G5-DOTA溶液混合室温下搅拌反应12-24小时，透析，冷冻干燥后得到G5-DOTA-(DG-PEG)；
或将PEG-COOH溶于水中，加入EDC、NHS活化，得到活化后的PEG-COOH，然后同G5-DOTA溶液混合室温下搅拌反应12-24小时，透析，冷冻干燥后得到G5-DOTA-PEG；
(4)将G5-DOTA-(DG-PEG)、G5-DOTA-PEG分别溶液水中，分别加入氯金酸水溶液，在室温条件下搅拌15～30min，然后加入遇冷的硼氢化钠水溶液，与冰水中搅拌反应3h，透析，冷冻干燥，分别得到{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}；
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中G5.NH2和DOTA的摩尔比为1:5～1:20。
所述步骤(2)中通过DG中的氨基与COOH-PEG-MAL中的马来酰亚胺基团(MAL)在氯化锂(Licl)与三乙胺(Et3N)的催化下发生迈克尔加成反应生成DG-PEG-COOH。
所述步骤(2)中催化剂为氯化锂((Licl)与三乙胺(Et3N)。
所述步骤(2)中COOH-PEG-MAL和氨基葡萄糖DG的摩尔比为1:0.5～1:2。
所述步骤(3)中G5-DOTA、DG-PEG-COOH或PEG-COOH的摩尔比为1:5～1:15。
所述步骤(4)中G5-DOTA-(DG-PEG)或G5-DOTA-PEG与氯金酸的摩尔比为1：25～1：200。
本发明提供一种标记放射性元素的复合材料，将所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}标记放射性元素68Ga。
{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}标记放射性元素68Ga和纯化标记产物的方法：首先用含有5mL HCl(0.1M)的注射器接入68Ge/68Ga发生器淋洗入口，然后缓慢推出，用5个1.5mL的EP管收集淋洗液，保留第二与第三管即可得到90％以上的放射性68Ga淋洗液。然后取上述得到的68Ga淋洗液(0.1M)与醋酸钠溶液(1M)混合，再加入{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}(5mg/mL),使混合溶液的酸碱度为5.5左右。最后通过100℃加热混合物15min后得到标记混合物。通过TLC薄层色谱分析法(TLC)分析放射性核素标记效率，再通过脱盐柱洗脱用来纯化标记混合物，收集脱盐柱下流出的标记产物通过TLC测定放射性化学纯度。所述68Ga淋洗液、与醋酸钠、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}的摩尔比为1：0.5～2：0.0001～0.0005。
本发明的一种负载CpG的聚酰胺-胺树状大分子复合材料，将所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}或{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}负载CpG，其中CpG为5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-5’。
本发明的一种负载CpG的聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：将所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}分别溶解在超纯水中与CpG按照氮磷比孵育，得到{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG所述氮磷比0.5-20；孵育时间为15-30min。
本发明提供一种所述方法制备的聚酰胺-胺树状大分子复合材料。
本发明提供一种所述方法制备的聚酰胺-胺树状大分子复合材料在制备PET/CT成像与抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明提供一种靶向分子修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG纳米复合物，将第五代聚酰胺-胺树状大分子作为为载体，在其表面修饰放射性核素68Ga螯合剂DOTA和聚乙醇化的DG靶向分子，然后经过原位还原合成法包裹金纳米颗粒，再进一步标记放射性核素68Ga。
本发明涉及一种靶向分子修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG纳米复合物的制备方法及在PET/CT成像与肿瘤免疫治疗方面上的应用。该方法包括：以第五代聚酰胺-胺树状大分子为载体，在其表面修饰放射性核素68Ga螯合剂DOTA和聚乙醇化的DG靶向分子，然后经过原位还原合成法包裹金纳米颗粒，再进一步标记放射性核素68Ga，或负载CpG形成功能化的树状大分子复合物，实验结果表明，对小鼠注射树状大分子复合物，可以有效地激活T细胞增强抗肿瘤免疫治疗，同时实现体内PET/CT双模态成像功能。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见光谱法(UV-vis)、动态光散射分析(DLS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势测试、透射电镜(TEM)等手段表征制备的功能化的树状大分子复合物的物理及化学性质。利用CCK-8法评价复合物细胞毒性，然后利用ICP-OES和共聚焦显微镜检测材料的靶向性。再利用流式细胞仪检测复合物激活树突细胞情况，通过酶联免疫吸附(ELISA)法评价复合物激活树突细胞后细胞因子的表达情况。最后建立黑鼠皮下肿瘤模型进行PET/CT成像以及抗肿瘤免疫实验。具体测试结果如下：
1.1H NMR表征结果
氢谱分析结果如图2所示，图2A为乙酰化G5-DOTA的核磁共振氢谱，1.89ppm处为乙酰基的特征峰，通过差量法可计算得出每个G5上连接的DOTA为8.2个。图2B为DG-PEG的核磁共振氢谱，3.6ppm处外为PEG的特征归属，3.81和3.87ppm为DG的特征峰，通过计算可得每个PEG上连接的DG为0.8个。图2C为G5-DOTA-(DG-PEG)的核磁共振氢谱，2.2-3.4ppm处为G5的特征峰，3.6ppm处为PEG的特征归属，通过积分计算可得每个G5上连接的9.4个PEG和7.8个DG。图2D为图G5-DOTA-PEG的核磁共振氢谱，3.6ppm处为PEG的特征归属，通过积分计算可得每个G5上连接的9.2个PEG。
2.UV-vis测试结果
UV-vis测试结果如图3所示，分析结果可知，合成的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}在520nm左右处有紫外吸收，说明成功合成了有独特吸收峰的纳米金颗粒。
3.透射电镜(TEM)测试结果
TEM测试结果如图4A-D所示，可以发现{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的单分散性良好，粒径统计结果表面包裹的金纳米颗粒尺寸都在2nm左右。
4.材料的X-射线衰减系数测试结果
X-射线衰减系数测试如图5A-B所示，可以发现{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的CT造影效果比临床所用的Omnipaque更强。
5.标记效率与稳定性测试结果
标记效率通过TLC实验可知{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}标记效率为85.9±2.19％，而{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}标记效率为85.7±2.49％，通过TLC测定标记后1h、2h和3h的稳定性，实验结果如图6所示，可以发现3h后两种材料均可以保持95％以上的放射性。
6.凝胶阻滞实验结果
取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}采用定氮试剂盒测定氨基的个数，然后将{(Au0 )100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}与CpG按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育之后进行琼脂糖凝胶电泳(如图7A-B所示)，实验结果表明{(Au0 )100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}大于等于2的条件下就可以完全压缩CpG。
7.Zeta电势及水动力学直径测试
将本发明制备的{(Au0) 100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}与CpG按不同N/P比(0、1、2、4、6)复合，室温孵育30分钟，然后加入1mL的PBS进行水动力学直径Zeta电势及测试(如图8A-B所示)。
8.细胞毒性实验结果
利用CCK-8细胞活力实验验证了材料对DCs和B16细胞的毒性。如图9A-B所示，两种载体与两种载体复合物本身均不影响DCs和B16细胞的活力。
9.靶向性效果评价
将本发明制备的
{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}与CpG(1μg)复合，室温孵育30分钟,与DG受体高表达的B16细胞共培养4h后再用胰酶消化并离心，弃上清液，得到的沉淀用1mL王水消化24h，消化完全后加入1mL超纯水，用ICP检测样品中的Au浓度。结果如图10所示，本实验充分证明了DG的靶向性能。
10.BMDC成熟效果评价
将本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}与CpG按照不同的氮磷比(2、5、10、20)复合，室温孵育30分钟,与BMDC细胞共培养24h,培养结束后，收集细胞，加入100μLPBS重悬，之后加入1μLCD80和CD86抗体，4度孵育30min,PBS洗两次，通过流式细胞仪检测(如图11A-B所示)。结果显示BMDC被成功激活。同时取激活前后细胞上清通过ELISA试剂盒检测IFN-α、IL-6、IL-12的浓度变化(如图11C-E所示)。结果显示{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}负载CpG之后，上清的细胞因子IFN-α、IL-6、IL-12都有明显变化，都明显增强，这也证明BMDC被成功激活。
11.组织分布
为研究纳米材料在生物体内各器官和组织的分布及代谢情况，将制备的纳米材料({(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG)配置成Au浓度为0.1M的PBS溶液。将2×106个B16细胞接种到白鼠的大腿内侧，待肿瘤体积达到200mm3左右时，通过小鼠尾静脉注射(100μL)各组材料。经过不同时间点(1、6、12,24、48h)处死荷瘤鼠并解剖，以尾静脉注射PBS(100μL)的荷瘤鼠作为空白对照，取出心、肝、脾、肺、肾、瘤称重，剪成2×2mm的碎块，然后用王水消化一周。最后，用ICP-OES测定各个样品中金元素的含量，计算出各个器官和肿瘤中金元素的含量(图12A-B)。从图中可以看出，在尾静脉注射完各组材料12小时之后，各器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织的金元素含量逐渐降低，这些结果证明了材料能够在小鼠体内正常代谢清除。从图12也可以看出，在尾静脉注射完两组材料后，在同一时间点靶向材料{({(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG比非靶向材料{{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG更多的肿瘤部位聚集，这也在动物实验水平上佐证了材料的靶向性能。
12.体内抗肿瘤效果评价
将皮下种植B16黑色素瘤的小鼠随机分成6组用于评价抗肿瘤效果。第一组：静脉注射PBS；
第二组：静脉注射CpG；第三组：静脉注射{((Au0)100-G5-DOTA-PEG}；第四组:静脉注射{{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}；第五组：静脉注射{((Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG；第六组：静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG如图13A-B所示，随着时间推移小鼠年龄增长且肿瘤体积增加，尤其是PBS组，小鼠体重有所增加。
如图13B所示，{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG的抑制效果最好。
有益效果
(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化的实施前景；
(2)本发明制备的{((Au0)100-G5-DOTA(68Ga)-(DG-PEG)}/CpG具有多功能性，可以用于体外、体内的树突细胞的激活，进一步激活T细胞，从而达到抗肿瘤效果，与此同时具备实现体内PET/CT双模态成像功能；
(3)本发明制备的复合物{((Au0)100-G5-DOTA(68Ga)-(DG-PEG)}/CpG在纳米医学、肿瘤免疫治疗和分子影像学领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明杂化树状大分子{((Au0)100-G5-DOTA(68Ga)-(DG-PEG)}/CpG复合物的合成示意图。
图2为本发明制备的G5.NHAc-DOTA(A)、DG-PEG(B)、G5-DOTA-(DG-PEG)(C)、G5-DOTA-PEG(D)的1H NMR谱图。
图3为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的UV-Vis图。
图4为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的透射电镜图(A)和粒径图(B)以及{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的透射电镜图(C)和粒径图(D)
图5为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}(1)和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}(2)与临床Omnipaque(3)的CT图像(A)和X射线衰减值(B)。
图6为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}标记68Ga后1h、2h和3h的放射性。
图7为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}复合CpG后在不同N/P下的凝胶阻滞实验电泳图(A)和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}复合CpG后在不同N/P下的凝胶阻滞实验电泳图(B)(条带1：DNA Marker；条带2：裸CpG；条带3：N/P＝0.25；条带4：N/P＝0.5；条带5：N/P＝1；条带6：N/P＝2；条带7：N/P＝3；条带8：N/P＝4)。
图8为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}复合CpG后在不同N/P下的和水动力学直径(A)Zeta电势(B)。
图9为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}、{Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG复合物{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG复合物与BMDC共培养后的CCK-8细胞活力检测图(A)或者与B16细胞共培养后的CCK-8细胞活力检测图(B)
图10为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与Cy3标记的CpG在不同的氮磷比形成复合物后与B16共孵育4h通过ICP测得的细胞吞噬材料Au含量。
图11为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与CpG在不同的氮磷比形成复合物后刺激BMDC成熟的流式检测图(A-B)和ELISA试剂盒检测三种细胞因子结果图(C-E)。
图12为C57BL/6小鼠静脉注射材料{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG在不同时间点(0、1、6、12、24、48h)在体内各器官和肿瘤组织金的分布图(A)和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG在不同时间点(0、1、6、12、24、48h)在体内各器官和肿瘤组织金的分布图(B)
图13为B16黑色素瘤荷瘤小鼠静脉注射PBS、CpG、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG、{(Au0)100-G5-DOTAPEG}/CpG处理15天过程中的(A)体重变化和(B)肿瘤体积变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
主要原料的来源
实施例1
(1)称取20mg的DOTA-NHS和60mg的第五代PAMAM树状大分子(G5)，分别溶解在5mL二甲基亚砜(DMSO)和20mL DMSO中，将DOTA-NHS溶液加入G5溶液中，30℃下水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5-DOTA干粉；
(2)称取4.3mg的氨基葡萄糖(DG)和40mg的聚乙二醇(Mw＝2000，MAL-PEG-COOH),分别溶解在2mL超纯水和5mL超纯水在，在氯化锂(Licl)与三乙胺(Et3N)的催化下发生迈克尔加成反应混合搅拌反应24h。反应结束后，使用截留分子量为500的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，即DG修饰的聚乙二醇(DG-PEG-COOH)；
(3)将步骤(2)所得产品20mg溶解在5mL水中，边搅拌边加入1mLEDC水溶液(1.56mg/mL)和NHS水溶液(1.1mg/mL)活化3h后，滴加5mL步骤(1)G5-DOTA的水溶液(5.39mg/mL)，室温条件搅拌反应24h。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5-DOTA-DG-PEG干粉；
称取20mg的聚乙二醇(Mw＝2000，mPEG-COOH)边搅拌边加入1mLEDC水溶液(1.56mg/mL)和NHS水溶液(1.1mg/mL)活化3h后，滴加5mL步骤(1)G5-DOTA的水溶液(5.39mg/mL)，室温条件搅拌反应24h。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到G5-DOTA-PEG干粉；
(4)将步骤(3)所得G5-DOTA-DG-PEG 30mg溶在5mL水中，边搅拌边加入氯金酸水溶液616μL(30mg/mL)磁力搅拌0.5h后，加入冰浴预处理的硼氢化钠水溶液2mL(3mg/mL),室温反应3h。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}。
将步骤(3)所得G5-DOTA-PEG 30mg溶在5mL水中，边搅拌边加入氯金酸水溶液616μL(30mg/mL)磁力搅拌0.5h后，加入冰浴预处理的硼氢化钠水溶液2mL(3mg/mL),室温反应3h。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}。
实施例2
(1)对实施例1步骤(1)中制备的G5-DOTA进行表征：
称取G5-DOTA充分溶解在5mL超纯水中，随后在溶液中加入50μL三乙胺，室温搅拌30分钟，随后加入29μL乙酸酐室温搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3L)中透析三天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到乙酰化的G5-DOTA粉末。称取2-3mg的G5.NHAc-DOTA粉末，加入500μL的氘代水(D2O)进行1H NMR测试。如图2A所示，通过1.89ppm处乙酰基的甲基质子峰，经差量法计算每个G5上连接的DOTA个数为8.2个。
(2)对实施例1步骤(2)中制备的聚乙二醇(DG-PEG-COOH)进行表征：
称取2-3mg的DG-PEG-COOH粉末，加入500μL的氘代水(D2O)进行1H NMR测试。如图2B所示，通过3.81ppm和3.87ppm处DG的特征峰，和3.6ppm处PEG的特征峰，通过积分面积计算每个PEG上连接的DG个数为0.8个。
(3)对实施例1步骤(3)中制备的G5-DOTA-(DG-PEG)进行表征：
称取2-3mg的G5-DOTA-(DG-PEG)粉末，加入500μL的氘代水(D2O)进行1H NMR测试。如图2C所示,通过2.2-3.4ppm处G5的特征峰，和3.6ppm处PEG的特征峰，通过积分面积计算每个G5上连接的PEG个数为9.4个，大约连接DG个数为7.5个。
实施例3
对实施例1中制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}进行表征。
称取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}粉末，分别配置成0.2mg/mL的水溶液，进行紫外可见光谱(UV-vis)测试。如图3所示，{Au0)100-G5-DOTA-PEG}和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}在520nm处左右出现了明显的吸收峰，为Au纳米颗粒的等离子体共振峰，表明了Au纳米颗粒的成功合成。
称取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}粉末，分别配置成2mg/mL的水溶液，滴于超薄碳膜上，烘干并进行投射电镜(TEM)测试。如图4A-D所示，{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}单分散性好，内部包裹的金纳米颗粒尺寸均一，在2.0nm左右。
实施例4
分别称取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}粉末，用超纯水充分溶解，配置成Au浓度为0.08M的母液，再分别稀释至0.04M、0.02M、0.01M和0.005M溶液各1mL。然后制备相同I浓度梯度的Omnipaque作为对照组。使用临床Brilliance 64层CT成像系统(Philips Healthcare，Andover，MA)进行CT扫描测试各个样品在不同Au或I浓度下的X-射线衰减特性，得出X-射线衰减与Au或I浓度的线性关系。如图5A-B所示，{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}的CT造影效果比临床所用的Omnipaque更强。
实施例5
{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}标记68Ga后通过TLC测定标记效率和稳定性。前者标记效率为85.9±2.19％，而后者标记效率为85.7±2.49％，通过TLC测定标记后1h、2h和3h的稳定性，实验结果如图6所示，可以发现3h后两种材料均可以保持95％以上的放射性。
实施例6
称取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}粉末，分别配置成2mg/mL的水溶液，采用定氮试剂盒测定{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和
{(Au0)100-G5-DOTAEG}的氨基的个数，然后将{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和
{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}与CpG按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育之后进行琼脂糖凝胶电泳。如图7A-B所示，{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}在N/P大于等于2的条件下就可以完全压缩CpG,具有很好的基因压缩能力。
实施例7
称取{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}和{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}粉末，分别配置成2mg/mL的水溶液，然后与CpG按照不同的氮磷比(0、1、2、4、6)孵育30分钟，然后加入1mL的PBS进行Zeta电势和水和动力学直径测试。如图8A-B所示，随着N/P比的增加，电势逐渐增加最后趋近34mV，而水动力逐渐降低。
实施例8
将B16、BMDC细胞按照每孔1×104的密度种植与96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成含Au浓度为0、100、500、1000、2000、3000nM的{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG、{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG(CpG含量为1μg)后培养24小时后，更换培养基为含有10％CCK-8溶液的无血清培养基，37℃培养24h后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力，如图9A-B所示，四种材料本身不影响B16、BMDC细胞活力，而且负载了CpG降低了细胞毒性。
实施例9
将B16、BMDC细胞按照每孔1×104的密度种植与96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成含Au浓度为0、100、500、1000、2000、3000nM的{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG(CpG含量为1μg)共培养4h后再用胰酶消化并离心，弃上清液，得到的沉淀用1mL王水消化24h，消化完全后加入1mL超纯水，用ICP检测样品中的Au浓度。结果如图10所示,本实验充分证明了DG的靶向性能。
实施例10
以树突细胞(BMDC)作为实验细胞，实施例1中步骤(4)制备的材料与CpG复合物来刺激BMDC成熟，通过流式细胞仪检测CD80和CD86的表达量来表征BMDC的成熟。将BMDC细胞按照每孔2×105的密度种植与6孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成100μL不同N/P比的{Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG(CpG含量为1μg)共培养24h。培养结束后，收集每孔细胞，离心，去上清。加1mLPBS重悬，加入1μLCD80和CD86，四度孵育30min，PBS洗两次，通过流式细胞仪检测。图11A结果显示，在N/P比为10时{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG，CD80和CD86表达量最高。而9B的荧光强度也表明这样的结果。同时取激活前后细胞上清通过Elisa试剂盒检测IFN-α、IL-6、IL-12的浓度变化。如图11C-E结果显示{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}负载CpG之后，上清的细胞因子IFN-α、IL-6、IL-12都有明显变化，都明显增强，这也证明BMDC被成功激活。
实施例11
为研究纳米材料在生物体内各器官和组织的分布及代谢情况，将制备的纳米材料({(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG)配置成Au浓度为0.1M的PBS溶液。将2×106个B16细胞接种到白鼠的大腿内侧，待肿瘤体积达到200mm3左右时，通过小鼠尾静脉注射(100μL)各组材料。经过不同时间点(1、6、12、24和48h)处死荷瘤鼠并解剖，以尾静脉注射PBS(100μL)的荷瘤鼠作为空白对照，取出心、肝、脾、肺、肾、瘤称重，剪成2×2mm的碎块，然后用王水消化一周。最后，用ICP-OES测定各个样品中金元素的含量，计算出各个器官和肿瘤中金元素的含量(图12A-B)。从图中可以看出，在尾静脉注射完各组材料12小时之后，各器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织的金元素含量逐渐降低，这些结果证明了材料能够在小鼠体内正常代谢清除。从图12也可以看出，在尾静脉注射完两组材料后，在同一时间靶向材料{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG比非靶向材料{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG更多的肿瘤部位聚集，这也在动物实验水平上佐证了材料的靶向性能。
实施例12
评价实施例1步骤(4)中的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}与{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}负载免疫激活剂CpG后对于B16黑色素瘤色抑制效果。
将取5-6周龄的雌性C57BL/6小黑鼠，每只皮下种植1.5×106的B16黑色素瘤，构建肿瘤模型至肿瘤体积达到0.4-0.6cm3随机分成6组，每组体重和肿瘤体积无差异。其中第一组：静脉注射PBS；第二组：静脉注射CpG；第三组：静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}；第四组:静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}；第五组：静脉注{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG；第六组：静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG。在治疗的第一天对各组小鼠静脉注射上述六组材料，每隔5天给药。其中{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}和{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}用量为5mg/kg,CpG用量为4.8μg。15天的治疗周期，每隔3天测量和记录小鼠的体重变化，并测算相对肿瘤体积变化。
如图13A-B所示，随着时间推移小鼠体重增长且肿瘤体积增加，尤其是PBS组，小鼠体重有所增加。如图13B所示，{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG的抑制效果最好。
Claims (10)
1.一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：
(1)将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2和螯合剂DOTA-NHS分别溶于溶剂中，混匀后，于室温下搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥后，得到螯合剂修饰的第五代聚酰胺-胺树状大分子，即G5-DOTA；
(2)聚乙二醇分子COOH-PEG-MAL和氨基葡萄糖DG分别溶解在超纯水中，混合均匀后，然后在催化条件下，搅拌反应12-24h，冷冻干燥，得到DG修饰的聚乙二醇分子DG-PEG-COOH；
(3)将DG-PEG-COOH溶于水中，加入EDC、NHS活化，得到活化后的DG-PEG-COOH，然后同G5-DOTA溶液混合室温下搅拌反应12-24小时，透析，冷冻干燥后得到G5-DOTA-(DG-PEG)；
或将PEG-COOH溶于水中，加入EDC、NHS活化，得到活化后的PEG-COOH，然后同G5-DOTA溶液混合室温下搅拌反应12-24小时，透析，冷冻干燥后得到G5-DOTA-PEG；
(4)将G5-DOTA-(DG-PEG)、G5-DOTA-PEG分别溶液水中，分别加入氯金酸水溶液，在室温条件下搅拌15～30min，然后加入硼氢化钠水溶液，与冰水中搅拌反应2-4h，透析，冷冻干燥，分别得到{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中G5.NH2和DOTA的摩尔比为1:5～1:20。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中催化剂为氯化锂与三乙胺Et3N；所述步骤(2)中COOH-PEG-MAL和氨基葡萄糖DG的摩尔比为1:0.5～1:2。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中G5-DOTA与DG-PEG-COOH或PEG-COOH的摩尔比为1:5～1:15。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中G5-DOTA-(DG-PEG)或G5-DOTA-PEG与氯金酸的摩尔比为1：25～1：200。
6.一种标记放射性元素的复合材料，其特征在于，将权利要求1所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}标记放射性元素68Ga。
7.一种负载CpG的聚酰胺-胺树状大分子复合材料，其特征在于，将权利要求1所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}或{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}负载CpG，其中CpG为5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-5’。
8.一种负载CpG的聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：将权利要求1所述方法制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}分别溶解在超纯水中与CpG按照氮磷比孵育，得到{(Au0)100-G5-DOTA-(DG-PEG)}/CpG、{(Au0)100-G5-DOTA-PEG}/CpG。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述氮磷比0.5-20；孵育时间为15-30min。
10.一种权利要求1所述方法制备的聚酰胺-胺树状大分子复合材料在制备PET/CT成像与肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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