CN113456672B - 一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用,本发明基于恶性肿瘤难彻底清除、易复发转移等挑战，设计一种非金属的杂掺杂石墨烯纳米仿生酶体系，有望通过CDT增强的PTT效应，高效清除肿瘤，抑制残余肿瘤的复发与转移，为恶性重大肿瘤的临床治疗提供新的解决思路。

Description

一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药 物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及非金属纳米仿生酶的制备及其在光热和化学动力学联合治疗等抗肿瘤技术领域，具体涉及一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤（如乳腺癌）严重威胁人类的健康和生命。尽管恶性肿瘤的治疗技术在不断更新，但其长期生存率并没有得到明显改善，而肿瘤预后的复发和转移是造成后期生存率降低的主要原因。当前临床上尚无针对恶性肿瘤术后转移和复发的有效治疗方案，因此，预防或阻断肿瘤的复发和转移是提高临床疗效和患者生存率的关键挑战。近年来，除了常规外科手术和化疗外，光热疗法（PTT）因其无创性、高靶向性和便捷性，引起了业内人士的广泛关注。PTT是将具有较高光热转换效率的材料注射入人体内部，采用靶向性识别技术聚集到肿瘤组织附近，在外部光源（一般是近红外光）的照射下将光能转化为热能，以杀死肿瘤细胞的一种治疗方法。但是肿瘤的异质性和多样性严重影响了光热治疗的疗效，尤其是受制于光热激发光源尺寸与组织渗透深度的限制，总有很小一部分的肿瘤组织会在光热治疗后残余下来，并进一步引发复发与转移。因此，本发明拟开发基于氮掺杂石墨烯等非金属纳米仿生酶的化学动力疗法（CDT）增强PTT体系，克服单一治疗引起的残余肿瘤复发与转移，提高恶性肿瘤患者的预后存活率。化学动力学疗法（CDT）是基于纳米材料的良好催化活性，催化类芬顿反应，使得肿瘤微环境中的过氧化氢产生羟基自由基，从而诱导肿瘤细胞凋亡，有望用于CDT治疗之后进一步清理残余肿瘤组织，从而抑制肿瘤的转移与复发。
常见的金属催化剂如氧化铁、硫化钼、硫化铜等具有较好的PTT和CDT催化活性，但是其生化稳定性差，及潜在的金属毒性限制了其在临床的进一步应用。而以石墨烯为代表的非金属碳基催化剂，具有良好的稳定性和生物相容性。石墨烯及其衍生物作为原子厚度的二维层状结构纳米材料，具有超大的比表面积和优异的近红外光吸收能力，可作为光热剂高效地将光能转化为热能。研究发现，通过在石墨烯晶格中的碳碳双键的边缘引入杂原子（如氮、硫等），改变了原有的电子自旋密度和电荷分布，从而产生了活性位点，可高效提升石墨烯衍生物的催化活性。因此，基于杂原子掺杂的石墨烯衍生物，可以构建高性能的CDT增强PTT体系，为恶性肿瘤的有效治疗并提高患者的长期生存率提供新的解决途径。
发明内容
针对临床上存在的恶性肿瘤治疗存在清除不彻底，易转移和易复发等问题，本发明提供了一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用, 通过优异的光热转换特性与类芬顿反应催化活性，实现了对于恶性肿瘤组织的高杀伤率，及其对于残余肿瘤复发与转移的高抑制率，为恶性肿瘤的临床治疗提供了一种便捷高效的新思路。
本发明采用的技术解决方案是：一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物,所述的靶向药物为基于杂原子掺杂的石墨烯衍生物。
所述的基于杂原子掺杂的石墨烯衍生物为杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶，所述的杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶为引入葡萄糖氧化酶（GOD）的杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）纳米颗粒纳米复合体系。
一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物的制备方法，包括以下步骤：
（1）杂原子掺杂石墨烯衍生物的制备：通过羧基端甲氧基聚乙二醇（mPEG-COOH）与含杂原子聚合物（HP）之间的酰胺化反应制备得到聚乙二醇功能化的含杂原子聚合物（HP-PEG），然后将所制备的HP-PEG与氧化石墨烯粉末（GO）按一定的比例混合，室温球磨，制备得到杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）；
（2）杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶的制备：将制备的杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）溶液与葡萄糖氧化酶（GOD）共同孵育，得到杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶（H-GPP/G）。
所述的步骤（1）中mPEG-COOH与HP的摩尔量比为1:1 ~ 1:5。
所述的步骤（1）中的酰胺化反应时间为12 ~ 24 h。
所述的含杂原子聚合物（HP）为含氮聚合物、含硫聚合物中的一种或几种。
所述的含氮聚合物为聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、聚苯胺中的一种或几种，所述的含硫聚合物为聚乙烯二氧噻吩。
所述的步骤（1）中聚乙二醇功能化的含杂原子聚合物（HP-PEG）与氧化石墨烯粉末（GO）的质量比1:1 ~ 1:3。
所述的步骤（2）中杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）与葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1000:1 ~ 2000:1。
一种杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶在制备化学动力学增强光热治疗体纳米靶向药物上的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种治疗恶性肿瘤的化学动力学增强光热治疗体系的靶向药物及其制备方法与应用, 本发明基于恶性肿瘤难彻底清除、易复发转移等挑战，设计一种非金属的杂掺杂石墨烯纳米仿生酶体系，有望通过CDT增强的PTT效应，高效清除肿瘤，抑制残余肿瘤的复发与转移，为恶性重大肿瘤的临床治疗提供新的解决思路。
附图说明
图1为本发明制备的杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶（H-GPP/G）体系的合成示意图。
图2为本发明制备的H-GPP/G纳米仿生酶体系的原子力显微镜图。
图3为所制备的杂原子石墨烯（H-GPP）在808 nm（1.2 W/cm2，5 min）近红外激光照射后的温度变化曲线。
图4为所制备的H-GPP在过氧化氢存在下，在四甲基苯二胺（TMB）溶液中的紫外吸收图谱。其中图4（a）不同GPP浓度下的紫外吸收曲线对比图；图4（b）不同时间点的紫外吸收曲线对比图。
图5为所制备的H-GPP纳米颗粒与GPP/G在中性（pH = 7.4）和酸性（pH = 6.0）条件下，经808 nm近红外激光（1.2 W/cm2，5 min）照射前后的细胞存活率变化。生理盐水（PBS）溶液作为对照组。其中，1为PBS无光照（NIR-）组；2为PBS光照（NIR+）组；3为H-GPP（NIR-）组；4为H-GPP（NIR+）组；5为H-GPP/G（NIR-）组；6为H-GPP/G（NIR+）组。
图6为裸鼠肿瘤模型经尾静脉注射H-GPP纳米颗粒和H-GPP/G纳米酶后，经过不同处理21天后肿瘤的变化情况。注射生理盐水的裸鼠肿瘤模型作为对照组。其中，1为PBS无光照（NIR-）组；2为PBS光照（NIR+）组；3为H-GPP（NIR-）组；4为H-GPP（NIR+）组；5为H-GPP/G（NIR-）组；6为H-GPP/G（NIR+）组。
图7为荷瘤裸鼠模型在不同处理后第 21 天主要脏器的 H&E 染色结果。其中，1为PBS无光照（NIR-）组；2为PBS光照（NIR+）组；3为H-GPP（NIR-）组；4为H-GPP（NIR+）组；5为H-GPP/G（NIR-）组；6为H-GPP/G（NIR+）组。箭头所指为肿瘤组织。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本发明。
实施例1
一种杂原子掺杂的石墨烯纳米仿生酶（H-GPP/G），其制备包括如下步骤：如图1所示，mPEG-COOH在EDC和NHS的催化下活化其羧基，并将活化的mPEG-COOH加入到含杂原子聚合物（HP）如聚乙烯亚胺溶液中（摩尔比1:1 ~ 1:5），搅拌反应12 ~ 24 h。将得到的产物HP-PEG透析、纯化之后，与氧化石墨烯粉末（GO）按照质量比1:1 ~ 1:3混合置于球磨罐内，以300 ~ 500 rpm的转速室温球磨2 ~ 4 h，离心收集沉淀，得到H-GPP。最后将H-GPP与GOD混合孵育，得最终的H-GPP/G纳米仿生酶。
实施例2
如图2所示，所制备的H-GPP/G呈现明显的片层状复合结构，纳米颗粒均匀的分布在石墨烯片层上，整体尺寸约为200 nm，石墨烯的厚度约1.5 nm，聚合物纳米颗粒厚度约在2.9 nm左右。
实施例3
如图3所示，本发明所制备的H-GPP在808 nm（1.2 W/cm2）激光照射5 min后，随着GPP浓度的增加，升温效果逐渐增强，在浓度为500 μg/mL的时候，温度从28℃升到了72℃。而在同样条件下，对照组的水温却趋于稳定。这证实了本发明制备的H-GPP具有优异的光热转换性能。
实施例4
图4展示了本发明制备的H-GPP能够催化3,3’，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）发生类芬顿反应，产生的高活性•OH，从而氧化TMB，发生从无色到蓝色的显色变化，可用紫外分光光度计检测其在650 nm的特征吸收峰。从图中可知，随着H-GPP浓度的增加和时间的推移，蓝色逐渐加深，且特征吸收峰逐渐明晰。这说明本发明制备的GPP能高效催化过氧化氢产生大量•OH，是一种有效的类芬顿催化剂。
实施例5
图5展示了本发明制备的纳米仿生酶H-GPP/G通过化学动力学增强的光热治疗对肿瘤细胞的杀伤效果。如图所示，pH 7.4/6.0条件下的PBS组和pH 7.4条件下的H-GPP无光照（NIR-）组细胞活力良好，平均存活率都显著大于90%。H-GPP光照（NIR+）组在pH 6.0时表现了明显的肿瘤细胞杀伤力，细胞存活率迅速下降到（28.8%），表明了PTT治疗对于肿瘤细胞具有良好的抑制效果。而将CDT引入到PTT疗法之后，H-GPP/G（NIR+）组的肿瘤细胞存活率进一步下降到13.8%，证实了CDT疗法能够更好的提高PTT对于肿瘤的治疗效果。
实施例6
本发明通过在裸鼠体内构建皮下移植瘤的肿瘤模型，考察所制备的纳米仿生酶H-GPP/G在体内的抗肿瘤效果。图6为荷瘤鼠注射H-GPP/G材料21天后的肿瘤生长情况。结果显示，生理盐水组和H-GPP （NIR-）组肿瘤一直处于增长状态，而在纯CDT治疗组即H-GPP/G（NIR-）组，肿瘤的增长得到一定的抑制。在纯PTT治疗组即H-GPP（NIR+），肿瘤的增长得到进一步的抑制，肿瘤尺寸明显小于纯CDT组合和对照组。但是在光热处理21天后，能够明显看到肿瘤的复发。而在在CDT增强的PTT组即H-GPP/G（NIR+）组，肿瘤的生长得到了显著的抑制，并且随着时间的推移而逐渐消失，从动物实验证实了CDT增强的PTT治疗对于肿瘤复发具有良好的抑制效果。
实施例7
在不同处理后第 21 天进行 H&E 染色，以确定不同处理对模型小鼠主要器官如心、肝、脾、肺、肾的影响。如图7所示，在生理盐水组、H-GPP 组、纯PTT组，以及纯CDT组，大鼠肺内均可见肿瘤细胞，这可能与21天后肿瘤细胞的转移有关。单纯的PTT或CDT不能完全杀灭肿瘤，残留的肿瘤细胞可以在原来的位置再生并形成新的肿瘤，然后转移到其他器官，如肺。而在CDT增强的PTT组，即H-GPP/G（NIR+）组，21天后没有发现肿瘤细胞，表明本发明所采用的的技术能有效的抑制肿瘤转移。
结论
本发明针对临床上恶性肿瘤的治疗存在清楚不彻底，易复发转移等瓶颈挑战，开发了一种杂原子掺杂的石墨烯纳米仿生酶体系，能够将化学动力学治疗作为光热治疗系统的增强疗法，实现了对于恶性肿瘤组织的高杀伤率，以及对于残余肿瘤复发与转移的有效抑制，为恶性肿瘤的临床治疗提供了一种新的思路。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶在制备化学动力学增强光热治疗体纳米靶向药物上的应用,其特征在于,所述的基于杂原子掺杂的石墨烯衍生物为杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶，所述的杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶为引入葡萄糖氧化酶（GOD）的杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）纳米颗粒纳米复合体系，所述的杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶通过以下步骤制备：
（1）杂原子掺杂石墨烯衍生物的制备：通过羧基端甲氧基聚乙二醇（mPEG-COOH）与含杂原子聚合物（HP）之间的酰胺化反应制备得到聚乙二醇功能化的含杂原子聚合物（HP-PEG），然后将所制备的HP-PEG与氧化石墨烯粉末（GO）按一定的比例混合，室温球磨，制备得到杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）；
（2）杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶的制备：将制备的杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）溶液与葡萄糖氧化酶（GOD）共同孵育，得到杂原子掺杂石墨烯纳米仿生酶（H-GPP/G）。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤（1）中mPEG-COOH与HP的摩尔量比为1:1 ~ 1:5。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤（1）中的酰胺化反应时间为12~ 24 h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的含杂原子聚合物（HP）为含氮聚合物，所述的含氮聚合物为聚乙烯亚胺。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤（1）中聚乙二醇功能化的含杂原子聚合物（HP-PEG）与氧化石墨烯粉末（GO）的质量比1:1 ~ 1:3。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤（2）中杂原子掺杂的石墨烯（H-GPP）与葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1000:1 ~ 2000:1。
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