CN109045310A - 一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用 - Google Patents

一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用，复合材料为树状大分子表面修饰有两性离子和靶向试剂RGD，表面螯合钆离子，且内部包裹金纳米颗粒。制备：G5‑DOTA‑(PEG‑RGD)水溶液，加入HAuCl4溶液，NaBH4还原，滴加硝酸钆溶液搅拌12h，最后滴加1,3‑PS反应24h，经透析、冻干即得。本发明方法简单，制备的纳米颗粒在小鼠体内血液半衰期长，能够在动物水平实现肿瘤CT/MRI双模态成像功能，具有产业化和商业化潜能。

Description

一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用
技术领域
本发明属于树状大分子复合材料及其制备和应用领域，特别涉及一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用。
背景技术
CT成像可以对图像进行3D重建，具有空间分辨率高、采集图像时间短、价格低廉等优点，但它的软组织分辨率差且有辐射等缺点，而MRI没有放射性辐射，软组织分辨率高，但是其费用昂贵，扫描时间长。而将CT和MRI以互补形式作为医疗成像检测手段，通常需要CT和MRI两种成像造影剂。虽然多种CT或MRI成像造影剂各自能够获较好的造影效果，但是若采用两种造影剂，一方面给临床应用造成了不便，另一方面也会增加造影剂对患者的毒副作用。因此，可以想象，一种多功能的造影剂系统，能够完成多模态成像造影诊断，将会大大提高诊断的灵敏度与准确度，而且会减轻对患者的因多次注射造成的痛苦和毒副作用，在临床应用中将具有极大的价值，可以提供更全面的诊断信息和疾病发展的动态过程。
聚酰胺胺(poly(amidoamine)，PAMAM)树状大分子是通过支化单元逐步重复反应得到的具有树状高度支化结构的大分子。它具有高度支化、高度单分散性，拥有可控的、规则的结构和组成。它不仅由于表面拥有众多的功能基团而具有独特的表面物理、化学性质，而且具有独特的内部空腔结构。表面大量的官能基团，可以通过共价键对其表面进行修饰与功能化，也可以通过静电作用等作用力等稳定或鳌合金属离子，形成复合材料。另外其内部的空腔结构还可以包裹目标分子，有选择性地结合客体分子，十分适合于作为金属纳米颗粒的载体。目前已有文献报道基于树状大分子包裹的金纳米粒子螯合钆的CT/MRI造影剂(Wen S,Li K,Cai H,et al.Biomaterials,2013,34(5):1570-1580)。
然而，纳米颗粒在临床应用之前，还需满足诸多苛刻条件(Sanhai W R,SakamotoJ H,Canady R,et al.Nature Nanotechnology,2008,3(5):242-244)。首先，纳米材料颗粒本身需要具备结构稳定性，并能在复杂生理环境下保持分散，以维持纳米效应所必须的纳米尺寸。其次，面对人体复杂的免疫系统，纳米材料还需要具备阻抗蛋白质非特异性吸附，从而逃离网状内皮系统(RES)的识别，延长体内血液循环时间，增大纳米材料到达病灶的几率(Fang C,Bhattarai N,Sun C,et al.Small,2010,5(14):1637-1641)。对于肿瘤而言，由于实体瘤组织具有高通透性和高滞留性效应(Maeda H,Wu J,Sawa T,et al.Journal ofControlled Release,2000,65(1):271-284)，因此具有长效循环功能和合适尺寸的纳米材料可以选择性地富集于肿瘤组织处。
PEG化(PEGylation)是当前最常用的生物材料表面修饰方法，甚至成为衡量其他新材料性能的标准。但是研究发现，PEG的抗污性能具有温度依赖性，易受氧化作用影响而发生分解，而与治疗性蛋白结合时还会降低蛋白质的亲和性及整体的生物活性(EstephanZ G,Schlenoff P S,Schlenoff J B.Langmuir,2011,27(11):6794-6800)。这些缺陷限制了PEG的实际应用，由此也引发了科研人员对新型生物相容性材料的探索研究。近期研究两性离子修饰的树状大分子可以有效的延长血液循环半衰期(Xiong Z,Wang Y,Zhu J,etal.Nanoscale,2017,9(34):12295-12301)。这种新的表面修饰使得材料具有极低的非特异性蛋白吸附，为材料在体内的应用拓宽了道路。
检索国内外文献，目前尚还没有发现关于两性离子修饰的聚酰胺胺树状大分子包裹的金纳米颗粒螯合钆的CT/MRI造影剂的制备及其应用研究的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两性离子修饰的树状大分子复合材料及其制备和应用，克服现有技术中PEG的抗污性能具有温度依赖性，易受氧化作用影响而发生分解，而与治疗性蛋白结合时还会降低蛋白质的亲和性及整体的生物活性的缺陷。
发明人发现一种抗污性能最好的两性离子适合用来修饰树状大分子，进而提供一种两性离子修饰的具有靶向功能的CT/MRI造影剂的制备方法。
本发明的一种两性离子修饰的树状大分子复合材料，复合材料为树状大分子表面修饰有两性离子和靶向试剂RGD，表面螯合钆离子，且内部包裹金纳米颗粒。
所述两性离子为丙烷磺内酯1,3-PS，树状大分子为第五代聚酰亚胺胺树状大分子G5.NH2。
本发明的一种所述两性离子修饰的树状大分子复合材料的制备方法，包括：
(1)将螯合剂DOTA-NHS溶液和树状大分子溶液混合，室温条件搅拌反应1-3天，得到G5-DOTA；
(2)将经EDC和NHS活化的RGD滴加到COOH-PEG-NH2溶液中，室温反应1-3天，透析，冻干，得到COOH-PEG-RDG；
(3)将上述COOH-PEG-RDG溶液，活化，然后与G5-DOTA溶液混合，搅拌反应1-3天，透析，冷冻干燥，得到G5-DOTA-(PEG-RGD)；
(4)将上述G5-DOTA-(PEG-RGD)溶液加入HAuCl4溶液、NaBH4溶液，1-4h之后滴加钆盐溶液搅拌3-12h，加入两性离子溶液搅拌反应1-2天，透析，冷冻干燥，即得树状大分子复合材料。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中螯合剂DOTA-NHS溶液和树状大分子溶液的溶剂均为二甲基亚砜。
所述步骤(1)DOTA-NHS与树状大分子的摩尔比为5-20:1。
所述步骤(2)中EDC与COOH-PEG-NH2的摩尔比为5-10:1，NHS与COOH-PEG-NH2的摩尔比为4-12:1。
所述步骤(2)中COOH-PEG-NH2的平均分子量为2000。
PEG一端为羧基，另一端为氨基。
所述步骤(2)中COOH-PEG-NH2溶液的溶剂为二甲基亚砜。
所述步骤(3)中活化均为采用EDC和NHS进行活化。
所述步骤(3)中COOH-PEG-RDG、G5-DOTA的摩尔比为5-20:1。
所述步骤(3)中COOH-PEG-RGD溶液与G5-DOTA溶液的溶剂均为二甲基亚砜。
所述步骤(4)中G5-DOTA-(PEG-RGD)溶液的溶剂为水，HAuCl4溶液为的溶剂为水。
所述步骤(4)中钆盐为硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O，两性离子为丙烷磺内酯1,3-PS。
所述步骤(4)中HAuCl4和树状大分子的摩尔比为50-250:1；NaBH4与HAuCl4的摩尔比为2-5:1；硝酸钆(Gd(NO3)3·6H2O)和DOTA的摩尔比为1-5:1；两性离子与树状大分子的摩尔比为20-40:1。
所述步骤(4)中透析为用截留分子量为8000～14000的透析袋透析1～3天。
进一步步骤(4)中透析为用纤维素透析膜(MWCO＝14000)在磷酸缓冲液和蒸馏水中透析1-3天。
本发明的一种所述两性离子修饰的树状大分子复合材料作为CT/MRI双模态成像的造影剂的应用。
复合材料作为具有有特异性靶向功能和抵抗非特异性蛋白吸附功能的CT/MRI造影剂。
本发明分别将三种两性离子CBAA、MPC和1,3-PS与G5.NH2在室温搅拌反应得到G5-CBAA、G5-MPC和G5-PS，加入HAuCl4溶液，NaBH4还原，最后加入三乙胺和乙酸酐反应即得树状大分子包裹的纳米金颗粒。然后比较三种材料的抗蛋白吸附性能、抗巨噬细胞吞噬性能和在小鼠体内血液循环时间的长短，筛选出抗污性能最佳的两性离子1,3-PS。
具体为：
将CBAA溶液和第五代聚酰胺胺树状大分子溶液混合，并以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚BHT为阻聚剂，然后室温条件下搅拌反应1-3天，得到G5-CBAA；其中CBAA溶液的溶剂为0.138M的NaCl水溶液；第五代聚酰胺胺树状大分子的溶液为甲醇溶液；CBAA与BHT的摩尔比为1:0.0081-0.1734；
将MPC溶液和第五代聚酰胺胺树状大分子溶液混合，然后室温条件下搅拌反应1-3天，得到G5-MPC；其中MPC与第五代聚酰胺胺树状大分子的溶液均为水溶液；
将1,3-PS溶液和第五代聚酰胺胺树状大分子溶液混合，然后室温条件下搅拌反应1-3天，得到G5-PS；其中1,3-PS与第五代聚酰胺胺树状大分子的溶液均为水溶液；
分别在上述三种溶液中加入HAuCl4溶液、NaBH4溶液，最后加入三乙胺和乙酸酐后反应20-30h，透析，冷冻干燥，即得两性离子修饰的树状大分子包裹的金纳米颗粒CT造影剂；其中G5-CBAA、G5-MPC和G5-PS与HAuCl4的摩尔比为1:100；HAuCl4与NaBH4的摩尔比为1:5-10；G5-CBAA、G5-MPC和G5-PS与三乙胺的摩尔比为1:6-10；G5-CBAA、G5-MPC和G5-PS与乙酸酐的摩尔比为1:5-10。
将螯合剂DOTA与第五代聚酰胺胺G5.NH2在室温下搅拌反应，然后加入靶向试剂COOH-PEG-RGD，加入HAuCl4溶液，NaBH4还原，滴加硝酸钆溶液搅拌，最后滴加1,3-PS反应，经透析、冻干即得。
本发明使用1H NMR、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势、水合粒径测试和透射电镜测试等方法表征制备得到的造影剂的物理化学性质，然后通过CCK8法来评价该造影剂的细胞毒性，体外蛋白吸附试验评价抗非特异性蛋白吸附性能，小鼠药物代谢实验研究其血液半衰期，分析筛选出抗蛋白非特异性吸附效果最佳的两性离子，然后制备两性离子修饰的树状大分子CT/MRI造影剂，并研究其小鼠肿瘤成像效果。具体测试结果如下：
(1)1H NMR表征
氢谱分析结果如图所示，图2(a)为{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}，1.89ppm是CBAA的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了19.3个CBAA。图2(b)为{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}，1.9ppm是MPC的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了20.2个MPC。图2(c)为{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}，1.93ppm是PS的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了19.8个PS。图3(a)为{G5-DOTA-mPEG}，其中3.6ppm处为PEG的特征峰，每个树状大分子上连接了9.8个PEG。图3(b)为{G5-DOTA-(PEG-RGD)}，其中3.6ppm处为PEG的特征峰，7.0和6.8ppm处为RGD的特征峰，经积分可得：每个树状大分子上连接了10.3个PEG和7.1个RGD。
(2)电势粒径表征
表1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的水合粒径分别是143.7nm、132.4nm和176.3nm。两性离子的修饰会使得颗粒表面形成一层厚厚的水化层，不同种类的两性离子形成水化层的能力不同，根据数据可以看出经PS修饰后水化层更厚。{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的Zeta电势分别是：5.1mV、4.8mV和5.3mV。几种材料电势均接近0，这为材料的低细胞毒性提供了保障。
表2中{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的水合粒径分别是173.7nm和168.4nm。{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的Zeta电势分别是：6.3mV和7.6mV。
(3)透射电镜(TEM)测试
TEM测试结果如图4所示，{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(图4(a))、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(图4(b))和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(图4(c))的金核粒径分别为2.2nm、2.4nm和2.7nm。分析结果可知，三种材料金核尺寸并无较大差异，且分布较窄，具有良好的单分散性。
(4)体外抗蛋白吸附实验
BSA蛋白在278nm处有紫外吸收峰(图5(a))，我们将材料与BSA蛋白孵育前后278nm处紫外吸收差值来判断三种两性离子抗蛋白吸附的效果。从附图5(b)可以看出，随着材料浓度的增加，三种材料的紫外吸收差值也在增加，但{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的紫外吸收差值一直都高于其他两种材料，在达到最高材料浓度时更明显，{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的紫外吸收差值分别为：0.34、0.49和0.21。从而说明，1,3-PS的修饰能够很好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
(5)CCK8细胞存活率测试结果
附图6(a)中，与对照组(PBS缓冲液组)相比，实施例1中的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}在实验浓度0到400μM范围内，RAW264.7细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在90％以上，在达到最高浓度400μM时，RAW264.7对应材料{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的存活率分别为：90.1％、90.8％、91.4％，这充分说明实施例1中合成的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}具有良好的细胞相容性。
附图7(a)中，与对照组(PBS缓冲液组)相比，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}在实验浓度0到400μM范围内，B16细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在89％以上，在达到最高浓度400μM时，B16细胞对应材料(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的存活率分别为：90.0％和89.6％，这充分说明制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}具有良好的细胞相容性，可以安全应用于生物体CT/MRI成像。
(6)体外细胞吞噬
{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}与巨噬细胞共培养4h后的吞噬情况(如附图6(b))，在浓度为0.5、1、2和4μM的情况下，RAW264.7细胞对材料{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的吞噬量总是少于对{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}的吞噬量，在用最高浓度4μM的情况下，RAW264.7细胞对材料{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的吞噬量分别为：16.95pg/细胞、19.58pg/细胞和12.53pg/细胞。吞噬实验表明，相比于CBAA、MPC而言，1,3-PS对材料的修饰能够有效地减少巨噬细胞对材料的吞噬。至此我们筛选出抗污性能最优的两性离子1,3-PS。
如图7(b)，在浓度为1、2和4μM的情况下，B16细胞对材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量总是多于对{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}和经RGD阻断之后的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量，在最高材料浓度时，{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}、经RGD阻断之后的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量分别为：19.34pg/细胞、19.47pg/细胞和27.96pg/细胞。本实验充分证明了RGD的靶向性能。
(7)药代动力学研究
从附图8可看出，从将材料注射入大鼠体内半小时后开始检测直至注射后96小时，三种材料在血液中的浓度随着时间的推移而逐渐降低，注射后96小时，血液中材料的浓度分别为：{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(1.56μg/g)、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(0.98μg/g)和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(1.64μg/g)。用DAS 2.0软件对数据处理后得到三种材料在小鼠体内的血液循环半衰期依次为：{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(29.9h)、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(28.9h)、{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(37.07h)，经1,3-PS修饰的材料拥有更长的血液循坏半衰期。相比于其他两种两性离子，1,3-PS能够更好地在血液中抵抗非特异性蛋白吸附，延长材料在血液中的循环时间。
(8)材料X-射线衰减性能测试
如图9所示，相比于Omnipaque拟合曲线的斜率(3454)，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}具有更大的斜率(5321)，而且从材料成像的效果图来看，相同浓度下，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}比Omnipaque具有更强的效果，进一步说明{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}材料具有比临床所用的Omnipaque更好的CT造影效果。
(9)材料MR成像性能测试
如图10所示，相比于{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}的弛豫率(7.1mM-1s-1)，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}具有更高的弛豫率(17.6mM-1s-1)，而且从成像效果图来看，相同浓度下{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}比{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}具有更高的信号值，更强的成像效果。实验结果表明，经1,3-PS修饰之后，材料的弛豫率可以显著提高，从而具有增强MR成像效果。
(10)小鼠肺部肿瘤CT成像
小鼠肺部肿瘤CT成像效果(如附图11：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(a)和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(b))，从图中可以看出，随着时间的延长，肺部肿瘤成像逐渐变清晰。在附图13(a)中，在注射后0.5小，小鼠肺部肿瘤信号增强，在1h达到峰值({(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对应的肿瘤CT值分别为：40.3HU和32.4HU)。在同一时间点，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}得信号增强效果要高于(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
(11)小鼠肺部肿瘤MR成像
小鼠肺部肿瘤MR成像效果(如附图12：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(a)和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(b))，随着时间的延长，肿瘤部位逐渐变亮然后慢慢变暗，说明材料通过血液循环在肿瘤部位逐渐富集而后代谢。在附图13(b)中，在注射后20分钟，小鼠肺部肿瘤信号增强，在1h达到峰值({(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对应的肿瘤部位的信噪比分别为61.7和43.8)。在同一时间点，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}实验组信号增强效果要显著高于(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对照组，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
有益效果
(1)本方法制备两性离子修饰的树状大分子CT/MRI造影剂，其金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的分散性，X-射线衰减强度测试结果表明(参见图9)，金纳米颗粒的X-射线衰减强度信号较好，体内试验也表明其具有良好的CT成像性能，磁共振成像测试结果表明，经两性离子1,3-PS修饰之后可以显著地缩短T1弛豫时间(修饰前弛豫率7.1mM-1s-1，修饰后为17.6mM-1s-1)显示信号增强，体内试验也表明其良好的MR成像性能；
(2)本发明采用的合成工艺简单，反应条件为常温常压，温和可控，易于操作；制备的CT/MRI造影剂具有良好的生物相容性，体外细胞实验显示与经CBAA和MPC相比，PS修饰的CT/MRI造影剂被巨噬细胞RAW264.7吞噬得更少，表现出良好的抗非特异性蛋白吸附效果；小鼠药物代谢实验也表明，其具有更长的血液循环时间{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(29.9h)、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(28.9h)而本发明材料{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(37.07h)；通过RGD的靶向功能，可以更多的在肿瘤部位富集；制备的纳米颗粒能够在动物水平实现肿瘤CT/MRI双模态成像功能，体现出良好CT/MRI成像效果，具有产业化和商业化潜能；
(3)本发明方法制备的两性离子修饰的树状大分子CT/MRI造影剂在分子影像诊断领域有着潜在的应用。
附图说明
图1为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的CT/MRI造影剂的合成示意图；
图2为氢谱分析图：(a)为{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}；(b)为{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}；(c)为{(Au0)100-G5.NH2-PS20}；
图3为氢谱分析图：(a)为{G5-DOTA-PEG}；(b)为{G5-DOTA-(PEG-RGD)}；
图4为本发明制备的{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}(a)、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}(b)和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}(c)的高分辨TEM图和粒径分布直方图；
图5为BSA蛋白的UV-vis光谱图(a)，不同浓度的{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}与BSA(1mg/mL)孵育2h后，离心去沉淀，测量其在278nm处的吸光值，吸收差值为离心前后紫外的吸收差值(b)；
图6(a)为CCK8法测得RAW264.7细胞经过{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}在不同金浓度(1-400μM)下处理24小时后的细胞活力；(b)为RAW264.7细胞经过{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}在材料浓度分别为0.5、1、2、4μM时处理4小时后的细胞吞噬材料的Au含量(***，P＜0.001)；
图7为CCK8法测得B16细胞经过{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}在不同金浓度(1-400μM)下处理24小时后的细胞活力(a)；B16细胞经过{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}在材料浓度分别为1、2、4μM时处理4小时后的细胞吞噬材料的Au含量(***，P＜0.001)(b)；
图8为尾静脉注射{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}(Au：0.1M,150μL)后不同时间点小鼠血液中材料的金浓度；
图9为本发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的CT成像图和X射线衰减与金或碘的浓度线性关系图(1：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}，2：Omnipaque)；
图10为发明制备的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}的弛豫率及MR成像图(1：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}，2：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)})；
图11为尾静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(Au：0.1M,150μL)后不同时间点小鼠肿瘤部位的CT成像图；
图12为尾静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(Au：0.1M,150μL)后不同时间点小鼠肿瘤部位的MR成像图；
图13为尾静脉注射{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(Au：0.1M,150μL)后不同时间点小鼠肿瘤部位的CT值(a)和MR值(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称量10mg的第五代PAMAM树状大分子(G5)和20mg的CBAA，分别溶解在5mL的甲醇和5mL的NaCl溶液(0.138M)中，待各自完全溶解后，室温搅拌3天得到产物G5.NH2-CBAA20。用截留分子量为10000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到G5.NH2-CBAA20；
称量10mg的第五代PAMAM树状大分子(G5)和26.5mg的MPC，分别溶解在5mL超纯水中，待各自完全溶解后，温搅拌3天得到产物G5.NH2-MPC20。用截留分子量为10000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到G5.NH2-MPC20；
称量10mg的第五代PAMAM树状大分子(G5)和1.2mg的1,3-PS,分别溶解在5mL超纯水中，待各自完全溶解后，温搅拌3天得到产物G5.NH2-PS20。用截留分子量为10000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到G5.NH2-PS20；
然后分别称取10mg的G5.NH2-CBAA20、G5.NH2-MPC20和G5.NH2-PS20分别溶于10mL的超纯水中。分别加入8.2mg的HAuCl4，搅拌15min后，再分别加入3.8mg NaBH4快速还原金，继续搅拌反应3h后，依次得到{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-G5.NH2-PS20}。
最后分别向装有{(Au0)100-G5.NH2-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NH2-MPC20}和{(Au0)100-PG5.NH2-PS20}的混合反应液中加入三乙胺40μL，搅拌反应30min，再分别加入24μL的乙酸酐，继续搅拌反应24h。反应结束后用截留分子量为8000-14000透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥得到终产物{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}。
实施例2
分别称取本发明制备的实施例1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}各5mg，分别溶于500μL D2O中，进行氢谱分析(如附图2所示)。图2(a)为{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}，1.89ppm是CBAA的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了19.3个CBAA。图2(b)为{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}，1.9ppm是MPC的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了20.2个MPC。图2(c)为{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}，1.93ppm是PS的特征峰，1.8ppm是乙酰基的峰，2.2-3.3ppm是G5的峰，经积分可得每个G5上修饰了19.8个1,3-PS。
实施例3
分别称取本发明制备的实施例1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}各0.5mg，分别溶于的1mL超纯水中进行电势粒径测试(如表1所示)。{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的水合粒径分别是143.7nm、132.4nm和176.3nm。两性离子的修饰会使得颗粒表面形成一层厚厚的水化层，不同种类的两性离子形成水化层的能力不同，根据数据可以看出经PS修饰后水化层更厚。{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的Zeta电势分别是：5.1mV、4.8mV和5.3mV。几种材料电势均接近0，这为材料的低细胞毒性提供了保障。
表1.样品的表面电势和水合粒径
实施例4
分别称取本发明制备的实施例1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}各0.5mg，分别溶于的1mL超纯水中进行TEM测试(如附图4所示)。{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的TEM粒径分别为2.2nm、2.4nm和2.7nm。分析结果可知，三种材料都尺寸分布较窄，具有良好的分散性。
实施例5
通过将实施例1中制备的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}进行蛋白吸附实验测试，能够比较三种两性离子抗非特异性蛋白吸附的效果。称取牛血清白蛋白(BSA)1mg溶解于PBS中，然后用紫外吸收光谱仪对其进行扫描，得到的结果如附图5(a)所示，BSA在278nm处有吸收峰。然后称取实施1中制备的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}各2mg，配置成浓度为4mg/mL的PBS溶液，然后分别稀释成2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL。称取BSA 2mg，配置成1mg/mL的PBS溶液。吸取0.5mL的BSA溶液分别加入刚刚配置好的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的溶液中，充分混匀后，分别测试其在278nm处的紫外吸收值。将混合溶液放置于37℃培养箱中2h，然后8000rpm离心5min，得到如附图5(b)的结果。然后去除沉淀，测量其在278nm处的紫外吸收值。将{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}所对应的孵育离心前后紫外吸收值相减即得紫外吸收差值。从附图5(b)可以看出，随着材料浓度的增加，三种材料的紫外吸收差值也在增加，但{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的紫外吸收差值一直都高于其他两种材料，在达到最高材料浓度时更明显，{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的紫外吸收差值分别为：0.34、0.49、0.21。从而说明，1,3-PS的修饰能够很好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
实施例6
通过CCK8比色法，以RAW264.7细胞为模型细胞评价本发明制备的实施例1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}对细胞存活的影响。分别称取{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}的重量为：2.01mg，分散在无菌PBS缓冲液中配制成金浓度为4mM的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制金浓度为0.1、0.25、0.5、1、2和4mM的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}溶液。RAW264.7细胞种植于96孔板过夜，弃去培养基，每孔加入90μL新鲜培养基与10μL的不同浓度的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}溶液，使得金浓度最终为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4mM，在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入90μL新鲜培养基与10μL CCK8的混合溶液，继续在37℃下培养4小时后，在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(以PBS缓冲液的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算得到RAW264.7细胞的存活率，如附图6(a))。以同样的方法测定实施例1中的{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的RAW264.7细胞的存活率(如附图6(a))。与对照组(PBS缓冲液组)相比，实施例1中的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}在实验浓度0到400μM范围内，RAW264.7细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在90％以上，在达到最高浓度400μM时，RAW264.7对应材料{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的存活率分别为：90.1％、90.8％、91.4％，这充分说明实施例1中合成的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}具有良好的细胞相容性。
实施例7
通过材料与巨噬细胞RAW264.7的共培养，可以检测CBAA、MPC和1,3-PS对材料的修饰对降低巨噬细胞RAW264.7吞噬的效果。称取{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(实施例1)2.01mg，分散在无菌PBS缓冲中配制成材料浓度为40μM的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制浓度为5、10、20μM的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}溶液。巨噬细胞RAW264.7种植于12孔板过夜，弃去培养基，每孔加入900μL新鲜培养基与100μL的不同浓度的{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}溶液，使得材料浓度最终为0.5、1、2和4μM，在37℃下共培养4小时。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，得到的沉淀用1mL王水消化24h，消化完全后加入1mL超纯水，用ICP-OES检测样品中的Au浓度。以同样的方法测定实施例1中的{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}与巨噬细胞共培养4h后的吞噬情况(如附图6(b))。在浓度为0.5、1、2和4μM的情况下，RAW264.7细胞对材料{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的吞噬量总是少于对{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}的吞噬量，在用最高浓度4μM的情况下，RAW264.7细胞对材料{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}的吞噬量分别为：16.95pg/细胞、19.58pg/细胞、12.53pg/细胞。吞噬实验表明，相比于CBAA、MPC而言，1,3-PS对材料的修饰能够有效地减少巨噬细胞对材料的吞噬。至此筛选出抗污性能最优的两性离子1,3-PS。
实施例8
将本发明制备的实施例1中{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}配置成金浓度为0.1M的0.1mL生理盐水溶液。在对小鼠腹腔注射麻药麻醉后，分别通过尾静脉注射每只小鼠100μL的三种不同的生理盐水溶液，并在注射后不同时间对小鼠进行眼眶静脉取血(取血时间为材料注射后：0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和96h)，对所取血液称重，用王水消化3天以上，取消化液用于ICP-OES分析金属元素金的含量，从而确定在注射的三种材料在不同时间点于小鼠血液内的含量，用以来研究材料在小鼠血液的药代动力学。从附图8可看出，从将材料注射入大鼠体内半小时后开始检测直至注射后96小时，三种材料在血液中的浓度随着时间的推移而逐渐降低，注射后96小时，血液中材料的浓度分别为：{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(1.56μg/g)、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(0.98μg/g)和{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(1.64μg/g)。用DAS 2.0软件对数据处理后得到三种材料在小鼠体内的血液循环半衰期依次为：{(Au0)100-G5.NHAc-CBAA20}(29.9h)、{(Au0)100-G5.NHAc-MPC20}(28.9h)、{(Au0)100-G5.NHAc-PS20}(37.07h)，经1,3-PS修饰的材料拥有更长的血液循坏半衰期。相比于其他两种两性离子，1,3-PS能够更好地在血液中抵抗非特异性蛋白吸附，延长材料在血液中的循环时间。
实施例9
称量10.35mg RGD溶解在5mL DMSO中，边搅拌边加入5mL EDC的DMSO溶液(5.61mg/mL)半小时之后，加入5mL NHS的DMSO溶液(3.45mg/mL)搅拌三小时后，将混合溶液加入到10mL COOH-PEG-NH2的DMSO溶液中(3mg/mL)反应1-3天。用截留分子量为1000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的COOH-PEG-RGD。
称量20mg第五代PAMAM树状大分子溶解在5mL DMSO中，边搅拌边加入3mLDOTA-NHS的DMSO溶液(1.95mg/mL)反应24h。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5-DOTA。
称量20mg COOH-PEG-RGD溶解在10mL DMSO中，边搅拌边加入搅拌边加入5mL EDC的DMSO溶液(5.55mg/mL)半小时之后，加入5mL NHS的DMSO溶液(1.53mg/mL)搅拌三小时后，将混合溶液加入到10mL G5-DOTA溶液中(2.24mg/mL)反应1-3天。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5-DOTA-(PEG-RGD)。
称量30mg的G5-DOTA-(PEG-RGD)溶解在10mL蒸馏水中，边搅拌边加入5mL HAuCl4的水溶液(3.88mg/mL)，15min后，加入3mL的NaBH4的冰水溶液(1.78mg/mL)反应3h，再加入2mL Gd(NO3)3·6H2O的水溶液(1.06mg/mL)，反应24h，再加入1.15mg的丙烷磺内酯反应1-3天。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}。
实施例10
分别称取本发明制备的实施例9中{G5-DOTA-(PEG-RGD)}和对比例1中{G5-DOTA-mPEG}的各5mg，分别溶于500μL D2O中，进行氢谱分析(如附图3所示)。图3(a)为{G5-DOTA-mPEG}，其中3.6ppm处为PEG的特征峰，每个树状大分子上连接了9.8个PEG。图3(b)为{G5-DOTA-(PEG-RGD)}，其中3.6ppm处为PEG的特征峰，7.0和6.8ppm处为RGD的特征峰，经积分可得：每个树状大分子上连接了10.3个PEG和7.1个RGD。
实施例11
分别称取本发明制备的实施例9中{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}各0.5mg，分别溶于的1mL超纯水中进行电势粒径测试(如表2所示)。{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的水合粒径分别是173.7nm和168.4nm。{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的Zeta电势分别是：6.3mV和7.6mV。
表2.造影剂材料的表面电势和水合粒径：
实施例12
用医用CT扫描仪对实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和Omnipaque的体外CT成像效果进行观察和比较。量取实施例9样品{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}在超纯水中配制Au浓度为0.1M的溶液，再分别稀释至为0.04M、0.03M、0.02M、0.01M和0.005M溶液各100μL。以同样的方法制备相同碘浓度梯度的Omnipaque。用CT测试仪测试各个样品的CT值并得出X-射线衰减与金浓度的线性关系。如图9所示，相比于Omnipaque拟合曲线的斜率(3454)，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}具有更大的斜率(5321)，进一步说明实施例9的材料具有比临床所用的Omnipaque更强的CT造影效果。
实施例13
用医用MR扫描仪对实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}的体外MR成像效果进行观察和比较。称取实施例9样品{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}在超纯水中配制Gd浓度为1mM的溶液，再分别稀释至为0.64mM、0.32mM、0.16mM、0.08mM和0.04mM溶液各100μL。用MR测试仪测试各个样品的弛豫时间并且得到弛豫时间的倒数于Gd浓度之间的线性关系。如图10所示，相比于{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)}的弛豫率(7.1mM-1s-1)，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}具有更高的弛豫率(17.6mM-1s-1)。实验结果表明，经1,3-PS两性离子修饰之后，可以显著提高材料的弛豫率，增强材料MR成像效果。
实施例14
通过CCK8比色法，以B16细胞为模型细胞评价本发明制备的实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对细胞存活的影响。称取{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}3.3mg，分散在无菌PBS缓冲液中配制成金浓度为4mM的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制金浓度为0.1、0.25、0.5、1、2和4mM的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}溶液。B16细胞种植于96孔板过夜，弃去培养基，每孔加入90μL新鲜培养基与10μL的不同浓度的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}溶液，使得金浓度最终为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mM，在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入90μL新鲜培养基与10μLCCK8的混合溶液，继续在37℃下培养4小时后，在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(以PBS缓冲液的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算得到B16细胞的存活率)。以同样的方法测定实对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-PEG-PS}的B16细胞的存活率(如附图7(a))。与对照组(PBS缓冲液组)相比，实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}在实验浓度0到400μM范围内，B16细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在89％以上，在达到最高浓度400μM时，B16细胞对应材料(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}的存活率分别为：90.0％、89.6％，这充分说明实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}具有良好的细胞相容性，可以安全应用于生物体CT/MRI成像。
实施例15
通过材料与B16细胞的共培养，可以检测材料对B16细胞的靶向性能。称取{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(实施例9)3.3mg，分散在无菌PBS缓冲中配制成材料浓度为40μM的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制浓度为10、20M的{(Au0)100-PAMAM.NHAc-CBAA20}溶液。B16细胞种植于12孔板过夜，弃去培养基，每孔加入900μL新鲜培养基与100μL的不同浓度的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}溶液，使得材料浓度最终为0、1、2和4μM，在37℃下共培养4小时。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，得到的沉淀用1mL王水消化24h，消化完全后加入1mL超纯水，用ICP-OES检测样品中的Au浓度。以同样的方法测定对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}与B16细胞共培养4h后的吞噬情况。还需要做靶向阻断实验，即称取{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(实施例9)3.3mg，分散在无菌PBS缓冲中配制成材料浓度为40μM的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制浓度为10、20μM的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}溶液。B16细胞与RGD溶液(5μM)共同种植于12孔板过夜，弃去培养基，每孔加入900μL新鲜培养基与100μL的不同浓度的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}溶液，使得材料浓度最终为0、1、2和4μM，在37℃下共培养4小时。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，得到的沉淀用1mL王水消化24h，消化完全后加入1mL超纯水，用ICP-OES检测样品中的Au浓度。
如图7(b)，在浓度为1、2和4μM的情况下，B16细胞对材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量总是多于对{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}和经RGD阻断之后的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量，在最高材料浓度时，{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}、经RGD阻断之后的{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}的吞噬量分别为：19.34pg/细胞、19.47pg/细胞和27.96pg/细胞。本实验充分证明了RGD的靶向性能。
实施例16
将本发明制备的实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}配置成金浓度为0.1M的0.1mL生理盐水溶液。在对小鼠腹腔注射麻药麻醉后，分别通过尾静脉注射每只小鼠100μL的两种不同的生理盐水溶液，并在注射前后不同时间进行CT扫描，用以来评价材料的CT成像效果(如附图11：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(a)和对比例1中的{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(b))。在附图13(a)与注射前相比较，在注射后0.5小时，小鼠肺部肿瘤信号增强，在1h达到峰值({(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对应的肿瘤信号值分别为：40.3HU和32.4HU)。在同一时间点，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}得信号增强效果要高于(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
实施例17
将本发明制备的实施例9制备的材料{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和对比例1中{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}配置成钆浓度为0.01M的0.1mL生理盐水溶液。在对小鼠腹腔注射麻药麻醉后，分别通过尾静脉注射每只小鼠100μL的两种不同的生理盐水溶液，并在注射前后不同时间进行MR扫描，用以来评价材料的MR成像效果(如附图12：{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}(a)和对比例1中的{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}(b))。在附图13(b)与注射前相比较，在注射后0.5小时，小鼠肺部肿瘤信号增强，在1h达到峰值({(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}和(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}对应的肿瘤部位的信噪比分别为：61.7和43.8)。在同一时间点，{(Au0)100-G5-DOTA-(PEG-RGD)-PS}得信号增强效果要显著高于(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
对比例1
称量30mg第五代PAMAM树状大分子溶解在5mL DMSO中，边搅拌边加入3mL DOTA-NHS的DMSO溶液(2.93mg/mL)反应24h。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5-DOTA。
称量20mg mPEG-COOH溶解在10mL DMSO中，边搅拌边加入5mL EDC的DMSO溶液(6.49mg/mL)半小时之后，加入5mL NHS的DMSO溶液(1.79mg/mL)搅拌三小时后，将混合溶液加入到10mL G5-DOTA溶液中(3.37mg/mL)反应1-3天。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到干燥的G5-DOTA-mPEG。
称量30mg的G5-DOTA-mPEG溶解在10mL蒸馏水中，边搅拌边加入5mL HAuCl4的水溶液(4.54mg/mL)，15min后，加入3mL的NaBH4的冰水溶液(2.08mg/mL)反应3h，再加入2mL Gd(NO3)3·6H2O的水溶液(1.24mg/mL)，反应24h，再加入1.15mg的丙烷磺内酯反应1-3天。用截留分子量为14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换水3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)，冷冻干燥，得到{(Au0)100-G5-DOTA-mPEG-PS}。

Claims (10)

1.一种两性离子修饰的树状大分子复合材料，其特征在于，复合材料为树状大分子表面修饰有两性离子和靶向试剂RGD，树状大分子表面螯合钆离子，且内部包裹金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述两性离子为丙烷磺内酯1,3-PS，树状大分子为第五代聚酰亚胺胺树状大分子G5.NH2。
3.一种如权利要求1所述两性离子修饰的树状大分子复合材料的制备方法，包括：
(1)将螯合剂DOTA-NHS溶液和树状大分子溶液混合，室温条件搅拌反应1-3天，得到G5-DOTA；
(2)将经EDC和NHS活化的RGD滴加到COOH-PEG-NH2溶液中，室温反应1-3天，透析，冻干，得到COOH-PEG-RDG；
(3)将上述COOH-PEG-RDG溶液，活化，然后与G5-DOTA溶液混合，搅拌反应1-3天，透析，冷冻干燥，得到G5-DOTA-(PEG-RGD)；
(4)将上述G5-DOTA-(PEG-RGD)溶液加入HAuCl4溶液、NaBH4溶液，1-4h之后滴加钆盐溶液搅拌3-12h，加入两性离子溶液搅拌反应1-2天，透析，冷冻干燥，即得树状大分子复合材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)DOTA-NHS与树状大分子的摩尔比为5-20:1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中EDC与COOH-PEG-NH2的摩尔比为5-10:1，NHS与COOH-PEG-NH2的摩尔比为4-12:1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中COOH-PEG-NH2的平均分子量为2000。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中活化均为采用EDC和NHS进行活化。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中COOH-PEG-RDG、G5-DOTA的摩尔比为5-20:1。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中HAuCl4和树状大分子的摩尔比为50-250:1；NaBH4与HAuCl4的摩尔比为2-5:1；钆盐和DOTA的摩尔比为1-5:1；两性离子与树状大分子的摩尔比为20-40:1。
10.一种权利要求1所述两性离子修饰的树状大分子复合材料作为CT/MRI双模态成像的造影剂的应用。
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