CN110090204A - 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法 - Google Patents

一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110090204A
CN110090204A CN201910312312.9A CN201910312312A CN110090204A CN 110090204 A CN110090204 A CN 110090204A CN 201910312312 A CN201910312312 A CN 201910312312A CN 110090204 A CN110090204 A CN 110090204A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
bmdc
mpeg
odn
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910312312.9A
Other languages
English (en)
Inventor
曹雪雁
史向阳
陈环
郝欣欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Donghua University
National Dong Hwa University
Original Assignee
Donghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Donghua University filed Critical Donghua University
Priority to CN201910312312.9A priority Critical patent/CN110090204A/zh
Publication of CN110090204A publication Critical patent/CN110090204A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/056—Immunostimulating oligonucleotides, e.g. CpG
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇修饰的聚酰胺‑胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备及激活免疫细胞的方法，包括将聚酰胺‑胺树状大分子溶于溶剂，加入mPEG‑COOH，再先后加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，经透析、冷冻干燥，得到{(Au0)25‑G5.NH2‑mPEG20}；再与CpG ODN复合，即得。本发明制备工艺周期短，易于操作；材料在使用剂量下毒性低，生物相容性好，很好地压缩CpG ODN，能有效刺激BMDC细胞的成熟，成熟的BMDC细胞可有效激活T细胞，为非病毒性载体在肿瘤免疫治疗上的应用提供了参考。

Description

一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒 负载CpG ODN的制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，特别涉及一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法。
背景技术
癌症是威胁我国健康的主要疾病之一。其发病率现已高居我国居民病死原因首位。癌症的早期发现、早期诊断及早期治疗是降低死亡率及提高生存率的主要策略之一。目前，手术治疗、放疗和化疗等是当前针对恶性肿瘤普遍采用的方法，但存在肿瘤的转移，以及放化疗不良反应等问题。由于免疫学和肿瘤生物学研究的飞速发展，免疫治疗成为了继经典的三大肿瘤治疗方式之后的第四种肿瘤治疗方式，并被2013年“科学期刊”评选为十大突破之一。肿瘤免疫疗法旨在激活人体的免疫系统，并依靠其自身的免疫功能来杀死癌细胞和肿瘤组织。
非病毒载体系统中，树状大分子能作为一种理想的纳米材料应用于基因传递系统。其区别于传统的线性聚合物类纳米材料，具有独特的高度支化三维立体结构，有良好的单分散性。树状大分子经过各种表面化修饰，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，产生了不同的理化性质。研究表明，第五代树状大分子有一定的细胞毒性，但是与纳米金颗粒形成复合物[Shan Y.,Luo T.,Peng C.,et al.,Gene delivery using dendrimer-entrappedgold nanoparticles as nonviral vectors[J].Biomaterials,2012,33(10):p.3025-3035.]会降低载体的毒性。
树突状细胞起源于造血干细胞，是目前发现的一类功能最强大的并可以激活未致敏初始型T细胞抗原提呈细胞，因此DC被称为是免疫系统的“哨兵”。大量的研究已经证明了DC在肿瘤形成、进展以及机体抗肿瘤中的作用，尤其是2010年第1个以DC为基础的DC疫苗产品获得美国食品和药品管理局批准用于治疗前列腺癌以来，以DC为基础的肿瘤免疫治疗正成为国内外研究的热点之一。成熟DC能有效的激活B细胞和T细胞，特别是CD8+ T细胞，激发机体产生抗肿瘤免疫应答反应。人工合成的非甲基化的CpG寡核苷酸是一种近年来引起广泛关注的激活剂。它可以激活TLR9，刺激DC分泌IL-12p70、TNF-α、IFN-5等细胞因子，从而激活T细胞，诱导产生抗肿瘤免疫反应。
检索国内外相关文献和专利结果表明：聚乙二醇修饰聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为基因载体负载CpG ODN，刺激树突状细胞的成熟，再利用成熟的树突状细胞激活T细胞，从而进行癌症的免疫治疗尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法，聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒复合物作为非病毒载体负载CpG ODN，该方法制备过程简单，实验条件温和，易操作；该方法得到的复合物具有良好生物相容性、细胞免疫安全性以及高效基因转染效率，可有效刺激BMDC成熟，在恶性肿瘤的基因治疗等方面有较好的应用前景。
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法，包括：
将mPEG-COOH溶解于溶剂中，通过EDC和NHS进行活化；将活化好的mPEG-COOH与G5.NH2的DMSO溶液混合，再加入氯金酸HAuCl4反应，然后加入NaBH4还原，透析、冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}；最后将{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}与CpG ODN按氮磷比0.5～6复合，即得。
所述溶剂为DMSO。
所述EDC、NHS和mPEG-COOH的摩尔比为10:10:1-2。
所述mPEG-COOH与G5.NH2的摩尔比为20～25:1。
所述mPEG-COOH中的树状大分子与氯金酸中的金的摩尔比为1:25～30。
所述CpG ODN的序列为5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’。
本发明还提供了一种负载CpG ODN的材料刺激BMDC细胞成熟的方法，包括：
BMDC由小鼠骨髓获得：脱颈处死C57BL/6小鼠，浸入75％的酒精中，无菌手术刀取出小鼠股骨和胫骨浸泡于PBS中。在超净台上剪去股骨、胫骨两端骨骺，用无血清RPM I1640培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨头变白，1500转/min离心3min除去上清，加红细胞裂解液裂解红细胞，用RPMI1640完全培养基冲洗，然后再离心后弃去上清。RPM I1640完全培养基重悬细胞并调整浓度.将细胞接种到孔板中，按浓度加入IL-4和浓度GM-CSF，放培养箱中培养。隔天半量换液。
将获得的BMDC与负载CpG ODN按照不同浓度共培养一段时间，最后获得的BMDC即为成熟的BMDC，通过流式细胞仪检测,即得。
所述IL-4浓度为5-10ng/mL。
所述GM-CSF浓度为10-20ng/mL。
所述负载CpG ODN的材料刺激BMDC的浓度为10μg/mL-100μg/mL。
所述BMDC与负载CpG ODN的培养时间为12-36h。
本发明还提供了一种成熟BMDC激活T细胞的方法，包括：
通过尼龙毛柱法获取T淋巴细胞，尼龙毛柱自组装：颈椎脱臼法处死C57 BL/6小鼠，无菌条件下取出其脾脏，剪碎研磨经滤网过滤，得到细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，尼龙毛柱法获得同种异体T细胞作为反应细胞。将上述获取的T细胞用CD3抗体对其进行标记，上流式检测。通过流式细胞仪检测结果计算其CD3荧光表达量。从而得到T细胞的纯度，并检测CD4和CD8的表达量。
将获得的T细胞与BMDC按照不同的浓度共培养一段时间，通过流式细胞仪再次检测其CD3、CD4、CD8的表达量，即得。
所述尼龙毛柱提取T细胞过尼龙毛柱次数为3-8次。
所述BMDC与T细胞比例为1:10-200。
所述BMDC与T细胞共培养时间为3-5d。
Au DENPs作为载体应用于刺激树突细胞成熟的方法是按照材料与CpG按照相同的N/P(树状大分子的伯氨基与pDNA分子中的磷酸基团摩尔比)2:1，材料按照不同浓度制备载体与CpG ODN的复合物；在37℃、5％CO2条件下培养树突细胞，再加入不同浓度的材料和基因复合物，培养24h，通过流式细胞仪检测其CD80、CD86、MHC-2的表达量以及相应细胞因子的表达量。
载体与CpG ODN复合物在小鼠骨髓来源树突细胞(BMDC)中共同孵育24小时后进行流式检测CD80、CD86、MHC-2的荧光强度，同时提供ELISA试剂盒检测细胞上清IL-6、IL-12p70和TNF-α细胞因子的含量，以表征BMDC的激活。
(1)小鼠骨髓来源树突细胞(BMDC)的提取：脱颈处死C57BL/6小鼠，浸入75％的酒精中2min，无菌手术刀取出小鼠股骨和胫骨浸泡于PBS中。在超净台上剪去股骨、胫骨两端骨骺，用无血清RPM I1640培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨头变白，1500转/min离心3min除去上清，加红细胞裂解液裂解红细胞，用RPMI1640完全培养基冲洗，然后再离心后弃去上清。RPM I1640完全培养基重悬细胞并调整浓度为1×106/mL.将细胞接种到6孔板中，按10ng/mL加入IL-4和浓度为20ng/mL GM-CSF，放37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。隔天半量换液。
(2)小鼠骨髓来源树突细胞的鉴定：倒置显微镜在1、3、5、7天观察细胞形态及增殖情况。第七天收集细胞上流式细胞仪通过抗体CD11c、CD80、CD86、MHC-2抗体检测纯度和成熟度。将第七天收集的小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)与CpG ODN按照相同的N/P(树状大分子的伯氨基与pDNA分子中的磷酸基团摩尔比)2:1，材料按照不同浓度制备载体与CpGODN的复合物，将复合物与BMDC共孵育24小时，流式检测其CD80、CD86、MHC-2的表达量和ELISA试剂盒检测成熟前后培养基上清细胞因子IL-6、IL-12p70、TNF-α的含量变化以表征BMDC的成熟。
(3)T细胞的提取及激活鉴定：
通过尼龙毛柱法获取T淋巴细胞，尼龙毛柱自组装。颈椎脱臼法处死C57 BL/6小鼠，无菌条件下取出其脾脏，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，尼龙毛柱法获得同种异体T细胞作为反应细胞。将上述获取的T细胞用CD3抗体对其进行标记，上流式检测。通过流式细胞仪检测结果计算其CD3荧光表达量。从而得到T细胞的纯度，并检测CD4和CD8的表达量。
将上述获得的T细胞作为反应细胞，调整密度为2×106/mL。取上述方法获得的DC细胞将其与上述T细胞以1:10、1:20、1:50、1:100、1:200的比例种于96孔板，两者在培养箱中共培养3-5d，培养结束后，将细胞加MTT在酶标仪570nm处检测吸光值，选出最佳比例。
在最佳比例下培养结束之后，将细胞取出离心，收集细胞，分别用CD3、CD4、CD8抗体标记，用流式细胞仪检测结果，即可通过T细胞的CD4和CD8的表达量得到T细胞是否被激活。
本发明以聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物为载体，通过负载CpG ODN刺激BMDC的成熟，再用成熟的BMDC激活T细胞，从而达到癌症的免疫治疗。通过核磁、紫外吸收测定、透射电子显微镜对材料的物理化学特征进行表征；利用末端氨基定量试剂盒测定载体的末端氨基数目；MTT检测载体与CpG ODN复合物的细胞毒性；琼脂糖凝胶电泳技术确定载体完全结合基因的氮磷比；通过表面电势与水动力学粒径对载体与CpG ODN复合物的电势和粒径进行了分析；流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测细胞吞噬；流式细胞仪检测BMDC的成熟度和纯度；流式细胞仪检测T细胞的纯度和刺激；MTT检测不同DC：T时的刺激指数。本发明将mPEG与G5PAMAM表面氨基基团共价结合，可以通过中和其部分表面氨基以降低材料的细胞毒性，并提高材料的生物相容性。
有益效果
(1)本发明制备的聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒具有良好的基因负载效果。
(2)本发明的材料激活过程易于操作，生物相容性好，可有效刺激树突状细胞成熟。
(3)成熟的树突状细胞可有效激活T细胞，这为肿瘤的免疫治疗提供参考。
附图说明
图1为实施例1材料的结构示意图。
图2为材料的核磁图谱；
图3为材料的紫外吸收图谱；
图4为材料的透射电子显微镜图；
图5为载体与CpG ODN复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图6为载体与CpG ODN复合物的表面电势图(a)和水动力学粒径图(b)；
图7 7A-D为BMDC的1、3、5、7天相差显微镜观察图；
图8为BMDC的CD11c的流式检测结果图；
图9为BMDC流式检测图计算出的细胞纯度图；
图10为载体和载体与CpG ODN复合物对BMDC的毒性结果图；
图11为BMDC对不同浓度载体与CpG ODN复合物吞噬流式检测图；
图12为BMDC对不同浓度载体与CpG ODN复合物吞噬流式检测相对荧光强度图；
图13为载体与CpG ODN复合物刺激BMDC成熟的流式检测图；
图14为载体与CpG ODN复合物刺激BMDC成熟的流式检测平均荧光强度图；
图15为ELISA试剂盒检测三种细胞因子结果图；
图16a-b为BMDC细胞对载体与CpG ODN复合物的荧光显微镜观察活死细胞染色图；
图17为T细胞的纯度和激活度流式检测图；
图18为DC与T细胞在不同比例下激活的刺激指数；
图19为成熟BMDC激活T细胞的检测图；
图20为激活的T细胞对B16细胞杀伤检测结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取18.55mg的mPEG-COOH(分子量为2000)溶解于DMSO中，17.78mg EDC与mPEG-COOH溶液按照10:1的比例均匀混合，再加入10.67mg NHS反应3小时。将24.13mg的G5.NH2溶解于DMSO溶液按照20:1的比例充分混合，反应72小时。在上述反应的产物中按照树状大分子与金摩尔比为1:25的量加入636.78μl HAuCl4反应30分钟，再加入0.88mg NaBH4搅拌条件下反应3小时。透析3天后经冷冻干燥得到{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}，获得材料。
实施例2
分别称取5mg的材料溶解于700mL的D2O中，对溶液进行超声，然后使用核磁共振波谱仪测定材料的核磁氢谱。核磁结果如图1所示，1H NMR图谱用于表征接到G5.NH2上的碳链的个数，G5.NH2特征基团的质子峰在化学位移2.0-3.5ppm之间，在3.4-3.6ppm之间出现的质子吸收峰，说明mPEG-COOH被成功的连接到G5.NH2上，利用origin软件计算出质子峰的积分面积，得到平均每个G5.NH2表面连接大约16.9个mPEG-COOH。结果表明按照预设的目标合成了{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}。
实施例3
将材料溶解于超纯水中，配制成浓度为200μg/mL溶液，利用紫外-可见分光光度计检测在300nm-800nm波段范围内的紫外吸收值。紫外-可见分光光度检测结果如图3所示，材料中G5.NH2在520nm处左右均有吸收峰，说明纳米金颗粒被成功包裹。
实施例4
将配制好的材料水溶液(1mg/mL)滴到有碳膜的铜网表面，置于室温下干燥，制得样品。然后采用JEM-2010F型透射电子显微镜在200kV下检测样品(图4)。采用Image J软件进行测量并计算出样品尺寸，材料的颗粒尺寸平均在3nm左右。图中可看出制备的材料呈球形，分散性较好。
实施例5
实施例1制备得到的材料末端氨基定氮检测。将材料溶解于水中配制成2mg/mL的溶液，再根据初级氨基检测试剂盒(PANOPA)的实验方法测定材料的表面氨基数目。实验步骤为：从试剂1中取一粒片状药品，用3mL超纯水溶解，配成溶液1。对照组中取50μL超纯水加入溶液1充分混匀，实验组中取待测材料50μL加入溶液1充分混匀，反应3分钟后在吸光度为340nm处测量，分别记录吸光度A0和A1；再分别加入100μL溶液2充分混匀并反应15分钟，在吸光度为340nm处记录数据A2和A3。根据公式计算出样品中末端氨基氮的浓度(mg/L)。结果显示，经mPEG-COOH修饰后，末端氨基的数目为39.9。这可能是由于mPEG-COOH与氨基共价连接，从而减少PAMAM表面氨基的数目，以降低材料的毒性。
实施例6
实施例1制备得到的材料与质粒DNA的结合能力一般采用琼脂糖凝胶电泳实验进行测定。按照氮磷比为0.5，1，2，3，4，5，6制备载体与CpG ODN复合物，单独的CpG ODN作为对照。称取0.5g琼脂糖加入至50毫升Tris-硼酸电泳缓冲液(1×TBE)中混合。在微波炉中反复加热三次，每次约1分钟，直至琼脂糖溶解，且瓶中无气泡。待瓶中温度降低至50-60℃，往胶中加入4μL浓度为1mg/mL的溴化乙锭(EB)染料，摇匀倒入摆好梳子的胶槽内，等待约15分钟后拔掉梳子，准备上样。将载体与CpG ODN复合物与上样缓冲液(6×loading buffer)混匀后分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。跑胶结束后用凝胶成像仪分析CpGODN在凝胶中的迁移情况。在不同N/P条件下，每个泳道中条带的分离状况表示不同浓度的材料包裹基因的能力，图5是载体与CpG ODN复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中显示材料和CpG ODN复合物在N/P为1时观察不到明显的条带，说明材料和CpG ODN复合物没有出孔，具有较强的包裹能力，能压缩CpG ODN。
实施例7
将CpG ODN与实施例1的方法制备的材料按照不同氮磷比为分别与1μg CpG ODN共孵育得到载体与CpG ODN复合物。材料与CpG ODN复合物作为实验组，单独材料作为对照组。在室温条件下孵育30分钟后加入1毫升PBS缓冲液，然后采用激光粒度仪(Malvern,UK)测定复合物的水动力学粒径和表面电势。测试是以He-Ne为激光源，激光波长是633nm，入射角为90°，测量温度为25℃为实验条件，对复合物进行表征。结果显示，载体与CpG ODN复合物的表面电势(图6a)均为正，CpG ODN的负电荷中和了载体材料正电荷，正如图中载体与CpGODN复合物的电势分别小于载体的电势。随着氮磷比的增加，复合物的表面电势也有增加的趋势，电势范围均在正常范围内，有利于复合物和细胞间相互作用，便于载体对目的基因的传递。载体与CpG ODN复合物随着氮磷比增加，相互作用增强，粒径依次减小(图6b)。当氮磷比为2时，粒径范围处于200nm与300nm之间，此时复合物容易进入细胞，利于细胞内细胞吞噬。
实施例8
脱颈处死C57BL/6小鼠，浸入75％的酒精中2-5min，无菌手术刀取出小鼠股骨和胫骨浸泡于PBS中。在超净台上剪去股骨、胫骨两端骨骺，用无血清RPM I1640培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨头变白，1500转/min离心3min除去上清，加红细胞裂解液裂解红细胞，用RPMI1640完全培养基冲洗，然后再离心后弃去上清。RPM I1640完全培养基重悬细胞并调整浓度为1×106/mL.将细胞接种到6孔板中，按10ng/m L加入IL-4和浓度为20ng/mlGM-CSF，放37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。隔天半量换液。倒置显微镜在1、3、5、7天观察细胞形态及增殖情况(图7A-D)。第七天收集细胞上流式细胞仪通过CD11c抗体检测纯度(图8、9)。结果显示其第1、3、5、7天的形貌基本符合骨髓来源树突细胞的形貌，且通过流式细胞仪检测其表面抗体CD11c表达量为77％，可用于后续实验。
实施例9
实施例1制备得到的单独材料以及材料与CpG ODN复合物的细胞毒性检测。将第七天培养好的BMDC收集，以1×104细胞每孔的密度将BMDC细胞种于96孔板中。在含有10％FBS的200μL 1640培养基中在37℃和5％CO2条件下培养12h，换成含有50nM,100nM,500nM,1000nM,2000nM,3000nM不同浓度梯度材料的培养基，在材料与CpG ODN复合物组再加入1μgpDNA复合物继续培养24h。培养结束后，每孔加入10μL MTT(5.0mg/mL)溶液，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，用酶联免疫检测仪测量570nm波长处各孔的吸光度。图10结果显示，随着材料的浓度增加，细胞活力逐渐降低。但是载体与CpG ODN复合物在BMDC细胞内的细胞存活率明显提高，表明材料与CpG ODN复合物的细胞毒性低，有利于后续实验。
实施例10
以提取所得的小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)作为实验细胞，体外细胞吞噬实验通过流式细胞仪检测，将材料按照1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，N/P比为2，配成不同浓度的材料和CpG ODN复合物。CpG ODN为带有FAM标记的绿色荧光。将第七天培养好的BMDC收集，以1×105细胞每孔的密度将BMDC细胞种于6孔板中。在含有10％FBS的1mL 1640培养基中在37℃和5％CO2条件下培养12h，换成含有不同浓度梯度材料和CpG ODN复合物的培养基，继续培养4至6h。单独的四种浓度下等量的CpG ODN作为阴性对照，设置空白组作为空白对照。培养结束后，通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度来检测细胞对材料的吞噬，图11显示，在浓度为50μg/ml、100μg/ml时细胞吞噬结果明显增强，且图12的荧光强度也显示这结果。
实施例11
以提取所得的小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)作为实验细胞，实施例1制备得到的材料与CpG复合物来刺激BMDC成熟，通过流式细胞仪检测CD80、CD86、MHC-2的表达量来表征BMDC的成熟。以1×104细胞每孔的密度将BMDC种于12孔板中，在含有10％FBS的1mL 1640培养基中在37℃和5％CO2条件下培养12h，将材料按照1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，N/P比为2，配成不同浓度的材料和CpG ODN复合物。将培养基换成含有不同浓度梯度材料的新鲜培养基，继续培养24h，每个梯度设定3个复孔。培养结束后，收集每孔细胞，离心，去上清。加1mLPBS重悬，加5μLCD80、CD86、MHC-2抗体，4度孵育30min，PBS洗两次，通过流式细胞仪检测。图13结果显示，随着材料的浓度增加，细胞的CD80、CD86、MHC-2表达量明显增加，从而选出最佳浓度，而图13的荧光强度也表明这样的结果。同时取激活前后细胞上清通过Elisa试剂盒检测IL-6、IL-12p70、TNF-α的浓度变化，图15表明，在材料负载CpG ODN之后，上清的细胞因子IL-6、IL-12p70、TNF-α都有明显变化，都明显增强，这证明BMDC被成功激活。
实施例12
将BMDC细胞与{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}在最佳浓度下共培养24-36h之后，离心去上清，加稀释之后的100μL CAM(钙黄绿素)避光培养箱染色15min，再离心去上清，加PI室温避光染色5min，然后用荧光显微镜观察绿色染色细胞和红色染色细胞，即为活死细胞，通过观察红色细胞与绿色细胞即可知道活死细胞情况，通过观察发现绿色居多，即活细胞居多，材料在此浓度下可用于后续实验(图16a-b)。
实施例13
通过尼龙毛柱法获取T淋巴细胞，尼龙毛柱自组装。颈椎脱臼法处死C57 BL/6小鼠，无菌条件下取出其脾脏，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，尼龙毛柱法获得同种异体T细胞作为反应细胞。将上述获取的T细胞用CD3抗体对其进行标记，上流式检测。通过流式细胞仪检测结果计算其CD3荧光表达量。从而得到T细胞的纯度，并检测CD4和CD8的表达量。结果如图17所示。结果显示，其CD3的表达量达到90％，故T细胞的纯度较高，而CD4和CD8的表达量较低，故此时的T细胞为未激活的T细胞。
实施例14
将实施例13的T细胞作为反应细胞，调整密度为2×106/mL。取上述实施例8获得的DC细胞将其与上述T细胞以1:10、1:20、1:50、1:100、1:200的比例种于96孔板，两者在培养箱中共培养3-5d，培养结束后，将细胞加MTT孵育4h，孵育结束之后加100微DMSO在摇床上摇10min，在酶标仪570nm处检测吸光值，通过结果从而选出最佳比例。结果如图18所示。结果显示，成熟的BMDC可促进T细胞增殖即激活T细胞，且其BMDC与T细胞比例越大，激活效果越好。
实施例15
将上述获得的T细胞作为反应细胞，取上述方法获得的C57BL/6小鼠骨髓性未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞，两者按照最佳比例共培养3d-5d，培养结束之后利用流式检测CD3、CD4、CD8的表达量。通过其表明抗体表达量的情况可观测T细胞是否被激活，结果如图19所示，结果显示，其CD3的表达量还是有90％以上，同时，CD4和CD8的表达量相对于刚提取的结果明显增加，故两者在最佳比例下可有效促进T细胞激活。
实施例16
将实施例14中的T细胞作为杀伤细胞，培养好的处于生长指数期的B16细胞为反应细胞。B16细胞用胰酶消化，1640培养基重悬，调整其浓度为1×105。两者按照1:1的比例分别种于Transwell孔板上下室中，每孔1×105个细胞。并设置5个复孔。单独的B16细胞做阴性对照，每孔也为1×105个细胞，培养基做空白对照。在放37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养条件下共培养24h。共培养结束后，用无菌的PBS洗涤每孔3次，每孔加入10μL CCK-8(5.0mg/mL)溶液，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，用酶联免疫检测仪测量450nm波长处各孔的吸光度，结果如图20所示。结果显示，与激活的T细胞共孵育的B16活性明显下降，在1:1的共培养比例下，其活力为30％左右，故激活的T细胞对B16有明显的杀伤作用，可用于抗肿瘤实验。

Claims (8)

1.一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法，包括：
将mPEG-COOH溶解于溶剂中，通过EDC和NHS进行活化；将活化好的mPEG-COOH与G5.NH2的DMSO溶液混合，再加入氯金酸HAuCl4反应，然后加入NaBH4还原，透析、冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}；最后将{(Au0)25-G5.NH2-mPEG20}与CpG ODN按氮磷比0.5～6复合，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂为DMSO。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述EDC、NHS和mPEG-COOH的摩尔比为10:10:1-2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述mPEG-COOH与G5.NH2的摩尔比为20～25:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述mPEG-COOH中的树状大分子与氯金酸中的金的摩尔比为1:25～30。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CpG ODN的序列为5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’。
7.一种负载CpG ODN的材料刺激BMDC细胞成熟的方法，包括：
BMDC由小鼠骨髓获得，将获得的BMDC与负载CpG ODN按浓度10μg/mL-100μg/mL共培养12-36h.，最后获得的BMDC即为成熟的BMDC，通过流式细胞仪检测。
8.一种成熟BMDC激活T细胞的方法，包括：
通过尼龙毛柱法获取T淋巴细胞，将获得的T细胞与BMDC按照体积比10-200:1共培养3-5d，通过流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8的表达量。
CN201910312312.9A 2019-04-18 2019-04-18 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法 Pending CN110090204A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910312312.9A CN110090204A (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910312312.9A CN110090204A (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110090204A true CN110090204A (zh) 2019-08-06

Family

ID=67445184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910312312.9A Pending CN110090204A (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110090204A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112023061A (zh) * 2020-07-30 2020-12-04 东华大学 一种功能化树状大分子包裹金纳米颗粒/PD-L1 siRNA复合物及其制备和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1869206A (zh) * 2006-05-27 2006-11-29 大连理工大学 一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法
CN103435815A (zh) * 2013-07-11 2013-12-11 东华大学 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
CN103710388A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 东华大学 包裹纳米金颗粒的peg功能化的pamam树状大分子载体的基因转染方法
CN103789315A (zh) * 2013-11-08 2014-05-14 上海交通大学 PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用
CN107142281A (zh) * 2017-06-07 2017-09-08 东华大学 聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1869206A (zh) * 2006-05-27 2006-11-29 大连理工大学 一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法
CN103435815A (zh) * 2013-07-11 2013-12-11 东华大学 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
CN103789315A (zh) * 2013-11-08 2014-05-14 上海交通大学 PEG修饰的CpG寡核甘酸及其应用
CN103710388A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 东华大学 包裹纳米金颗粒的peg功能化的pamam树状大分子载体的基因转染方法
CN107142281A (zh) * 2017-06-07 2017-09-08 东华大学 聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李岩等: "CpG ODN 对树突状细胞抗肝癌作用的影响", 《中国病理生理杂志》 *
王闻雅等: "CpG-ODN对树突状细胞的分化成熟的影响", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112023061A (zh) * 2020-07-30 2020-12-04 东华大学 一种功能化树状大分子包裹金纳米颗粒/PD-L1 siRNA复合物及其制备和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102600462B (zh) 人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN107446019A (zh) 抗菌肽衍生物及其用途
CN103221034A (zh) 来自肿瘤组织的纳米囊泡及使用该纳米囊泡的癌症疫苗
CN109998998A (zh) 一种纳米疫苗及其制备方法
CN107142281A (zh) 聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法
CN105477630B (zh) 一种同时实现促进树突细胞迁移至淋巴结和多模式成像的方法
CN111150716A (zh) 一种普适性的抗原自递呈肿瘤疫苗及其制备方法
WO2023010777A1 (zh) 基于淋巴细胞的同源靶向性人工抗原呈递细胞及其构建和应用
CN110090204A (zh) 一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法
CN112023061B (zh) 一种功能化树状大分子包裹金纳米颗粒/PD-L1 siRNA复合物及其制备和应用
CN113663086B (zh) 一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备和应用
CN110623938B (zh) 一种mpc修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用
CN116139260A (zh) 一种wt1肿瘤疫苗及其制备方法与应用
CN114225029B (zh) 一种声敏响应的纳米颗粒及其应用
CN115040494B (zh) 一种人参皂苷修饰的共载多元复合物的多功能纳米囊泡及其制备方法和应用
CN111110866A (zh) 还原性聚谷氨酸/聚乙烯亚胺/siRNA复合纳米粒及制备与应用
CN114522247B (zh) 一种复合纳米粒及其制备方法和用途
CN105396140B (zh) 抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统及其构建方法
CN116004538A (zh) 一种搭载细胞内生成dsRNA的纳米囊泡、制备与应用
CN107574149B (zh) 一种树突状细胞的促成熟方法及其用途
CN107137702A (zh) 一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗制备方法
CN110101853B (zh) 蒲公英型异质纳米囊泡及其应用
CN115300638B (zh) 一种基于树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒的肿瘤疫苗及其制备和应用
CN113209043A (zh) 一种负载靶基因siRNA的新型胞内响应纳米粒子及其制备方法
CN111617054B (zh) 一种纳米声遗传学敏感微球及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190806

RJ01 Rejection of invention patent application after publication