CN110960697A - 一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法 - Google Patents
一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法。该方法包括：G5‑mPEG或G5‑PEG‑RGD制备；G5‑mPEG‑PS或G5‑PEG‑RGD‑PS制备；G5‑mPEG‑PS@CuS或G5‑PEG‑RGD‑PS@CuS制备；G5‑mPEG‑PS@CuS/HIC1 pDNA或G5‑PEG‑RGD‑PS@CuS/HIC1 pDNA复合物制备。该方法制备过程简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的纳米颗粒具有良好的生物相容性、单分散性、胶体稳定性和PA成像功能，可用于肿瘤的光热治疗和基因治疗的联合治疗，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于诊疗一体化功能纳米材料的制备领域，特别涉及一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法。
背景技术
癌症的治疗手段除了传统的手术切除、化疗、放疗外，近年来出现了一些新的治疗手段如光热治疗以及基因治疗等。手术治疗存在切除不干净的隐患，而化疗和放疗则缺乏特异性，对正常组织损伤较大。基因治疗具有肿瘤针对性强、治疗效果显著、不损伤正常细胞的优点，但也面临基因高效传递以及高效表达的挑战。近年来发展起来的光热治疗方法(photothermal therapy，PTT)利用近红外区域的光热转换试剂将光能转换成热能，成为一种潜在的治疗肿瘤的强有力的手段。光热治疗一方面通过破坏细胞膜性结构、引起细胞核内的DNA、RNA和蛋白质变性而造成细胞不可逆的损伤；另一方面可促使肿瘤组织缺血再灌注和缺氧复氧的过程加剧，从而增强疗效。单一手段难以达到理想的治疗效果，因而需要两种或多种手段联合，发挥高效协同治疗的效果。
近年来，纳米硫化铜(CuS)以其制备简单、成本低及表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance，SPR)吸收引起的光热性能等特性受到了较多的关注(Zhou,M.,Zhang,R.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(43):15351-15358)。纳米CuS除了可以用于光声(PA)造影剂外，还较多地用于光热治疗。程等人以树状大分子为模板在其内部包裹合成纳米CuS、Pt和Pd颗粒，并在其外围修饰靶向基团和荧光染料，用于肿瘤模型的靶向荧光成像和光热治疗(Zhou,Z.,Wang,Y.,et al.ACS Nano 2016,10(4):4863-4872)。
此外，树状大分子的独特性能也使其能够作为载体负载光热转换剂或基因药物用于光热治疗和基因治疗(Wei,P.,Chen,J.,et al.Adv.Healthcare Mater.2016,5(24):3203-3213)。树状大分子外围大量的氨基基团，可以进行多功能化修饰，为解决造影剂和药物的高效输送提供了可能。聚乙二醇(PEG)和寡聚乙二醇(OEG)是研究中最常见的抗非特异性蛋白吸附的修饰材料，然而PEG或OEG在氧和过渡金属离子的存在下很容易被氧化。有文献资料表明与聚乙二醇(PEG)修饰相比，纳米颗粒上修饰两性离子后更容易逃离网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)的识别，可有效阻抗非特异蛋白质吸附，延长其血液循环时间，增强在肿瘤部位的渗透和保留(Xiong Z,Wang Y,Zhu J,et al.Nanoscale2017,9(34):12295-12301)。
检索国内外文献，目前尚未发现关于两性离子和RGD修饰的树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒的制备及其应用于PA成像和光热与基因联合治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物，所述复合物为表面修饰PEG或PEG-RGD和两性离子1,3-PS、内部包裹硫化铜纳米颗粒的树状大分子G5与HIC1 pDNA的复合物。
本发明还提供一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法，包括：
(1)将mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD溶解于溶剂中，经EDC和NHS活化，加入到G5.NH2溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG或G5-PEG-RGD，其中mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD与G5.NH2的摩尔比为10～12:1；
(2)将步骤(1)中G5-mPEG或G5-PEG-RGD溶于超纯水中，加入1,3-PS(1,3-丙烷磺酸内酯)溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS；其中G5-mPEG或G5-PEG-RGD与1,3-PS的摩尔比为1:20～22；
(3)将步骤(2)中G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS溶于超纯水中，加入CuCl2·2H2O水溶液搅拌，再加入Na2S·9H2O水溶液反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS，其中G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS、CuCl2·2H2O和Na2S·9H2O的摩尔比为1:80～100:80～300；
(4)将步骤(3)中G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA共同孵育，得到G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA或G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物，即两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物。
所述步骤(1)中COOH-PEG-RGD的制备方法包括：将RGD和COOH-PEG-Mal分别溶解于二甲基亚砜溶液中，将得到的RGD溶液滴加到得到的COOH-PEG-Mal溶液中，室温反应1-2天，透析、冻干，得到COOH-PEG-RGD；其中，RGD与COOH-PEG-Mal的摩尔比为1:1～1.2。
所述透析的条件为：用截留分子量为1000的透析袋透析2-3天。
所述COOH-PEG-Mal的分子量为2000。
所述步骤(1)中溶剂为DMSO。
所述步骤(1)中mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。
所述步骤(1)中G5.NH2溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(1)中活化时间为2-4h。
所述步骤(1)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2-4天。
所述步骤(1)、(2)、(3)中透析的条件为：用截留分子量为8000～14000的透析袋透析2-3天。
所述步骤(2)中搅拌反应温度为25～30℃，搅拌反应时间为1-2天。
所述步骤(3)中搅拌时间为25-30min。
所述步骤(3)中反应温度为30～35℃，反应时间为4-8h。
所述步骤(4)中G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA的N/P为5:1～20:1。
所述步骤(4)中共同孵育时间为15-30分钟。
本发明还提供一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物在制备体外PA成像、光热治疗和基因治疗的诊疗剂中的应用。
本发明基于第五代聚酰胺胺树状大分子为平台，表面修饰两性离子烷磺内酯(1,3-PS)和靶向基团RGD，内部包裹硫化铜纳米颗粒，最后与HIC1 pDNA复合，形成复合物，得到具有特异性靶向功能和抵抗非特异性蛋白吸附功能的诊疗剂。实验结果表明，G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA或G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA不仅可以作为体外PA成像造影剂，而且兼具肿瘤的光热治疗和基因治疗两种治疗模式，实现了诊疗一体化的需求。
本发明使用1H NMR、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、动态光散射(DLS)和透射电镜测试等方法表征制备得到的纳米颗粒，然后通过CCK8法来评价该纳米材料的细胞毒性，体外蛋白吸附试验评价抗非特异性蛋白吸附性能，并评价了该纳米材料作为光热治疗试剂在近红外激光照射下的升温效果，采用凝胶阻滞实验和绿色荧光蛋白表达实验来确定最佳氮磷比，再利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的细胞吞噬、凋亡情况和胞内定位，最后采用Western Blot来评价HIC1pDNA介导的基因表达情况，具体测试结果如下：
(1)1H NMR表征
氢谱分析结果如图2所示，图2a为G5-mPEG-PS氢谱图，1.9ppm是1,3-PS的特征峰，3.6ppm是PEG的特征峰，2.2-3.4ppm是G5的特征峰，经积分可得每个G5上修饰了19.9个1,3-PS和9.7个PEG。图2b为G5-PEG-RGD-PS氢谱图，其中3.6ppm处为PEG特征峰，7.0和6.8ppm处为RGD的特征峰，2.2～3.4ppm为G5的特征峰，1.9ppm处为1,3-PS的特征峰，并通过积分计算得到每个树状大分子上连接了9.8个PEG、20.1个1,3-PS和6.9个RGD。
(2)UV-Vis测试结果
UV-Vis测试结果如图3所示，分析结果可知，硫化铜纳米颗粒在1000nm左右有吸收峰，此结果说明成功合成了在近红外区域具有独特吸收峰的纳米硫化铜颗粒。
(3)透射电镜(TEM)测试
TEM测试结果如图4所示，G5-mPEG-PS(图4a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图4b)，分析结果可知，G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的尺寸均一、分散性良好，平均粒径分别为4.3nm和4.2nm。
(4)体外光热升温效果实验
材料光热转换性能测试结果如图5所示，与对照组(超纯水组)相比，实施例1中G5-PEG-PS@CuS(图5a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图5b)在实验浓度0.3到1.5mM范围内，G5-PEG-PS@CuS(图5a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图5c)表现出优异的光热转换能力，随着光照时间的延长，G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS水溶液的温度明显升高，而且升温效果随着浓度的增加而提高。在照射五分钟后，G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS([Cu]＝1.5mM)水溶液温度分别达到了79.8℃和74.9℃。通过计算单个循环升温降温曲线，可得G5-PEG-PS@CuS(图5b)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图5d)光热转换效率分别为45.61％、49.83％，说明CuS纳米颗粒可以很好地将光能转化为热能。
(5)体外抗蛋白吸附实验
通过将实施例1中制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS进行蛋白吸附实验测试，测定两性离子抗非特异性蛋白吸附的效果。称取牛血清白蛋白(BSA)1mg溶解于2mLPBS)中，然后用紫外吸收光谱仪对其进行扫描，得到的结果如附图6(a)所示，BSA在278nm处有吸收峰。然后称取实施1中制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS各3mg，配置成浓度为1.5mg/mL的PBS溶液，然后分别稀释成1.0mg/mL和0.5mg/mL。称取BSA 2mg，配置成1mg/mL的PBS溶液。吸取0.5mL的BSA溶液分别加入刚刚配置好的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的溶液中，充分混匀后，分别测试其在278nm处的紫外吸收值。将混合溶液放置于37℃培养箱中4h后8000rpm离心5min，然后去除沉淀，测量其在278nm处的紫外吸收值。将G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS所对应的孵育离心前后紫外吸收值相减即得紫外吸收差值。从附图6(b)可以看出，在最高浓度时，G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的紫外吸收差值分别为：0.12和0.12。从而说明材料经过1,3-PS的修饰能够很好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
(6)材料稳定性测试
取实施例1中的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS分别溶于超纯水中配置成1mg/mL的水溶液，通过纳米激光粒度仪，在1-7天之内每天测试材料的水合粒径来研究材料的稳定性。结果如图7所示，随着时间的推移，G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的粒径没有明显的变化，这一结果也证明了合成的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS具有良好的稳定性。
(7)CCK8细胞活力测试结果
附图8中，与对照组(PBS缓冲液组)相比，实施例1中的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS在实验浓度0.2到1.6mM范围内，MDA-MB-231细胞的的活力没有明显影响，细胞活力均保持80％以上，在达到最高浓度1.6mM时，MDA-MB-231对应材料G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的细胞活力分别为84.1％和85.6％，这充分说明实施例1中合成的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS具有良好的细胞相容性。
将MDA-MB-231细胞分为两组(一组实验在1064nm激光下照射5min，另一组实验不进行激光照射)，接着用生理盐水清洗3次，每孔加100μL的无血清(FBS)培养基和10μL的CCK8溶液，继续在37℃培养箱中培养，4小时后在450nm处测其吸光值，并根据此值计算细胞的活力。CCK8法测得细胞活力，结果如图9所示，与对照组(PBS缓冲液组)相比，实施例1中的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS在实验浓度0.2到1.6mM范围内，未经过1064nm激光照射的细胞均保持较高的细胞活力；经过激光照射的组，随着浓度的增加，细胞活力逐渐降低，实验结果表明该材料对MDA-MB-231细胞具有很好的光热消融效果。当材料的浓度达到1.6mM时，G5-PEG-RGD-PS@CuS经激光照射后，细胞活力为28.5％，G5-PEG-PS@CuS经激光照射后，细胞活力为41.6％。充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向肿瘤细胞，增强光热杀伤效果。
(8)凝胶阻滞实验
取本发明制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS，将其配置成浓度为2mg/mL的溶液，采用定氮试剂盒法测定G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的氨基的个数，然后将G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA按照不同的氮磷比(0.25、0.5、1、2、3、4、5)孵育15-30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(如图10所示)，实验结果表明G5-PEG-PS@CuS(图10a)或G5-PEG-RGD-PS@CuS(图10b)在N/P为1的条件下就可以完全包裹pDNA，说明该材料具有很好的pDNA包裹能力。
(9)Zeta电势及水动力学直径测试结果
将实施例1中G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA按不同N/P比(N/P＝1、5、10、15、20)复合，最终体积为100μL，室温孵育30min，然后加入1mL的PBS。测试结果如图11所示，G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物的粒径大小和电势都在合适的细胞转染范围内。
(10)流式细胞仪检测吞噬情况
收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，按照细胞以每孔1.5×105密度MDA-MB-231细胞种植于12孔细胞培养板中，在37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用PBS洗三次，在将带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS按照不同的N/P值(N/P＝1、5、10、15、20)共同孵育30分钟，然后用此复合物分别在有血清和无血清下的DMEM培养液在37℃培养箱中培养4h。之后将所有孔板的细胞消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图12所示)。实验结果表明，在N/P＝10的时候，荧光强度最高，表明在有血清存在下G5-PEG-RGD-PS@CuS负载HIC1 pDNA后的细胞内吞效果最好。在同一氮磷比下，G5-PEG-RGD-PS@CuS的荧光强度要高于G5-PEG-PS@CuS，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向肿瘤细胞。
(11)细胞定位实验
收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，按照细胞以每孔1.5×105密度MDA-MB-231细胞种植于confocal皿中，在37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用PBS清洗三次，再将带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS在N/P＝10下共同孵育30分钟，然后分别在有血清和无血清下的DMEM培养液中，37℃培养箱中培养4h。培养结束后用PBS清洗三次，然后用4％的戊二醛4℃固定15分钟，固定后用DAPI染色15分钟，然后在有油镜下观察细胞的荧光信号(如图13所示)。实验结果表明，相比于PBS和单独的pDNA组，带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的复合物处理的细胞均显示了较高的荧光强度。说明本发明制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS能很好的转染HIC1 pDNA。此外，G5-PEG-RGD-PS@CuS的荧光强度要高于G5-PEG-PS@CuS，本实验也充分证明了RGD赋予材料的靶向性能。
(12)体外Western Blot实验结果
如附图14所示。以PBS为空白对照组，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参蛋白。实验结果表明，在实验组和对照组中内参蛋白量表达都很正常，相比于PBS和pDNA组，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA处理的实验组HIC1蛋白有明显的上调。这一结果也证明了本发明合成的载体可以有效地携带pDNA进入细胞，从而达到基因治疗的目的。相比于G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA组，G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA组中HIC1蛋白上调的更为明显，这也充分证明了RGD赋予材料的靶向性能。
(13)体外细胞刮伤愈合实验
通过细胞刮伤愈合实验来验证癌细胞的侵袭能力。如图15所示，PBS组和单独的pDNA组中随时间的推移，虚线间的宽度有明显的变窄，细胞在24h时比12h时线的宽度更窄，说明细胞有明显的迁移；相比于PBS组和单独的pDNA组，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA实验组中能看到虚线之间的宽度没有明显的变化，说明本发明制备的G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA能明显的抑制细胞的迁移，这一结果也证明了本发明的载体可以在MDA-MB-231细胞系中恢复HIC1的表达，从而使其发挥作用，抑制癌细胞的迁移和转移。在12h时，相比于无血清组，有血清组抑制细胞侵袭效果更佳，充分证明了经两性离子修饰后，在有血清条件下转染效果更佳。
(14)体外联合治疗实验
收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，按照细胞以每孔1.0×104密度MDA-MB-231细胞种植于96孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入含有PBS、HIC1 PDNA、G5-mPEG-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA的新鲜DMEM培养基，每组六个平行，培养24小时后，将孔板置于1064nm的激光照射下分别照射五分钟，未经激光照射的细胞作为对照组，结果如图16所示，未经激光照射的对照组，细胞活仍保持在80％左右。此外，相比于G5-mPEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS组，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA组经激光照射后细胞活力有明显的下降。而细胞经过G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA激光照射处理后，细胞活力显著降低，达到41％左右，说明本发明制备的G5-mPEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS可以将光热治疗和基因治疗整合在一个纳米平台上，实现联合治疗。
(15)材料光声测试性能
取实施例1中所得产品用超纯水配制铜浓度为15mM的母液，之后梯度稀释为12、9、6和3mM的材料，并对一系列浓度材料在1064nm激光下进行光声成像测试。以超纯水作为空白对照。测试结果显示：在实验浓度范围内，G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS均表现出优异的PA成像效果(图17)。
(16)体内肿瘤光声测试结果
裸鼠肿瘤PA成像效果如附图18，从图中可以看出，G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS材料在注射后12h达到最佳成像效果，随着时间的增加，小鼠肿瘤部位PA信号减弱，在24h PA信号值略高于对照组。在同一时间点G5-PEG-RGD-PS@CuS的信号增强效果要高于G5-mPEG-PS@CuS，证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
(17)体内抗肿瘤效果评价
取实施例1中制备的G5-PEG-RGD-PS@CuS用无菌PBS缓冲液配置成铜浓度为1.2mM的溶液，同时将实验荷瘤裸鼠随机分为四组，随后通过瘤内注射的方式向每只荷瘤裸鼠瘤内注射100μL溶液：第一组瘤内注射PBS(对照组)，第二组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA(基因组)，第三组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS并用激光照射5min(光热组)，第四组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA并用激光照射5min(光热+基因组)。之后，记录22天内裸鼠的肿瘤体积、体重和35天内的裸鼠存活率。实验结果如图19所示，相比于对照组和基因组，光热组和基因+光热组裸鼠的肿瘤体积得到有效地控制，治疗后肿瘤彻底清除；此外，与对照组相比，基因组裸鼠的肿瘤生长速度也得到了一定的抑制。实验结果证明本发明中合成的G5-PEG-RGD-PS@CuS能应用于动物体内，并实现体内肿瘤的光热-基因联合治疗。
有益效果
(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化的实施前景；
(2)本发明制备两性离子修饰的树状大分子诊疗试剂，经1,3-PS修饰后具有明显的抗污性能，在有血清条件下转染效果更佳，修饰聚乙二醇化的RGD实现靶向，最后与HIC1pDNA共同孵育，形成复合物；
(3)本发明制备的RGD修饰树状大分子包裹的纳米硫化铜颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和特定细胞的靶向性。体外实验结果表明显示该纳米材料不仅具有良好的PA成像效果，同时可以把光热治疗和基因治疗两种治疗模式集中在一个纳米平台上，增强了对癌细胞和肿瘤的治疗效果，为联合治疗提供一种新方法；
(4)本发明制备的两性离子修饰的树状大分子靶向诊疗试剂在分子影像学和肿瘤治疗领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的反应流程和应用示意图。
图2为本发明制备的G5-mPEG-PS(a)和G5-PEG-RGD-PS(b)的核磁共振分析(1HNMR)图。
图3为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的UV-Vis图。
图4为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS(a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(b)高分辨透射电镜图片以及对应的粒径分布图。
图5为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的光热升温曲线(a，c)和单个升降温循环曲线图(b，d)，其中(a)、(b)为G5-PEG-PS@CuS，(c)、(d)为G5-PEG-RGD-PS@CuS。
图6为本发明BSA蛋白的UV-vis光谱图(a)，不同浓度的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS与BSA(1mg/mL)孵育离心前后紫外吸收差值(b)。
图7为本发明G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS在不同天数通过纳米激光粒度仪测得的水合粒径图。
图8为本发明G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS(Cu浓度为0-1.6mM)与MDA-MB-231细胞处理24h后通过CCK8法测得的细胞活力。
图9为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS(Cu浓度为0-1.6mM)在有无激光照射下的细胞活力测试。
图10为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS(a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(b)复合HIC1 pDNA在不同N/P下的凝胶阻滞实验电泳图谱(条带1：裸HIC1 pDNA；条带2：N/P＝0.25:1；条带3:N/P＝0.5:1；条带4:N/P＝1:1；条带5:N/P＝2:1；条带6:N/P＝3:1；条带7:N/P＝4:1；条带8:N/P＝5:1)。
图11为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA复合物的电势(b)和水动力学粒径图(a)。
图12为本发明制备的G5-PEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA复合物在不同N/P比例下处理后细胞的平均荧光强度。
图13为实施例13中Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS在N/P＝10形成复合物后处理细胞4h后的激光共聚焦显微镜图片。
图14为实施例14中MDA-MB-231细胞分别经过PBS、HIC1 pDNA、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物分别在有无血清条件下转染癌细胞后，HIC1蛋白表达的Western Blot结果分析图。
图15为实施例15中MDA-MB-231细胞分别经过PBS、HIC1 pDNA、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物处理后的刮伤愈合图。
图16为实施例16中CCK8法测试的MDA-MB-231细胞分别与HIC1 PDNA、G5-mPEG-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA处理后，经过有无激光照射后的细胞活力图。
图17为本发明制备的G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS在超纯水中的PA成像图(a)和PA信号值(b)。
图18为本发明制备的G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS通过尾静脉注射入小鼠体内，利用PA成像仪扫描获得小鼠肿瘤部位的PA成像图(a)和PA成像信号值(b)。
图19为实施例19中PBS、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA材料通过瘤内注射入小鼠肿瘤部位，前两组不用1064nm激光器照射，后两组用1064nm激光照射5min，记录35天内小鼠存活率(a)和22天内小鼠体重(b)、小鼠肿瘤体积(c)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取10mg的第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)(Mw＝28826)和7.7mg的mPEG-COOH(Mw＝2000)，7.3mg的EDC和4.4mg的NHS，先将mPEG-COOH和EDC分别溶于5mL和2mL DMSO中，使其充分溶解，将EDC溶液加入mPEG-COOH溶液中搅拌半个小时，然后将称好的NHS加入2mL DMSO中，待其充分溶解后，加入上述反应中，搅拌三个小时后，加入溶解于5mLDMSO中的第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)，室温搅拌三天得到G5-mPEG产物，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到G5-mPEG粉末。
(2)分别称取10mg的COOH-PEG-Mal(Mw＝2000)、3.5mg的RGD、先将RGD溶于5mLDMSO中，然后加入溶于2mL DMSO的COOH-PEG-Mal，反应一天后，用截留分子量为1000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到干燥的COOH-PEG-RGD。
(3)称取10mg COOH-PEG-RGD溶于5mL DMSO中，待其充分溶解后加入溶于2mL DMSO中的EDC(14.2mg)搅拌半小时，然后加入溶于2mL DMSO中的NHS(9.4mg)搅拌三小时，再将12.9mg第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)(Mw＝28826)溶于5mL DMSO中加入上述反应中，搅拌三天，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到G5-PEG-RGD。
(4)称取G5-mPEG或G5-PEG-RGD 10mg，将其溶于5mL超纯水中，待其充分溶解后，分别加入0.6mg、0.59mg的1,3-PS，30℃水浴搅拌反应一天，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS。
(5)称取G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS 10mg，CuCl2·2H2O 7.8mg，Na2S·9H2O41.2mg，将G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS溶解于1.3mL水中，加入溶于0.5mL水的CuCl2·2H2O，搅拌半个小时，继续加入溶于2.4mL的Na2S·9H2O，30℃搅拌四个小时，溶液变成墨绿色，用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS。
实施例2
分别称取实施例1中的G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS各5mg，分别将其溶于500μLD2O中，进行核磁氢谱分析(如图2所示)。如图2a所示，其中3.6ppm处为PEG的特征峰，2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，1.9ppm处为1,3-PS的特征峰，通过积分计算得到每个树状大分子上连接了9.7个PEG和19.9个1,3-PS。如图2b所示，其中3.6ppm处为PEG特征峰，7.0和6.8ppm处为RGD的特征峰，2.2～3.4ppm为第五代树状大分子的特征峰，1.9ppm处为1,3-PS的特征峰，并通过积分计算得到每个树状大分子上连接了9.8个PEG、20.1个1,3-PS和6.9个RGD。
实施例3
取实施例1制备得到的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS配置成0.5mg/mL的水溶液，测量紫外吸收，结果如图3所示。紫外结果表明，硫化铜纳米颗粒在1000nm左右有吸收峰，此结果说明成功合成了在近红外区域具有独特吸收峰的纳米硫化铜颗粒。
实施例4
为了对制备得到的纳米颗粒的形貌和尺寸进行表征，分别取本发明实施例1制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS 1mg溶解在1mL超纯水中配成纳米颗粒悬浮液，并取悬浮液5μL滴在铜网表面，进行TEM测试(如图4所示)。TEM结果显示G5-PEG-PS@CuS(图4a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图4b)尺寸均一、分散性良好，平均粒径分别为4.3nm和4.2nm。
实施例5
为了评价本发明制备的纳米材料在近红外激光照射下的升温效果，取实施例1中所得产品用超纯水配置1.5mM的母液，之后梯度稀释成、1.2、0.9、0.6和0.3mM的溶液，并对一系列浓度的材料在1064nm激光照射下(5min)进行光热转换性能测试。以超纯水作为空白对照，结果如图5所示，可知在实验浓度范围内，G5-PEG-PS@CuS(图5a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图5c)表现出优异的光热转换能力，随着照射时间的延长，G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS水溶液的温度明显升高，而且升温效果随着浓度的增加而提高。通过计算单个循环升温降温曲线，可得G5-PEG-PS@CuS(图5b)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图5d)光热转换效率分别为45.61％、49.83％，说明CuS纳米颗粒可以很好地将光能转化为热能。
实施例6
通过将实施例1中制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS进行蛋白吸附实验测试，能够测定两性离子抗非特异性蛋白吸附的效果。称取牛血清白蛋白(BSA)1mg溶解于PBS中，然后用紫外吸收光谱仪对其进行扫描，得到的结果如附图6(a)所示，BSA在278nm处有吸收峰。然后称取实施例1中制备的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS各3mg，配置成浓度为1.5mg/mL的PBS溶液，然后分别稀释成1.0mg/mL和0.5mg/mL。称取BSA2mg，配置成1mg/mL的PBS溶液。吸取0.5mL的BSA溶液分别加入刚刚配置好的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的溶液中，充分混匀后，分别测试其在278nm处的紫外吸收值。将混合溶液放置于37℃培养箱中4h后8000rpm离心5min。然后去除沉淀，测量其在278nm处的紫外吸收值。将G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS所对应的孵育离心前后紫外吸收值相减即得紫外吸收差值。从附图6(b)可以看出，随着材料浓度的增加，两种材料的紫外吸收差值也在增加，G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的紫外吸收差值分别为：0.12、0.12。从而说明，1,3-PS的修饰能够很好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
实施例7
取实施例1中的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS分别溶于超纯水中配置成1mg/mL的水溶液，通过纳米激光粒度仪，在1-7天之内每天测试材料的水合粒径来研究材料的稳定性。结果如图7所示，随着时间的推移，G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS的粒径没有明显的变化，这一结果也证明了合成的G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS具有良好的稳定性。
实施例8
通过CCK8比色法来评价G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS对细胞增殖的影响，以MDA-MB-231细胞为细胞模型评价实施例1制备的靶向{G5-PEG-RGD-PS@CuS(T)}和非靶向{G5-PEG-PS@CuS(NT)}材料对细胞增殖的影响。用无菌PBS配置不同浓度的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的PBS溶液。MDA-MB-231细胞种植于96孔板分别与G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS(Cu浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.6mM)在37℃下共培养24h，然后换为新的培养液100μL，后加入10μLCCK8，继续在37℃下培养4小时，然后在450nm处测其吸光值，并根据此值计算细胞的活力(如图8)。以PBS缓冲液为对照组，与对照组相比，G5-PEG-PS@CuS组和G5-PEG-RGD-PS@CuS组在实验浓度(Cu浓度为0.2-1.6mM)范围内对MDA-MB-231细胞的活力无明显影响，细胞活力均保持80％以上，说明合成的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS具有良好的细胞相容性。
实施例9
以MDA-MB-231细胞为模型细胞，在1064nm激光照射下评价G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS对细胞的杀伤作用。用无菌PBS配置成铜浓度为1.6mM的母液，之后梯度稀释为0.8、0.6、0.4、0.2mM的材料。取培养好的MDA-MB-231细胞种植于96孔板中，每组按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积为100μL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的材料，每个梯度用培养液稀释10倍，与细胞共培养24小时后，用生理盐水清洗三次，之后将MDA-MB-231细胞分为两组(一组实验在1064nm激光下照射5min，另一组实验不进行激光照射)，接着用生理盐水清洗3次，每孔加100μL的无血清培养基和10μL的CCK8溶液，继续培养在37℃下，培养4小时后，在450nm处测其吸光值，并根据此值计算细胞的活力。CCK8法测得细胞活力，结果如图9所示，随着浓度的增加，未照射的细胞仍然能够保持很高的活性；而经过激光照射的组，随着浓度的增加，细胞活力逐渐降低。实验结果表明该材料对MDA-MB-231细胞具有很好的光热消融效果。当材料的浓度达到1.6mM时，G5-PEG-RGD-PS@CuS经激光照射后，细胞活力为28.5％，G5-PEG-PS@CuS经激光照射后，细胞活力为41.6％。充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向肿瘤细胞，增强光热杀伤效果。
实施例10
凝胶阻滞实验用来表征载体对pDNA包裹的能力，首先采用定氮试剂盒法测出本发明制备的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS的氨基的个数，然后将G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA按照不同的氮磷比(0.25、0.5、1、2、3、4、5)孵育15-30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(如图10所示)，实验结果表明G5-PEG-PS@CuS(图10a)和G5-PEG-RGD-PS@CuS(图10b)在N/P为1的条件下就可以完全包裹pDNA，说明该材料具有很好的pDNA包裹能力。
实施例11
通过表面电势和粒径来表征载体/HIC1 pDNA复合物。将实施例1中G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA按不同N/P比(N/P＝1、5、10、15、20)复合，最终体积为100μL，室温孵育30min，然后加入1mL的PBS。采用马尔文激光粒度仪对其表面电势和粒径进行了表征，结果如图11所示，结果表明，G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物的大小在合适的转染尺寸范围内，且电势都在适合转染的电势范围内。
实施例12
通过流式细胞仪检测制备的G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS/Cy3-HIC1pDNA复合物在MDA-MB-231细胞内的吞噬效率，将细胞以每孔1.5×105密度MDA-MB-231细胞种植于12孔细胞培养板中，在37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用PBS洗三次，再将带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS按照不同的N/P值(N/P＝1、5、10、15、20)共同孵育30分钟，然后用此复合物的分别在有FBS和无FBS下的DMEM培养液在37℃培养箱中培养4h。培养结束后用PBS清洗三次，再用胰酶消化、离心，最后加入300μLPBS重悬细胞，通过流式细胞仪检测其平均荧光强度(如图12所示)。实验结果表明，在N/P＝10的时候，荧光强度最高，表明在有血清存在下G5-PEG-RGD-PS@CuS负载HIC1pDNA后的细胞内吞效果最好。实验结果表明，在N/P＝10的时候，荧光强度最高，表明在有血清存在下G5-PEG-RGD-PS@CuS负载HIC1 pDNA后的细胞内吞效果最好。在同一氮磷比下，G5-PEG-RGD-PS@CuS的荧光强度要高于G5-PEG-PS@CuS，充分证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向肿瘤细胞。
实施例13
为了更进一步探究G5-PEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS/Cy3-HIC1 pDNA复合物在胞内的定位，采用共聚焦显微镜来进一步观察。将MDA-MB-231细胞以1.5×105的密度种植于confocal皿中，在37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后，然后弃去培养基，用PBS洗三次，再将带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS在N/P＝10下共同孵育30分钟，然后用此复合物的分别在有血清和无血清下的DMEM培养液在37℃培养箱中培养4h。培养结束后用PBS清洗三次，然后用4％的戊二醛4℃固定15分钟，固定后用DAPI染色15分钟，然后在油镜下观察细胞的荧光信号(如图13所示)，实验结果表明，PBS和单独的pDNA组的细胞没有红色荧光信号，带有Cy3标记的HIC1 pDNA与G5-PEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS形成复合物后处理的细胞均显示了较高的荧光强度，且G5-PEG-RGD-PS@CuS组的荧光强度要高于G5-PEG-PS@CuS组，本实验也充分证明了RGD赋予材料的靶向性能。
实施例14
采用Western Blot来评价MDA-MB-231细胞内HIC1蛋白表达情况。将MDA-MB-231细胞以每孔1.5×105的密度种植于12孔板中，在37℃培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基，加入PBS、pDNA和本发明制备的G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA(N/P＝10)复合物在有FBS或无FBS的DMEM培养基中，继续培养24h，然后用细胞裂解液提取MDA-MB-231细胞的总蛋白，后将蛋白质变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ECL化学发光，显影，定影，成像结果如图14所示。以PBS为空白对照组，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参蛋白。实验结果表明，在实验组和对照组中内参蛋白量表达都很正常，相较于PBS和pDNA组，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA处理的实验组HIC1蛋白有明显的上调，这一结果也证明了本发明合成的载体可以有效地携带pDNA进入细胞，从而达到基因治疗的目的。同一条件处理后，G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA组比G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA组中HIC1蛋白上调的更为明显，这也充分证明了RGD赋予材料的靶向性能。
实施例15
通过细胞刮伤愈合实验来验证癌细胞侵袭能力。将MDA-MB-231细胞以每孔1.5×105的密度种植于12孔板中，在37℃培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基，用200μL移液器枪头在每孔中呈“一”字划痕，划完用PBS清洗两次，同时加入有FBS和无FBS的培养基，拍照时间为0h点。然后将PBS、HIC1 pDNA、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA分别加入有FBS和无FBS的孔板中，继续在37℃培养箱培养，继续培养12h、24h，并分别在各个时间点拍照，并整理各个时间点的照片，观察细胞迁移率的差别(如图15所示)。实验结果表明，PBS组和单独的pDNA组细胞有明显的迁移，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA实验组能明显抑制癌细胞的侵袭，这一结果也证明了本发明制备的载体可以在MDA-MB-231细胞中转染HIC1pDNA产生HIC1蛋白的表达，从而使其发挥作用，抑制癌细胞的侵袭。G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA分别在有血清和无血清处理下，相比于无血清组有血清组能更明显的抑制癌细胞的侵袭，充分证明了经两性离子修饰后，在有血清条件下转染效果更佳。
实施例16
为了验证本发明合成的G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA纳米材料具有光热治疗和基因治疗的联合治疗效果，将HIC1 PDNA、G5-mPEG-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA五组材料与细胞共孵育后经近红外激光照射后，以PBS组为对照组，最后由CCK8比色法检测细胞活力，从而来评价纳米材料的治疗效果。将MDA-MB-231细胞以每孔一万的密度种植于96孔板细胞培养板中，待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入含有PBS、HIC1 PDNA、G5-mPEG-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA、G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA的新鲜DMEM培养基，每组六个平行，培养24小时后，将孔板置于1064nm的激光照射下分别照射五分钟，未经激光照射的细胞作为对照组，结果如图16所示，未经激光照射的对照组，细胞活仍保持在80％左右。此外，相比于G5-mPEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS组，G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA和G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA组经激光照射后细胞活力有明显的下降。而细胞经过G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1pDNA激光照射处理后，细胞活力显著降低，达到41％左右，说明本发明制备的G5-mPEG-PS@CuS和G5-PEG-RGD-PS@CuS可以将光热治疗和基因治疗元素整合在一个纳米平台上，实现联合治疗。
实施例17
取实施例1中所得产品用超纯水配制铜浓度为15mM的母液，之后梯度稀释为12、9、6和3mM的材料，并对一系列浓度材料在1064nm波长下进行光声成像测试。以超纯水作为空白对照。测试结果显示：在实验浓度范围内，G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS均表现出优异的PA成像效果(图17)。
实施例18
将实施例1中所得产品用无菌PBS缓冲液配制成铜浓度为15mM的G5-mPEG-PS@CuS、G5-PEG-RGD-PS@CuS溶液，取100μL通过尾部静脉注射到小鼠体内，之后在12h、24h分别通过PA成像仪扫描获得小鼠肿瘤部位的PA成像图和PA信号值。以注射G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS材料之前的小鼠PA成像作为空白对照。小鼠体内PA成像测试结果显示：G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS材料可以通过EPR效应在小鼠肿瘤部位聚集，并进行增强PA成像，而且在12h时达到最佳的成像效果。由于材料的代谢，随着时间的增加，小鼠肿瘤部位PA信号减弱(图18)。证明本方法合成的G5-PEG-RGD-PS@CuS、G5-mPEG-PS@CuS具有较好的PA成像效果。在同一时间点G5-PEG-RGD-PS@CuS的信号增强效果要高于G5-mPEG-PS@CuS，证明了经RGD修饰之后，材料可以特异性靶向到肿瘤组织，增强成像效果。
实施例19
取实施例1中制备的G5-PEG-RGD-PS@CuS用无菌PBS缓冲液配置成铜浓度为1.2mM的溶液，同时将实验荷瘤裸鼠随机分为四组，随后通过瘤内注射的方式向每只荷瘤裸鼠瘤内注射100μL溶液：第一组瘤内注射PBS(对照组)，第二组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA(基因组)，第三组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS并用激光照射5min(光热组)，第四组瘤内注射G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA并用激光照射5min(光热+基因组)。之后，记录22天内裸鼠的肿瘤体积、体重和35天内的裸鼠存活率。实验结果如图19所示，相比于对照组和基因组，光热组和基因+光热组裸鼠的肿瘤体积得到有效地控制，治疗后肿瘤彻底清除；此外，与对照组相比，基因组裸鼠的肿瘤生长速度也得到了一定的抑制，证明本发明中合成的G5-PEG-RGD-PS@CuS能应用于动物体内，并实现体内肿瘤的光热-基因联合治疗。
Claims (10)
1.一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物，其特征在于，所述复合物为表面修饰PEG或者PEG-RGD和两性离子1,3-PS、内部包裹硫化铜纳米颗粒的树状大分子G5与HIC1 pDNA的复合物。
2.一种两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物的制备方法，包括：
(1)将mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD溶解于溶剂中，经EDC和NHS活化，加入到G5.NH2溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG或G5-PEG-RGD，其中mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD与G5.NH2的摩尔比为10～12:1；
(2)将步骤(1)中G5-mPEG或G5-PEG-RGD溶于超纯水中，加入1,3-PS溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS；其中G5-mPEG或G5-PEG-RGD与1,3-PS的摩尔比为1:20～22；
(3)将步骤(2)中G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS溶于超纯水中，加入CuCl2·2H2O水溶液搅拌，再加入Na2S·9H2O水溶液反应，透析，冷冻干燥，得到G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS，其中G5-mPEG-PS或G5-PEG-RGD-PS、CuCl2·2H2O和Na2S·9H2O的摩尔比为1:80～100:80～300；
(4)将步骤(3)中G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA共同孵育，得到G5-mPEG-PS@CuS/HIC1 pDNA或G5-PEG-RGD-PS@CuS/HIC1 pDNA复合物，即两性离子修饰树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒/pDNA复合物。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中COOH-PEG-RGD的制备方法包括：将RGD和COOH-PEG-Mal分别溶解于二甲基亚砜溶液中，将得到的RGD溶液滴加到得到的COOH-PEG-Mal溶液中，室温反应1-2天，透析、冻干，得到COOH-PEG-RGD；其中，RGD与COOH-PEG-Mal的摩尔比为1:1～1.2。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为DMSO；mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化时间为2-4h；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2-4天。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)、(3)中透析的条件为：用截留分子量为8000～14000的透析袋透析2-3天。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌反应温度为25～30℃，搅拌反应时间为1-2天。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中搅拌时间为25-30min；反应温度为30～35℃，反应时间为4-8h。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中G5-mPEG-PS@CuS或G5-PEG-RGD-PS@CuS与HIC1 pDNA的N/P为5:1～20:1；共同孵育时间为15-30分钟。
10.一种如权利要求1所述复合物在制备体外PA成像、光热治疗和基因治疗的诊疗剂中的应用。
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