CN112957461A - 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 - Google Patents
一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112957461A CN112957461A CN202110141555.8A CN202110141555A CN112957461A CN 112957461 A CN112957461 A CN 112957461A CN 202110141555 A CN202110141555 A CN 202110141555A CN 112957461 A CN112957461 A CN 112957461A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- vaccine
- ampf
- cells
- polypeptide vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 279
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 252
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 249
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 237
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 67
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 55
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 21
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 16
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 6
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 6
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 4
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 claims 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 claims 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 claims 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 claims 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 claims 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 claims 1
- 238000013230 female C57BL/6J mice Methods 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 claims 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 claims 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 claims 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 46
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 12
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 abstract description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 abstract description 2
- SHINASQYHDCLEU-BKLSDQPFSA-N (2s)-4-aminopyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC1CN[C@H](C(O)=O)C1 SHINASQYHDCLEU-BKLSDQPFSA-N 0.000 abstract 2
- 238000001553 co-assembly Methods 0.000 abstract 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 31
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 19
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 13
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 13
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 11
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 7
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 7
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 6
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 5
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 5
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011220 combination immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940127130 immunocytokine Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- OAVCWZUKQIEFGG-UHFFFAOYSA-O 2-(5-methyl-2H-tetrazol-1-ium-1-yl)-1,3-thiazole Chemical compound CC1=NN=N[NH+]1C1=NC=CS1 OAVCWZUKQIEFGG-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126533 immune checkpoint blocker Drugs 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000011332 tumor tissue staining Methods 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/19—Dichroism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/22—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material
- G01N23/2202—Preparing specimens therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/22—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material
- G01N23/2206—Combination of two or more measurements, at least one measurement being that of secondary emission, e.g. combination of secondary electron [SE] measurement and back-scattered electron [BSE] measurement
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
- G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法。基于4‑氨基脯氨酸五肽的结构特征，合成了HPV E7抗原肽功能化的五肽衍生物，通过共组装制备得到。同时，将4‑氨基脯氨酸替换成天然脯氨酸，通过共组装制备纳米颗粒多肽疫苗，考察疫苗形貌对疫苗免疫应答的影响。生物实验表明多肽疫苗能够成功诱导树突成熟和抗原呈递并促进T细胞增殖，具有自佐剂功能。细胞摄取实验结果表明纳米纤维多肽疫苗比纳米颗粒多肽疫苗在细胞内具有更长的保留时间，而且其在促进DC成熟，引流淋巴结，T淋巴细胞浸润肿瘤组织以及最终杀伤肿瘤细胞方面具有更优异的性能。与抗PD‑1抗体组合使用，证明了组合治疗策略可以提高纳米纤维肽疫苗治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及多肽纳米疫苗技术领域，具体涉及一种形貌可控的免疫增强型治疗HPV相关癌症的多肽疫苗的制备方法。
技术背景
免疫疗法已被证明是一种有前途的癌症治疗策略，因为它能够引起宿主被抑制的天然免疫反应，以防御和根除癌细胞。在过去的几十年中，通过利用诸如癌症疫苗，免疫佐剂，细胞因子或免疫检查点阻断剂之类的疗法来激发内部免疫细胞或直接利用工程化的嵌合抗原受体T细胞疗法，证实了基于该策略的癌症免疫疗法的治疗效果。在这些免疫疗法中，由源自病原体的抗原组成的癌症疫苗不仅能够引发免疫反应以清除已存在的癌细胞，还可以建立免疫记忆来防御进一步的感染。迄今为止，基于纳米药物递送平台的优势，已经开发了无机纳米颗粒，聚合物平台，脂质体和树状聚合物等多种材料用于制备癌症疫苗，以提高其激发免疫应答的能力。尽管癌症疫苗具有巨大的治疗潜力，但由于低免疫应答以及潜在的不良副作用(例如细胞因子释放综合征)一些癌症疫苗的临床应用受到严重阻碍。
短肽由有限数量的氨基酸残基组成，由于其出色的生物相容性和组装能力，已被广泛用于组织再生，药物递送和癌症疫苗等多个领域。在开发癌症疫苗方面，多肽可以直接与免疫疗法一起使用，也可以自组装成形态明确的纳米结构作为抗原的递送平台或免疫佐剂。与抗体相比，肽抗原易于合成，并且在稳定性和防止由病原体污染物引起的过敏或自身免疫反应方面显示出显着优势。此外，由于多肽之间可靠的非共价相互作用，短肽自组装成纳米结构或水凝胶可负载和递送其他免疫治疗剂。将具有组装倾向的肽序列与肽抗原结合，可以产生无需常规佐剂(如铝佐剂)的自佐剂疫苗。在这些多肽疫苗中，已证明疫苗的适应性免疫反应与多肽组装体密切相关。但是，多肽纳米结构的形貌对抗原疫苗的影响研究较少，因此限制了有效多肽疫苗的开发。为了解决这个问题，在此报道了形貌可控的自佐剂多肽疫苗，并阐明了纳米纤维多肽疫苗的更优异的免疫应答能力，可有效抑制与HPV相关的肿瘤。
发明内容
本发明目的是研究多肽纳米结构的形貌对抗原疫苗的影响，提供形貌可控的免疫增强型自佐剂多肽疫苗制备方法，用于HPV相关癌症的有效治疗。该多肽疫苗制备方法简单，反应条件温和，操作简便。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，
多肽AmpF，PF，E749-57，E744-57，AmpFE749-57，AmpFE744-57，PFE749-57和PFE744-57是通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)方法合成的。在制备多肽疫苗之前，首先将多肽冻干粉(AmpF，PF，AmpFE749-57，AmpFE744-57，PFE749-57和PFE744-57)溶解在水中来制备浓度为5mM的不同多肽的储备溶液。多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57是通过将多肽AmpF和AmpFE749-57或多肽AmpF和AmpFE744-57的溶液以90:10的摩尔比混合制备的，最终的总浓度为2mM。同时，按照相同的方案，以90:10的摩尔比混合多肽PF和PFE749-57或PF和PFE744-57的溶液制备多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57。同时，还制备了浓度为2mM的AmpF，PF，E749-57和E744-57的多肽溶液。在进行所有表征和生物学实验之前，将多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57的溶液均放置2天。在研究多肽疫苗自组装之前，通过记录尼罗红的最大发射波长来估算多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57，PF-E744-57的临界聚集浓度(CAC)。研究表明，多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57聚集浓度均低于10μM。
本发明制备得到的多肽疫苗的二级结构通过圆二色(CD)光谱进行了表征。多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57的CD光谱分别在193和215nm或195和213nm处显示最小或最大强度。这些信号表明多肽疫苗AmpF-E7初步形成了β-折叠构象。此外，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57的CD光谱在200和220nm处显示两个正峰，表明多肽疫苗PF-E7采用无规卷曲构象。硫黄素T(ThT)分析证实了由疫苗AmpF-E7形成的β-折叠。添加疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57后，ThT荧光发射强度分别增加了230倍和240倍。值得注意的是，多肽疫苗诱导的ThT荧光强度的增加与仅由多肽AmpF诱导的ThT荧光强度的增加相当，这意味着长抗原表位不参与AmpF结构域的自组装。相反，在ThT溶液中添加PF-E7不会引起ThT荧光的明显改善，这证实了多肽疫苗PF-E7形成了无规卷曲。
通过原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)研究了多肽疫苗的形貌。AFM图像显示多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57为纤维状，单根纤维的高度约为3nm。TEM图像证实了由多肽疫苗AmpF-E7形成的纳米纤维，单根纳米纤维的宽度约为3nm，这与AFM图像中显示的纳米纤维的高度一致。相反，AFM和TEM研究均显示，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57分别形成平均直径为100±20nm和100±10nm的纳米颗粒。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明所形成的多肽组装体具有生物兼容性、低免疫原性和生物降解性等优点。(2)本发明所有的反应条件非常温和，制备方法简单，操作简便。(3)本发明得到的多肽疫苗具有自佐剂功能，尤其是纤维状多肽疫苗具有更强的免疫增强功能，能够有效抑制HPV相关肿瘤生长。(4)本发明证实了纤维状多肽疫苗由于细胞内更长时间的滞留时间比纳米颗粒状多肽疫苗具有更好的免疫增强功能，对高效多肽疫苗的设计具有指导意义。(5)本发明制备的多肽疫苗与免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体联合使用可以进一步增强免疫治疗效果，更有效的抑制肿瘤生长。
附图说明
图1.五肽AmpF和PF，抗原肽E749-57和E744-57，含抗原表位的肽AmpFE749-57，AmpFE744-57，PFE749-57和PFE744-57，FAM标记的肽AmpF-FAM，PF-FAM，E749-57-FAM和E744-57-FAM的化学结构式。
图2.在多肽疫苗AmpF-E749-57(a)，AmpF-E744-57(b)，PF-E749-57(c)和PF-E744-57(d)中的尼罗红的最大荧光发射波长(λmax)与多肽浓度之间的函数曲线图(0.01至50μM)。
图3.(a和b)在多肽AmpF和PF(a)或肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57(b)中的ThT溶液的荧光光谱图。(c和d)在多肽AmpF和PF(c)或肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57(d)中的ThT分子在最大发射(@483nm)处的荧光强度。
图4.(a)多肽疫苗AmpF-E7(AmpF-E749-57和AmpF-E744-57)和PF-E7(PF-E749-57和AmpF-E744-57)的制备示意图。(b)多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7在pH 7.4下的CD光谱。(c-j)多肽疫苗在pH 7.4下的AFM和TEM图像，AmpF-E749-57(c，g)，AmpF-E744-57(d，h)，PF-E749-57(e，i)和PF-E744-57(f，j)。插图显示所选纳米纤维的高度或相应纳米粒子的直径分布。
图5.在五肽AmpF和PF，多肽疫苗AmpF-E749-57，PF-E749-57，AmpF-E744-57和PF-E744-57，肽抗原E749-57和E744-57的存在下培养的3T3,TC-1和DC2.4细胞的细胞活力(1：AmpF；2：PF；3：AmpF-E749-57；4：PF-E749-57；5：E749-57；6：AmpF-E744-57；7：PF-E744-57；8：E744-57)。
图6.(a，b)与FAM标记的五肽，游离抗原肽或多肽疫苗共孵育2、4、8、12、16、24小时后BMDC的流式细胞仪分析结果(a)和DC2.4细胞的CLSM图像(b)。(c)对BMDC流式细胞仪分析结果的量化。(d，e)与疫苗AmpF-E7和PF-E7共孵育2、4和8h的DC2.4细胞的CLSM图像(d)和LysoTracker与FAM信号之间的皮尔逊相关系数(e)。蓝色：被DAPI染色的细胞核；绿色，FAM标记的多肽；红色，溶酶体荧光探针。比例尺：40μm。0：PBS，1：AmpF，2：PF，3：AmpF-E749-57，4：PF-E749-57，5：E749-57，6：AmpF-E744-57，7：PF-E744-57，8：E744-57。
图7.(a)多肽疫苗刺激骨间充质干细胞(MSC)衍生的BMDC成熟以及体外CTL诱导TC-1细胞裂解的示意图。(b-d)CD86+和CD80+(b)，MHC-I(c)和MHC-II(d)在五肽AmpF和PF，游离抗原E749-57和E749-57或多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7刺激的BMDC上的表达。(e-h)用CFSE标记的T淋巴细胞的流式细胞分析结果(e)和定量统计图(f)，或将经不同多肽或疫苗预处理的BMDC与脾中T淋巴细胞共孵育后，T淋巴细胞中CD8+T细胞(g)和CD4+T细胞(h)定量统计图。(i)经预处理后的BMDC激活的T淋巴细胞与TC-1细胞共孵育后，TC-1的细胞活性定量统计。
图8.(a，c)皮下注射FAM标记的多肽，多肽疫苗和游离多肽抗原的小鼠在不同时间时体内荧光图像及荧光强度定量统计。(b，d)从注射了FAM标记的多肽，多肽疫苗和游离多肽抗原的小鼠中解剖出的脾脏(顶部)和LNs(底部)的离体荧光图像及荧光强度定量统计。(e-f)皮下注射FAM标记的多肽，多肽疫苗和游离多肽抗原48小时后的小鼠解剖出的LNs中CD4+(e)和CD8+(f)T细胞的百分比。
图9.(a)对HPV相关的TC-1肿瘤模型小鼠多肽疫苗免疫治疗的示意图。(b)用五肽，抗原肽E7，多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7治疗后，小鼠的相对肿瘤大小。(c)在使用不同治疗21天后TC-1肿瘤的代表性图像。(d)采用不同治疗方法后的小鼠的体重。(e)对浸润到肿瘤组织中的CD4+和CD8+T细胞的流式细胞分析结果图。(f，g)对浸润到肿瘤组织中的CD4+和CD8+T细胞的定量统计图。
图10.(a，b)经五肽，游离抗原肽E7，多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7处理的小鼠的脾脏中的CD4+和CD8+T细胞的定量统计图。(c)不同处理的小鼠的LNs中的TCM(CD44HiCD62L+)细胞的定量统计图。(d-e)不同处理的小鼠脾脏中的CD4+(d)或CD8+(d)T细胞相关的细胞因子IFN-γ+的定量统计图。(f-g)不同处理的小鼠眼眶血液中细胞因子IL-2(f)和TNF-α(g)的ELISA试剂盒分析结果图。(h-j)对不同处理的小鼠的肿瘤组织的H&E(h)，抗CD4+(i)或抗CD8+(j)免疫组织化学(IHC)染色的代表性图像。比例尺：50μm。
图11.(a)对HPV相关的TC-1肿瘤模型小鼠多肽疫苗和抗PD-1抗体联合免疫治疗的示意图。(b)用PBS，抗PD-1，抗原E744-57+抗PD-1，多肽疫苗PF-E744-57+抗PD-1或多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1治疗后，小鼠的相对肿瘤大小。(c)在使用不同治疗21天后TC-1肿瘤的代表性图像。(d)采用不同治疗方法后的小鼠的体重。(e)对浸润到肿瘤组织中的CD4+和CD8+T细胞的流式细胞分析结果图。(f，g)对浸润到肿瘤组织中的CD4+和CD8+T细胞的定量统计图。
(h-j)不同处理的小鼠眼眶血液中细胞因子TNF-α(h)，IL-2(i)和TNF-α(j)的ELISA试剂盒分析结果图。0：PBS；9：抗PD-1；10：E744-57+抗PD-1；11：PF-E744-57+抗PD-1；12：AmpF-E744-57+抗PD-1。(k-m)对不同处理的小鼠的肿瘤组织的H&E(k)，抗CD4+(l)或抗CD8+(m)免疫组织化学(IHC)染色的代表性图像。比例尺：50μm。
具体实施方式
下面将通过实例描述，阐述本发明的优点和效果。
多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7的合成与表征
图1为本发明实施例中所有多肽的结构式。如图2所示，在研究多肽疫苗自组装之前，通过记录尼罗红的最大发射波长来估算多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57，PF-E744-57的临界聚集浓度(CAC)。本发明基于尼罗红最大发射波长随着所处微环境疏水性变化而变化的原理，尼罗红被用作荧光探针，将尼罗红乙醇溶液(2μL 100μM)加入到不同浓度的每种多肽(2mL)中，并孵育过夜以进行测量。设置激发波长为550nm，激发和发射光源的狭缝宽度为10nm，用荧光分光光度计(Agilent Cary Eclipse)记录600至700nm波长范围内尼罗红的荧光光谱。将尼罗红的最大荧光发射波长绘制为多肽浓度的函数，以估算CAC值。研究表明，多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57聚集浓度均低于10μM。
本发明多肽AmpF，PF，E749-57，E744-57，AmpFE749-57，AmpFE744-57，PFE749-57和PFE744-57是通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)方法合成的。在制备多肽疫苗之前，首先将多肽冻干粉(AmpF，PF，AmpFE749-57，AmpFE744-57，PFE749-57和PFE744-57)溶解在水中来制备浓度为5mM的不同多肽的储备溶液。多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57是通过将多肽AmpF和AmpFE749-57或多肽AmpF和AmpFE744-57的溶液以90:10的摩尔比混合制备的，最终的总浓度为2mM。同时，按照相同的方案，以90:10的摩尔比混合多肽PF和PFE749-57或PF和PFE744-57的溶液制备多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57。同时，还制备了浓度为2mM的AmpF，PF，E749-57和E744-57的多肽溶液。在进行所有表征和生物学实验之前，将多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57的溶液均放置2天。
多肽疫苗的二级结构通过圆二色(CD)光谱进行了表征(图4b)。多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57的CD光谱分别在193和215nm或195和213nm处显示最小或最大强度。这些信号表明多肽疫苗AmpF-E7初步形成了β-折叠构象。此外，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57的CD光谱在200和220nm处显示两个正峰，表明多肽疫苗PF-E7采用无规卷曲构象。硫黄素T(ThT)分析证实了由疫苗AmpF-E7形成的β-折叠(图2)。添加疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57后，ThT荧光发射强度分别增加了230倍和240倍。值得注意的是，多肽疫苗诱导的ThT荧光强度的增加与仅由多肽AmpF诱导的ThT荧光强度的增加相当，这意味着长抗原表位不参与AmpF结构域的自组装。相反，在ThT溶液中添加PF-E7不会引起ThT荧光的明显改善，这证实了多肽疫苗PF-E7形成了无规卷曲。
圆二色性(CD)光谱表征中，五肽AmpF，PF，多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57，肽抗原E749-57和E744-57的CD光谱通过分光光度计记录(Biologic MOS-500)。将浓度为2mM的多肽肽溶液转移到两片0.1mm的石英载玻夹片中间进行扫描。波长扫描范围为190nm至250nm，间隔为1.0nm。
硫黄素T(ThT)结合测定中，使用荧光分光光度计(Agilent Cary Eclipse)记录在多肽存在或不存在条件下ThT的荧光光谱。将ThT(20μM)加入多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57(2mM)中放置过夜，然后用于测量。在测量期间，使用光程为1cm的石英池，设置激发波长为421nm，激发和发射光源的狭缝宽度为20nm，记录以450至600nm范围内的荧光光谱。
通过原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)研究了多肽疫苗的形貌(图4，c-j)。AFM图像显示多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57为纤维状，单根纤维的高度约为3nm(图4，c和d)。TEM图像证实了由多肽疫苗AmpF-E7形成的纳米纤维，单根纳米纤维的宽度约为3nm(图4，g和h)，这与AFM图像中显示的纳米纤维的高度一致。相反，AFM和TEM研究均显示，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57分别形成平均直径为100±20nm和100±10nm的纳米颗粒(图4，e，f，i和j)。
原子力显微镜(AFM)研究中，在敲击模式下，使用Bruker ICON仪器记录多肽疫苗的AFM图像。首先，将10μL浓度为2mM的多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57滴加在云母片表面，静置5分钟。残留的液体用滤纸吸干，在空气中晾干后用于测试。
透射电子显微镜(TEM)研究中，多肽疫苗的TEM图像是在Philips Tecnai G220 S-TWIN显微镜上获得的。将多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57(2mM，10μL)滴加到碳涂层铜网格的表面并静置5分钟。用滤纸将溶液吸干，随后将10μL的2wt％乙酸双氧铀滴加在铜网表面，静置3分钟后用滤纸将其除去。在测试之前，将样品存储在干燥器中。
BMDCs和DC2.4细胞对多肽疫苗的细胞摄取
进一步通过甲基噻唑基四唑鎓(MTT)分析评估了多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7对APC，健康细胞和肿瘤细胞(包括DC2.4，3T3细胞和TC-1细胞)的细胞毒性(图5)。用浓度范围从0到200μM的多肽疫苗处理所有这些细胞，48小时所有细胞的细胞活力的降低可忽略不计，这表明多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7具有出色的生物相容性。随后，利用流式细胞仪和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)对骨髓树突状细胞(BMDC)和DC2.4细胞进行了多肽疫苗的细胞摄取实验(图6)。流式细胞仪分析显示所有多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57逐渐被BMDC摄取(图6a)。荧光强度定量分析显示，所有处理组荧光强度约在8小时后达到最大。与游离肽抗原E744-57和E749-57相比，BMDC对多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57的摄取明显增强，表明该多肽疫苗组装体可以促进细胞摄取。值得注意的是，共孵育12小时后，纳米纤维肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57在BMDC中的残留量显著高于纳米颗粒疫苗PF-E749-57和PF-E744-57。直到共孵育24小时，BMDC中多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57的荧光强度的下降量可忽略不计，而多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57的荧光强度几乎下降到游离抗原肽的水平(图6a，c)。通过DC2.4细胞的CLSM实验，证实了多肽疫苗的细胞摄取(图6b)，与流式细胞仪检测结果一致。将流式细胞仪与CLSM实验结果均表明，与纳米颗粒疫苗和游离抗原肽相比，纳米原纤维肽疫苗在细胞中的保留时间更长，这证明了形态学调控在优化疫苗输送效率中的关键作用，并可能有助于增强疫苗的免疫反应。
利用CLSM监测多肽疫苗在细胞中的定位验证多肽疫苗的细胞摄取途径(图6，d和e)。用红色的Lyso-Tracker标记细胞溶酶体，通过绿色的FAM标记的多肽疫苗与红色溶酶体的荧光信号的Pearson相关系数，可以确定多肽疫苗的摄取途径。在整个摄取过程中游离肽抗原E744-57和E749-57的Pearson相关系数较小，但纳米原纤维和纳米颗粒多肽疫苗在与DC2.4细胞共孵育2小时后均显示出最大的相关系数。这些结果表明多肽疫苗通过溶酶体介导的内吞作用进入细胞。延长DC2.4细胞的孵育时间会导致共定位相关系数降低，这表明多肽疫苗可以成功实现溶酶体逃逸。
多肽疫苗诱导的抗原呈递和T细胞增殖
为了验证所制备的自佐剂多肽疫苗的免疫治疗潜力，对用多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7处理后的BMDC进行了流式细胞术分析，研究了BMDC的抗原呈递和其对脾细胞中T细胞的增殖的影响(图7)。流式细胞分析结果显示，多肽疫苗AmpF-E749-57，AmpF-E744-57，PF-E749-57和PF-E744-57处理的BMDC表面CD86+，CD80+，MHC-I和MHC-II的表达明显比五肽AmpF和PF以及游离抗原肽E749-57和E744-57处理组BMDC表面的表达高(图7，b，c，d)。这些结果表明BMDC能够被纳米纤维和纳米颗粒多肽疫苗诱导成熟并实现抗原呈递，从而证明了多肽疫苗具有自佐剂功能。由纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7诱导的BMDC表面促成熟及抗原呈递特征分子的百分比明显高于纳米颗粒多肽疫苗。这一发现表明，与纳米颗粒多肽疫苗相比，纳米纤维多肽疫苗更有利于BMDC的成熟和抗原呈递。
通过流式细胞术进一步研究了与被不同多肽疫苗处理后的BMDC共孵育后的T淋巴细胞的增殖情况(图7，e-h)。与五肽AmpF和PF以及游离抗原肽E749-57和E744-57处理组相比，与多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7预处理的BMDC共孵育后，原始CFSE标记的T淋巴细胞显著分裂增殖。特别是，用纳米纤维疫苗AmpF-E7预处理后的BMDC诱导T细胞增殖的能力更出色。此外，与多肽疫苗预处理的BMDC共孵育的T淋巴细胞中的CD8+和CD4+T细胞的百分比比其他预处理组更高。同时，纳米纤维疫苗诱导增殖的T淋巴细胞中CD8+和CD4+T细胞的百分比约为纳米颗粒多肽疫苗的1.5倍和1.4倍。该结果证实了与纳米颗粒多肽疫苗相比，纳米纤维多肽疫苗更促进了T细胞的增殖。
进一步研究了多肽疫苗在体外诱导CTL的产生并进一步杀伤TC-1肿瘤细胞的能力(图7i)。经五肽或游离肽抗原预处理的BMDC孵育的T淋巴细胞存在下，TC-1细胞的死亡率几乎可以忽略不计。同样，用纳米纤维疫苗AmpF-E7激活的T淋巴细胞处理的TC-1细胞的死亡率远高于与纳米颗粒多肽疫苗PF-E7处理组。这些结果表明，通过多肽疫苗预处理的BMDCs促进了T淋巴细胞增殖并促进了肿瘤细胞死亡，肿瘤细胞死亡率与多肽疫苗的形貌密切相关。
多肽疫苗的淋巴结富集和T细胞增殖
由于引流淋巴结在引发免疫反应中的关键作用，在小鼠尾根部皮下注射FAM标记的多肽疫苗后，评估了不同时间后小鼠的LNs上多肽疫苗的积累(图8)。注射多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7的小鼠的荧光图像在LNs处出现了明显的荧光信号，而用游离肽抗原处理的小鼠在LNs处却没有看到明显的荧光信号(图8a)。从注射了多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7的小鼠身上解剖出的LNs和脾脏的离体图像也显示出较强的荧光信号(图8b)。这些结果清楚地表明，多肽疫苗在LN和脾脏中的有效积累，可能归因于成熟BMDC或单独疫苗的迁移。不同处理组小鼠体内或离体荧光强度的定量分析结果显示，用纳米纤维肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57处理12小时的小鼠的LNs上荧光信号强度是PF-E749-57和PF-E744-57疫苗处理组的3-4倍。同时，在注射多肽疫苗48小时后，纳米纤维疫苗处理组的LNs和脾仍有可见的荧光信号，这表明纳米纤维疫苗在LN和脾中具有更长的保留时间。
还通过流式细胞术分析了在48小时后不同处理组的小鼠解剖的LNs中CD4+和CD8+T细胞的增殖情况(图8e和f)。发现，只有用纳米纤维疫苗AmpF-E744-57和AmpF-E749-57处理组的LNs中表现出CD4+和CD8+T细胞的明显增殖，表明与纳米颗粒多肽疫苗相比，纳米纤维疫苗更有利于诱导T细胞增殖。
多肽疫苗的HPV相关肿瘤免疫治疗
基于多肽疫苗在抗原呈递，LNs富集和滞留以及引发T细胞相关免疫应答方面的发现，通过对小鼠皮下注射HPV相关TC-1肿瘤细胞研究了多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的功效。(图9)。给小鼠接种TC-1细胞7天后，在第0天，第7天，第14天将PBS，五肽，抗原肽及多肽疫苗皮下注射到小鼠体内(图9a)。在21天内监测不同处理组小鼠的肿瘤体积和体重(图9，b和c)。在监测期间，所有治疗小鼠的体重没有出现明显变化(图9c)，表明多肽疫苗具有较好的生物相容性。用游离抗原肽和多肽疫苗治疗小鼠后，小鼠体内肿瘤的生长受到不同程度的抑制。与其他治疗组相比，用纳米纤维疫苗AmpF-E7治疗小鼠可显着抑制肿瘤生长，证明了纳米纤维疫苗在肿瘤免疫疗法中的优异功效。
通过流式细胞术分析T细胞向肿瘤组织的浸润，以研究抑制小鼠肿瘤生长的潜在机制(图9e)。当用PBS和五肽AmpF或PF治疗小鼠时，其CD4+或CD8+T细胞的浸润率非常低，而用多肽疫苗注射的小鼠解剖出的肿瘤组织中所含CD4+或CD8+T细胞的浸润率超过2％。另外，与纳米颗粒疫苗相比，纳米纤维疫苗AmpF-E7治疗组导致CD4+或CD8+T细胞向肿瘤组织的浸润率增强。用多肽疫苗AmpF-E744-57治疗的小鼠的肿瘤组织中CD4+或CD8+T细胞的浸润率分别为5.39％和6.07％。这些结果表明活化的T细胞浸润到肿瘤组织中，从而通过免疫治疗机制裂解肿瘤细胞。
还分析了用PBS，五肽，抗原肽及多肽疫苗治疗的小鼠脾脏中T淋巴细胞的增殖和免疫细胞因子的分泌，以确认抑制肿瘤的免疫治疗机制(图10)。在用纳米纤维肽疫苗AmpF-E749-57治疗小鼠后，脾脏中CD8+T细胞的增殖能力很强，在多肽疫苗AmpF-E744-57治疗组的小鼠身上解剖出来的脾脏中观察到了高含量的CD4+和CD8+T细胞。(图10，a和b)。另外，用纳米纤维和纳米颗粒肽疫苗接种的小鼠的脾脏中可检测到CD4+和CD8+T细胞分泌的INF-γ(图10，d和e)。然而，用纳米纤维疫苗治疗的小鼠脾脏中INF-γ明显高于纳米粒子疫苗治疗组。这些结果表明，与纳米颗粒多肽疫苗相比，纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7诱导了脾脏T淋巴细胞的快速增殖和分化，这可能归因于有效的淋巴引流和延长的滞留时间。
为了研究多肽疫苗治疗期间T淋巴细胞在免疫反应中的作用，进一步估计了小鼠血清中免疫促进细胞因子IL-2和TNF-α的水平(图10，f和g)。流式细胞仪分析表明，与其他治疗组相比，纳米纤维疫苗AmpF-E7治疗组的小鼠血液中的这两种免疫促进细胞因子含量更高。为了验证多肽疫苗能够引起免疫记忆反应的激活，还评估了不同治疗组的小鼠的LNs中中央记忆T(TCM)细胞的增殖(图10c)。流式细胞仪结果显示用纳米纤维疫苗AmpF-E7治疗的小鼠中检测到的TCM细胞(CD44HiCD62L+)的含量比PF-E7多肽疫苗高出近1.7倍。这些结果表明纳米纤维疫苗可促进小鼠免疫细胞因子的分泌和免疫记忆的产生，从而成为针对HPV相关肿瘤的有效的自佐肽疫苗。
为了评估多肽疫苗的组织病理学毒性，收集不同治疗组的小鼠的肿瘤组织进行了常规苏木精和伊红(H&E)染色(图10h)。不同治疗组的小鼠的肿瘤组织染色结果显示了不同水平的细胞凋亡，其中纳米纤维疫苗AmpF-E7处理诱导了最显著的细胞死亡，证实了多肽疫苗AmpF-E7的增强的免疫治疗功效。还进行了免疫组织化学染色测定，以进一步验证不同治疗组的小鼠中T淋巴细胞的肿瘤浸润情况(图10，i和j)。抗CD8+免疫组织化学分析表明，两种纳米纤维疫苗治疗组的小鼠均导致CD8+T淋巴细胞在肿瘤细胞周围大量富集。然而，在抗CD4+免疫组织化学测定中，多肽疫苗AmpF-E744-57治疗组观察到CD4+T淋巴细胞在肿瘤组织附近的大量富集，因此，免疫组织化学染色测定法证明了纳米纤维疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤组织的浸润增强，从而促进肿瘤细胞死亡并抑制肿瘤生长。
多肽疫苗与抗PD-1抗体的联合免疫疗法
进一步研究了多肽疫苗结合抗PD-1抗体的组联合免疫疗法针对HPV相关TC-1肿瘤的治疗功效(图11)。在第0天，第7天，第14天给TC-1肿瘤小鼠皮下注射PBS，抗PD-1，抗原肽E744-57+抗PD-1，多肽疫苗PF-E744-57+抗PD-1和多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1(图11a)。抗PD-1，抗原肽E744-57+抗PD-1和多肽疫苗PF-E744-57+抗PD-1治疗组均可不同程度的抑制肿瘤生长，但是多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1治疗组可以显著抑制小鼠肿瘤的生长(图11b)。所有治疗组小鼠的恒定体重表明多肽疫苗的系统毒性可忽略不计(图11d)。还通过流式细胞术分析了不同治疗组的小鼠T淋巴细胞的肿瘤浸润情况(图11e)。与抗PD-1，抗原肽E744-57+抗PD-1，多肽疫苗PF-E744-57+抗PD-1相比，多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1的组合显著增强了CD4+和CD8+T细胞的肿瘤浸润(图11，f和g)，其中肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的含量约为12％和9.1％。因此，的结果证明了多肽疫苗和抗PD-1抗体的联合使用对肿瘤免疫治疗具有协同作用，从而进一步提高纳米纤维多肽疫苗免疫治疗效果。
另外，利用ELISA试剂盒测定了不同治疗组小鼠血液中免疫细胞因子IFN-γ，IL-2和TNF-α的含量(图11，h-j)。结果表明，多肽疫苗AmpF-E744-57和抗PD-1联合治疗可促进IFN-γ，IL-2和TNF-α的产生，含量均高于任何其他治疗组。
通过H&E和免疫组化染色测定，评估不同治疗组小鼠肿瘤组织的细胞凋亡和T淋巴细胞浸润情况(图11，k-m)。不同治疗组的小鼠的肿瘤组织的H&E染色图像显示了不同水平的细胞凋亡。多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1联合治疗组的小鼠的肿瘤组织观察到明显的细胞死亡，证实了多肽疫苗AmpF-E744-57+抗PD-1联合治疗的增强的免疫治疗功效。免疫组织化学染色图像显示，抗PD-1，抗原肽E744-57+抗PD-1和多肽疫苗PF-E744-57+抗PD-1治疗组引起部分T淋巴细胞的浸润，从而导致部分肿瘤细胞的凋亡。然而，多肽疫苗AmpF-E744-57和抗PD-1的组合免疫疗法显着增强了CD4+和CD8+T淋巴细胞对肿瘤组织的浸润，进而诱导了强烈的免疫反应并导致肿瘤细胞大规模凋亡。这些结果表明，多肽疫苗AmpF-E744-57和抗PD-1的组合免疫疗法可促进T淋巴细胞的浸润和多种免疫促进细胞因子的产生，从而引发有效的肿瘤免疫反应。
Claims (10)
1.一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：包括纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7和纳米颗粒多肽疫苗PF-E7的制备，其中纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7包括多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57，多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57是通过将多肽AmpF和AmpFE749-57或多肽AmpF和AmpFE744-57的溶液以90:10的摩尔比混合制备的，最终的总浓度为2mM；纳米颗粒多肽疫苗PF-E7包括多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57，是以90:10的摩尔比混合多肽PF和PFE749-57或PF和PFE744-57的溶液制备得到。
2.根据权利要求1所述的形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：包括在制备多肽疫苗之前，将多肽冻干粉AmpF、PF、AmpFE749-57、AmpFE744-57、PFE749-57和PFE744-57溶解在水中来制备浓度为5mM的不同多肽的储备溶液的步骤。
3.根据权利要求1所述的形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：多肽AmpF、PF，E749-57、E744-57、AmpFE749-57、AmpFE744-57、PFE749-57和PFE744-57是通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)方法合成的。
4.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，包括临界聚集浓度、圆二色性光谱、硫黄素T结合测定、原子力显微镜、透射电子显微镜的表征，其特征是：多肽疫苗AmpF-E749-57、AmpF-E744-57、PF-E749-57和PF-E744-57聚集浓度均低于10μM；多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57形成了β-折叠构象，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57采用无规卷曲构象；多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57为纤维状，单根纤维的高度为3nm，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57分别形成平均直径为100±20nm和100±10nm的纳米颗粒。
5.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外细胞毒性分析
通过使用MTT比色法评估了多肽或多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7的细胞毒性，选择了正常细胞3T3，树突细胞DC2.4和肿瘤细胞TC-1三种类型的细胞，以考察不同疫苗对不同细胞的毒性，首先将细胞添加至每孔1×104个细胞的96孔细胞培养板中，加入DMEM培养基，其中含有10％胎牛血清(FBS)，1％青霉素-链霉素(PS)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时，用DMEM培养基稀释不同多肽原液至浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、150或200μM，移除96孔板中原始培养基，将不同浓度多肽溶液每孔100μL添加到96孔细胞培养板中，并在培养箱中培养48小时，随后，向细胞中加入MTT溶液，每孔10μL、5mg/mL，孵育4小时后除去培养基并添加DMSO每孔100μL显色，最后通过酶标仪测量492nm波长处的吸光度来评估细胞的活力。
6.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外细胞摄取和溶酶体逃逸
将FAM标记的不同的多肽衍生物AmpF-FAM，PF-FAM，E749-57-FAM和E744-57-FAM掺入相应的多肽或多肽疫苗中并保证不同多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度一致，就多肽疫苗而言，将多肽AmpF，AmpF-E7和AmpF-FAM或PF，PF-E7和PF-FAM以摩尔比为85:10:5混合，总浓度为2mM，对于五肽而言，将多肽AmpF和AmpF-FAM或PF和PF-FAM以95:5的摩尔比混合，总浓度为2mM，对于抗原肽，将多肽E749-57或E744-57与FAM标记的衍生物以1:1的摩尔比混合，总浓度为200μM；
对于BMDC细胞摄取实验，将MSC诱导分化形成的BMDC铺到48孔细胞培养板中，其中每孔2×105个细胞，加入FAM标记的不同多肽溶液，每孔200μL，利用1640培养基稀释确保所有多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度分别为10μM和20μM，在37℃、5％CO2细胞培养箱孵育2，4，6，8，12，16和24小时，收集处理后的BMDC，用PBS离心洗涤三遍，然后通过流式细胞仪分析；
对于DC2.4细胞摄取实验，将DC2.4细胞每孔1×105个细胞和每皿1mL、10％FBS、1％PS、0.1％β-巯基乙醇的DMEM培养基加入共聚焦小皿中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时，除去原培养基后，添加用DMEM培养基稀释的FAM标记的不同多肽溶液，每皿1mL，所有多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度分别为10μM和20μM，共孵育2，4，6，8，12，16和24小时，除去培养基后，将剩余的DC2.4细胞用PBS洗涤3次，然后用4％多聚甲醛固定，每皿1mL、室温、20分钟；用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)每皿1mL50 nM室温20分钟标记DC2.4细胞的细胞核，以便通过激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，另外，在溶酶体逃逸实验中，使用上述相同的方案处理细胞并培养2、4和8小时，在细胞固定和细胞核染色之前，将DC2.4细胞用溶酶体探针染色LysoTracker、红色、每皿1mL、50nM、37℃、30分钟以标记其溶酶体，最后用上述CLSM对DAPI和LysoTracker染色的DC2.4细胞成像。
7.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外多肽疫苗促进BMDC成熟并实现抗原呈递
将未成熟的BMDC每孔4×105个细胞添加到24孔细胞培养板中，在37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时，然后，添加不同的多肽溶液，利用RPMI 1640培养基稀释至多肽总浓度为200μM或抗原结构域浓度为20μM，在培养箱中培养24小时后，收集BMDC，并用PBS洗涤3次，向每个收集的细胞样品中加入1μL的CD16/32，并在4℃下避光孵育15分钟，以封闭细胞表面上的多余结合位点，为了评估BMDC的成熟程度，将处理过的BMDC与1μL、0.5mg/mL的CD11c-FITC，1μL、0.5mg/mL的CD80-APC和1μL，0.5mg/mL的CD86-PE在4℃下孵育30分钟，此外，为了分析抗原呈递，将处理过的BMDC与1μL，0.5mg/mL的CD11c-FITC，(1μL，0.5mg/mL的MHC-I-PE或1μL，0.5mg/mL的MHC-II-PE在4℃下孵育30分钟，随后，将细胞用PBS洗涤3次，并重悬于PBS，最后，通过流式细胞仪分析其成熟或抗原呈递情况。
8.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外T淋巴细胞增殖
将消毒灭菌后的小鼠脾脏组织剪成小块，置于70μm细胞筛网上，加入5mL小鼠淋巴细胞分离液并用5mL注射器塞头端轻轻研磨，通过细胞筛过滤后，梯度离心收集T淋巴细胞，在进行流式细胞仪分析前，使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)活细胞染料对脾脏T淋巴细胞进行染色，利用RPMI 1640培养基将收集的T淋巴细胞稀释至2×106个细胞每毫升，加入终浓度为4μM的CFSE，在37℃下孵育10分钟，收集染色后T淋巴细胞，用RPMI 1640培养基洗涤3次，然后重悬于该培养基中，将CFSE标记的T淋巴细胞铺到每孔1×106个细胞的48孔细胞培养板中，加入经不同多肽样品预处理24小时的BMDC，在37℃5％CO2培养箱中共孵育3天，收集T淋巴细胞后，用PBS洗涤3次，最后用流式细胞仪分析T淋巴细胞的增殖情况；
为了评估CD4+和CD8+T细胞的增殖，将提取的脾脏中T淋巴细胞直接铺到每孔1×106个细胞的48孔细胞培养板中，加入经不同多肽样品预处理24小时的BMDC，在37℃5％CO2培养箱中共孵育3天，收集T淋巴细胞并用PBS洗涤，向每个收集的T淋巴细胞样品中加入1μL、0.5mg/mL的CD16/32和1μL，0.5mg/mL的CD3-FITC，1μL，0.5mg/mL的CD8-PE，1μL，0.5mg/mLCD4-APC的混合物，先后在4℃下孵育15和30分钟，用PBS洗涤细胞三遍，最后通过流式细胞仪对CD4+和CD8+T细胞定量分析。
9.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
细胞毒性T细胞(CTL)诱导的体外TC-1细胞死亡
首先将脾脏中取出的T淋巴细胞按照上诉提到的实验方法与不同多肽疫苗处理后的BMDC共养3天，用于TC-1细胞体外杀伤实验，将TC-1肿瘤细胞铺到每孔1×105个细胞的96孔细胞培养板中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时，收集刺激后的T淋巴细胞，加入TC-1肿瘤细胞中，37℃、5％CO2共孵育48小时，移除培养基及悬浮的T淋巴细胞，并用PBS洗3次，然后加入100μL含10％CCK8试剂和10％胎牛血清的1640培养基的CCK-8检测液，再孵育4小时，最后，用酶标仪记录450nm波长下的的OD值来评估TC-1细胞活性。
10.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体内多肽疫苗引流淋巴结和相应的T细胞增殖
制备FAM标记的不同多肽溶液，其中FAM部分的浓度为100μM，E7抗原肽结构域的浓度为200μM，将雌性C57BL/6J小鼠随机分为9组，每组21只小鼠，并在小鼠尾根部皮下注射FAM标记的多肽溶液100μL，给药0、6、12、24、36和48小时后，用异氟烷麻醉小鼠，并使用体内成像系统监测小鼠腹股沟淋巴结(LNs)处的荧光信号，同时，在给药0、6、12、24、36和48小时后，每组三只小鼠解剖摘取腹股沟LNs和脾脏，通过成像系统探测LNs和脾脏的荧光信号，并通过CRI Maestro分析软件计算荧光强度；
另外，给药48小时后，每组三只小鼠解剖摘取腹股沟LNs，在PBS中研磨，将混合物通过70μm细胞过滤筛过滤，并用PBS洗涤3次，收集T淋巴细胞，将收集的T淋巴细胞与1μL，0.5mg/mL的CD16/32和1μL，0.5mg/mL的CD3-FITC，1μL，0.5mg/mLCD8-PE，1μL，0.5mg/mLCD4-APC混合物先后在4℃下孵育15和30分钟，用PBS洗涤细胞三遍并通过流式细胞仪对CD4+和CD8+T细胞定量分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110141555.8A CN112957461B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110141555.8A CN112957461B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112957461A true CN112957461A (zh) | 2021-06-15 |
| CN112957461B CN112957461B (zh) | 2023-01-10 |
Family
ID=76273247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110141555.8A Active CN112957461B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112957461B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114133430A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-04 | 南开大学 | 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2502696A1 (en) * | 2002-10-21 | 2004-05-06 | Mgi Pharma Biologics, Inc. | Compositions and methods for treating human papillomavirus-mediated disease |
| CN102008721A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-04-13 | 浙江大学 | 一种hpv多肽/dc混合疫苗及其制备 |
| US20120237535A1 (en) * | 2009-09-11 | 2012-09-20 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Therapeutic Compositions For The Treatment of HPV-Induced Diseases |
-
2021
- 2021-02-02 CN CN202110141555.8A patent/CN112957461B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2502696A1 (en) * | 2002-10-21 | 2004-05-06 | Mgi Pharma Biologics, Inc. | Compositions and methods for treating human papillomavirus-mediated disease |
| US20120237535A1 (en) * | 2009-09-11 | 2012-09-20 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Therapeutic Compositions For The Treatment of HPV-Induced Diseases |
| CN102008721A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-04-13 | 浙江大学 | 一种hpv多肽/dc混合疫苗及其制备 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MINGMING LI等: "Proline Isomerization-Regulated Tumor MicroenvironmentAdaptable Self-Assembly of Peptides for Enhanced Therapeutic Efficacy", 《NANO LETTERS》 * |
| TZU-YU LIU等: "Polyacrylate-Based Delivery System for Self-adjuvanting Anticancer Peptide Vaccine", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114133430A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-04 | 南开大学 | 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 |
| CN114133430B (zh) * | 2021-11-30 | 2024-04-05 | 南开大学 | 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112957461B (zh) | 2023-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Muraoka et al. | Antigen delivery targeted to tumor-associated macrophages overcomes tumor immune resistance | |
| Qin et al. | Development of a cancer vaccine using in vivo click‐chemistry‐mediated active lymph node accumulation for improved immunotherapy | |
| Shi et al. | Enhanced antitumor immunity by targeting dendritic cells with tumor cell lysate-loaded chitosan nanoparticles vaccine | |
| Meng et al. | Two‐Pronged Intracellular Co‐Delivery of Antigen and Adjuvant for Synergistic Cancer Immunotherapy | |
| Christian et al. | Tat-functionalized near-infrared emissive polymersomes for dendritic cell labeling | |
| Li et al. | Allogenic dendritic cell and tumor cell fused vaccine for targeted imaging and enhanced immunotherapeutic efficacy of gastric cancer | |
| Chang et al. | Targeting and specific activation of antigen‐presenting cells by endogenous antigen‐loaded nanoparticles elicits tumor‐specific immunity | |
| Li et al. | A supramolecular “trident” for cancer immunotherapy | |
| WO2020038299A1 (zh) | 一种基于外泌体的抗肿瘤疫苗 | |
| Feng et al. | An acid-responsive MOF nanomedicine for augmented anti-tumor immunotherapy via a metal ion interference-mediated pyroptotic pathway | |
| CN103221034A (zh) | 来自肿瘤组织的纳米囊泡及使用该纳米囊泡的癌症疫苗 | |
| Su et al. | Nanovaccine biomineralization for cancer immunotherapy: a NADPH oxidase‐inspired strategy for improving antigen cross-presentation via lipid peroxidation | |
| Wang et al. | The mechanism of action of acid-soluble chitosan as an adjuvant in the formulation of nasally administered vaccine against HBV | |
| Chen et al. | Magnetic resonance and near-infrared imaging using a novel dual-modality nano-probe for dendritic cell tracking in vivo | |
| Xie et al. | A nanovaccine based on adjuvant peptide FK‐13 and l‐phenylalanine poly (ester amide) enhances CD8+ T cell‐mediated antitumor immunity | |
| Yu et al. | Mannose-modified liposome designed for epitope peptide drug delivery in cancer immunotherapy | |
| CN112957461A (zh) | 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法 | |
| Ma et al. | Boosting cancer immunotherapy by biomineralized nanovaccine with ferroptosis-inducing and photothermal properties | |
| CN107223051B (zh) | 抗原递送系统 | |
| Zhao et al. | A co-formulated vaccine of irradiated cancer cells and cowpea mosaic virus improves ovarian cancer rejection | |
| Dai et al. | PD-L1 antibodies-armed exosomal vaccine for enhanced cancer immunotherapy by simultaneously in situ activating T cells and blocking PD-1/PD-L1 axis | |
| Dong et al. | Antigen-conjugated silica solid sphere as nanovaccine for cancer immunotherapy | |
| CN112826928A (zh) | 一种cd40靶向树突状细胞纳米疫苗及其构建方法 | |
| Wang et al. | Phenylboronic ester-modified polymeric nanoparticles for promoting TRP2 peptide antigen delivery in cancer immunotherapy | |
| Zhao et al. | Reversing immune evasion using a DNA nano-orchestrator for pancreatic cancer immunotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |