CN104350109A - 官能化的硅纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及硅纳米颗粒、包含硅纳米颗粒的医药组合物、合成所述硅纳米颗粒的方法和其用于体内诊断、药物递送的可视化或细胞、生物过程或生物学通路的染色的用途。所述硅纳米颗粒的特征在于，它们包含大小为1到10nm的硅核芯并且由烯丙胺或包含不多于10个烯丙胺基团的聚(烯丙胺)封端。

Description

官能化的硅纳米颗粒
技术领域
本发明涉及硅纳米颗粒、包含所述硅纳米颗粒的医药组合物、合成所述硅纳米颗粒的方法和其用于靶向体内诊断或药物递送以及细胞、生物过程或生物学通路的可视化或染色的用途。
背景技术
数字成像技术在各种科学领域中使用已达几十年。随着科学发展，对于用于成像技术的新仪器和技术有巨大需求。成像技术包括光/荧光成像、x射线成像、磁共振成像(MRI)、超声、微波、X射线计算机断层摄影(CT)、正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)。
生物成像描述用以研究生物分子、细胞、器官系统及整个生物体的综合功能的成像技术。成像技术利用分子探针或与分子的相互作用。
也已出现以新的计算方法为支撑的先进多模态成像技术。这些新的成像技术能够检查与功能数据(如电磁领域所述)、机械运动、和代谢机制相关联的解剖学结构。
生物成像用于但不限于体内诊断、药物递送的可视化及细胞染色。也可以可视化生物学通路和生物过程。
已证实大小及形状均匀的纳米颗粒(优选直径为3-5nm)是一种有效的生物成像工具。纳米颗粒具有高的面积体积比；它们是活性高的好催化剂且附着到生物分子。硅是一种优选材料，因为硅是惰性的、无毒、丰富且经济。硅表面可以被官能化。硅纳米颗粒在电磁谱的可见光部分显示出高效的光致发光性，且具有生物惰性以及化学稳定性。具有类似生物相容性的唯一材料是多孔硅。小于100nm的颗粒在肿瘤中显示出增强的渗透以及保持效应(EPR效应)，这是一种重要的非特异性靶向效应。
硅纳米颗粒，也称为硅量子点，可以用在成像技术中，也可用于LED、光生伏打电池(photovoltaics)、锂离子电池、晶体管、聚合物或双光子吸收。
Wang等人(Bioconjug.Chem.20044；15:409-12)已显示了硅纳米颗粒与核苷酸的有效偶合。核苷酸由此获得发光标记。也已显示，硅量子点可以偶合到抗生蛋白链菌素，抗生蛋白链菌素保留了硅量子点与生物素结合的能力。硅量子点-蛋白质络合物中保留了蓝光发射(Choi等人：Bioconjug.Chem.2008；19:680-85)。
Erogbogbo等人(Bioconjug.Chem.2011；22(6):1081-8)已描述了癌细胞的标记。硅量子点被结合到赖氨酸、叶酸、间皮素抗体(antimesothelin)或脱铁运铁蛋白进行细胞标记。
然而，仍存在有关纳米颗粒毒性的重要的安全性考虑。Fujioka等人已对硅量子点的细胞毒性及成像特性进行了研究。与镉系量子点相比，硅量子点显示出对HeLa细胞的有效标记以及更低的毒性(Nanotechnology2008；19(41):415102)。
Choi等人与硅微粒相比对硅纳米颗粒的毒性及炎症可能性进行了研究。当在相同浓度下比较时，虽然微粒(10到3000nm)细胞毒性要低，但硅纳米颗粒(3nm)显示出显著更低的每颗粒的细胞毒性。在高浓度下，硅纳米颗粒也显示出低的炎症应答(Choi等人：J.Appl.Toxicol.2009；29:52-60)。
尽管已进行了大量研究，Rivolta等人强调，硅纳米颗粒仍然需要在生理介质中达到更佳的稳定性，且需要进行更多的毒性研究(BONSAI ProjectSymposium；AIP Conference Proceedings2010；1275:94-97)。
Tu等人通过PET研究了葡聚糖涂覆的64Cu-DO3A结合的硅纳米颗粒的生物相容性和血浆清除率。生物相容性和血浆清除率是临床应用的重要参数。虽然纳米颗粒也经由肾脏过滤及膀胱从身体排泄，但它们主要积聚在肝脏(ACS Med.Chem.Lett.2011,2:285-288)。
发明内容
本发明的目的是提供低毒性且安全的硅纳米颗粒，其显示出快速分布和快速清除率，可用于高分辨率成像技术。本发明也旨在提供一种用于制造硅纳米颗粒的方法以及它们用于靶向体内诊断、靶向体内治疗、药物递送的可视化或细胞、生物过程或生物学通路的染色的用途。
本发明提供硅纳米颗粒，其特征在于其包含大小为1到10nm的硅核芯并且由烯丙胺或包含不多于10个烯丙胺基团的聚(烯丙胺)封端。
所述纳米颗粒可以被单官能化或多官能化。
所述官能团可选自包含下列的组：发光化合物、荧光化合物、光吸收化合物、放射性化合物、使用x射线可视化的金属化合物、使用磁共振成像(MRI)可视化的化合物、使用超声或微波可视化的化合物、可用于光成像的发光/荧光材料、通过X射线计算机断层摄影(CT)成像的对比度赋予剂(contrast-giving agent)或可通过正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像的同位素。
在本发明意义内的“单官能化”意指一类官能团被结合到纳米颗粒的表面。因此，这一类的不同官能团(例如，不同的荧光化合物)或仅一种特定官能团(例如一种特定荧光化合物)均是可以的。结合量是可变的。各自官能团的仅一些被结合是可能的。整个表面被官能团所饱和也是可能的。
在本发明意义内的“多官能化”意指至少两种不同类的官能团被结合到纳米颗粒的表面。再次，仅一些官能团可以被结合，或整个表面可以饱和有官能团。各自官能团的比例也是可变的且可通过在官能化纳米颗粒的合成期间改变不同官能团的浓度来加以调整。因此，使用允许多于一个的官能团的定向附着的方法来加入官能团。
硅纳米颗粒可至少包含荧光化合物Kodak X-Sight-670和/或放射性化合物64Cu。
纳米颗粒可以被结合到选自包含毒素、放射性核素和化学治疗药物的组的靶向分子和/或治疗相关的分子，且X射线对比度赋予剂可包括碘化的化合物或基于钆的化合物。
硅纳米颗粒可被结合到或包含至少一种生物分子，所述生物分子选自包含肽、蛋白质、糖分子、核酸或核酸类似物的组，其结合到纳米颗粒。
所述蛋白质可以是抗原、抗体、受体或配体。
另外地，所述纳米颗粒被结合到蛋白质、脂质、表面活性剂、诸如全氟丙烷或六氟化硫的聚合物封装气体中的至少一种。
对比度赋予材料包含至少一种顺磁性材料，所述顺磁性材料选自包含稀土元素、钆、锰、铁和铜络合物的组，且用于X射线计算机断层摄影的对比度赋予剂可包含钡盐和/或多金属氧酸盐。
对于PET核素，它们可选自包含64Cu、68Ga、86Y、89Zr、110In或18F系示踪剂的组，且SPECT核素可选自包含67Ga、99mTc、111In或201Tl的组。
医药活性化合物可被结合到纳米颗粒。本发明意义内的医药活性化合物意指带来药理效应的任何化合物。药理效应可为单个效应，例如细胞生长抑制效应。所述效应也可为广泛的效应，例如对病原体的免疫应答的改善。
本发明还提供一种医药组合物，其包含硅纳米颗粒以及医药上适宜的载体。根据本发明的医药上适宜的载体意指与纳米颗粒相容且不毒害接受者的任何添加剂、赋形剂或封装剂。医药上适宜的载体可以是能够与纳米颗粒共同施用以便于应用的任何有机或无机化合物。
还提供一种用以合成硅纳米颗粒的方法。所述方法包括以下步骤：混合表面活性剂和溶剂并超声处理所述混合物以形成微团(micelles)，添加SiCl4并进行超声处理，添加还原剂以形成氢封端的硅纳米颗粒并进行超声处理，在催化剂的存在下添加烯丙胺或包含不多于10个烯丙胺基团的聚(烯丙胺)并进行超声处理，和提取并纯化所得的硅纳米颗粒。
在各步骤中的超声处理可以同时进行或在相应步骤随后进行。
所述方法包含四辛基溴化铵作为表面活性剂、甲苯作为溶剂、LiAlH4作为还原剂以及H2PtCl6作为催化剂。
所述纳米颗粒可用于生物成像。
所述药物也可用于生物成像。
生物成像可用于体内诊断、药物递送的可视化或染色、细胞、生物过程或生物学通路的可视化或染色。
还提供所述纳米颗粒用于化学治疗的用途，其中选自包含顺氯氨铂、卡铂、氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)或阿霉素(doxorubicin)的组的化学治疗剂被结合到所述纳米颗粒。
所公开的纳米颗粒也可用于放射性核素治疗，其中使用射电金属络合物，其包含选自67Cu、90Y、131I、153Sm、166Ho、177Lu、186Re或188Re的组的治疗相关的放射性核素。
所公开的纳米颗粒也可用于分子成像和疾病靶向治疗的组合，其中靶向治疗应意指特定细胞或组织的治疗以及例如阻断细胞分裂或其相关途径的特定途径或分子相互作用。
附图说明
本发明将通过附图予以说明，但并不限于这些图。其中显示：
图1：1A：硅纳米颗粒的吸收光谱。
1B：以氨基封端的硅纳米颗粒在不同激发波长下的发射光谱。
图2：2A：硅纳米颗粒的寿命谱。
2B：硅纳米颗粒的FTIR谱。
图3：经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒和Kodak-XS-670(内插图)在水中的吸收光谱。
图4：使用经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒的NMRI nu/nu小鼠的体内荧光图像(Kodak体内成像系统FX)。
图5：单次静脉注射经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒后5分钟(A)、60分钟(B)及24小时(C)NMRI nu/nu小鼠的离体全身冷冻切片(80μm)荧光图像。
图6：单次静脉注射200μL经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒后2小时裸小鼠的典型2D荧光图像上的ROI(膀胱、心脏、肠、肿瘤、肌肉)的轮廓图。
图7：经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒注射前(0分钟)以及长达2小时每5分钟测量的2D近红外(NIR)荧光(激发670nm、发射790nm、每一帧的测量持续时间5分钟)图像。
图8：单次静脉注射经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒后典型小鼠的ROI中体内荧光强度的动力学。
图9：NMRI nu/nu带有肿瘤(FaDu)小鼠中的荧光强度动力学的肿瘤相对于肌肉比例的时间曲线。
图10：使用经64Cu放射性标记的含DMPTACN硅纳米颗粒的NMRInu/nu小鼠的小动物PET图像(1、5及60分钟)的典型最大强度投影图。
图11：经64Cu标记的硅纳米颗粒(含DMPTACN的硅纳米颗粒)(NAP1-小鼠1，NAP2–小鼠2)及64Cu-TETA(TETA1–小鼠3，TETA2–小鼠4)的积聚动力学，在四种小鼠的膀胱中进行比较。
具体实施方式
官能化是通过化学合成方法将官能团添加到材料的表面。所添加的官能团可经过普通合成方法将几乎任何种类的化合物附着于表面上。硅纳米颗粒可以被发光化合物、荧光化合物、光吸收化合物、放射性化合物、使用x射线可视化的金属化合物、使用磁共振成像(MRI)可视化的化合物、使用超声或微波可视化的化合物、可通过X射线计算机断层摄影(CT)或正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像的同位素官能化。使用相同的策略也可以进行多模态成像。使用例如毒素、放射性核素和化学治疗药物等治疗剂对硅纳米颗粒进行官能化将能够实现治疗应用。
因此，可以用某一特定应用所需要的相关官能团对颗粒进行官能化，例如靶向一类特殊组织或细胞的一种基团以及作为报导基团(reporter group)的另外的基团，如染料或荧光化合物或放射性标记或对比度增强单元。
本发明意义内的生物成像是指对生物结构的非侵入性标记，所述生物结构例如生物分子、全细胞或亚细胞结构、器官系统、肿瘤组织等组织或整个生物体。也可以可视化生物学通路和过程。
生物成像可用于但不限于体内诊断、药物递送的可视化及细胞、生物学通路和过程的染色。
本发明意义内的体内诊断包含成像技术，其旨在标记特定的生物结构，例如生物分子、全细胞或亚细胞结构、器官系统或肿瘤组织等组织，以在细胞水平诊断疾病或失调。就此而言，造影剂、抗体或纳米颗粒是在检查之前或期间施用的示例性分子。
药物递送包括施用医药组合物以在人体或动物中达成治疗效果。生物成像可用于药物递送的可视化在于医药组合物被如上所述标记且通过成像技术监控施用情况。
细胞染色可以用相同的方式进行。全细胞或亚细胞结构被如上所述标记且通过成像技术可视化。
治疗处理可以如下进行：将经金属结合配体修饰的硅纳米颗粒与治疗性放射性核素、毒素以及化学治疗药物组合，并在患有肿瘤或其他阻留纳米颗粒的病灶的患者中施用。
靶向分子应包含将纳米颗粒导向特定细胞、细胞结构或组织的分子，以及例如靶向特定细胞通路且因此阻断肿瘤生长或扩散的分子。
合成和表征
合成
使用Warner等人所报导的方法的改进制备硅纳米颗粒。将1.5g四辛基溴化铵与100ml无水甲苯混合，混合物在N2手套箱中超声处理30分钟。通过气密注射器加入100μl SiCl4，并继续超声处理30分钟，允许其进入微团中。随后，加入2.3mL LiAlH4(1M，在THF中)，以形成氢封端的硅纳米颗粒。超声处理30分钟后，加入无水脱气甲醇(30ml)，以与过量的LiAlH4反应。
在40μl0.05M H2PtCl6催化剂的存在下，在脱气烯丙胺(2.7g)与氢封端的硅纳米颗粒的反应中获得烷基胺封端的纳米颗粒。超声处理30分钟后，将3-氨基-丙基硅纳米颗粒用水提取，用乙酸乙酯洗涤并通过注射器膜过滤器(Millex，Millipore，PVDF，0.45μm)过滤两次。所得的硅纳米颗粒进一步通过对水透析纯化(MWCO7000，SERVA，Membra-Cel透析管，直径22mm)，以移除任何残留的未反应的氨基烯烃和表面活性剂。
硅纳米颗粒的表征
这些颗粒的表征与Manuel Tsotsalas博士合作进行。这些包括FTIR、NMR和HRTEM。除此以外，进行完整的光物理表征。这些结果显示于图1和图2中。
这些结果确认了硅纳米颗粒的形成。IR数据中的1661cm-1可归因于烯丙胺振动，且其清楚地显示对Si表面的附着。1000cm-1到1100cm-1之间的峰可归因于Si-OR振动。这些赋值是基于文献。
实施例
本发明将通过以下实施例进行说明，但并不限于这些实施例。所示实施例涉及体内实验。
实施例1：经荧光团标记的硅纳米颗粒(经Kodak-XS-670标记的纳米颗粒) 的制备和体内表征
将36μL氨基封端的硅纳米颗粒(c＝2mg/mL)加入964μL磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.5)中。然后，加入1mg(0.88μmol)KODAKX-Sight-670四氟苯基酯，且将混合物在室温下搅拌3小时。通过透析(MWCO7000，Serva，Membra-Cel)分离出未反应的材料，直到溶剂变成无色(8次，在8小时循环中每次300mL H2O)。将20μL含XS-670的硅纳米颗粒加入680μL H2O(C～0.025mg/mL)并记录吸收光谱。自图3可看出，含XS-670的硅纳米颗粒具有与游离染料相同的吸收光谱。使用水溶液(～870μg XS-670-Si-纳米颗粒/mL)进行体内实验。在典型的实验中，将200μL此溶液施用到NMRI nu/nu小鼠。在5分钟、1小时及24小时(图4)后，使用经Kodak-XS-670标记的硅纳米颗粒的NMRI nu/nu小鼠的体内荧光图像用Kodak体内成像系统FX曝光。并行地，于5分钟、1小时或24小时后用牺牲的小鼠进行利用NMRI nu/nu小鼠的冷冻切片(80μm厚)的离体研究。图像(图5)显示，经Kodak-XS-670标记的纳米颗粒通过肾脏快速消除进入膀胱中。所述颗粒在具有淋巴系统的身体部位短暂地观察到。然而，24小时后，在体内检测不到源自所述颗粒的荧光，仅在膀胱检测到痕量。
在单次静脉注射200μL经Kodak-XS-670标记的纳米颗粒后，在带有肿瘤(FaDu)NMRI nu/nu小鼠中对经Kodak-XS-670标记的纳米颗粒的快速分布进行更详细的动态研究。在吸入麻醉(9％地氟烷，30％氧气)的小鼠(体温37℃)中在注射前(0分钟)及长达2小时内每5分钟测量2D近红外(NIR)荧光(激发670nm、发射790nm、每一帧5分钟的测量持续时间)。通过ROVER软件(ABX GmbH，Radeberg，Germany)测量图像中(见图6)代表心脏、肿瘤、肌肉、肠和膀胱的不同区域的荧光强度。设置用于界定相关二维区域(ROI)的遮罩，所述ROI用阈值界定，并且得出ROI时间活性曲线(TAC)用于随后的数据分析。使用荧光强度(单位/cm2)和标准化到最大值的数据进行进一步分析。多个帧(图7)显示纳米颗粒在膀胱的快速积聚且在胸腔区域强度降低。2小时后的荧光强度在膀胱中最高，随后是肠、肿瘤、心脏和肌肉。时间荧光曲线(图8)的动力学分析显示在所有所测量区域中的清除，半排出期(half-lives)为24分钟(胸腔-心脏)、22分钟(肌肉)、25分钟(肿瘤)。如果所测量区域靠近表面(皮肤)，体内的这些纳米颗粒动力学荧光信号与使用小动物PET的定量测量非常一致(64Cu标记的纳米颗粒的半排出期在肌肉中为18分钟)。荧光测量结果中所测量的半排出期的类似值可以由血液中经Kodak-XS-670标记的纳米颗粒的显性效应加以解释。值得注意的是，肿瘤相对于肌肉的荧光强度的关系显示出随时间持续增强(图9)。
实施例2：经 64 Cu标记的硅纳米颗粒(含DMPTACN的硅纳米颗粒)的制备 和体内表征
将在200μL水中的0.7mg(1.4μmol)2-[4,7-双(吡啶基甲基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基]-N-(4-异硫氰酰苯基)-乙酰胺(DMPTACN-Ph-NCS)作为双官能螯合剂加入溶解在NaHCO3缓冲液(10mM，pH＝8.3)中的0.5mL氨基封端的硅纳米颗粒(c＝2mg/mL)中。将混合物在室温下搅拌24小时。使用透析(MWCO7000，SERVA，Membra-Cel)进行含DMPTACN-Ph-硫脲的硅纳米颗粒的纯化。在减压下浓缩透析液。将残余物溶解于100μL水/乙腈(1/1)中并通过HPLC分析。透析重复五次，在8小时循环中每次500mL H2O。之后，通过HPLC(Jupiter proteo4μm C12(Phenomenex)，250×4.6mm；洗脱液A(含0.1％三氟乙酸的乙腈)，洗脱液B(含0.1％三氟乙酸的水，洗脱梯度，于60分钟内10％A到100％，1mL/min，tR(DMPTACN-Ph-NCS)＝20.6分钟)检测不到DMPTACN-Ph-NCS。然后在减压下浓缩渗余物。将含DMPTACN-Ph-硫脲的硅纳米颗粒(100μg于160μL中)溶解于2-[N-吗啉基]乙烷磺酸(MES)-NaOH缓冲液中(0.02M，pH＝6.2，c＝625μg纳米颗粒/mL)。对于生物分布和小动物PET实验，在室温下用[64Cu]CuCl2(40MBq于0.01HCl中)对溶解于250μL MES-NaOH缓冲液中的100μg含DMPTACN-Ph-硫脲的硅纳米颗粒进行放射性标记30分钟。为了去除非特异性结合的放射性，将10μL的10mM TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)水溶液加入经放射性标记的硅纳米颗粒中并在室温下培育10分钟。通过HPLC((Jupiter proteo4μm C12(Phenomenex)，250×4.6mm；洗脱液A(含0.1％三氟乙酸的乙腈)，洗脱液B(含0.1％三氟乙酸的水，洗脱梯度，于30分钟内10％A到100％，1mL/min，tR(64Cu-TETA)＝4.1分钟，tR(64Cu-DMPTACN-硅纳米颗粒)＝12.3min)进行经64Cu标记的硅纳米颗粒的纯化。将用于HPLC的溶剂在真空中蒸发，之后将经64Cu标记的硅纳米颗粒溶解于等渗氯化钠溶液中。
经1分钟将在0.5mL等渗NaCl溶液中的20MBq64Cu-硅纳米颗粒经静脉施用入NMRI nu/nu小鼠的尾部静脉内。通过吸入在30％氧气/空气(气体流量，1L/min)中的地氟烷(10％优宁(Suprane))将小鼠(体重40±3g)麻醉。将小鼠俯卧放置并固定，它们的中轴平行于扫描仪(P4，Siemenspreclinical solutions，Knoxville，TN，USA)的轴。对于衰减校正，在示踪剂注射和发射扫描收集前使用旋转的57Co点源获得10分钟的透射扫描。在用扫描仪交叉校准的井式计数器中测量1mL注射器中的注射溶液的放射性。启动120分钟PET获取的发射扫描，延迟30秒启动放射性示踪剂的输注。使用套针(needle catheter)利用Harvard Apparatus44注射器泵(HarvardApparatus,Holliston,Ma,USA)将约1MBq/动物的0.5mL等渗溶液的溶液经1分钟输注入尾部静脉中。以3D列表模式进行数据获取。连续地收集发射数据。将列表模式数据分类为32帧的正弦图(15×10s、5×30s、5×60s、4×300s、3×600s)。数据经衰变、散射及衰减校正。使用FastMAP算法(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN)通过施加到3D正弦图(OSEM3D)的Ordered Subset Expectation Maximization(14个子集，15个OSEM3D迭代，25个最大后验(posteriori)(MAP)迭代，及1.8mm分辨率)重建各帧。像素大小为0.07×0.07×0.12cm，且视野中心的分辨率为1.8mm。未对部分体积和恢复效应进行校正。将图像体积数据转换成SiemensECAT7格式以进行进一步的处理。然后使用ROVER软件(ABX GmbH,Radeberg,Germany)处理图像文件。设置用于界定相关三维区域(ROI)的遮罩，所述ROI用阈值界定，并且得出ROI时间活性曲线(TAC)用于随后的数据分析。使用R(根据免费软件基金会(Free Software Foundation)的GNU通用公共许可证(General Public License)以源代码形式作为免费软件可获得的R)和特别开发的程序包(van den Hoff,Helmholtz-ZentrumDresden-Rossendorf,Dresden,Germany)对ROI数据和TAC进行进一步分析。在ROI中计算标准化更新值(SUVPET,SUVPET＝(活性/mL组织)/(注射活性/体重)，mL/g；g/mL)以及注射活性的分数。图10显示注射后1、5和60分钟时64Cu-DMPTACN-硅纳米颗粒的分布。颗粒快速分布并通过肾脏从血液中清除。1小时后，主要的活性量位于膀胱(图11中所示的定量数据)和肾脏中。总而言之，64Cu-DMPTACN-硅纳米颗粒的生物分布和药代动力学非常类似于经64Cu标记的亲水性螯合剂TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)。
实施例3：经 64 Cu标记的硅纳米颗粒(含NOTA的硅纳米颗粒)的制备和体 内表征
将1mg(1.8μmol)S-2-(4-异硫氰酰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(SCN-Bn-NOTA)作为双官能螯合剂加入溶解在硼酸盐缓冲液(0.1M，pH＝9.2)中的0.5mL氨基封端的硅纳米颗粒(c＝2mg/mL)中。将混合物在室温下搅拌24小时。使用透析(Pierce Slide A-Lyzer Cassette(MWCO＝7000g/mol),2×PBS400mL,1×H2O400mL)进行含NOTA的硅纳米颗粒的纯化。在减压下浓缩透析液。将残余物溶解于100μL水/乙腈(1/1)中并通过HPLC分析。通过超速离心纯化后，通过HPLC(ZORBAX300Extend-C185μm,4.6×250mm；洗脱液A(含0.1％三氟乙酸的H2O)，洗脱液B(含0.1％三氟乙酸的乙腈，洗脱梯度，于20分钟内90％A到10％，1mL/min，tR (SCN-Bn-NOTA)＝13.697分钟)检测不到SCN-Bn-NOTA。然后在减压下浓缩渗余物。将含NOTA-硫脲的硅纳米颗粒溶解于2-[N-吗啉基]乙烷磺酸(MES)-NaOH缓冲液中(0.05M，pH＝5.5，c＝400μg纳米颗粒/mL)。对于生物分布和小动物PET实验，在室温下用[64Cu]CuCl2(40MBq于0.01HCl中)对溶解于250μL MES-NaOH缓冲液中的100μg含DMPTACN-Ph-硫脲的硅纳米颗粒进行放射性标记30分钟。在反应结束时，将10μL的10mMTETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)水溶液加入经放射性标记的硅纳米颗粒中并在室温下培育10分钟以去除非特异性结合的放射性。(ZORBAX300Extend-C185μm,4.6×250mm；洗脱液A(含0.1％三氟乙酸的H2O)，洗脱液B(含0.1％三氟乙酸的乙腈，洗脱梯度，于20分钟内90％A到10％，1mL/min，tR(64Cu-NOTA-硅纳米颗粒＝11.72分钟)。将用于HPLC的溶剂在真空中蒸发，并将64Cu标记的硅纳米颗粒溶解于等渗氯化钠溶液中。经1分钟将在0.5mL等渗NaCl溶液中的20MBq64Cu-NOTA-硅纳米颗粒经静脉施用入NMRI nu/nu小鼠的尾部静脉内。64Cu-NOTA-硅纳米颗粒的生物分布和药代动力学与64Cu-DMPTACN-硅纳米颗粒的相当。
实施例4：经 90 Y标记的硅纳米颗粒(含DOTA的硅纳米颗粒)的制备和体内 表征
将40μL(291μg,0.4μmol)(S)-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N’’,N’’’-四乙酸(NH2-Bn-DOTA)溶解于1mL0.5M NH4OAc缓冲液(pH＝6.8)中。然后，添加在0.04HCl中的30μL[90Y]YCl3(120MBq)，且将溶液在恒温混合器中于95℃下搅拌20分钟(1000rpm)。借助SepPak PlusC18滤筒(Waters,USA)进行经90Y标记的NH2-Bn-DOTA的纯化。用10mLNH4OAc缓冲液(pH＝6.5,0.05M)分离出未结合的90Y3+后，用1.5mL乙腈/水(80/20v/v)选择性洗脱[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA。在氮气流下将溶液蒸发到干燥。将残余物溶解于100μL MES-NaOH缓冲液中，且通过Radio-HPLC(Phenomenex Aqua-C18,5μm,4.6×250mm；洗脱液：50mM NH4OAc于水/乙腈＝95/5中，等度洗脱，1mL/min,(90YIII,tR＝3.8min；[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA-异构体1，tR＝9.1min；[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA-异构体2，tR＝11.9min；根据Schlesinger等人的异构体：Bioconjugate Chem.2008；19:928-39)以及Radio-TLC(50mM NH4OAc于水/乙腈＝90/10中，于二氧化硅板上([90Y]YCl3,Rf＝0；[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA,Rf＝0.7)检查纯度。使用Radio-HPLC测得放射化学产率高于99％。
向溶解于150μL MES-NaOH缓冲液(pH＝5.5)中的100μg羧酸封端的硅纳米颗粒中，加入1mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，且将混合物在室温下在恒温混合器中培育10分钟。向此溶液中，加入100MBq[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA，且将混合物在室温下搅拌3小时。使用透析(Pierce Slide A-Lyzer Cassette(MWCO＝7000g/mol),2×PBS400mL,1×H2O400mL)进行经90Y标记的含DOTA的硅纳米颗粒的纯化。在减压下浓缩透析液。将残余物溶解于100μLMES-NaOH缓冲液中并通过HPLC分析。通过超速离心纯化后，通过Radio-HPLC检测不到游离[90Y]Y-NH2-Bn-DOTA。使用氮气流蒸发溶剂，且将经90Y标记的硅纳米颗粒溶解于等渗氯化钠溶液中。使用比活性为10到200MBq/μg硅纳米颗粒的溶解于等渗氯化钠溶液中的经90Y标记的硅纳米颗粒进行体内研究。
动物组群：将诸如人鳞状细胞癌细胞或前列腺癌细胞等致瘤人癌细胞皮下植入于腿或颈部区域或使用立体定向手术将人脑癌细胞植入于若干无胸腺裸小鼠的脑部中，并允许8到24天发展成肿瘤。选择肿瘤直径在6到12mm(体积约为1cm3)的小鼠进行研究。在研究中施用约0.2ml的经90Y标记的含DOTA硅纳米颗粒(0.5到5MBq)。
生物分布：使用SPECT、切开术或放射自显影术(autoradiography)在3周的不同时间点上在小鼠中进行使用经90Y标记的含DOTA硅纳米颗粒的生物分布研究，以评估90Y含量。安乐死后立即在各时间点上使用小动物SPECT/CT进行放射性核素成像。
对于SPECT图像的解剖定位，获取X射线CT数据；通过制造商所提供的算法重建体积CT图像。安乐死后，分离出主要的器官，包括心、肺、脑、肝、胰、肾、小肠和肠，切除肿瘤，并解剖骨(股骨)、皮肤和肌肉样本。将这些样本称重并以合适的标准使用经校准的伽马闪烁计数器计数，或将样本溶解于组织增溶剂中并用过氧化氢和高氯酸盐漂白，随后加入闪烁体并在闪烁计数器中计数，以确定经特异性放射标记的纳米颗粒在各器官中的定位。闪烁计数的结果表达为每克组织的注射剂量的百分数(％ID/g)或SUV(g/mL)且修正物理放射性核素衰变。为了确定90Y-纳米颗粒的生物分布的不同，使用SPSS11软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计分析(Student’s t test)。
放射自显影术：将肿瘤组织样本立即冷冻于-60℃并包埋于组织培养基中。将组织样本以20μm的厚度冷冻切片。将切片安放在玻璃盖玻片上，置于卡板上，并在存储磷光体图像板上曝光1到12小时。然后用成像系统对板进行扫描。
存活研究：存活研究最少涉及三组群小鼠，其在肿瘤移植后一到三周通过静脉输注或腹腔内注射或借助对流增强递送入脑部来接受90Y-DOTA或未标记的纳米颗粒或放射性标记的经90Y-标记的含DOTA的硅纳米颗粒。存活研究中的小鼠分为三组：一组包括接受未经标记的纳米颗粒的未处理的小鼠，一组包括接受90Y-DOTA的小鼠，且另一组包含接受经90Y-标记的含DOTA的硅纳米颗粒的处理的小鼠，其接受20MBq到60MBq的经90Y-标记的含DOTA的硅纳米颗粒。使用Kaplan-Meier统计方法评估存活数据。
实施例5：经 177 Lu标记的硅纳米颗粒(含DOTA的硅纳米颗粒)的制备和体 内表征
使用与实施例4中所述应用于90Y标记的相同程序获得经177Lu标记的硅纳米颗粒。使用比活性为10到200MBq/μg硅纳米颗粒的溶解于等渗氯化钠溶液中的经177Lu标记的硅纳米颗粒进行体内研究。
动物组群：将诸如人鳞状细胞癌细胞或前列腺癌细胞等致瘤人癌细胞皮下植入于腿或颈部区域或使用立体定向手术将人脑癌细胞植入于若干无胸腺裸小鼠的脑部中，并允许8到24天发展成肿瘤。选择肿瘤直径在6到12mm(体积约为1cm3)的小鼠进行研究。在研究中施用约0.2ml的177Lu(40±20MBq)。
生物分布：使用SPECT、切开术或放射自显影术在3周的不同时间点上在小鼠中进行经177Lu标记的颗粒的生物分布研究，以评估177Lu含量。安乐死后立即在各时间点上使用小动物SPECT/CT进行放射性核素成像。
对于SPECT图像的解剖定位，获取X射线CT数据；通过制造商所提供的算法重建体积CT图像。安乐死后，分离出主要的器官，包括心、肺、脑、肝、胰、肾、小肠和肠，切除肿瘤，并解剖骨(股骨)、皮肤和肌肉样本。将这些样本称重并以合适的标准使用经校准的伽马闪烁计数器计数，以确定经特异性放射标记的纳米颗粒在各器官中的定位。闪烁计数的结果表达为每克组织的注射剂量百分数(％ID/g)或SUV(g/mL)且修正物理放射性核素衰变。为了确定177Lu-纳米颗粒的生物分布的不同，使用SPSS11软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计分析(Student’s t test)。
放射自显影术：将肿瘤组织样本立即冷冻于-60℃并包埋于组织培养基中。将组织样本以20μm的厚度冷冻切片。将切片安放在玻璃盖玻片上，置于卡板上，并在存储磷光体图像板上曝光1到12小时。然后用成像系统对板进行扫描。
存活研究：存活研究最少涉及三组群小鼠，其在肿瘤移植后一到三周通过静脉输注或腹腔内注射或借助对流增强递送入脑部来接受177Lu-DOTA或未经标记的纳米颗粒或经放射性标记的177Lu-纳米颗粒。存活研究中的小鼠分为三组：一组包括接受未经标记的纳米颗粒的未处理的小鼠，一组包括接受177Lu络合物的小鼠，且另一组包括用177Lu-标记的纳米颗粒处理的小鼠，其接受20MBq到60MBq的177Lu-纳米颗粒。使用Kaplan-Meier统计方法评估存活数据。
实施例6：肽缀合的硅纳米颗粒的制备以及靶向表皮生长因子受体(EGFR)
向溶解于100μL PBS缓冲液中的0.5mg氨基封端的硅纳米颗粒中加入137μg(11μmol)2-亚氨基硫烷醇(2-iminothiolane)盐酸盐，并将混合物在室温下搅拌12小时。通过在室温下用在100μL PBS缓冲液中的0.55μmol3-(马来酰亚胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯处理0.5μmolgly-gly-gly-leu-ala-arg-leu-leu-thr12小时而获得经马来酰亚胺基官能化的肽缀合物。通过0.15μmol8-(3-氨基丙基)-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼3a,4a-s-茚烯(8-(3-Aminopropyl)-4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora3a,4a-s-indacene)(BODIPY-NH2))与0.15μmol3-(马来酰亚胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯在500μL PBS缓冲液中室温反应12小时来制备经马来酰亚胺基官能化的染料分子。将三种反应产物(巯基封端的硅纳米颗粒、经马来酰亚胺基官能化的肽以及染料缀合物)一起混合并且在室温下搅拌15小时。使用膜过滤器(Amicon Ultra–0.5ml3K,Amicon Ultra离心过滤器，MILLIPORE)用PBS缓冲液以6000rpm将反应产物过滤三次。为了了使余下的巯基饱和，将经纯化的硅纳米颗粒重新悬浮于100μL PBS缓冲液中，并加入7μmol25-马来酰亚胺基-23-氧-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十五烷酸琥珀酰亚胺酯。将反应混合物在室温下搅拌8小时。使用膜过滤器(Amicon Ultra–0.5ml3K,Amicon Ultra离心过滤器，MILLIPORE)用去离子水以6000rpm将经聚乙二醇化(pegylated)的颗粒纯化三次。
通过免疫结合测定证实了含肽残基(5％gly-gly-gly-leu-ala-arg-leu-leu-thr)和荧光标记BODIPY(1％)的经聚乙二醇化的硅纳米颗粒的靶向表皮生长因子受体(EGFR)。收获在适宜条件下生长的人表皮肿瘤细胞系(A431)并通过在包含0.05％的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中机械破碎而溶解。此洗涤剂适用于膜蛋白的增溶，所述膜蛋白是在经溶解细胞离心后在上清液中获得。通过Bradford的方法(Bradford,Anal.Biochem.1976,72,248-254)确定蛋白质含量。将不同浓度的含gly-gly-gly-leu-ala-arg-leu-leu-thr和BODIPY的经聚乙二醇化的硅纳米颗粒加入在PBS缓冲液中的具有确定蛋白质浓度的上清液中，并允许在37℃下反应30分钟。通过加入Laemmli样本缓冲液停止反应，且随后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(Laemmli,Nature1970,227,680-685)分离出蛋白质。通过在4℃下整夜半干电印迹将蛋白质从凝胶转移到硝基纤维素膜上。使用488/520nm的激发/发射波长通过成像系统检测膜上的荧光蛋白质带。封闭后，将膜用抗EGFR抗体培养并随后用二级经山葵过氧化物酶标记的抗体进行培养。使用产生化学发光的过氧化物酶反应检测EGFR带。荧光(BODIPY)与化学发光在一个蛋白质带上的精确对齐表明硅纳米颗粒肽缀合物与EGFR之间的稳定结合，即使是在SDS凝胶电泳期间的还原条件下。

Claims (25)

1.硅纳米颗粒，其特征在于，它们包含大小为1到10nm的硅核芯并且由烯丙胺或包含不多于10个烯丙胺基团的聚(烯丙胺)封端。
2.根据权利要求1所述的硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒经选自包含下列的组的官能团单官能化或多官能化：发光化合物、荧光化合物、光吸收化合物、放射性化合物、使用x射线可视化的金属化合物、使用磁共振成像(MRI)可视化的化合物、使用超声或微波可视化的化合物、可用于光成像的发光/荧光材料、可通过X射线计算机断层摄影(CT)成像的对比度赋予剂或可通过正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像的同位素。
3.根据权利要求1或2所述的硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒被结合到选自包含毒素、放射性核素和化学治疗药物的组的靶向分子和/或治疗相关的分子。
4.根据权利要求2所述的硅纳米颗粒，其中所述X射线对比度赋予剂包括碘化的化合物或基于钆的化合物。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒涂覆有蛋白质、脂质、表面活性剂、诸如全氟丙烷或六氟化硫的聚合物封装气体中的至少一种。
6.根据权利要求2到5中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述对比度赋予材料包括至少一种顺磁性材料，所述顺磁性材料选自包含稀土元素、钆、锰、铁和铜络合物的组。
7.根据权利要求2到6中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述用于X射线计算机断层摄影的对比度赋予剂包括钡盐和/或多金属氧酸盐。
8.根据权利要求2到7中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述PET核素选自包含64Cu、68Ga、86Y、89Zr、110In或18F系示踪剂的组。
9.根据权利要求2到8中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述SPECT核素选自包含67Ga、99mTc、111In或201Tl的组。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的硅纳米颗粒，其包含选自包含下列的组的至少一种生物分子：肽、蛋白质、糖分子、核酸或核酸类似物，所述生物分子结合到所述纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的硅纳米颗粒，其中所述蛋白质是抗原、抗体、受体或配体。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒上结合有医药活性化合物。
13.医药组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的硅纳米颗粒和医药上适宜的载体。
14.合成根据权利要求1到12任一项所述的硅纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
-混合表面活性剂和溶剂并超声处理所述混合物以形成微团，
-加入SiCl4并进行超声处理，
-加入还原剂以形成氢封端的硅纳米颗粒并进行超声处理，
-在催化剂的存在下加入烯丙胺或包含不多于10个烯丙胺基团的聚(烯丙胺)并进行超声处理，和
-提取并纯化所得的硅纳米颗粒。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在各步骤中的所述超声处理同时或随后进行。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述表面活性剂是四辛基溴化铵，所述溶剂是甲苯，所述还原剂是LiAlH4并且所述催化剂是H2PtCl6。
17.根据权利要求1到12任一项所述的硅纳米颗粒的用途，其用于生物成像。
18.根据权利要求13所述的医药组合物的用途，其用于生物成像。
19.根据权利要求17所述的硅纳米颗粒的用途或根据权利要求18所述的医药组合物的用途，其中生物成像用于体内诊断、药物递送、细胞、生物过程或生物学通路的可视化或染色。
20.根据权利要求1到12中任一项所述的硅纳米颗粒的用途或根据权利要求13所述的医药组合物的用途，其用于化学疗法。
21.根据权利要求20所述的用途，其中选自包含顺氯氨铂、卡铂、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛或阿霉素的组的化学治疗剂被结合到所述纳米颗粒。
22.根据权利要求1到12中任一项所述的硅纳米颗粒的用途或根据权利要求13所述的医药组合物的用途，其用于放射性核素治疗。
23.根据权利要求22所述的用途，其中使用射电金属络合物，所述射电金属络合物包含选自67Cu、90Y、131I、153Sm、166Ho、177Lu、186Re或188Re的组的治疗相关的放射性核素。
24.根据权利要求1到12中任一项所述的硅纳米颗粒的用途或根据权利要求13所述的医药组合物的用途，其用于分子成像和疾病靶向治疗的组合。
25.根据权利要求1到12中任一项所述的硅纳米颗粒的用途或根据权利要求13所述的医药组合物的用途，其用于选自包含下列的组的治疗方法的组合：使用靶向硅纳米颗粒的高热治疗、化学治疗、放射治疗和/或放射性核素治疗。
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