CN114133430A - 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 - Google Patents

一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114133430A
CN114133430A CN202111438093.2A CN202111438093A CN114133430A CN 114133430 A CN114133430 A CN 114133430A CN 202111438093 A CN202111438093 A CN 202111438093A CN 114133430 A CN114133430 A CN 114133430A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dex
ampfqb
polypeptide
hours
ampfq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111438093.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114133430B (zh
Inventor
余志林
宋艳秋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN202111438093.2A priority Critical patent/CN114133430B/zh
Publication of CN114133430A publication Critical patent/CN114133430A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114133430B publication Critical patent/CN114133430B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于酶共生多肽自组装药物递送载体的制备方法，并研究了其在提高常规药物抗炎功效方面的作用。在4‑氨基脯氨酸五肽的侧链引入醌丙酸，合成了NQO1响应性多肽，将其与蛋白质配体功能化的衍生物共组装而制备了与酶共生的多肽自组装药物递送载体。多肽被NQO1还原后形成对Keap1具有高亲和力的纳米纤维，从而通过Nrf2途径上调NQO1的表达。上调的NQO1反过来促进多肽组装成纳米纤维，从而建立多肽组装与NQO1表达之间的共生关系。体外和体内研究均表明共生组装系统既能够缓解地塞米松的ROS副作用又下调促炎细胞因子来增强抗炎功效。

Description

一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制 备方法
技术领域
本发明属于多肽纳米药物及递送载体技术领域，具体涉及一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法。
背景技术
通过外部或内部刺激在活细胞中可控地自组装赋予多肽纳米结构从疾病诊断到治疗的广泛生物学功能。由于酶在特定微环境下催化化学反应和选择性表达，酶被认为是调节多肽组装的一种通用策略。其中，包括碱性磷酸酶、硝基还原酶、caspase-3/7等多种酶已被用于调控活细胞中多肽自组装。然而，在大多数情况下，所使用的酶都是由细胞自然产生的，缺乏酶的表达与多肽组装之间的密切关联。这导致对特定细胞中酶的过度表达的强烈依赖，从而导致多肽的组装受到上述酶的限制，特别是在早期检测病理细胞和干扰其命运方面的挑战。
共生不仅是生物体间普遍存在的生物现象，也是活细胞间代谢、相互作用的潜在机制。例如，缺氧的肿瘤细胞和癌症相关的成纤维细胞将乳酸转运到含氧的肿瘤细胞，而含氧的肿瘤细胞将ATP重新提供给缺氧细胞以维持能量。此外，癌症相关成纤维细胞和癌细胞之间氨基酸的共生振荡在细胞增殖和癌症病理学中起着关键作用。这些过程启发我们建立酶的表达和多肽的组装之间的共生关系，其中它们密切的共生关联可能会在酶的表达正常的条件下加速活细胞中肽的自组装。NAD(P)H醌脱氢酶1(NQO1)是一种细胞质中黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性还原酶，在抗氧化应激中具有抗氧化功能。NQO1的细胞内表达由蛋白质核因子红细胞相关因子2(Nrf2)调节，并且通常在肿瘤细胞中上调，从而应用于NQO1响应前药或药物递送。然而，在生物微环境的许多情况下，细胞中NQO1的表达水平并未上调，从而限制了NQO1响应系统用于疾病治疗。
发明内容
本发明目的是解决在生物微环境的细胞中NQO1的表达水平不高，从而限制了NQO1响应系统用于疾病治疗的问题，提供一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法。
本发明通过研究多肽组装与酶的表达之间的关系确认它们的共生关联，用于炎症相关疾病的有效治疗。该多肽自组装药物递送载体方法简单，反应条件温和，操作简便。
本发明的技术方案为：
一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，所述多肽自组装药物递送载体为DEX@AmpFQB，制备步骤如下：
步骤1：多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE的合成；
1)将相对于Merrifield树脂2倍当量的Boc-Phe-OH、3倍当量的K2CO3和3倍当量的KI溶解于DMF中并加入含有Merrifield树脂的固相合成管，在60-80℃下摇动12-16小时，依次用95％乙醇、DMF和DCM洗涤树脂，利用DCM稀释的体积百分含量为30％的TFA脱掉Boc保护基团，从而使第一个氨基酸接到树脂上；
2)之后，通过常规的Fmoc固相合成法连接剩下的FFAmpF四个氨基酸，具体操作是，将相对于Merrifield树脂4倍当量的Fmoc保护的氨基酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中与接了第一个氨基酸的树脂反应1.5小时，用25％哌啶去除Fmoc保护基团；
3)在合成FFAmpFF之后，将N-末端Fmoc-保护基团保留在树脂上，用DCM稀释的50％TFA除去4-氨基脯氨酸的Boc-保护基团；
4)随后，将相对于Merrifield树脂4倍当量的醌丙酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中加入含有接了FFAmpFF的树脂的合成管中并反应1.5小时，接着用25％哌啶去除FFAmpQFF的N-末端Fmoc保护基团；
5)对于多肽AmpFQ-ETGE，通过常规Fmoc固相合成法连接相应的序列或功能部分；最后，使用体积比为35：6：9的TFA，茴香硫醚和TMSOTF组成的切割剂将多肽从树脂上裂解下来；
步骤2：通过将AmpFQ和AmpFQ-ETGE共组装制备AmpFQB；
首先将多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE冻干粉分别用pH为7.4的PBS缓冲液溶解制备得到浓度均为5mM的AmpFQ和AmpFQ-ETGE的多肽母液；通过90:10的体积比混合多肽AmpFQ的母液和多肽AmpFQ-ETGE的母液制备得到浓度为5mM的AmpFQB的母液；
步骤3：通过溶剂蒸发法制备DEX@AmpFQB；
将浓度均为5mM的DEX与AmpFQB按照摩尔比1：1分别溶解在HFIP中，然后在离心管中混合，在室温下用吹风机除去HFIP；然后，将离心管中剩余的DEX与AmpFQB粉末重新溶解在水中，通过离心去除沉淀物，从而制备得到了多肽浓度为5mM的DEX@AmpFQB。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明所形成的多肽组装体具有生物兼容性、低免疫原性和生物降解性等优点。(2)本发明所有的反应条件非常温和，制备方法简单，操作简便。(3)本发明得到的多肽组装体能够实现与细胞中酶的共生，提高治疗急性肺损伤的常规药物的抗炎功效。(4)本发明制备的酶-共生组装系统允许独立于酶的过度表达来操纵肽的自组装，从而为未来创建用于疾病诊断和治疗的超分子治疗诊断剂提供了一种独特的策略。
下面将通过实例描述，阐述本发明的优点和效果。
附图说明
图1.多肽AmpFQ的合成路线。
图2.AmpFQ,ETGE,AmpFQ-ETGE,AmpF-ETGE,ETGE-FAM,AmpFQ-FAM,AmpF,drug DEX，PF-ETGE,PF,PF-FAM的化学结构式。
图3.(A)不同癌细胞和有或无LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NQO1水平的免疫蛋白印迹分析。(B)用NQO1和NADH处理的AmpFQ在0、1、2、4、6和8小时的UPLC结果曲线图。图中的成分I、II和III分别表示AmpFQ、chQPA和AmpF。(C)在存在或不存在NQO1和NADH的情况下AmpFQ转化的动力学曲线。(D)QPA还原产生的AmpFQ和AmpF的CD光谱。(E和F)QPA还原前后AmpFQ(E)和AmpF(F)的AFM图像。插图显示了纳米颗粒直径的分布或所选纳米纤维的高度。(G)AFM揭示的由QPA还原促进的多肽AmpFQ的形态转变动力学。
图4.AmpFQB还原前(A)和还原后(B),DEX@AmpFQ还原前(C)和还原后(D)及AmpFB(E),PFB(F)的AFM图片，插图显示所选纳米纤维的高度或相应纳米粒子的直径分布。
图5.AmpFQ还原前(A)和还原后(B),AmpFQB还原前(C)和还原后(D),DEX@AmpFQ还原前(E)和还原后(F),DEX@AmpFQB还原前(G)和还原后(H)还原前后的TEM图片，插图显示相应纳米粒子的直径分布。
图6.AmpFQB,DEX@AmpFQ还原前后的CD光谱图。
图7.用于分析多肽ETGE、共组装AmpFQB或AmpFB和Keap1蛋白结合的MST测定(A)和相应的定量结合常数(B)。(C)用PBS(对照)或LPS刺激的巨噬细胞或经AmpFQ、ETGE、PFB和AmpFQB处理的LPS刺激的巨噬细胞中Nrf2、NQO1和HO-1表达的免疫蛋白印迹分析。(D-E)与AmpFQ(D)和AmpFQB(E)一起孵育12小时的LPS刺激巨噬细胞的生物TEM图像。(F)AmpFQB组装与NQO1分泌之间共生关系的潜在机制的图示说明。(G)与AmpFQB一起孵育12小时的非刺激巨噬细胞的生物TEM图像。
图8.用AmpFQ、ETGE、AmpFQB、PFB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB处理RAW264.7巨噬细胞后不同时间点的流式细胞术的平均荧光强度定量统计图。
图9.(A)QPA还原前后治疗药物DEX@AmpFQB的UPLC曲线。DEX@AmpFQB在还原前(B)和还原后(C)AFM图像。插图显示了纳米颗粒直径的分布或所选纳米纤维的高度。(D)QPA还原前后DEX@AmpFQB的CD光谱。(E)用AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB处理巨噬细胞在不同时间的流式细胞术的平均荧光强度定量统计图。(F)LPS刺激的巨噬细胞用各种治疗剂孵育24小时的CLSM图像，其中细胞用ROS探针DCFH-DA染色。比例尺：10μm。(G)经处理的巨噬细胞中与DCFH-DA相关的荧光信号的量化统计图。(H)LPS刺激的巨噬细胞用各种治疗剂孵育24小时后促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的ELISA测定结果，从(F)到(H)，PBS处理的未刺激巨噬细胞作为对照组。
图10.用AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX@AmpFQ或DEX@AmpFQB处理RAW 264.7巨噬细胞2、4和8小时后Lyso-Tracker和FAM部分相关的荧光信号之间的Pearson相关系数(A)和量化统计(B)。
图11.LPS刺激的急性肺损伤小鼠在气管内注射DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB不同时间点后的体内荧光图像(A)，或24时后从小鼠体内收集的主要器官的荧光图像(B)。不同时间点的体内荧光强度的定量统计图(C)或主要器官在24小时后(D)荧光强度的定量统计图。(E)从LPS刺激的小鼠收集的BALF中细胞因子TNF-α、IL-6和COX-2的ELISA测定结果。(F)从用PBS、DEX或DEX@AmpFQB处理20小时的肺损伤小鼠解剖的肺组织经DCFH-DA染色后的CLSM图像。(G)肺组织内的DCFH-DA探针相关的荧光信号的定量统计。(H)从肺损伤小鼠身上解剖的肺组织的H&E染色图像。比例尺：40μm。从(E)到(H)，用PBS处理的健康小鼠作为对照组。
图12.从健康小鼠或LPS刺激的小鼠收集的BALF中细胞因子IL-1β的ELISA分析(A)，总蛋白的BCA蛋白定量分析(B),总细胞数计数分析(C)，小鼠肺组织的湿干重比(D),这些小鼠用PBS、AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB给药20小时。
图13.从健康小鼠或LPS刺激的小鼠收集的肺组织中细胞因子TNF-α(A)、IL-1β(B),IL-6(C)，和COX-2(D)的ELISA分析结果，这些小鼠用PBS、AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB给药20小时。
图14.从用PBS、AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB处理的健康小鼠给药24小时后收集的主要组织(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的H&E染色图像。比例尺：40μm。
图15.巨噬细胞中DEX@AmpFQB与NQO1共生自组装的示意图。
具体实施方式
实施例1：
一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法及结构表征，所述多肽自组装药物递送载体为DEX@AmpFQB，制备方法包括如下步骤：
步骤1：多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE的合成；
1)将相对于Merrifield树脂2倍当量的Boc-Phe-OH、3倍当量的K2CO3和3倍当量的KI溶解于DMF中并加入含有Merrifield树脂的固相合成管，在60℃下摇动12小时，依次用95％乙醇、DMF和DCM洗涤树脂，利用DCM稀释的体积百分含量为30％的TFA脱掉Boc保护基团，从而使第一个氨基酸接到树脂上；
2)之后，通过常规的Fmoc固相合成法连接剩下的FFAmpF四个氨基酸，具体操作是，将相对于Merrifield树脂4倍当量的Fmoc保护的氨基酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中与接了第一个氨基酸的树脂反应1.5小时，用25％哌啶去除Fmoc保护基团；
3)在合成FFAmpFF之后，将N-末端Fmoc-保护基团保留在树脂上，用DCM稀释的50％TFA除去4-氨基脯氨酸的Boc-保护基团；
4)随后，将相对于Merrifield树脂4倍当量的醌丙酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中加入含有接了FFAmpFF的树脂的合成管中并反应1.5小时，接着用25％哌啶去除FFAmpQFF的N-末端Fmoc保护基团；
5)对于多肽AmpFQ-ETGE，通过常规Fmoc固相合成法连接相应的序列或功能部分；最后，使用体积比为35：6：9的TFA，茴香硫醚和TMSOTF组成的切割剂将多肽从树脂上裂解下来；
步骤2：通过将AmpFQ和AmpFQ-ETGE共组装制备AmpFQB；
首先将多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE冻干粉分别用pH为7.4的PBS缓冲液溶解制备得到浓度均为5mM的AmpFQ和AmpFQ-ETGE的多肽母液；通过90:10的体积比混合多肽AmpFQ的母液和多肽AmpFQ-ETGE的母液制备得到浓度为5mM的AmpFQB的母液；
步骤3：通过溶剂蒸发法制备DEX@AmpFQB；
将浓度均为5mM的DEX与AmpFQB按照摩尔比1：1分别溶解在HFIP中，然后在5mL离心管中混合，在室温下用吹风机除去HFIP；然后，将5mL离心管中剩余的DEX与AmpFQB粉末重新溶解在水中，通过离心去除沉淀物，从而制备得到了多肽浓度为5mM的DEX@AmpFQB。
NQO1酶对QPA的还原切割及AmpFQ的形貌构象转变
如图3A所示，在对多肽进行研究之前，我们通过蛋白质印迹分析，研究了不同癌细胞和小鼠有无LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NQO1的细胞内表达水平，其中β-肌动蛋白作为内参。我们发现，与未经LPS处理的巨噬细胞相比，癌细胞A549、TC-1、MCF-7、4T1和Hela的细胞内NQO1水平显着提高。然而，用LPS刺激的巨噬细胞NQO1水平仅略微增加，从而限制了NQO1作为巨噬细胞刺激物用于抗炎治疗的利用。这证明了在巨噬细胞中开发NQO1-共生多肽自组装的重要性。
首先我们利用标准固相合成法合成了多肽AmpFQ。在估测细胞内NQO1水平的基础上，我们研究了QPA的NQO1响应切割和多肽AmpFQ的构象转变，其为DEX@AmpFQB发生形貌构象转变的基础，如图3B-D所示。超高效液相色谱分析表明，将酶NQO1添加到多肽AmpFQ中后，由于QPA的还原，导致AmpFQ定量转化为AmpF，从而证明AmpF的NQO1响应形成。NQO1诱导的AmpFQ转化的动力学研究表明QPA还原在8小时内完成。如图3D所示，NQO1处理前在pH7.4下多肽AmpFQ的圆二色光谱在198和220nm处显示两个正峰，表明AmpFQ的无规卷曲构象。在我们之前的结果中，我们研究了多肽AmpF的构象，它在中性条件下采用β-折叠构象。多肽AmpFQ形成的无规卷曲意味着由于QPA部分的缀合而破坏了有序结构。然而，将NQO1添加到多肽AmpFQ导致在CD光谱中分别在195和218nm处出现一个最大或最小峰，这表明QPA还原和多肽AmpF形成后β-折叠的形成。这些结果表明了由QPA还原引起的多肽AmpFQ的NQO1响应性构象转变。
如图3E-F，图4A,B和图5A,B所示，在QPA还原前后由多肽AmpFQ形成的组装体的形貌通过原子力显微镜和透射电子显微镜表征。由于多肽AmpFQ的浓度相对较高，在形态学研究中从AmpFQ上还原QPA是利用无机还原剂NaBH4进行的。多肽AmpFQ的AFM图像显示纳米颗粒的平均直径为100±10nm，但从肽AmpFQ还原QPA导致形成高度约6nm的明确纳米纤维。这些结果与AmpFQ和AmpF之间的独特构象一致，证明了由QPA还原诱导的多肽AmpFQ的形貌转变。如图5A，B所示，TEM研究证实了具有或不具有QPA部分的多肽AmpFQ的形貌，其中在QPA还原之前和之后分别检测到直径为70±10nm的纳米颗粒和宽度为6nm的纳米纤维。如图3F所示，我们进一步研究了由QPA还原促进的多肽AmpFQ形貌转变的动力学。AFM图像显示了QPA还原后分别在0、4、8和12小时的纳米颗粒、纳米纤维和纳米颗粒的共存、主要的纳米纤维以及明确定义的纳米纤维。我们的形态学研究证明了多肽AmpFQ的QPA还原切割诱导的形貌转换。
AmpFQB在RAW264.7巨噬细胞中的组装及组装过程与细胞内NQO1水平之间的关系
为了制备AmpFQB，AmpFB和PFB对照分子，首先我们将AmpFQ、AmpF、PF、AmpFQ-ETGE、AmpF-ETGE和PF-ETGE的冻干粉末溶解在PBS缓冲液中制备浓度为5mM的多肽母液。通过90:10的体积比分别混合多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE、AmpF和AmpF-ETGE以及PF和PF-ETGE的母液来制备浓度为5mM的AmpFQB、AmpFB和PFB的母液。
如图7所示，我们随后研究了AmpFQB在RAW264.7巨噬细胞中的组装，并阐明了组装过程与细胞内NQO1水平之间的关系，其为研究DEX@AmpFQB组装与酶NQO1共生的基础。具有蛋白质Keap1结合表位的AmpFQB组装体是通过将多肽AmpFQ与AmpFQ-ETGE以90:10的摩尔比共组装而创建的。图5A及图6中构象和形态研究显示AmpFQB的无规卷曲构象和纳米颗粒形态。QPA从AmpFQB还原切割诱导形成β-折叠和明确定义的纳米纤维，表明QPA还原诱导AmpFQB的构象和形态转换，如图5B和图6F。这些结果表明，在将结合序列整合到共组装体后，与多肽AmpFQ相比，AmpFQB保持了结构特征。此外，还通过以90:10的摩尔比混合多肽AmpF和AmpF-ETGE来制备具有纳米纤维形态的AmpFB，如图5E。
为了研究AmpFQB和AmpFB与Keap1蛋白的结合，我们对游离肽ETGE、AmpFQB和AmpFB与Keap1蛋白进行了微量热泳动(MST)研究如图7A和B所示。MST结果显示多肽ETGE和Keap1之间的结合常数为167nM。此外，AmpFQB表现出与ETGE相近的Keap1亲和力，但AmpFB和Keap1之间的结合常数与其他两种底物相比，提高了4倍。这些结果表明ETGE结合基序与Keap1蛋白的结合受组装体形貌的影响，其中纳米纤维形态促进其与蛋白质的结合。这可能归因于纳米纤维表面上的ETGE结合基序与二聚化Keap1的协同结合，Keap1通常经历二聚化，从而增强与配体的结合强度。我们的结果证明了多肽纳米结构与Keap1蛋白的结合具有形貌依赖性，并进一步证实了QPA的NQO1还原促进的形貌转变的必要性。为了直接阐明NQO1的表达与巨噬细胞中多肽的组装之间的关系，我们进行了NQO1表达的免疫蛋白印迹研究和巨噬细胞中多肽组装的生物TEM研究，如图7C和图7D-E。我们发现与单独的AmpFQ和ETGE相比，经AmpFQB处理的LPS刺激的巨噬细胞中Nrf2的细胞内水平显着提高。这归因于含有ETGE的结合基序与Keap1的竞争性结合导致Nrf2从其与Keap1二聚体的复合物中释放，从而防止其降解。Nrf2的上调随后促进了由ARE基因介导的巨噬细胞中NQO1和HO-1水平的增加。这些结果证实了AmpFQB处理后会引起巨噬细胞中NQO1的上调。我们假设NQO1水平的提高可能反过来促进QPA部分从AmpFQB的还原裂解和AmpFB的形成，这表现出更强的Keap1结合能力，并进一步激活Nrf2并上调NQO1。此外，图7D中经AmpFQ处理的LPS刺激的巨噬细胞的生物TEM图像仅观察到细胞质内的纳米颗粒。巨噬细胞中没有纳米纤维表明NQO1对QPA的还原切割可以忽略不计，并且在LPS刺激的巨噬细胞中形成的AmpF含量低。相比之下，图7E中在AmpFQB处理的LPS刺激的巨噬细胞的生物TEM图像中观察到明显的纳米纤维，表明由于NQO1水平的提高，QPA部分的有效还原裂解和多肽AmpF的形成。值得注意的是，流式细胞仪分析显示AmpFQ或AmpFQB在巨噬细胞中的摄取量相当，从而排除了摄取差异引起的不同形貌的多肽纳米结构的可能。WB测定与生物TEM研究的结合有力地证明了酶NQO1的表达与AmpFQB组装成纳米纤维之间的共生关系。
由于AmpFQB与Keap1的结合能力，直接通过AmpFQB-Keap1结合上调Nrf2和NQO1的途径也可能存在如图7F。为了验证AmpFQB-Keap1结合对促进NQO1表达上调的影响，我们估计了对照分子PFB处理的巨噬细胞中的NQO1水平。如图5F所示，由多肽FFPFF(PF)和PF-ETGE组成的共组装体PFB形成纳米粒子并且没有表现出NQO1响应性。图8中显示PFB和AmpFQB的细胞摄取相近，我们的WB分析表明，与AmpFQB相比，PFB处理的巨噬细胞中NQO1的水平大大降低，如图7C所示，从而证实了共生组装途径在改善NQO1表达中的主要作用。考虑到LPS刺激引起的NQO1细胞内水平略有提高，我们进一步研究了该系统在没有LPS刺激并含有天然细胞内NQO1水平的正常巨噬细胞中的酶-共生组装，如图7G。经AmpFQB处理的未受刺激的巨噬细胞的生物TEM图像也显示出相当数量的纳米纤维，这意味着QPA的还原裂解和促进多肽在具有正常酶水平的微环境下通过共生过程组装成纳米纤维。
DEX@AmpFQB的体外治疗效果
我们在溶液和细胞中的研究均表明组装系统的建立及其与酶表达的共生关系。随后我们研究了已建立的组装系统与药物DEX联合对急性肺损伤的治疗效果。我们致力于抗氧化酶水平上调对缓解ROS升高引起的DEX严重副作用的功效，以及活化Nrf2对促炎细胞因子分泌的抑制。将药物DEX包封到由AmpFQ和AmpFQB形成的纳米粒子中，包封率为20％，从而分别形成治疗剂DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB。图9A中UPLC研究证实了DEX@AmpFQB的NQO1响应特征，其中将NQO1添加到治疗剂溶液中导致QPA部分从多肽AmpFQ上还原裂解。DEX@AmpFQB的NQO1还原动力学研究表明，DEX在8小时内完全释放。通过AFM和TEM实验表征QPA还原裂解前后治疗剂的形态，如图9B-C和图5C,D所示。在QPA还原裂解之前，DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB的AFM图像显示纳米颗粒的平均直径为115±15nm，类似于单独的AmpFQ或AmpFQB。然而，从治疗剂中还原裂解QPA导致形成高度为6nm的纳米纤维。治疗剂的QPA还原裂解诱导的形态转变与AmpFQ和AmpFQB的形态转变一致，并归因于多肽AmpF的形成。在形态转变过程中，药物DEX从DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB中释放出来。如图9D和图6，治疗剂DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB的CD研究证明在QPA裂解之前和之后形成了无规卷曲和β-折叠，这也类似于AmpFQ和AmpFQB产生chQPA实现构象转变。
我们通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜研究表征了LPS刺激的巨噬细胞对治疗剂的细胞摄取，如图9E。流式细胞术分析显示，所有纳米颗粒处理的AmpFQ、AmpFQB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB都被巨噬细胞以几乎相同的量摄取，但高于多肽ETGE。这些结果表明肽纳米颗粒改善了细胞对ETGE部分的摄取。巨噬细胞对治疗剂的内化也表明多肽载体将DEX递送到巨噬细胞中。如图10，巨噬细胞的CLSM图像中2小时时溶酶体与治疗剂的共定位表明治疗剂主要通过溶酶体介导的内吞途径被巨噬细胞摄取。
我们随后评估了治疗剂在缓解ROS引起的副作用和下调促炎细胞因子方面的作用，如图9，F-H。利用CLSM研究了巨噬细胞的细胞内ROS水平。我们的结果表明，与天然巨噬细胞相比，LPS对巨噬细胞的刺激导致细胞内ROS水平增加，表明LPS诱导巨噬细胞的炎症反应。用DEX处理巨噬细胞导致ROS水平进一步提高，这与DEX处理引起ROS水平升高而引起的副作用一致。然而，多肽ETGE、AmpFQB和DEX@AmpFQB对刺激的巨噬细胞的处理降低了ROS水平，特别是对于AmpFQB和DEX@AmpFQB处理，ROS水平几乎降至天然巨噬细胞的水平。结果表明共生体组装系统在缓解DEX的ROS副作用中的作用。
此外，LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素1β和环氧合酶2的分泌是急性肺损伤导致高死亡率关键原因，通过ELISA检测分析。如图9H所示，用AmpFQB和DEX孵育巨噬细胞会使促炎细胞因子有所降低，表明具有潜在抗炎作用。特别是，通过DEX@AmpFQB处理LPS刺激的巨噬细胞导致促炎细胞因子水平非常低，这意味着DEX和AmpFQB在促炎细胞因子下调中的协同作用。有趣的是，在DEX@AmpFQ存在下巨噬细胞中促炎细胞因子没有明显降低，这可能是由于有限的NQO1水平和AmpFQ的形貌转变受到抑制，从而阻止了药物释放。然而，我们的细胞研究证明了治疗剂的细胞内化以及共生组装系统在缓解DEX的ROS副作用和防止促炎细胞因子分泌方面的作用。
DEX@AmpFQB的体内治疗效果
通过对LPS刺激的小鼠气管内注射治疗剂，进一步评估所得治疗剂对急性肺损伤的体内抗炎治疗作用如图11。在给药后2小时、4小时、8小时、16小时24小时，在成像系统下记录AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB在小鼠体内的生物分布。与游离多肽ETGE相比，AmpFQ和AmpFQB或治疗剂DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB给药组的小鼠显示出更强的荧光信号，从而表明多肽平台的递送效率提高。特别是，在给药后24小时，与AmpFQ和DEX@AmpFQ相比，AmpFQB和DEX@AmpFQB给药组导致荧光强度增加了大约2.5倍。这一结果意味着小鼠体内AmpFQB和DEX@AmpFQB的积累增强。此外，离体成像分析显示，从施用AmpFQB和DEX@AmpFQB的小鼠中解剖出的肺表现出强烈的荧光信号，表明AmpFQB和DEX@AmpFQB主要保留在肺部。相比之下，服用AmpFQ和DEX@AmpFQ的小鼠的荧光信号主要在肝脏中检测到。AmpFQB或DEX@AmpFQB积累和保留的改善归因于治疗剂的NQO1共生组装成纳米纤维，这通常会阻止肝脏对纳米颗粒的代谢。因此，我们的研究结果表明，在气管内给药时，所得到的治疗剂在肺部表现出显着的积累和滞留，从而允许将靶向药物递送到肺部以治疗急性肺损伤。
为了直接评估治疗剂的疗效，通过ELISA研究了支气管肺泡灌洗液和肺组织中与肺炎相关的促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的表达。如图11E，图12A和图13所示，与LPS刺激的小鼠相比，用AmpFQB和DEX治疗的小鼠的BALF和肺中促炎细胞因子的水平下调，表明AmpFQB和DEX分别具有独立的治疗作用。由于AmpFQB和DEX的组合治疗作用，给小鼠施用DEX@AmpFQB导致细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的分泌显着减少。通过评估小鼠肺组织中的ROS水平，揭示了治疗剂在缓解DEX的ROS相关副作用如图11F-G。使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯作为细胞内ROS探针，使用DEX@AmpFQB的小鼠肺部CLSM图像显示可忽略不计的荧光信号，而使用LPS和DEX显示出与ROS探针相关的强信号。这些结果有力地证实了DEX@AmpFQB在消除DEX的ROS副作用中的作用，这主要归因于抗氧化酶的表达和促炎细胞因子的下调。
我们通过苏木精/伊红染色进一步对肺组织进行了组织学分析，以确认治疗剂对急性肺损伤的治疗。如图11H所示，LPS刺激引起的肺损伤以间质和肺泡间隙变小以及肺泡壁增厚为特征。然而，给小鼠施用DEX@AmpFQB导致肺组织内的间质变大和肺泡恢复，从而证明该疗法成功治疗了肺损伤。值得注意的是，肺泡毛细血管屏障的通透性增加也是肺损伤的一个指标，通常会导致BALF中总细胞计数和蛋白质浓度增加。所图13B,C所示，给小鼠施用DEX@AmpFQB后，总细胞计数和蛋白质水平与健康小鼠相当，表明受伤的肺得到了恢复。此外，用DEX@AmpFQB治疗的小鼠肺组织的湿/干重比几乎与正常水平相同(图13D)，证实肺组织中的肺水肿已治愈。此外，如图14中的H&E染色分析表明治疗剂并未导致正常小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的主要器官明显损伤，表明治疗剂的系统性细胞毒性可以忽略不计。总体而言，我们的体内结果有力地证明了酶共生组装系统通过与药物DEX联合有效治疗急性肺损伤，从而为抗炎治疗提供了一种新策略。

Claims (10)

1.一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述多肽自组装药物递送载体为DEX@AmpFQB，制备步骤如下：
步骤1：多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE的合成；
1)将相对于Merrifield树脂2倍当量的Boc-Phe-OH、3倍当量的K2CO3和3倍当量的KI溶解于DMF中并加入含有Merrifield树脂的固相合成管，在60-80℃下摇动12-16小时，依次用95％乙醇、DMF和DCM洗涤树脂，利用DCM稀释的体积百分含量为30％的TFA脱掉Boc保护基团，从而使第一个氨基酸接到树脂上；
2)之后，通过常规的Fmoc固相合成法连接剩下的FFAmpF四个氨基酸，具体操作是，将相对于Merrifield树脂4倍当量的Fmoc保护的氨基酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中与接了第一个氨基酸的树脂反应1.5小时，用25％哌啶去除Fmoc保护基团；
3)在合成FFAmpFF之后，将N-末端Fmoc-保护基团保留在树脂上，用DCM稀释的50％TFA除去4-氨基脯氨酸的Boc-保护基团；
4)随后，将相对于Merrifield树脂4倍当量的醌丙酸、4倍当量的HATU和6倍当量的DIEA溶解于DMF中加入含有接了FFAmpFF的树脂的合成管中并反应1.5小时，接着用25％哌啶去除FFAmpQFF的N-末端Fmoc保护基团；
5)对于多肽AmpFQ-ETGE，通过常规Fmoc固相合成法连接相应的序列或功能部分；最后，使用体积比为35：6：9的TFA，茴香硫醚和TMSOTF组成的切割剂将多肽从树脂上裂解下来；
步骤2：通过将AmpFQ和AmpFQ-ETGE共组装制备AmpFQB；
首先将多肽AmpFQ和AmpFQ-ETGE冻干粉分别用pH为7.4的PBS缓冲液溶解制备得到浓度均为5mM的AmpFQ和AmpFQ-ETGE的多肽母液；通过90:10的体积比混合多肽AmpFQ的母液和多肽AmpFQ-ETGE的母液制备得到浓度为5mM的AmpFQB的母液；
步骤3：通过溶剂蒸发法制备DEX@AmpFQB；
将浓度均为5mM的DEX与AmpFQB按照摩尔比1：1分别溶解在HFIP中，然后在离心管中混合，在室温下用吹风机除去HFIP；然后，将离心管中剩余的DEX与AmpFQB粉末重新溶解在水中，通过离心去除沉淀物，从而制备得到了多肽浓度为5mM的DEX@AmpFQB。
2.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB的表征，包括NQO1酶还原实验、临界聚集浓度、圆二色性光谱、原子力显微镜和透射电子显微镜的表征，各种表征方法如下：
1)NQO1酶还原实验：向100μM DEX@AmpFQB的PBS缓冲溶液中快速加入5μg/mL的NQO1酶和200μM的NADH；DEX@AmpFQB与NQO1和NADH在37℃下孵育1、2、4、6和8小时后，DEX@AmpFQB与NADH在37℃下孵育0小时作为对照，利用UPLC-MS对DEX@AmpFQB进行分析；
2)临界聚集浓度：使用尼罗红作为荧光探针，DEX@AmpFQB的CAC值是基于在不同浓度的共组装体存在下尼罗红的最大发射波长的偏移来估算的；通过梯度稀释浓度为5mM的多肽母液获得不同浓度的多肽溶液；随后，将1μL，100μM的尼罗红乙醇溶液加入到每管多肽溶液中，得到含有浓度为100nM的尼罗红的样品，在测试前将所有样品放置过夜，最后利用Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计记录尼罗红的荧光光谱，激发波长为550nm；
3)圆二色性光谱：CD光谱由Biologic MOS-500光谱仪在25℃下使用2mm石英比色皿记录；DEX@AmpFQB的CD样品通过将5mM多肽母液稀释至200μM制备；DEX@AmpFQB在37℃条件下加入10μg/mLNQO1酶和500μM NADH反应12小时以上进行酶促还原实验；酶还原前后的DEX@AmpFQB的所有CD光谱扫描均以1.0nm的波长间隔和190至260nm的波长范围进行记录；
4)原子力显微镜：还原前后的DEX@AmpFQB的AFM图片是由CSPM 5500仪器在轻敲模式下拍摄的；DEX@AmpFQB的AFM样品是通过将多肽母液稀释至2mM的浓度制备的；NaBH4用作还原剂以还原DEX@AmpFQB，即将2mM的DEX@AmpFQB与10eq.的NaBH4在37℃条件下共孵育12小时以上；将10μL还原前后多肽溶液滴至新切割的云母片表面放置5分钟，然后用滤纸去除剩余的溶液并在大气条件下干燥后用于样品测试；
5)透射电子显微镜：TEM图像由HITACHI HT7700 Exalens显微镜在100kV的加速电压下记录；DEX@AmpFQB的TEM样品是通过将母液稀释至2mM的浓度制备的；NaBH4用作还原剂以还原DEX@AmpFQB；将2mM DEX@AmpFQB与10eq.的NaBH4在37℃条件下共孵育12小时以上；将8μL还原前后多肽溶液滴在碳涂层铜网上放置5分钟并用滤纸除去剩余溶液之后，滴加5μL,2wt％醋酸双氧铀溶液染色3分钟；将铜网放置于干燥器中干燥以备后期测试。
3.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB的体外细胞毒性的表征，通过使用标准MTT测试确定DEX@AmpFQB对RAW 264.7巨噬细胞和3T3细胞的细胞毒性，方法如下：
1)将所述RAW 264.7巨噬细胞或3T3细胞以每孔5000个的密度接种于含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的96孔板中；
2)孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的DEX@AmpFQB再共孵育48小时；其中所述不同浓度的DEX@AmpFQB的ETGE结构域的浓度分别为：0、0.39、0.78、1.56、3.13、6.255、12.5、25、50、75和100μM；或DEX部分的浓度分别为：0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、150和200μM；
3)随后，加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液并进一步培养4小时；
4)最后，去除上清液，每孔注入100μLDMSO溶解紫色晶体，在酶标仪上通过记录495nm处的吸收强度测量所述细胞的活力。
4.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB的细胞摄取的表征，通过流式细胞仪和共聚焦显微镜确定DEX@AmpFQB的细胞摄取情况，方法如下：
RAW264.7巨噬细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中，并在37℃下培养24小时；然后，向所述细胞中添加含有5％FAM标记多肽的治疗剂DEX@AmpFQB，其中FAM部分的剂量为10μM，ETGE结构域的剂量为20μM；孵育2、4、8h后，用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞并通过流式细胞仪进行分析。
5.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB的内/溶酶体逃逸的表征，通过共聚焦显微镜观察DEX@AmpFQB的内/溶酶体逃逸情况，方法如下：
RAW 264.7巨噬细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于共聚焦小皿中，并在37℃下培养24小时，然后，向细胞中添加含有5％FAM标记多肽的200μM治疗剂DEX@AmpFQB，孵育2、4、8h后，用PBS洗涤细胞3次后，将细胞与50nM Lyso-Tracker Red在37℃下孵育30分钟，4％多聚甲醛固定20min，DAPI染色20min后，PBS洗细胞3次，利用共聚焦激光扫描显微镜成像。
6.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB调控细胞内蛋白表达的表征，通过免疫蛋白印迹的方法验证DEX@AmpFQB调控细胞内蛋白表达的情况，方法如下：
对巨噬细胞暴露于治疗剂DEX@AmpFQB后细胞中Nrf2和抗氧化酶NQO1和HO-1的表达进行了蛋白质印迹研究；RAW264.7巨噬细胞以2×106的密度接种于10cm2细胞培养皿中在DMEM培养基中培养过夜，然后，RAW264.7巨噬细胞直接先用100ng/mL的LPS刺激1小时后再加入ETGE结构域和DEX的浓度分别为20μM和40μM的DEX@AmpFQB持续培养24小时，之后，将细胞用2％SDS处理并收集，通过Bradford蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度后，将蛋白质与上样缓冲液在100℃下孵育10分钟，随后，将每个样品中25μg的蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶并电泳转移到PVDF膜上，将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在相应的特异性一抗中在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，在Tanon-5200Multi仪器下用ECL化学发光检测试剂盒对蛋白条带进行成像。
7.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB调节细胞内ROS水平的表征，通过共聚焦显微镜验证DEX@AmpFQB对细胞内ROS水平的调节作用，方法如下：RAW264.7巨噬细胞接种于共聚焦小皿中，细胞密度为1×105个细胞/皿，37℃培养24小时，随后，RAW264.7巨噬细胞直接用PBS处理或先用100ng/mLLPS刺激1小时，再加入ETGE结构域和DEX的浓度分别为20μM和40μM的DEX@AmpFQB持续培养24小时，用PBS洗涤3次后，将细胞与10μM的DCFH-DA在无血清DMEM中孵育30分钟，最后，用PBS冲洗细胞，通过记录与ROS探针相关的荧光强度，利用共聚焦激光扫描显微镜检测细胞内ROS水平。
8.根据权利要求1述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB调节细胞内促炎因子的表征，通过ELISA检测验证DEX@AmpFQB调节细胞内促炎因子的情况，方法如下：
RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105个细胞/孔，37℃培养24小时，将100ng/mL LPS添加到含有巨噬细胞的6孔板中刺激1小时，随后，LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞用ETGE结构域和DEX的浓度分别为20μM和40μM的DEX@AmpFQB处理24小时，RAW264.7巨噬细胞用PBS洗涤3次后，用RIPALysis Buffer处理，3000r/min离心10min，收集上清液，按照制造商提供的标准说明，通过酶联免疫吸附测定分析上清液，对促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的分泌定量化，通过酶标仪监测450nm处的吸收强度记录数据。
9.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB在小鼠体内及五脏中分布的表征，通过活体荧光成像分析DEX@AmpFQB在小鼠体内及五脏中分布，方法如下：6-8周雌性BALB/c小鼠购自查尔斯河实验动物科技有限公司，所有体内实验均按照南开大学动物护理与使用委员会批准的方案进行；BALB/c小鼠气管内注射50μL，5mg/kg LPS溶液建立急性肺损伤动物模型，4小时后，对小鼠气管内注射含有100μM FAM标记多肽的治疗剂DEX@AmpFQB，在给药后2、4、8、16和24小时后，通过IVIS Lumina系统检测荧光强度，在24小时后，处死小鼠，并收集心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏主要器官用于离体成像和分析。
10.根据权利要求1所述的与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法，其特征在于，得到的多肽自组装药物递送载体DEX@AmpFQB调节体内促炎因子及改善LPS刺激肺组织的表征，通过ELISA检测，共聚焦显微镜及H&E染色后显微镜观察验证DEX@AmpFQB的体内抗炎功效，方法如下：
将雌性BALB/c小鼠用于研究治疗剂对小鼠急性肺损伤的治疗效果，对小鼠气管内注射50μL，5mg/kg LPS以诱导急性肺损伤，4h后，小鼠气管内注射ETGE结构域和DEX的浓度分别为20μM和40μM的DEX@AmpFQB；
收集小鼠支气管肺泡灌洗液BALF和肺组织，用于分析促炎细胞因子的表达、总细胞计数及总蛋白表达、肺组织中的ROS水平以及肺组织的H&E染色研究，小鼠给药后20小时安乐处死，收集小鼠左侧肺的BALF，并在4℃下15000rpm离心10分钟，收集上清液，分别用ELISA试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒测定TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2水平和总蛋白水平；此外，将从BALF收集的所得沉淀物重新悬浮在PBS中，通过自动细胞计数器计算总细胞数；
同时，在给药后20小时从安乐死的小鼠中每组收集9个肺组织用于以下分析：
i)将收集的三个肺组织用RIPA裂解缓冲液匀浆，用于肺组织内TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2含量的ELISA分析；
ii)取三份收集的肺组织，用PBS洗涤并用滤纸吸干后，记录湿重和80℃脱水72小时后的干重，用于测定湿/干重比；
iii)剩余的三个收集的肺组织中的一半用于组织层面ROS水平检测，将肺组织嵌入OCT化合物中并通过冷冻切片机切成厚度为8μm的肺组织切片，在4％多聚甲醛中固定30分钟，PBS洗涤3次后，DCFH-DA孵育30min，树脂密封切片，共聚焦激光扫描显微镜(NIKONA1+)分析成像；
iv)三个肺组织的另一半在4％多聚甲醛中固定并包埋在石蜡中，利用石蜡切片机将肺组织切成6μm的厚度，经H&E染色处理后，用光学显微镜对肺组织的切片进行成像；
为了确认治疗剂的生物相容性，将未受刺激的正常小鼠气管内注射ETGE结构域和DEX的浓度分别为20μM和40μM的DEX@AmpFQB，在给药后24小时对小鼠实施安乐死，之后，收集主要器官，包括心、肝、脾、肺和肾，并固定在4％多聚甲醛中，将组织包埋在石蜡中，切片，厚度为6μm；对组织切片进行H&E染色，并通过光学显微镜成像。
CN202111438093.2A 2021-11-30 2021-11-30 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法 Active CN114133430B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111438093.2A CN114133430B (zh) 2021-11-30 2021-11-30 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111438093.2A CN114133430B (zh) 2021-11-30 2021-11-30 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114133430A true CN114133430A (zh) 2022-03-04
CN114133430B CN114133430B (zh) 2024-04-05

Family

ID=80389549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111438093.2A Active CN114133430B (zh) 2021-11-30 2021-11-30 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114133430B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030138A2 (en) * 2003-09-26 2005-04-07 Webb Waring Institute Methods of modulating inflammatory reactions by modulating xanthine oxidoreductase activity
CN107216394A (zh) * 2017-06-21 2017-09-29 江南大学 一种小窝蛋白‑1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用
CN111153963A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 华南理工大学 抗炎五肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用
CN111233972A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 华南理工大学 一种抗炎三肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用
RU2739572C1 (ru) * 2020-12-06 2020-12-25 Игорь Юрьевич Малышев Модифицированный антивоспалительный макрофаг, способ его получения и применения
CN112957461A (zh) * 2021-02-02 2021-06-15 南开大学 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法
CN113144171A (zh) * 2021-03-24 2021-07-23 南开大学 一种氧化响应形貌转变多肽纳米药物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030138A2 (en) * 2003-09-26 2005-04-07 Webb Waring Institute Methods of modulating inflammatory reactions by modulating xanthine oxidoreductase activity
CN107216394A (zh) * 2017-06-21 2017-09-29 江南大学 一种小窝蛋白‑1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用
CN111153963A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 华南理工大学 抗炎五肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用
CN111233972A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 华南理工大学 一种抗炎三肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用
RU2739572C1 (ru) * 2020-12-06 2020-12-25 Игорь Юрьевич Малышев Модифицированный антивоспалительный макрофаг, способ его получения и применения
CN112957461A (zh) * 2021-02-02 2021-06-15 南开大学 一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法
CN113144171A (zh) * 2021-03-24 2021-07-23 南开大学 一种氧化响应形貌转变多肽纳米药物

Also Published As

Publication number Publication date
CN114133430B (zh) 2024-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Tumor‐exocytosed exosome/aggregation‐induced emission luminogen hybrid nanovesicles facilitate efficient tumor penetration and photodynamic therapy
Rico et al. Diruthenium (II, III) metallodrugs of ibuprofen and naproxen encapsulated in intravenously injectable polymer–lipid nanoparticles exhibit enhanced activity against breast and prostate cancer cells
Li et al. Histology and antitumor activity study of PTX-loaded micelle, a fluorescent drug delivery system prepared by PEG-TPP
Wang et al. A theranostic nanoplatform: magneto-gold@ fluorescence polymer nanoparticles for tumor targeting T 1 & T 2-MRI/CT/NIR fluorescence imaging and induction of genuine autophagy mediated chemotherapy
Rao et al. ROS-responsive mesoporous silica nanoparticles for MR imaging-guided photodynamically maneuvered chemotherapy
Fisichella et al. Uptake of functionalized mesoporous silica nanoparticles by human cancer cells
CN112402622B (zh) 靶向pd-l1的抗肿瘤多肽纳米药物载体及其应用
Huang et al. Hypoxia-triggered gene therapy: A new drug delivery system to utilize photodynamic-induced hypoxia for synergistic cancer therapy
Ma et al. Size‐transformable bicomponent peptide nanoparticles for deep tumor penetration and photo‐chemo combined antitumor therapy
Sun et al. Manipulating endogenous exosome biodistribution for therapy
Zeng et al. HCPT-peptide prodrug with tumor microenvironment-responsive morphology transformable characteristic for boosted bladder tumor chemotherapy
Yang et al. Photocontrolled chondrogenic differentiation and long-term tracking of mesenchymal stem cells in vivo by upconversion nanoparticles
Wu et al. A transformable gold nanocluster aggregate-based synergistic strategy for potentiated radiation/gene cancer therapy
Shu et al. Cobalt protoporphyrin-induced nano-self-assembly for CT imaging, magnetic-guidance, and antioxidative protection of stem cells in pulmonary fibrosis treatment
CN113144171B (zh) 一种氧化响应形貌转变多肽纳米药物
Shen et al. High rapamycin-loaded hollow mesoporous Prussian blue nanozyme targets lesion area of spinal cord injury to recover locomotor function
CN113004536A (zh) 一种金属-氨基酸/肽配位聚合物及其应用
CN114133430A (zh) 一种与酶共生增强炎症治疗的多肽自组装药物递送载体的制备方法
Chen et al. Theranostic nanosystem mediating cascade catalytic reactions for effective immunotherapy of highly immunosuppressive and poorly penetrable pancreatic tumor
CN109453364A (zh) 一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用
CN112939905B (zh) 一种具有聚集诱导发光性质的化合物及其制备方法和应用
CN114560913A (zh) 一种用于癌症治疗的多肽探针及其制备方法和应用
US20120207681A1 (en) Chemical compositions to detect and treat amyloid in a patients brain and retina
Zheng et al. Hypoxia-responsive calixarene-grafted self-assembled peptide hydrogel for inflammation suppression in ischemic stroke
Xu et al. Cu2+-pyropheophorbide-a-cystine conjugate-mediated multifunctional mesoporous silica nanoparticles for photo-chemodynamic therapy/GSH depletion combined with immunotherapy cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant