CN114522247B - 一种复合纳米粒及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于制药技术领域，公开了一种复合纳米粒及其制备方法和用途。所述纳米粒包括介孔二氧化硅、三氧化二砷和聚乙二醇，所述三氧化二砷包载于所述介孔二氧化硅内部，所述聚乙二醇通过亚胺键修饰于所述介孔二氧化硅的表面。本发明利用具有蛋白吸附作用和免疫激活能力的介孔二氧化硅作为药物载体来负载三氧化二砷，并在介孔二氧化硅的表面用酸敏感的亚胺键连接亲水性的聚乙二醇，增强复合纳米粒的稳定性，实现三氧化二砷在肿瘤部位的精准释放以及介孔二氧化硅对肿瘤抗原的吸附，从而实现免疫系统的激活，进而减轻三氧化二砷的毒副作用并增强治疗效果。

Description

一种复合纳米粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种复合纳米粒及其制备方法和用途。
背景技术
三氧化二砷(Arsenic trioxide，以下简称ATO)为中药砒霜的主要有效成分，20世纪70年代，我国学者首次将ATO应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗并取得了显著疗效。随着对ATO的深入研究，人们发现ATO对肝癌等实体瘤有很好的抑制作用。ATO中砷(As)原子能显著影响许多细胞内信号转导途径，并引起细胞功能的改变，从而诱导细胞凋亡、抑制血管生成与生长从而促进分化，因此ATO也被用于多种恶性肿瘤的研究与治疗。然而ATO为剧毒药物，且将ATO应用于实体肿瘤治疗时所需的药量大于治疗血液系统的恶性肿瘤时所需剂量，也会对心、肝等器官产生毒副作用，甚至导致死亡。因此，ATO对人体产生的毒副作用是导致ATO治疗肝癌等实体瘤局限性的重要因素。目前常用的降低ATO剂量、改善其在体内分布、降低毒性的策略为制备基于ATO的纳米新剂型，旨在通过改善药物的吸收、分布、新陈代谢和排泄来减少药物不良反应。
介孔二氧化硅纳米粒(Mesoporous silica nanoparticle，以下简称MSN)，因具有热稳定性良好、比表面积巨大、表面易于修饰等一系列优点，成为目前最具代表性的介孔材料研究热点之一，被广泛应用于新型给药系统的研究中。此外，MSN与生物分子之间的相互作用，包括氢键、静电相互作用和疏水相互作用，使得它们对各种生物分子表现出很强的吸附亲和力，能够有效的吸附抗原，形成一个极佳的抗原贮库，并缓慢释放抗原，从而使免疫系统的抗原暴露时间更长，并引发更强的免疫反应。另外，MSN可以作为免疫佐剂显著提高机体的抗肿瘤免疫力，有研究证明，普通的介孔二氧化硅纳米球经皮下注射入小鼠体内后，可以有效的抑制肿瘤的产生及复发。
目前没有针对将ATO的肿瘤治疗作用和MSN的免疫激活作用相结合来降低ATO毒性并增强药效的药物递送系统的研究。
发明内容
鉴于以上现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种复合纳米粒及其制备方法和用途，以降低三氧化二砷的毒副作用，并将三氧化二砷的肿瘤杀伤作用和介孔二氧化硅的免疫激活作用相结合，增强疗效。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明的第一方面，提供一种复合纳米粒，所述纳米粒包括介孔二氧化硅、三氧化二砷和聚乙二醇，所述三氧化二砷包载于所述介孔二氧化硅内部，所述聚乙二醇通过亚胺键修饰在所述介孔二氧化硅的表面。
优选地，所述三氧化二砷、所述聚乙二醇与所述介孔二氧化硅的质量比为(3.48～10.66)：(20～30)：100。更优选地，质量比可以为(3.48～5.66)：(20～28)：100，也可以为(5.02～10.66)：(25～30)：100。在某个优选的实施方式中，为10.414：27：100。
优选地，所述复合纳米粒中三氧化二砷的载药量为2.90％～8.20％。
优选地，所述复合纳米粒中三氧化二砷的包封率为1.60％～29.0％。
优选地，所述复合纳米粒的粒径为230～310nm。
优选地，所述复合纳米粒的粒径多分散系数(PDI)为0.03～0.3。
优选地，所述复合纳米粒的表面电位为7～38mV。
本发明的第二方面，提供上文所述的复合纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
1)氨基化介孔二氧化硅与三氧化二砷溶液混合，得到反应产物；
2)将所述反应产物与甲氧基聚乙二醇醛在催化剂下进行催化反应，得到所述的复合纳米粒。
优选地，所述氨基修饰二氧化硅和所述三氧化二砷的质量比为(1～2)：(1～4)。更优选地，质量比可以为1：(1～4)，也可以为1.5：(1～4)，也可以为2：(1～4)。在某个优选的实施方式中，为2:1。
优选地，所述甲氧基聚乙二醇醛和所述三氧化二砷的质量比为(0.02～2)：1。更优选地，质量比可以为(0.02～1)：1，也可以为(0.5～1.5)：1，也可以为(1.4～2)：1。在某个优选的实施方式中，为1：1。
优选地，所述三氧化二砷溶液的浓度为0.1～4mg/mL。更优选地，可以为0.1～3mg/mL，也可以为2～3.5mg/mL，也可以为3.1～4mg/mL。在某个优选的实施方式中，为0.5mg/mL。
优选地，所述甲氧基聚乙二醇醛的分子式为CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2CHO，分子量为5000～20000KDa。更优选地，分子量为5000～10000KDa，也可以为8000～15000KDa，也可以为12000～20000KDa。在某个优选的实施方式中，为10000KDa。
优选地，所述催化剂选自醋酸、甲酸和对甲苯磺酸中一种或多种。更优选地，所述催化剂为醋酸。本发明中的催化剂提供的氢离子能使甲氧基聚乙二醇醛中的醛基质子化，更容易被氨基修饰二氧化硅中氨基含有的氮原子进攻进而发生亲核加成反应，进一步脱水形成亚胺键。
优选地，以反应产物、甲氧基聚乙二醇醛和催化剂的总体积为基准计，所述催化剂的浓度为0～0.25v/v％。
更优选地，可以为0～0.15v/v％，也可以为0.05～0.20v/v％，也可以为0.15～0.25v/v％。在某个优选实施方式中，为0.15v/v％。
优选地，步骤1)中，所述混合的温度为10～50℃。
更优选地，可以为10～30℃，也可以为20～40℃，也可以为30～50℃。在某个优选实施方式中，为25℃。
优选地，步骤1)中，所述混合的时间为1～8h。
更优选地，可以为1～5h，也可以为3～6h，也可以为5～8h。在某个优选实施方式中，为4h。
优选地，步骤1)中，混合后还包括固液分离，收集沉淀，洗涤和干燥。
更优选地，所述固液分离为离心。
更优选地，所述洗涤为采用水洗涤1～6次。较佳地，为3。
优选地，步骤2)中，所述催化反应的温度为10～80℃。
更优选地，可以为10～40℃，也可以为20～60℃，也可以为50～80℃。在某个优选实施方式中，为40℃。
优选地，步骤2)中，所述催化反应的时间为6～20h。
更优选地，可以为6～10h，也可以为8～15h，也可以为12～20h。在某个优选实施方式中，为12h。
优选地，步骤2)中，所述催化反应在溶剂中进行。更优选地，所述有机溶剂为乙醇。
优选地，步骤2)中，催化反应后还包括固液分离，收集沉淀，洗涤和干燥。
更优选地，所述固液分离为离心。
更优选地，所述洗涤为采用水洗涤1～6次。较佳地，为3。本发明中离心和洗涤为了除去未反应的甲氧基聚乙二醇醛。
优选地，所述氨基化二氧化硅的制备方法为：
在碱性条件下，模板剂、硅源和硅烷偶联剂进行水解缩合反应，得到所述的氨基化二氧化硅。
更优选地，所述模板剂选自十六烷基三甲基溴化铵。
更优选地，所述硅源选自正硅酸乙酯和正硅酸丙酯中的一种或两种。进一步优选地，所述硅源为正硅酸乙酯。
更优选地，所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲氧基硅烷和N-氨乙基-3-氨丙基二甲氧基硅烷中的一种或多种。进一步优选地，所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
更优选地，所述水解缩合反应的温度为60～90℃。
进一步优选地，可以为60～75℃，也可以为70～85℃，也可以为80～90℃。在某个优选的实施方式中，为80℃。
更优选地，所述水解缩合反应的时间为2～8h。
进一步优选地，可以为2～5h，也可以为4～7h，也可以为6～8h。在某个优选的实施方式中，为2h。
更优选地，所述水解缩合反应的pH值为11.5～12.5。
进一步优选地，为12。
更优选地，所述模板剂、硅源和硅烷偶联剂的质量比为1：(0.93～5.6)：(0.47～2.8)。进一步优选地，可以为1：(0.93～3)：(0.47～1.2)，也可以为1：(2～4.5)：(0.8～1.6)，也可以为1：(3.5～5.6)：(1.5～2)。在某个优选实施方式中，为1：4.65：23.7。
更优选地，所述水解缩合反应后，还包括去除模板剂的步骤；所述去除模板剂的方法为：将水解缩合反应产物与含有酸的醇溶液混合。
进一步优选地，所述含有酸的醇溶液为由酸和醇的混合物，所述酸为盐酸，所述醇为乙醇，所述酸和所述醇的体积比为1：(80～120)。在某个优选的实施方式中，体积比为1：100。
进一步优选地，所述混合时的温度为60～120℃。较佳地，可以为60～90℃，也可以为80～110℃，也可以为100～120℃。在某个优选的实施方式中，为80℃。
在某个优选实施方式中，将模板剂溶于水中，然后与硅源和硅烷偶联剂加热进行水解缩合反应，固液分离，收集沉淀，去除沉淀中的模板剂，离心，洗涤，冻干，获得所述氨基化介孔二氧化硅。
本发明的第三方面，提供如上文所述的复合纳米粒或上文所述的制备方法获得的复合纳米粒在制备抗肿瘤药物和/或免疫联合制剂中的用途。
本发明中硅源和硅烷偶联剂在模板剂下，得到氨基化介孔二氧化硅(NH2-MSN)，并负载剧毒化疗药物三氧化二砷(ATO)，通过在介孔二氧化硅表面采用具有酸响应的亚胺键连接无毒无免疫原性的聚乙二醇(Polyethylene glycol，以下简称PEG)，构建获得对pH敏感的复合纳米粒。本发明的复合纳米粒的生物相容性更高，能有效阻止复合纳米粒在到达肿瘤部位前的非特异性蛋白吸附。本发明的复合纳米粒的将酸刺激响应释药和介孔二氧化硅的免疫激活能力结合，减少药物的提前泄露，增加病灶处药物的积累，实现肿瘤部位免疫细胞的激活，进一步增强药物的治疗效果，其作为肿瘤微环境响应性载体在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明利用具有蛋白吸附作用和免疫激活能力的MSN作为药物载体负载剧毒化疗药物ATO，并在其表面用酸敏感的亚胺键连接亲水性的PEG，增强复合纳米粒的稳定性。本发明的复合纳米粒在纯水中静置15d后，粒径多分散系数(PDI)始终保持在0.2以下，极其稳定。
2)本发明的复合纳米粒是将酸刺激响应释药和介孔二氧化硅的免疫激活能力结合，有效避免药物在到达肿瘤部位前的提前泄露，具有良好的酸响应释药能力，能实现ATO在肿瘤部位的精准释放。
3)本发明的复合纳米粒通过具有酸敏感的亚胺键修饰有PEG，能有效避免对血液中蛋白的非特异性吸附以及避免被巨噬细胞吞噬清除，且能够有效吸附肿瘤部位肿瘤细胞死亡后释放的抗原，从而刺激机体产生更强的免疫激活效果，进而减轻ATO的毒副作用并增强治疗效果。
4)本发明的复合纳米粒在肿瘤酸性微环境下PEG基团会发生断裂，有助于肿瘤细胞对复合纳米粒的摄取，说明本发明的复合纳米粒具有很好肿瘤细胞杀伤能力。
附图说明
图1显示为本发明的实施例4中NH2-MSN和PEG-MSN的粒径分布、粒径多分散系数(PDI)和电位图。
图2显示为本发明的实施例4中PEG-MSN@ATO的稳定性实验结果图。
图3显示为本发明的实施例4中NH2-MSN和PEG-MSN的透射电镜图。
图4显示为本发明的实施例4中NH2-MSN和PEG-MSN的红外光谱图。
图5显示为本发明的实施例4中NH2-MSN和PEG-MSN的热重分析图。
图6显示为本发明的实施例5中PEG-MSN@ATO和NH2-MSN@ATO在不同pH条件下的体外释放曲线图。
图7显示为本发明的实施例6中NH2-MSN和PEG-MSN对血浆蛋白的吸附实验结果图。
图8显示为本发明的实施例6中NH2-MSN和PEG-MSN对肿瘤抗原的吸附实验结果图。
图9显示为本发明的实施例7中激光共聚焦显微镜观察RAW 264.7细胞对NH2-MSN和PEG-MSN的摄取实验结果图。
图10显示为本发明的实施例8中Raw 264.7对PEG-MSN和NH2-MSN的摄取实验结果图。
图11显示为本发明的实施例8中H22细胞对PEG-MSN和NH2-MSN的摄取实验结果图。
图12显示为本发明的实施例9中分别与PBS、NH2-MSN、NH2-MSN+TA共孵育24h后的树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的表达情况图。其中，A图代表PBS组；B图代表NH2-MSN组；C图代表NH2-MSN+TA组。
图13显示为本发明的实施例9中树突状细胞分别和PBS、NH2-MSN和TA+NH2-MSN共孵育24h后的CD80和CD86表达阳性的树突状细胞比例的柱状图。
图14显示为本发明的实施例10中不同浓度的ATO、PEG-MSN@ATO(pH7.4)、PEG-MSN@ATO(pH6.5)分别和H22细胞共孵育24h后的细胞存活率曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请的下述实施例中：
正硅酸乙酯(Tetraethyl orthosilicate，TEOS)，化学纯。
3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)，化学纯。
十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB)，化学纯。
甲氧基聚乙二醇醛(Methoxy polyethylene glycol formaldehyde，mPEG-CHO)，购买自上海凌峰化学试剂有限公司，分子结构是CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2CHO，KDa＝10000。
实施例1氨基化介孔二氧化硅纳米粒(NH2-MSN)的制备
本实施例中，考察硅源TEOS和硅烷偶联剂APTES的用量对氨基化介孔二氧化硅纳米粒(NH2-MSN)的粒径、PDI及表面电位的影响。具体步骤如下：
CTAB溶液的制备：称取CTAB粉末0.1g溶于48mL超纯水中，在50℃油浴条件下加热搅拌使其溶解，制得浓度为0.055mM的CTAB溶液。
待48mL的0.055mM的CTAB溶液温度升到70℃时，向其中快速滴加TEOS和APTES的混合液，在80℃搅拌条件下反应2h。反应结束后，冷却，离心去上清，收集底部沉淀，将其分散在含浓盐酸(质量分数为37％)的酸性乙醇((EtOH:HCL)＝100:1(v/v))中，并在80℃搅拌条件下回流12h，以除去其中的模板剂CTAB。回流结束后，于13000rpm离心10min收集产物，并用乙醇和超纯水各洗涤三遍，冻干，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒，标记为NH2-MSN。TEOS和APTES共分为6个添加量，对应形成6组，分别为1#组，TEOS为0.1mL和APTES为0.05mL；2#组，TEOS为0.2mL和APTES为0.10mL；3#组，TEOS为0.3mL和APTES为0.15mL；4#组，TEOS为0.4mL和APTES为0.20mL；5#组，TEOS为0.5mL和APTES为0.25mL；6#组，TEOS为0.6mL和APTES为0.30mL。
在本实施例中，不同TEOS和APTES的用量对得到的NH2-MSN的粒径、粒径多分散系数及表面电位影响如表1所示。
表1
如表1所示，不同TEOS和APTES的添加量得到的NH2-MSN的粒径为203.840～281.271nm，粒径多分散系数为0.090～0.252，表面电位为17.443～46.867mV。当TEOS和APTES的用量从0.1mL、0.05mL分别增长至0.6mL、0.3mL时，NH2-MSN的粒径略有增长，但表面电位有显著增加，表明表面修饰的氨基数量显著增加；当TEOS和APTES的用量分别为0.5mL和0.25mL时(即组5#)，NH2-MSN的表面电位最大，且粒径较小，因此为TEOS和APTES的用量分别为0.5mL和0.25mL为最佳添加量。
本申请的后续实施例中，均采用组5#制备氨基化介孔二氧化硅纳米粒(NH2-MSN)进行研究。
实施例2复合纳米粒(PEG-MSN@ATO)的制备
本实施例中，采用实施例1中组5#制备的氨基化介孔二氧化硅纳米粒(NH2-MSN)负载三氧化二砷得到NH2-MSN@ATO，然后采用甲氧基聚乙二醇甲醛(mPEG-CHO)与NH2-MSN@ATO反应，得到复合纳米粒(PEG-MSN@ATO)；采用实施例1中组5#制备的氨基化介孔二氧化硅纳米粒(NH2-MSN)与甲氧基聚乙二醇甲醛(mPEG-CHO)反应，得到聚乙二醇修饰介孔二氧化硅纳米粒(PEG-MSN)，具体步骤如下：
1、制备复合纳米粒(PEG-MSN@ATO)
(1)ATO溶液的制备：称取一定量的ATO粉末溶于pH值为12的NaOH溶液，待ATO完全溶解后，用浓盐酸调pH至中性，再加入超纯水调节ATO溶液至一定的体积，使得ATO的浓度为0.5mg/mL。
(2)NH2-MSN@ATO的制备：称取实施例1中组5#得到的5mg NH2-MSN，超声使其均匀分散在本实施例中步骤(1)得到的5mL ATO溶液中，室温下磁力搅拌4h后，离心收集上清液A，以除去游离ATO并用于后续游离ATO浓度检测，同时收集沉淀A，用超纯水洗涤3次，干燥后得氨基化介孔二氧化硅负载三氧化二砷纳米粒，标记为NH2-MSN@ATO。
(3)PEG-MSN@ATO的制备：称取本实施例中步骤(2)得到的5mg的NH2-MSN@ATO，超声使其分散在5mL无水乙醇中，再称取5mg mPEG-CHO，加热使mPEG-CHO溶解后，加入醋酸作为催化剂，醋酸的终浓度见表2，然后分别于40℃搅拌12h，离心分别收集上清液B和沉淀B，沉淀B用纯水洗涤3次，除去未反应的mPEG-CHO，干燥后得复合纳米粒，标记为PEG-MSN@ATO。
在本实施例中，催化剂醋酸的终浓度对PEG-MSN@ATO的粒径、粒径多分散系数及表面电位的影响如表2所示。
表2
从表2可知，mPEG-CHO和NH2-MSN反应后，NH2-MSN表面的氨基会和mPEG-CHO含有的醛基反应形成亚胺键，从而使得复合纳米粒表面的正电荷大大降低。当醋酸的终浓度为0.15v/v％时，反应最完全，因此可以确定醋酸的终浓度为0.15％时最佳。本发明后续实施例中均采用的是醋酸终浓度为0.15v/v％时，制备得到的复合纳米粒(PEG-MSN@ATO)。
2、制备聚乙二醇修饰介孔二氧化硅纳米粒(PEG-MSN)
制备聚乙二醇修饰介孔二氧化硅纳米粒(PEG-MSN)，包括如下步骤：
称取实施例1中组5#得到的5mg NH2-MSN，超声使其分散在5mL无水乙醇中，再称取5mg mPEG-CHO，加热使mPEG-CHO溶解后，加入醋酸作为催化剂，醋酸的终浓度为0.15wt％，然后分别于40℃搅拌12h，离心收集沉淀，并用纯水洗涤3次，除去未反应的mPEG-CHO，干燥后得聚乙二醇修饰介孔二氧化硅纳米粒，标记为PEG-MSN。
实施例3复合纳米粒(PEG-MSN@ATO)的载药量和包封率的检测
在本实施例中，考察不同浓度的ATO对载药量和包封率的影响，PEG-MSN@ATO的制备方法同实施例2。包括如下步骤：
(1)上清液收集：将实施例2中步骤(2)中的上清液A、(3)得到的上清液B合并混合，精密量取其体积，用超纯水稀释数倍后，取10mL过0.22μm的滤膜，得到滤液。
(2)ICP-AES检测：取5mL本实施例中步骤(1)的滤液用电感耦合等离子体发射光谱仪检测其中的As浓度，进一步换算成其中游离ATO的含量，按公式计算包封率(Encapsulation Efficiency，EE)和载药量(Loading Efficiency，LE)，
EE(％)＝(W1-W2)/W1×100％
LE(％)＝(W1-W2)/Wn×100％，
式子中，W1—加入的ATO的总质量；
W2—游离ATO的质量；
Wn—复合纳米粒的总质量。
测定条件为：
高频发生器频率：27.12MHz；RF功率：1150W；冷却气流量：1.0L/min；辅助气流量：0.5L/min；载气流量：0.5L/min；垂直观测高度：15.0mm；冲洗泵速：50rmp/min；分析泵速：50rmp/min；泵稳定时间：5s；冲洗时间30s；积分时间：短波15s；长波5s。标准溶液为美国SPEX多元素混标液(1000μg/mL)。
本实施例中，不同浓度的ATO对载药量和包封率的影响结果见下表3。
表3
如表3所示，复合纳米粒的载药量为2.90％～8.20％，包封率为1.60％～29.0％，当ATO浓度为0.5mg/mL时，复合纳米粒的载药量最大，所以确定ATO浓度为0.5mg/mL时为最佳。
实施例4 NH2-MSN、PEG-MSN和PEG-MSN@ATO的表征
本实施例中，对实施例1得到的NH2-MSN、实施例2得到PEG-MSN和PEG-MSN@ATO进行粒径、粒径多分散系数、表面电位、红外光谱、透射电镜、热重分析等表征。包括如下：
图1为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN的粒径分布、粒径多分散系数(PDI)和表面电位图。其中，图A为NH2-MSN和PEG-MSN的粒径分布图；图B为NH2-MSN和PEG-MSN的粒径多分散系数图；图C为NH2-MSN和PEG-MSN的表面电位图。
从图1可知，当MSN表面被PEG修饰以后其粒径相对于被氨基修饰后的粒径略有增长，但PDI有所下降，表面电位显著下降，证明PEG成功修饰在MSN表面。
将PEG-MSN@ATO分散在超纯水中，使其终浓度分别为0.5mg/mL，室温下静置，每隔一天取1mL粒溶液用马尔文粒度仪测试复合纳米粒的粒径和粒径多分散系数(PDI)，以考察PEG-MSN@ATO在水中的稳定性。
图2为本实施例中PEG-MSN@ATO在水中的稳定性实验结果图。其中，图A为PEG-MSN@ATO的粒径分布图；图B为PEG-MSN@ATO的粒径多分散系数图。
从图2可知，PEG-MSN@ATO在纯水中静置15d后粒径略有增长，粒径多分散系数(PDI)始终保持在0.2以下，较为稳定。
图3为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN的透射电镜图。其中，图A为NH2-MSN的透射电镜图；图B为PEG-MSN的透射电镜图。
从图3可知，NH2-MSN为表面光滑的球形；经mPEG-CHO修饰之后的PEG-MSN，由于PEG长链的存在，表面变得模糊。
分别称取1～2mg NH2-MSN以及1～2mg的PEG-MSN粉末，将它们分别和溴化钾按照1：100的质量比混合均匀后，研磨压片，用红外光谱仪进行检测。
图4为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN的红外光谱图。
从图4可知，NH2-MSN可以观察到1507cm-1处的峰，为N-H的特征峰，经PEG修饰后，PEG-MSN可以观察到2898cm-1处C-H的特征峰，及1650cm-1处C＝N的特征峰，证明PEG已通过亚胺键被成功连接在NH2-MSN纳米粒表面。
图5为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN的热重分析图。
从图5可知，NH2-MSN的失重率达到22.27％；修饰PEG后，PEG-MSN的失重率达到37.82％，从而推算出PEG基团的质量占PEG-MSN总质量的27.11％。
实施例5体外药物释放实验
本实施例中，以实施例2中步骤(2)得到的NH2-MSN@ATO和步骤(3)得到的PEG-MSN@ATO为研究对象，进行体外释放实验研究。包括如下：
分为3组，第一组为NH2-MSN@ATO的药物释放实验在pH值为7.4，第二组为PEG-MSN@ATO的药物释放实验的pH值为7.4，第三组为PEG-MSN@ATO的药物释放实验的pH值为6.5，每组设3个平行样品。
取分别称取5mg的NH2-MSN@ATO和5mg的PEG-MSN@ATO分散于5mL对应pH的PBS中，得到分散液，吸取1mL分散液置于透析袋中，将透析袋转移至50mL pH相同的PBS中。然后置于37℃恒温磁力搅拌器上，调节转速为100rpm，在不同时间点吸取1mL透析外液，并补充1mLPBS。用ICP-AES检测透析外液中的ATO含量，并计算释放率。
图6为本实施例中PEG-MSN@ATO和NH2-MSN@ATO在不同pH条件下的体外释放曲线图。
从图6可知，在pH 7.4的条件下，PEG-MSN@ATO的药物释放速率显著慢于在pH 6.5的条件下的药物释放速率，同时也低于NH2-MSN@ATO的释放速率，说明制备的复合纳米粒能有效避免药物ATO在到达肿瘤部位前的泄露，并具有良好的酸响应释药能力。
实施例6 NH2-MSN和PEG-MSN在体外对血浆蛋白和肿瘤抗原的吸附实验
本实施例中，以实施例1得到的NH2-MSN和实施例2得到的PEG-MSN为研究对象，进行体外对血浆蛋白和肿瘤抗原的吸附实验研究。包括如下：
(一)血浆蛋白的吸附实验研究
NH2-MSN和PEG-MSN分别分散在PBS中制成浓度为1mg/mL的NH2-MSN溶液和1mg/mL的PEG-MSN溶液。FBS(胎牛血清蛋白)用PBS稀释至浓度为0.5mg/mL的FBS溶液。模拟正常生理条件下(即pH值为7.4下)，将1mL 0.5mg/mL的FBS溶液分别与1mL1mg/mL的NH2-MSN和1mL1mg/mL的PEG-MSN混合后于37℃培养箱中孵育24h后，离心，取上清液。用BCA试剂盒(购买于碧云天)测试上清液中蛋白浓度。吸附前后上清液中蛋白含量的差值即为纳米粒对蛋白的吸附量。
图7为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN对血浆蛋白的吸附实验结果图。
从图7可知，PEG-MSN对血浆蛋白的吸附量显著少于NH2-MSN对血浆蛋白的吸附量，说明制备的PEG-MSN能有效避免对血液中蛋白的非特异性吸附。
(二)肿瘤抗原的吸附实验研究
采用液氮反复冻融法制备肿瘤抗原，收集对数生长期的H22细胞，并用PBS洗涤3次后，用PBS将其浓度调节为106个/mL，得到细胞悬液；取1mL细胞悬液于1.5mL离心管中，封口，于液氮中冷冻5min后取出，置于37℃水浴中解冻5min，反复3次后，2000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌后即为肿瘤冻融抗原。
取0.5mL制备的肿瘤冻融抗原，将其分别与NH2-MSN和PEG-MSN溶液在37℃培养箱中混合孵育24h，离心，得到上清液。采用BCA试剂盒(购买于碧云天)测上清中蛋白浓度，计算纳米粒的吸附量。
图8为本实施例中NH2-MSN和PEG-MSN对肿瘤抗原吸附实验的结果图。
从图8可知，在模拟的肿瘤酸性微环境中，PEG-MSN对肿瘤抗原的吸附效果与NH2-MSN的吸附效果接近，说明制备的PEG-MSN具有明显的酸响应效应，能够有效吸附肿瘤部位肿瘤细胞死亡后释放的抗原。
实施例7激光共聚焦显微镜观察RAW 264.7细胞对纳米粒的摄取
本实施例中，以实施例1得到的NH2-MSN和实施例2得到的PEG-MSN为研究对象，进行RAW 264.7细胞对纳米粒的摄取研究。包括如下：
(1)NH2-MSN和PEG-MSN的荧光标记
分别将5mg NH2-MSN和PEG-MSN粉末分散在5mL无水乙醇中，然后向其中加入0.8mgFITC粉末并使其充分溶解，接着在室温下避光搅拌反应24h后，12000rpm，离心10min，弃上清，将沉淀物用无水乙醇洗涤至上清无色，真空干燥，即分别得到FITC标记的NH2-MSN和FITC标记的PEG-MSN。
(2)细胞给药
取灭菌的12孔板，准备6个孔，分成2组，分别为RAW 264.7-NH2-MSN组、RAW264.7-PEG-MSN组，每组3个复孔。
收集对数生长期的RAW 264.7，用RPMI 1640完全培养基调节浓度为105个/mL后，接种于灭菌的12孔细胞培养板，每孔1mL，将培养板置于培养箱中培养2h，离心弃旧细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，将其重悬于无血清培养基(也即RPMI 1640培养基)中，饥饿1h。将NH2-MSN和PEG-MSN分别分散在含血清的RPMI 1640培养基中制成浓度均为50μg/mL的RPMI 1640完全培养基，然后将RAW 264.7细胞和含NH2-MSN和PEG-MSN的完全培养基在培养箱中孵育2h后取出，在避光条件下进行后续操作。
RPMI 1640完全培养基：由10％的胎牛血清(FBS)、1％的双抗和89％的无血清的RPMI1640完全培养基配制成，以上材料均购买于Adamas life。
(3)激光共聚焦显微镜观察
镜下观察：1)去除旧培养基，PBS清洗3次；
2)加入4％多聚甲醛500μL，室温下固定细胞15min；
3)去除多聚甲醛，PBS清洗3次；
4)将RAW 264.7细胞爬片倒扣在滴加了含DAPI的抗荧光淬灭液的载玻片上，用无色指甲油封片；
5)激光共聚焦扫描显微镜下观察。
图9为本实施例中激光共聚焦显微镜观察RAW 264.7细胞对NH2-MSN和PEG-MSN的摄取实验结果图。
从图9可知，与NH2-MSN相比，PEG-MSN被RAW 264.7细胞的摄取率显著下降，说明PEG的修饰能够有效避免纳米粒被免疫系统清除。
实施例8 Raw 264.7和H22细胞对复合纳米粒的摄取研究
本实施例中，以实施例1得到的NH2-MSN和实施例2得到的PEG-MSN为研究对象，进行Raw 264.7细胞和H22细胞对NH2-MSN和PEG-MSN的摄取研究。包括如下：
FITC标记的NH2-MSN和FITC标记的PEG-MSN的制备方法同实施例7中步骤(1)。
取灭菌的12孔板，准备21个孔，分成7组，其中5个实验组、1个RAW 264.7-空白组和1个H22-空白组，5个实验组分别为RAW 264.7-NH2-MSN(pH 7.4)组、RAW 264.7-PEG-MSN(pH7.4)组、H22-NH2-MSN(pH 7.4)组、H22-PEG-MSN(pH 7.4)组、H22-PEG-MSN(pH 6.5)组，每组3个复孔。细胞分别为Raw 264.7和H22。
向孔中接种1mL细胞密度约为105个/mL的细胞液，培养箱中培养2h后，离心弃旧细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，将其重悬于无血清培养基(也即RPMI 1640培养基)中，饥饿1h后，向实验组加入FITC标记的NH2-MSN和FITC标记的PEG-MSN(纳米粒浓度均为50μg/mL)的RPMI 1640完全培养基1mL，空白组加入等量去血清培养液，培养箱中孵育1h后取出。移除培养基，PBS清洗3次，离心收集细胞，移除上清液，PBS清洗3次，最后重悬于500μL PBS中，用流式细胞仪FITC通道检测细胞摄取情况。
图10为本实施例中Raw 264.7对PEG-MSN和NH2-MSN的摄取实验结果图。
从图10可知，与PEG-MSN共孵育后的阳性率相比，RAW 264.7细胞和NH2-MSN共孵育后的FITC阳性率显著增高，表明PEG的修饰能有效避免复合纳米粒被巨噬细胞的吞噬清除。
图11为本实施例中H22细胞对PEG-MSN和NH2-MSN的摄取实验结果图。
从图11可知，H22细胞在模拟肿瘤酸性微环境(pH 6.5)下和PEG-MSN共孵育后的FITC阳性率显著高于在正常生理条件(pH 7.4)下和PEG-MSN共孵育后阳性率。
从图10和图11可知，制备的PEG-MSN在肿瘤酸性微环境下PEG基团会发生断裂，有助于肿瘤细胞对纳米粒的摄取。
实施例9树突状细胞的体外激活实验
本实施例中，以实施例1中得到的NH2-MSN为研究对象，进行在体外刺激树突状细胞的研究。包括如下：
(一)树突状细胞的制备
采用Lutz细胞制备骨髓来源的树突状细胞。
(1)第0天：选取6-8周龄的雄性C57BL/6J一只，以颈椎脱臼法处死，浸没在75％酒精中消毒3min。在生物安全柜中，将小鼠的腹部朝上置于解剖台，用剪刀小心地剪开腿部皮毛，取出股骨和胫骨，用剪刀和镊子将腿骨外面的肌肉组织清理干净，腿骨置于预冷的无血清培养基中。
(2)在股骨和胫骨的关节连接处将两骨分开，剪去两骨的两端，露出骨髓腔，用1mL注射器吸取培养基后冲洗骨髓腔，反复冲洗4-6遍直至骨头变白。
(4)将细胞稍作吹打，单细胞悬液，通过70μm的细胞筛过滤掉骨渣，肌肉等，培养基800rpm离心5min，弃上清得到骨髓细胞。
(5)将获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×105个/mL；
(6)将BMDC铺至100mm细菌培养皿中，每皿10mL细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF，使其终浓度为20ng/mL，在37℃，5％CO2培养箱中培养；
(7)第3天，向培养皿中再加入10mL含20ng/ml重组小鼠GM-CSF的完全培养液；
(8)第6天和第8天分别半量换液，即收集旧培养液，高心后用含20ng/ml重组小鼠GM-CSF的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿；
(9)第10天即可收集细胞，即为骨髓来源的树突状细胞，标记为BMDC。
(二)细胞给药
取灭菌的6孔板，准备15个孔，分为3个组，分别为NH2-MSN组、NH2-MSN+TA组(TA为肿瘤抗原(tumor antigen，TA))、PBS组，每组3个复孔。其中NH2-MSN+TA为NH2-MSN吸附TA制备而成，制备方法为先采用反复冻融法获得TA，将NH2-MSN和TA于37℃条件下孵育24h后离心，收集纳米粒并用PBS洗涤3次即得吸附TA的NH2-MSN。
将本实施例中步骤(一)得到的BMDC接种在6孔板中，每孔接种1×106个，按分组加入NH2-MSN、NH2-MSN+TA(终浓度均为10μg/mL)、PBS，将细胞置于37℃培养箱中孵育24h。孵育结束后，将细胞用anti-CD11c-PerCP-Cy5.5、anti-CD80-FITC、anti-CD86-PE染色，然后用流式细胞仪分析树突状细胞的激活情况，进而分析成熟情况。树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的上调是BMDC成熟的标志。
图12为本实施例中分别与PBS、NH2-MSN、NH2-MSN+TA共孵育24h后的树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的表达情况图。其中，A图代表PBS组；B图代表NH2-MSN组；C图代表NH2-MSN+TA组。
从图12可知，PBS组(A组)的树突状细胞由于未经刺激，故仅11.8％的树突状细胞在Q2象限(即CD80、CD86均表达阳性)，呈现成熟状态；NH2-MSN组(B组)的树突状细胞有20.5％在Q2象限，呈现成熟状态；NH2-MSN+TA组(C组)的树突状细胞有39.4％在Q2象限，呈现成熟状态。综合表明，NH2-MSN和树突状细胞共同孵育后能够有效激活树突状细胞，且NH2-MSN吸附肿瘤抗原后激活效果更好，说明制备的复合纳米粒在吸附了肿瘤抗原后能够有效激活树突状细胞发挥疗效。
按照Q2象限中细胞数量占细胞总数的比例为CD80和CD86表达阳性的细胞比例进行统计。
图13为本实施例中树突状细胞分别和PBS、NH2-MSN和TA+NH2-MSN共孵育24h后的CD80和CD86表达阳性的树突状细胞比例的柱状图。
从图13可知，与NH2-MSN和TA+NH2-MSN孵育后的BMDC表面CD80和CD86表达均上调，即BMDC成熟率增加，其中和TA+NH2-MSN共孵育后的BMDC成熟率增加更为显著，意味着MSN吸附肿瘤细胞死亡产生的抗原后对机体会产生更强的免疫激活效果。
实施例10 PEG-MAN@ATO对H22细胞的体外有效性实验
本实施例中，以实施例2步骤(2)得到的NH2-MSN@ATO和步骤(3)得到的PEG-MSN@ATO，进行H22细胞对纳米粒的摄取研究。包括如下：
取灭菌的96孔板，准备9个孔，分为3组，分别为ATO组、PEG-MSN@ATO(pH 7.4)组、PEG-MSN@ATO(pH 6.5)组，每组平行3个复孔。收集对数生长期的H22细胞，用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为1×105个/ml，每孔接种0.1mL，分别向其中加入ATO、NH2-MSN@ATO、PEG-MSN@ATO，以ATO的含量计，各组的浓度梯度为2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL和4.5mg/mL。一起孵育24h后，每孔分别加入20μL CCK8工作液，然后将细胞培养板置于培养箱中孵育30min，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
图14为本实施例中ATO、PEG-MAN(pH 7.4)、PEG-MAN(pH 6.5)分别和H22细胞共孵育24h后的细胞存活率曲线图。
从图14可知，模拟肿瘤酸性微环境下，即pH值为6.5的PEG-MSN@ATO对肿瘤细胞的杀伤效果与游离ATO杀伤效果相同，而正常生理pH下的PEG-MSN@ATO对肿瘤细胞的杀伤效果较弱，说明制备的复合纳米粒具有很好的酸响应释药效果和肿瘤细胞杀伤能力。
本发明以多孔结构的介孔二氧化硅(MSN)为载体材料，静电吸附作用负载三氧化二砷(ATO)，通过具有酸敏感的亚胺键连接无毒无免疫原性的聚乙二醇，构建了一种pH值相应的复合纳米粒，其在到达肿瘤部位前易对血液中的蛋白进行非特异性吸附，同时具有较高的生物相容性。本发明的复合纳米粒的将酸刺激响应释药和介孔二氧化硅的免疫激活能力结合，减少药物的提前泄露，增加病灶处的药物积累，实现肿瘤部位免疫细胞的激活，进一步增强药物的治疗效果，其作为肿瘤微环境响应性载体在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种复合纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的原料由氨基化介孔二氧化硅、三氧化二砷和甲氧基聚乙二醇醛组成，所述三氧化二砷包载于所述氨基化介孔二氧化硅内部，所述甲氧基聚乙二醇醛通过亚胺键修饰于所述氨基化介孔二氧化硅的表面；所述氨基化介孔二氧化硅和所述三氧化二砷的质量比为(1～2)：(1～4)，所述甲氧基聚乙二醇醛和所述三氧化二砷的质量比为(0.02～2)：1。
2.如权利要求1所述的复合纳米粒，其特征在于，所述复合纳米粒中三氧化二砷的载药量为2.90％～8.20％；
和/或，所述复合纳米粒中三氧化二砷的包封率为1.60％～29.0％。
3.如权利要求1或2所述的复合纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)氨基化介孔二氧化硅与三氧化二砷溶液混合，得到反应产物；
2)将所述反应产物与甲氧基聚乙二醇醛在催化剂下进行催化反应，得到所述的复合纳米粒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：A1)所述氨基化介孔二氧化硅和所述三氧化二砷的质量比为(1～2)：(1～4)；
A2)所述甲氧基聚乙二醇醛和所述三氧化二砷的质量比为(0.02～2)：1；A3)所述三氧化二砷溶液的浓度为0.1～4mg/mL；
A4)所述催化剂选自醋酸、甲酸和对甲苯磺酸中一种或多种；
A5)以反应产物、甲氧基聚乙二醇醛和催化剂的总体积为基准计，所述催化剂的浓度为0～0.25v/v％。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：B1)所述混合的温度为10～50℃；
B2)所述混合的时间为1～8h；
B3)所述甲氧基聚乙二醇醛的分子量为5000～20000KDa；
B4)所述催化反应的温度为10～80℃；
B5)所述催化反应的时间为6～20h。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基化介孔二氧化硅的制备方法为：在碱性条件下，模板剂、硅源和硅烷偶联剂进行水解缩合反应，得到所述的氨基化介孔二氧化硅。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述模板剂选自十六烷基三甲基溴化铵；
和/或，所述硅源选自正硅酸乙酯和正硅酸丙酯中的一种或两种；
和/或，所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-氨乙基-3-氨丙基二甲氧基硅烷中的一种或多种；
和/或，所述水解缩合反应的温度为60～90℃；
和/或，所述水解缩合反应的时间为2～8h；
和/或，所述水解缩合反应的pH值为11.5～12.5；
和/或，所述模板剂、硅源和硅烷偶联剂的质量比为1：(0.93～5.6)：(0.47～2.8)。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述水解缩合反应后还包括去除模板剂的步骤；所述去除模板剂的方法为：将水解缩合反应产物与含有酸的醇溶液混合。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有酸的醇溶液为酸和醇的混合物，所述酸为盐酸，所述醇为乙醇，所述酸和所述醇的体积比为1：(80～120)。
10.如权利要求1或2所述的复合纳米粒在制备抗肿瘤药物和/或免疫联合制剂中的用途。
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