CN112089836B - 一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用 - Google Patents

一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用，通过构建一种智能的纳米酶系统，实现了pH可控的化学动力学增强的光热抗肿瘤疗法，以解决致命癌症的高复发问题。这种纳米仿生酶系统以硫化铜纳米颗粒核心作为光热剂和类芬顿催化剂，超支化大分子聚合物作为模板包裹硫化铜并接枝葡萄糖氧化酶。研究结果证明在肿瘤的微酸环境下，所制备的纳米仿生酶体系具有优秀的化学动力学和光热治疗性能，能够高效的抑制肿瘤的生长和复发，为临床治疗高复发性的中晚期癌症提供一种新的策略。

Description

一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米仿生酶的制备及其在光热和化学动力学联合治疗等抗肿瘤领域的应用技术领域，具体涉及一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用。
背景技术
癌症作为世界三大疾病之一，具有极高的致死率，且每年的患病人数呈快速上升趋势，是严重威胁人类生存的重大疾病。研究证实，早期癌症的治愈率高，而中晚期的癌症具有较高的复发率和死亡率。即使经过成功的治疗，晚期癌症的生存率也极为低下。癌症的常规手术治疗对人体创伤较大，容易引起多种手术并发症，作为一种局部治疗手段，更多适用于早期肿瘤的治疗。而其它的非手术方法，如化疗和放疗，易造成周围正常组织的损伤，并且只能治标，对于癌细胞的复发没有好的效果。现代医学迫切需要开发能够有效抑制肿瘤复发的新技术。光热治疗作为一种新型疗法，其强大的组织穿透能力和低侵袭性，可以为中晚期的癌症治疗提供一种更合理的选择。在近红外光的作用下，纳米材料被激光照射激发，产生良好的光热性能，能够有效的抑制肿瘤的生长。但近红外发射器的光斑大小不能完全覆盖某些无定型的肿瘤部位及皮下深处的肿瘤组织，因此，这种形式治疗后的肿瘤复发仍是一个巨大的挑战。
化学动力学治疗能通过芬顿或类芬顿反应在肿瘤组织内产生大量羟基自由基(•OH)，诱导肿瘤部位的细胞凋亡，而不损伤正常组织。虽然化学动力学不能有效清除大的肿瘤组织，但可将其作为一种额外手段去除光热治疗后残留的肿瘤细胞。
虽然大多数的化学动力学治疗系统可以通过不同的芬顿催化剂将癌细胞内的内源性过氧化氢转化为羟基自由基，但由于光热治疗后残留肿瘤细胞内可利用的内源性过氧化氢数量不足，化学动力学对肿瘤复发的影响并不显著。
发明内容
为了解决现有技术的中肿瘤易复发、难治愈等临床重大挑战以及光热治疗后残留肿瘤细胞内可利用的内源性过氧化氢数量不足，化学动力学对肿瘤复发的影响并不显著的缺陷，本发明提供了一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用，可通过高效的近红外响应光热效应，抑制绝大部分肿瘤的生长，并且进一步通过芬顿催化化学动力学效应，高效抑制肿瘤的复发，为癌症的临床治疗提供一种治标又治本的新策略。
本发明采用的技术解决方案是：一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶为引入葡萄糖氧化酶（GOD）的树状大分子包裹的硫化铜纳米颗粒纳米复合体系。
一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）超支化大分子包裹硫化铜纳米颗粒的制备：在超支化大分子溶液中加入氯化铜溶液（CuCl2•2H2O），搅拌，再加入硫化钠（Na2S•9H2O），于30℃继续搅拌反应，透析，得到树状大分子包裹的硫化铜纳米颗粒（CuS@G5）。
（2）葡萄糖氧化酶的负载：将甲氧基-聚乙二醇-羧基（mPEG-COOH）经过（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，搅拌，得到活化的mPEG-COOH，然后将活化的mPEG-COOH滴加到步骤（1）合成的CuS@G5溶液中，继续搅拌，透析，得到CuS@G5-PEG（CuGP），将所制备的CuGP与GOD孵育，得到硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶（CuGP/G）。
所述的步骤（1）中超支化大分子为第五代聚酰胺树状大分子或聚乙烯亚胺。
所述的步骤（1）中的超支化大分子与氯化铜的摩尔比为1: 50~1:200。
所述的步骤（1）中的氯化铜和硫化钠的摩尔比为1:3~1:5。
所述的步骤（1）中的搅拌和继续搅拌的时间为别为15 ~ 30 min和6 h。
所述的步骤（2）中的mPEG-COOH、EDC与NHS的摩尔比为1:1:1 ~ 1:5:5
所述的步骤（2）中的mPEG-COOH与CuS@G5的摩尔比为20:1 ~ 30:1。
所述的步骤（2）中的搅拌和继续搅拌的时间为别为3 ~ 4 h和12 ~ 24 h。
所述的步骤（1）和步骤（2）中的搅拌的速度为900~1000 rpm。
所述的步骤（1）和步骤（2）中透析步骤为：为用去离子水透析3 d，每天3次，每次4L去离子水，其中；透析袋截留分子量为1000。
所述的步骤（2）中CuGP与GOD的质量比为1000:1 ~ 1500:1。
所述的步骤（2）中的孵育的时间为20~30 min。
一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶在制备用于肿瘤光热和化学动力学联合治疗的纳米体系材料上的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶的制备方法与应用，通过构建特殊性能的纳米复合体系，通过化学动力学增强光热治疗效果，从而有效抑制光热治疗后的肿瘤的复发问题，本发明使用了过渡金属硫化物无机材料——硫化铜纳米颗粒作为催化剂。硫化铜纳米颗粒具有较强的近红外吸收性能和较高的光热转换效率，对芬顿反应具有良好的催化活性，本发明进一步将葡萄糖氧化酶引入纳米复合体系，构建生物仿生酶，特异性的催化葡萄糖产生过氧化氢。同时以超支化聚合物大分子作为载体，保护GOD在体内的传输，免于被降解，超支化大分子聚合物表面丰富的氨基赋予其正电性，能通过静电相互作用与带负电荷的GOD紧密结合，这种相互作用在如肿瘤微环境的酸性条件下会减弱，并导致GOD的释放，再加上芬顿反应也是在酸性环境中发生，这为在肿瘤环境特异性的酶催化化学动力学反应提供了条件。
附图说明
图1为本发明制备的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶CuGP/G的合成示意图。
图2为如图1示意图中所示制备的负载葡萄糖氧化酶前后的（a）CuGP纳米颗粒与（b）CuGP/G纳米酶的扫描电子显微镜图。
图3为所制备的不同浓度的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶CuGP/G在808 nm（1.2 W/cm2，5 min）近红外激光照射后的温度变化曲线。
图4为所制备的CuGP/G纳米酶在5 mM葡萄糖存在下，对四甲基苯二胺（TMB）溶液的紫外吸收曲线。（a）添加CuGP/G至上述溶液前后的紫外吸收曲线对比图；（b）为添加CuGP/G后不同时间溶液的颜色变化与紫外吸收峰的变化。
图5为所制备的CuGP纳米颗粒与CuGP/G在中性（pH = 7.4）和酸性（pH = 6.0）条件下，经808 nm（1.2 W/cm2，5 min）近红外激光照射前后的细胞存活率变化。生理盐水（PBS）溶液作为对照组。
图6裸鼠肿瘤模型通过尾静脉注射CuGP纳米颗粒和CuGP/G纳米酶（溶于PBS）3天后，在不同条件下，肿瘤体积的变化情况。注射生理盐水（PBS）溶液的裸鼠肿瘤模型作为对照组。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
如图1 所示，硫化铜/超支化大分子纳米酶的制备包括如下步骤：首先将CuCl2•2H2O与超支化大分子聚合物（如第五代聚酰胺胺树状大分子—G5）以一定比例混合于水中。磁力搅拌混匀后，再将Na2S•9H2O加入到上述溶液中，继续30℃搅拌。将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天（4 L × 3），得到纯化的CuS@G5。之后将mPEG-COOH通过EDC和NHS活化羧基，加入到上述纯化的CuS@G5溶液中，继续搅拌24 h。将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天（4L×3），得到纯化的CuGP。最后将上述制备的CuGP与GOD混合孵育，相互作用20 ~ 30 min后，形成组装的CuGP/G纳米仿生酶。
实施例2
如图2所示，所合成的CuGP为平均尺寸为25 nm的均匀纳米颗粒当负载了GOD制备得到CuGP/G纳米酶之后，所得产物的形貌大小与CuGP相似，说明GOD的负载并不影响CuGP的尺寸。
实施例3
如图3所示，本发明所制备的0.1 mg/mL CuGP/G纳米酶在808 nm（1.2 W/cm2）激光照射5 min后，溶液温度从初始的29.5℃升高到了43.1℃。随着CuGP/G浓度的增加，温度的增幅也随之提高。当CuGP/G浓度提高到1.5 mg/mL的时候，温度在5 min内提高到了68.1℃，表明了所制备的CuGP/G具备优异的光热性能。
实施例4
本发明通过3,3’，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色反应来检测所制备的CuGP/G纳米酶的类芬顿催化性能。在本发明中，CuGP/G纳米酶中的GOD能够催化葡萄糖底物产生H2O2，并通过纳米酶催化芬顿反应，产生•OH。而无色TMB在酸性溶液中与•OH相互作用时，会转化为显色的TMB氧化物，可以通过650 nm处的紫外吸收峰的形成来确定。如图4a所示，溶液中未添加CuGP/G时，葡萄糖与TMB混合溶液没有可见的吸光度峰。当150 μg/mL CuGP/G加入到溶液中时，产生了明显的特征吸收峰，并且会随着反应时间的进行，这种吸收逐渐增强（图4b）。这些结果证实了CuGP/G能够催化芬顿反应，产生•OH。图4b表明，CuGP/G催化芬顿反应的催化活性，随着时间的进行逐渐加强
实施例5
图5展示了所制备的CuGP/G纳米仿生酶通过化学动力学增强的光热效应在体外抑制肿瘤细胞（如4T1）的效果评价。将不同浓度的PBS、CuGP纳米颗粒和CuGP/G纳米酶分别于中性（pH = 7.4）和酸性（pH = 6.0）与肿瘤细胞共孵育24 h，随后用808 nm（1.2 W/cm2）近红外激光照射5 min，检测细胞存活率。结果发现，PBS组和CuGP纳米颗粒（NIR-）组存活率均高于90%，而CuGP纳米颗粒（NIR+）组的细胞存活率只有27%，表明CuGP纳米颗粒具有良好的光热性能。当负载了GOD构建CuGP/G纳米酶之后，CuGP/G（NIR-）组具有pH依赖的抗肿瘤活性，在酸性条件中的肿瘤细胞存活率低到55%。而CuGP/G（NIR+）组的细胞存活率在酸性条件下低至13%，与单独的化学动力学治疗（存活率55%）和单独的光热治疗（存活率27%）相比，化学动力学疗法增强了光热治疗的协同效应，提高了整个体系的抗肿瘤活性。这些结果也进一步说明了，单纯的光热效应（CuGP NIR+组）只能杀伤73%的肿瘤，但是化学动力学增强的光热效应（CuGP/G NIR+组），可以杀伤87%的肿瘤，能够进一步的杀伤光热治疗后的残留的肿瘤细胞，有望用于肿瘤的复发的抑制。
实施例6
在裸鼠体内构建皮下肿瘤模型，通过尾静脉注射所制备的CuGP/G生理盐水溶液（1.0 mg/mL溶于0.1 mL生理盐水中），并在肿瘤部位用808 nm（1.2 W/cm2）近红外激光照射5 min，以考察CuGP/G纳米酶的抗肿瘤效果。其中，生理盐水组和CuGP组作为对照。如图6所示，相对于对照组，纯光热治疗组（CuGP NIR+）在前期能够较好的抑制肿瘤的生长。但是治疗两周后，肿瘤体积又发生了明显的增长，表明肿瘤有了一定程度的复发。但是在化学动力学增强的光热治疗组，4周的时间内，肿瘤体积能够一如既往的被抑制并趋向于零。动物实验再次证实了所构建的CuGP/G纳米酶优异的抑制肿瘤生长与复发的活性。
结论
本发明针对临床上癌症易复发、难治愈的特点，致力于开发结合双重治疗模式的新型功能化综合纳米仿生酶，通过化学动力学增强的光热疗法，以实现对于癌症细胞的生长与复发的高效抑制。所发明的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶能够将化学动力学诱导的催化反应与光热治疗系统结合，有效抑制肿瘤的生长与复发。本发明的研究结果为临床治疗癌症的复发提供了新的思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶为引入葡萄糖氧化酶GOD的树状大分子包裹的硫化铜纳米颗粒纳米复合体系，所述的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶通过以下步骤制备：
（1）超支化大分子包裹硫化铜纳米颗粒的制备：在超支化大分子溶液中加入氯化铜溶液，搅拌，再加入硫化钠，于30℃继续搅拌反应，透析，得到树状大分子包裹的硫化铜纳米颗粒CuS@G5，所述的超支化大分子为第五代聚酰胺树状大分子；
（2）葡萄糖氧化酶的负载：将甲氧基-聚乙二醇-羧基mPEG-COOH经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，搅拌，得到活化的mPEG-COOH，然后将活化的mPEG-COOH滴加到步骤（1）合成的CuS@G5溶液中，继续搅拌，透析，得到CuS@G5-PEG，简称CuGP，将所制备的CuGP与GOD孵育，得到硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶CuGP/G，所述的的mPEG-COOH、EDC与NHS的摩尔比为1:1:1 ~ 1:5:5，mPEG-COOH与CuS@G5的摩尔比为20:1 ~ 30:1，CuGP与GOD的质量比为1000:1 ~ 1500:1。
2.根据权利要求1所述的一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的步骤（1）中的超支化大分子与氯化铜的摩尔比为1: 50~1:200，氯化铜和硫化钠的摩尔比为1:3~1:5。
3.根据权利要求1所述的一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的步骤（1）中的搅拌和继续搅拌的时间为别为15 ~ 30 min和6 h。
4.根据权利要求1所述的一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的步骤（2）中的搅拌和继续搅拌的时间为别为3 ~ 4 h和12 ~ 24 h，孵育的时间为20~30min。
5.根据权利要求1所述的一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的步骤（1）和步骤（2）中的搅拌的速度为900~1000 rpm。
6.根据权利要求1所述的一种硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶，其特征在于，所述的步骤（1）和步骤（2）中透析步骤为：为用去离子水透析3 d，每天3次，每次4 L去离子水，其中；透析袋截留分子量为1000。
7.一种权利要求1-6中任意一项所述的硫化铜/超支化大分子纳米仿生酶在制备用于肿瘤光热和化学动力学联合治疗的纳米体系材料上的应用。
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