CN110623938A - 一种mpc修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种MPC修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用，包括将MPC溶于溶剂中，加入溶于溶剂中的聚酰胺‑胺树状大分子反应，再先后加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，经透析、冷冻干燥，即得。本发明制备工艺周期短，操作便捷；且材料在使用剂量下毒性较低，生物相容性好，可压缩CpG基因，负载CpG基因的复合物可有效刺激免疫细胞进而杀伤肿瘤细胞，这为非病毒性载体在肿瘤免疫治疗上的应用提供了参考。

Description

一种MPC修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，特别涉及一种MPC修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，其发病率逐年增加。随着科学的发展和医疗技术的提高，恶性肿瘤患者的生存率有所提高，但死亡率仍未改变，这主要是由于肿瘤的复发和转移。目前，治疗恶性肿瘤的主要方法有手术治疗、放疗和化疗及联合治疗等，但存在肿瘤的转移、复发，及放化疗不良反应等诸多问题。随着肿瘤免疫学治疗与现代生物高科技技术的发展，肿瘤免疫治疗已经发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗方法。肿瘤免疫治疗是指激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。免疫治疗是全身性的持续的免疫反应，可有效治疗转移瘤，并且，免疫治疗产生记忆细胞，可有效防止肿瘤复发。
树状大分子由于其高度支化的结构和独特的单分散性使其具有特殊的性质和功能，从而在化学、催化剂、金属纳米材料、纳米复合材料、膜材料、表面活性剂、医学等研究领域都有广泛的用途。同时，树状大分子也是一种理想的纳米材料可应用于基因传递系统。相关研究表明，第五代树状大分子有一定的细胞毒性，但是其经过各种表面化修饰，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等可有效降低树状大分子的毒性并提高其基因负载效率。
树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)，在免疫反应中起着举足轻重的作用。DC是否成熟对其功能的发挥十分重要。目前人们已发现了可以刺激DC成熟的多种因素，如LPS，TNF-α和CD40-CD40L等，研究表明，细菌基因组DNA因含有非甲基化的CpG基序可以有效地活化APC，具有较强免疫刺激性。利用合成的含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containingoligonucleotides，CpG-ODN)与小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-deriveddendritic cells，BMDC)培养。CpG-ODN能够刺激DC前体细胞增殖，提高DC表面MHCⅡ类分子、B7-2和CD40等的表达，增加IL-12、IL-6等细胞因子的分泌，提高DC抗原提呈能力。同时，显著增强DC刺激初始型T细胞增殖。诱导产生抗肿瘤免疫反应。
检索国内外相关文献和专利结果表明：2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)修饰聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为基因载体负载CpG基因，刺激免疫细胞，利用免疫细胞进而达到癌症的免疫治疗目前尚未见报道。
CN 106512028 A公开了一种两性离子修饰的树状大分子包裹的金纳米颗粒CT造影剂及其制备和应用，只应用于肿瘤成像，且其金颗粒与树状大分子比例为80:1，负载基因能力较差。两性离子与树状大分子比例为10:1，生物相容性较低。而本发明将材料金颗粒与树状大分子比例为25:1，提高了材料的基因负载效率。两性离子与树状大分子比例为20:1，提高了材料的生物相容性。将此材料应用与基因载体肿瘤治疗方面，且最终具有较好的基因负载能力和肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种MPC修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用，克服现有技术具有较低的生物相容性和基因负载效率，只应用于肿瘤成像造影剂的缺陷，将其应用于基因载体，并发现其具有较高的基因负载效率和生物相容性。本发明中采用2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒。本发明提供的一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料，所述复合材料为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒。
本发明的一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：
将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC溶解于溶剂中，与第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2的溶液混合，反应48-72h，然后加入氯金酸HAuCl4反应，再加入NaBH4还原，经透析、冷冻干燥，即得复合材料{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}。
所述溶剂为水。
所述溶剂与MPC的摩尔比为10:1-2。
所述MPC与G5.NH2的摩尔比为20～25:1。
所述树状大分子与氯金酸中的金的摩尔比为1:20～35。
本发明的一种所述聚酰胺-胺树状大分子复合材料作为基因载体的应用。
本发明提供一种基于所述聚酰胺-胺树状大分子复合材料与CpG基因的复合物，所述复合物中的N/P比为0.125，0.25，0.5，1，2，3或4。
本发明提供一种所述复合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明所得{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}与CpG(序列：5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’)两者通过不同比例复合，再与BMDC培养刺激BMDC成熟。成熟的BMDC与T细胞共培养，诱导T细胞增殖产生抗肿瘤免疫应答。其中，BMDC由小鼠骨髓间充质干细胞诱导获得,T淋巴细胞由小鼠脾脏中淋巴细胞通过尼龙毛柱法获取。
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)修饰的树状大分子包裹的Au DENPs作为载体应用于肿瘤免疫治疗的方法是材料与CpG基因按照相同的N/P(树状大分子的伯氨基与CpG中的磷酸基团摩尔比)2:1，按照不同浓度制备载体与CpG基因的复合物与BMDC培养24h，通过流式细胞仪检测BMDC表面CD80、CD86和MHC-2的表达量以表征BMDC的成熟，成熟的BMDC与T细胞共培养3d，利用CD4和CD8抗体以表征T细胞的激活。激活的T细胞与A549细胞利用Transwell共培养24h，之后利用CCK-8检测A549细胞的细胞活力，从而证明T细胞对A549细胞的杀伤效果。
本发明以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒为基因载体，通过负载CpG基因刺激BMDC的成熟，成熟的BMDC激活T细胞，利用T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用进而达到癌症免疫治疗。通过核磁、紫外吸收测定、透射电子显微镜对材料的物理化学特征进行表征；利用末端氨基定量试剂盒测定载体的末端氨基数目；MTT试剂盒检测单独载体及载体与CpG基因复合物的细胞毒性；琼脂糖凝胶电泳技术确定载体完全结合基因的氮磷比；通过表面电势与水动力学粒径对载体与CpG复合物的电势和粒径进行了分析；通过流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测细胞吞噬，流式细胞仪表征BMDC的成熟及T细胞的激活，利用Transwell实验表征T细胞对A549细胞的杀伤效果；本发明将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)与PAMAM表面氨基基团结合，可通过中和其部分表面氨基以降低材料的毒性，并提高材料的生物相容性。
有益效果
(1)本发明制备的MPC修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒易于制备，操作简单，实验条件温和，制备周期短，产量高，产率可达到80％以上；
(2)本发明制备的MPC修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒具有良好的生物相容性及高效的基因负载效果(凝胶电泳实验表明具有高效的负载效率)，在恶性肿瘤的免疫治疗等方面有较好的应用前景；
(3)本发明制备工艺周期短，操作便捷，且材料在使用剂量下毒性较低，生物相容性好，可压缩CpG基因，负载CpG基因的{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}可有效刺激免疫细胞进而杀伤肿瘤细胞，这为非病毒性载体在肿瘤免疫治疗上的应用提供了参考；
(4)本发明的材料刺激免疫细胞过程易于操作，且高效，这为肿瘤的免疫治疗提供参考。
附图说明
图1为实施例1材料的结构示意图；
图2为实施例2材料的核磁图谱；
图3为实施例3材料的紫外吸收图谱；
图4为实施例4材料的透射电子显微镜图；其中a为(TEM图)；b为(粒径分布直方图)；
图5为实施例6材料与CpG复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图6为实施例9材料和材料与CpG复合物对BMDC的毒性结果图；
图7为实施例10中BMDC对不同浓度材料与CpG复合物吞噬流式检测图；
图8为实施例10中BMDC对不同浓度载体与CpG复合物吞噬流式检测相对荧光强度图
图9为实施例10中BMDC对不同浓度载体与CpG复合物吞噬共聚焦显微镜检测图；
图10为实施例11材料与CpG复合物刺激BMDC成熟的流式检测图；
图11为实施例13成熟BMDC激活T细胞的检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。第五代聚酰胺-胺树状大分子购买于Dendritech公司，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)购买于上海百灵威科技有限公司，氯金酸(HAuCl4·4H2O)和硼氢化钠(NaBH4)购买于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
称取3.51mg的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)溶解于超纯水中，再将20.13mg的G5.NH2溶解于超纯水并与上述溶液充分混合，反应72小时。在上述反应的产物中按照树状大分子与金摩尔比为1:25的量加入265.72μL HAuCl4反应30分钟，再加入2.19mg NaBH4搅拌反应3小时。透析3天后经冷冻干燥即获得材料{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}。
实施例2
分别称取2mg的材料({(Au0)25-G5.NH2-MPC20})溶解于500μL的D2O中，然后使用核磁共振波谱仪测定材料的核磁氢谱。核磁结果如图2所示，1H NMR图谱用于表征接到G5.NH2上的碳链的个数，G5.NH2特征基团的质子峰在2.2-3.4ppm之间，而在1.9ppm出现的质子吸收峰为MPC上1号碳原子上甲基的吸收峰，说明MPC被成功的连接到G5.NH2上，利用origin软件计算出质子峰的积分面积，得到平均每个G5.NH2表面连接大约20.1个MPC。结果表明按照预设的目标合成了{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}。
实施例3
将材料({(Au0)25-G5.NH2-MPC20})溶解于超纯水中，配制成浓度为2mg/mL溶液，利用紫外-可见分光光度计检测在300nm-800nm波段范围内的紫外吸收值。紫外-可见分光光度检测结果如图3所示，包裹金颗粒的材料在520nm处左右有吸收峰，这说明纳米金颗粒被成功包裹。
实施例4
将配制好的材料水溶液({(Au0)25-G5.NH2-MPC20})(2mg/mL)滴到有碳膜的铜网表面，置于室温下干燥，制得样品。然后采用JEM-2010F型透射电子显微镜在200kV下检测样品(如图4)。采用Image J软件进行测量并计算出样品尺寸，材料的颗粒尺寸平均在1.7nm左右。图中可看出制备的材料呈球形，分散性较好。
实施例5
实施例1制备得到的材料末端氨基定氮检测。将材料溶解于水中配制成2mg/mL的溶液，再根据初级氨基检测试剂盒(PANOPA)的实验方法测定材料的表面氨基数目。实验步骤为：从试剂1中取2粒片状药品，用3mL超纯水溶解，配成溶液1。对照组中取50μL超纯水加入溶液1充分混匀，实验组中取待测材料50μL加入溶液1充分混匀，反应3分钟后在吸光度为340nm处测量，分别记录吸光度A0和A1；再分别加入100μL溶液2充分混匀并反应15分钟，在吸光度为340nm处记录数据A2和A3。根据公式计算出样品中末端氨基的个数。结果显示，经MPC修饰后，末端氨基的数目为60.42。这可能是由于MPC与氨基共价连接，从而减少PAMAM表面氨基的数目，以降低了PAMAM的毒性。
实施例6
实施例1制备得到的材料与CpG基因的结合能力采用琼脂糖凝胶阻滞实验进行测定。按照氮磷比为0.125，0.25，0.5，1，2，3，4制备载体与CpG基因复合物，单独的CpG基因作为对照。称取0.25g琼脂糖加入至25毫升Tris-硼酸电泳缓冲液(1×TBE)中混合。在微波炉中加热至溶解，且瓶中无气泡。待瓶中温度降低至50-60℃，往胶中加入2μL浓度为1mg/mL的溴化乙锭(EB)染料，摇匀倒入摆好梳子的胶槽内，等待约15分钟后拔掉梳子，准备上样。将载体与CpG基因复合物与上样缓冲液(6×loading buffer)混匀后分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压90V，时间30min。跑胶结束后用凝胶成像仪分析CpG基因在凝胶中的迁移情况。在不同N/P条件下，每个泳道中条带的分离状况表示不同浓度的材料包裹基因的能力，载体与CpG基因复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱，如图5所示，图中显示材料与CpG基因复合物在N/P为1时观察不到明显的条带，说明材料与CpG基因复合物没有出孔，材料具有较强的包裹能力，能压缩CpG基因。
实施例7
将CpG基因与实施例1的方法制备的材料按照不同氮磷比为分别与1μg CpG基因共孵育得到载体与CpG基因复合物。材料与CpG基因复合物作为实验组，单独材料作为对照组。在室温条件下孵育20分钟后加入1mL PBS缓冲液，然后采用激光粒度仪(Malvern,UK)测定复合物的水动力学粒径和表面电势对复合物进行表征。结果显示，载体与CpG基因复合物的表面电势(参见表1)均为正，CpG基因的负电荷中和了载体材料正电荷，正如表中载体与CpG基因复合物的电势分别小于载体的电势。随着氮磷比的增加，复合物的表面电势也有增加的趋势，电势范围均在正常范围内，有利于复合物和细胞间相互作用，便于载体对目的基因的传递。载体与CpG基因复合物随着氮磷比增加，相互作用增强，粒径依次减小(表1)。当氮磷比为2时，粒径范围处于200nm与300nm之间，此时复合物容易进入细胞，利于细胞内细胞吞噬。
表1为实施例1材料与CpG复合物的表面电势图和水动力学粒径大小。
表1：
实施例8
脱颈处死C57BL/6小鼠，浸入75％的酒精中2-5min，无菌手术刀取出小鼠股骨和胫骨浸泡于PBS中。在超净台上剪去股骨、胫骨两端骨骺，用无血清培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨头变白，离心除去上清，加红细胞裂解液裂解红细胞，用RPMI1640完全培养基冲洗，然后再离心后弃去上清。完全培养基重悬细胞。加入相应诱导因子，放培养箱中培养。隔天半量换液，第七天收集上清细胞，即得。
实施例9
实施例1制备得到的单独材料以及材料与CpG基因复合物的细胞毒性检测。将BMDC以每孔的密度1×105细胞在含有浓度范围为0-200μg/mL不同浓度梯度材料的200μL培养基种于96孔板中培养24h，同时，BMDC每孔的密度1×105细胞在含有浓度范围为0-200μg/mL不同浓度梯度的材料与CpG基因复合物(1μg)的200μL培养基种于96孔板中培养24h。培养结束后，每孔加入20μL MTT(5.0mg/mL)溶液，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，加入100μL的DMSO室温震动10min溶解甲瓒。之后用酶联免疫检测仪测量570nm波长处各孔的吸光度。如图6结果显示，随着材料的浓度增加，细胞活力逐渐降低。但是载体与CpG复合物在BMDC细胞内的细胞存活率明显提高，在浓度为时50μg/mL时，细胞活力达到80％以上。表明材料与CpG基因复合物在使用剂量下细胞毒性低，有利于后续实验。
实施例10
体外细胞吞噬实验通过流式细胞仪和共聚焦显微镜检测，将材料按照1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、75μg/mL，N/P比为2，配成不同浓度的材料和CpG基因复合物。CpG基因为带有FAM标记的绿色荧光。以1×106细胞每孔的密度将BMDC细胞与含有不同浓度梯度材料和CpG基因复合物的1mL培养基种于12孔板中培养6h，单独的四种浓度下等量的CpG基因作为阴性对照，并设置空白组作为空白对照。培养结束后，通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度来检测细胞对材料的吞噬，如图7显示，在浓度为50μg/mL和75μg/mL时细胞吞噬结果显示吞噬明显增强，且如图8的荧光强度也显示这结果，之后在同样条件下利用共聚焦显微镜检测细胞吞噬，在如图9中显示与前面流式细胞仪检测结果相符。
实施例11
实施例1制备得到的材料与CpG基因复合物来刺激BMDC成熟，通过流式细胞仪检测CD80、CD86、MHC-2的表达量来表征BMDC的成熟。以1×105细胞每孔的密度将BMDC种于12孔板中，在完全培养基中在37℃和5％CO2条件下培养24h，将材料按照1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、75μg/mL，N/P比为2，配成不同浓度的材料和CpG基因复合物。将培养基换成含有不同浓度材料的新鲜培养基，继续培养24h，每个梯度设定3个复孔。培养结束后，收集每孔细胞，离心，去上清。加1mLPBS重悬，加5μL CD80、CD86、MHC-2抗体，4℃孵育30min，PBS洗两次，加300μLPBS重悬，通过流式细胞仪检测。如图10结果显示，随着材料的浓度增加，细胞表面的CD80、CD86、MHC-2表达量增加，在50μg/mL时达到最佳效果。
实施例12
通过尼龙毛柱法获取T淋巴细胞，颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，无菌条件下取出其脾脏，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，经尼龙毛柱，即得同种异体T细胞。
实施例13
将上述获得的T细胞作为反应细胞，取上述方法获得的C57BL/6小鼠骨髓来源成熟树突状细胞，两者共培养3d-5d，培养结束之后利用流式检测CD4、CD8的表达量。通过其表明抗体表达量的情况可观测T细胞是否被激活，结果如图11所示，结果显示，CD4和CD8的表达量明显增加，分别达到87.72％、80.29％，故成熟的BMDC可有效促进T细胞激活。

Claims (9)

1.一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料，其特征在于，所述复合材料为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒。
2.一种聚酰胺-胺树状大分子复合材料的制备方法，包括：
将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC溶解于溶剂中，与第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2的溶液混合，反应48-72h，然后加入氯金酸HAuCl4反应，再加入NaBH4还原，经透析、冷冻干燥，即得复合材料{(Au0)25-G5.NH2-MPC20}。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述溶剂为水。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述溶剂与MPC的摩尔比为10:1-2。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述MPC与G5.NH2的摩尔比为20～25:1。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述树状大分子G5.NH2与氯金酸中的金的摩尔比为1:20～35。
7.一种权利要求1所述聚酰胺-胺树状大分子复合材料作为基因载体的应用。
8.一种基于权利要求1所述聚酰胺-胺树状大分子复合材料与CpG基因的复合物，其特征在于，所述复合物中的N/P比为0.125，0.25，0.5，1，2，3或4。
9.一种权利要求8所述复合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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