CN116370492A - 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法 - Google Patents

一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116370492A
CN116370492A CN202310157591.2A CN202310157591A CN116370492A CN 116370492 A CN116370492 A CN 116370492A CN 202310157591 A CN202310157591 A CN 202310157591A CN 116370492 A CN116370492 A CN 116370492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcstd
dox
mir
dota
room temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310157591.2A
Other languages
English (en)
Inventor
沈明武
巩军丽
宋聪
郭云琦
李高明
王志强
史向阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Donghua University
Original Assignee
Donghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Donghua University filed Critical Donghua University
Priority to CN202310157591.2A priority Critical patent/CN116370492A/zh
Publication of CN116370492A publication Critical patent/CN116370492A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
    • A61K49/106—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA
    • A61K49/108—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA the metal complex being Gd-DOTA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法，包括具有抗蛋白吸附性能和磁共振成像功能的核壳树状分子(PCSTD‑Gd)的制备和纳米平台PCSTD‑Gd/DOX/miR 21i的制备。本发明反应条件简单，产物易于操作分离，具有良好的发展前景，尤其在联合超声靶向微泡破坏技术后，提高了纳米复合物的肿瘤靶向性和在肿瘤部位的积累，为构建精准高效的诊疗一体化纳米平台提供了新选项。

Description

一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤诊疗一体化领域，特别涉及一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法。
背景技术
在纳米医学领域，各种纳米平台已经被广泛用于癌症的成像和治疗。其中，聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子因其具有完美的球状结构、单分散性以及良好水溶性、非免疫原性和易官能化等特点，在基因递送、药物传递、分子影像和肿瘤诊疗等生物医学领域表现出极大的应用潜力。而基于PAMAM树状大分子构建的核壳结构树状大分子(CSTDs)不但继承了单代树状大分子高度可修饰性、无免疫原性等优点，还克服了单代树状大分子有限药物负载量、基因传递效率低等局限。因此，利用树状大分子作为反应性构件，开发多功能性CSTDs纳米平台，并将其应用于前沿生物医学领域已成为科研工作者研究的最新方向之一。
目前，已利用β-环糊精(β-CD)和金刚烷(Ad)或苯并咪唑(BM)之间强烈的超分子主客体相互作用构建CSTDs。研究表明，在第3代(G3)氨基封端的PAMAM树状大分子部分表面修饰Ad或BM，第5代(G5)氨基封端的PAMAM树状大分子表面部分修饰β-CD后，可利用Ad或BM和β-CD的主客体识别，合成以G5为核、G3为壳的G5-CD/Ad-G3 CSTDs或G5-CD/BM-G3 CSTDs。和单独的G5-CD或Ad-G3树状大分子相比，G5-CD/Ad-G3 CSTDs基因传递效率分别提高了20倍和170倍(Chen F.et al.J.Mater.Chem.B,2017,5,8459)。G5-CD/BM-G3 CSTDs也被证明比单独的G5和G5-CD/Ad-G3 CSTDs拥有更好的抗癌药物负载能力和肿瘤渗透能力(Wang J.etal.Nanoscale 2019,11,22343-22350)。而且，G5-CD/Ad-G3作为纳米平台还可以实现基因和药物共递送并用于三阴性乳腺癌细胞的基因-化疗的联合治疗(Song C.etal.J.Mater.Chem.B.2020,8,2768-2774)。但遗憾的是，由于纳米平台本身的限制(如表面电势过高、无主动靶向性能、抗蛋白吸附能力差等)，这些CSTDs平台负载药物和/或基因后，没有用于体内联合治疗评价。
尽管构建诊疗一体化的纳米平台在个性化医疗和精准治疗等方面展现巨大的应用潜力。但目前用于临床实验的纳米药物其治疗效果仍然很不理想。就现有的纳米材料(如CSTDs)而言，不加修饰的纳米材料被用于体内后，是否能够有效地在肿瘤病灶区发挥作用也是纳米药物应用于药物传递、疾病诊断等方面的关键。蛋白对材料的非特异性吸附会导致纳米材料被非目标细胞吞噬或者聚集，从而引起免疫响应和其他不利结果。有研究报道，通过对纳米材料表面修饰两性离子，可以降低体内网状内皮系统(RES)以及各种蛋白对材料的非特异性吸附而减少材料被清除，延长血液循环时间，增加纳米药物在病灶区域的聚集，达到在肿瘤部位的高渗透和高保留效果。此外，超声靶向微泡破坏技术(UTMD)已被证明是增强药物在肿瘤区域富集的新策略。其作用机制是在超声作用下，造影微泡与超声的能量相互作用引起微泡爆破，微泡爆破瞬间产生的微射流、微冲力作用在血管壁或细胞膜表面产生声空化效应，增加了细胞膜的通透性，从而促进纳米材料在肿瘤部位的渗透。所以借助UTMD技术可以促进纳米颗粒在肿瘤部位的渗透，从而达到增强的治疗效果。
检索国内外相关文献和专利表明：多重修饰的多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台用于MR成像介导的化疗/基因治疗的联合治疗，目前尚未见报道。联合UTMD技术，促进新型多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台在肿瘤部位的渗透，增强MR成像和联合治疗的效果，目前尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法，该纳米平台在联合超声靶向微泡破坏技术后，提高了纳米复合物的肿瘤靶向性和在肿瘤部位的积累，为构建精准高效的诊疗一体化纳米平台提供了新选项。
本发明提供了一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台，所述纳米平台包括螯合钆离子和修饰两性离子的核壳树状分子PCSTD-Gd以及化疗药物阿霉素DOX和microRNA21基因抑制剂miR 21i。
所述PCSTD-Gd和DOX的摩尔比为1:10～1:20；所述PCSTD-Gd和miR 21i的N/P比为0.125:1～30:1。
本发明还提供了一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第三代聚酰胺-胺树状大分子溶于二甲基亚砜DMSO中，然后在磁力搅拌条件下，逐滴加入同样溶于DMSO中的羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸酯DOTA-NHS进行反应，透析、冻干处理，得到G3-DOTA；
(2)将金刚烷乙酸Ad-COOH分散在DMSO中，然后在磁力搅拌条件下，逐滴加入1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基丁二酰亚胺NHS的DMSO溶液活化，将活化的Ad-COOH溶液缓慢加入到G3-DOTA溶液中反应，透析、冻干处理，得到Ad-G3-DOTA；
(3)将β-环糊精β-CD分散在DMSO中，逐滴加入羰基咪唑CDI的DMSO溶液活化，将活化的β-CD溶液加入到G5.NH2溶液中，继续反应，透析、冻干处理，得到G5-CD；
(4)将步骤(2)中Ad-G3-DOTA和步骤(3)中G5-CD分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到G5-CD/Ad-G3-DOTA核壳树状分子，即CSTD；
(5)将步骤(4)中CSTD溶于超纯水中，然后将两性离子1,3-丙烷磺内酯1,3-PS逐滴加入到CSTD溶液中，反应，透析、冻干处理，得到1,3-PS-CSTD，即PCSTD；
(6)将步骤(5)中PCSTD和硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到PCSTD-Gd；
(7)将步骤(6)中PCSTD-Gd溶于超纯水中，与甲醇溶解的去质子化的DOX·HCl溶液混合，敞口反应，离心处理，取上清液进行冻干处理，得到PCSTD-Gd/DOX复合物；
(8)将步骤(7)中PCSTD-Gd/DOX与miR 21i进行孵育，得到PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物。
所述步骤(1)中G3.NH2和DOTA-NHS的摩尔比为1:3～6；反应温度为室温，反应时间为24～30h；透析采用截留量为1000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析(用去离子水透析3天，每天3次，每次2L去离子水)。
所述步骤(2)中Ad-COOH、EDC·HCl、NHS和G3-DOTA的摩尔比为1～2:20:20:1；活化温度为室温，活化时间为2～4h；反应温度为室温，反应时间为2～4d；透析采用截留量为1000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析三天。
所述步骤(3)中β-CD、CDI和G5.NH2的摩尔比为25～30:250～300:1；活化温度为室温，活化时间为4～6h；反应温度为室温，反应时间为48～60h；透析采用截留量为8000-10000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析三天。
所述步骤(4)中Ad-G3-DOTA与G5-CD的摩尔比为1:12～15；反应温度为室温，反应时间为48～60h；透析采用截留量为10000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析三天。
所述步骤(5)中1,3-PS与CSTD的摩尔比为1:90～100；反应温度为室温，反应时间为24-30h；透析采用截留1000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析三天。
所述步骤(6)中PCSTD与Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:60～70；反应温度为室温，反应时间为24-30h；透析采用截留量为1000Da的纤维素透析膜在超纯水中透析三天。
所述步骤(7)中PCSTD-Gd核壳树状分子与DOX的摩尔比为1:10～20；敞口反应为避光敞口室温搅拌过夜，反应结束后离心的转速为7500～8500r/min，离心时间为8～20min。
所述步骤(8)中PCSTD-Gd/DOX与miR 21i的孵育为：将PCSTD-Gd/DOX和miR 21i分别用焦碳酸二乙酯DEPC水溶解，然后按照不同的氮磷比将两种溶液混合均匀后于室温孵育20～30min。
本发明的技术方案之二提供了多功能诊疗一体化核壳树状分子-基因复合物，其采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明的技术方案之三提供了多功能诊疗一体化核壳树状分子-药物与基因共负载复合物，其采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明的技术方案之四提供了联合UTMD技术后，多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台在肿瘤MR成像、化疗及基因治疗中的应用。制备的一系列核壳树状分子纳米平台及其复合物具有抗蛋白吸附、MR成像、化疗及基因治疗性能，联合UTMD技术后，进行了体外抗三阴性乳腺癌研究和通过静脉注射的方式用于原位三阴性乳腺癌模型的MR成像、化疗及基因治疗的联合治疗。
本发明利用修饰了螯合剂(DOTA)和Ad的氨基末端的壳组分树状分子(Ad-G3-DOTA)和修饰了β-CD的氨基末端的核组分树状分子(G5-CD)通过超分子自组装形成核壳树状分子纳米平台(G5-CD/Ad-G3-DOTA，CSTD)，并在表面进一步修饰两性离子1,3-PS和螯合Gd3+，最终形成集磁共振(MR)成像功能和抗蛋白吸附功能于一体的多功能诊疗一体化纳米平台。利用多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台用于抗非特异性蛋白吸附，共负载造影剂(Gd)、抗癌药物阿霉素(DOX)和基因抑制剂(miR 21i)，并联合UTMD技术，大大改善了成像和联合治疗效果。通过对核壳树状分子的理性设计和精准合成，该发明克服了核壳树状分子在应用上的一些缺陷，并且将目前临床上诊断和治疗两个分离的过程/功能集成于一个纳米材料，利用多重修饰，构建了多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台。
有益效果
(1)本发明利用修饰了螯合剂的氨基末端的壳组分树状分子，通过超分子自组装与核组分树状分子形成了核壳树状分子，进而表面修饰两性离子并螯合钆离子，构建出具有抗蛋白吸附性能和MR成像性能的核壳树状分子纳米平台。其次，本发明利用核壳树状分子纳米平台的内部空腔和静电相互作用分别物理包裹抗癌药物DOX和压缩了基因抑制剂miR 21i用于三阴性乳腺癌的化疗与基因治疗的联合治疗。最后，本发明联合UTMD技术，进一步增强了多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台在肿瘤部位的渗透，用于增强的三阴性乳腺癌的MR成像、化疗与基因治疗的联合治疗。通过对核壳树状分子纳米材料的理性设计和应用，该发明克服了核壳树状分子在应用上的一些缺陷，并且将对临床上的药物副作用和单一治疗效果有限这两大难题有潜在的指导意义，在实现肿瘤联合治疗、诊疗一体化方面具有潜在的应用前景。
(2)本发明工艺简单，成本低廉，易于操作分离，具有良好的发展前景；本发明制备的两性离子修饰的核壳树状分子具有良好的抗污性能，可以抵抗网状内皮系统的清除，延长血液循环时间；制备的多功能核壳树状分子纳米平台具有MR成像功能、药物缓释性能和基因转染功能，可实现诊疗一体化；本发明联合UTMD技术后，可进一步增强纳米平台在肿瘤部位的聚集和渗透，增强多功能核壳树状分子纳米平台成像和联合治疗效果。
附图说明
图1为本发明纳米平台制备过程示意图和应用示意图。
图2为本发明制备的G3.NHAc(a)、G3.NHAc-DOTA(b)、Ad-G3-DOTA(c)、G5-CD(d)、CSTD(e)以及PCSTD(f)的核磁共振氢谱图(1H NMR)。
图3为实施例1制备的CSTD的2D NOESY谱图。
图4为本发明制备的PCSTD-Gd的原子力显微镜(AFM)图片(a)和高度图(b)。
图5为本发明制备的PCSTD-Gd和CSTD-Gd在不同质量条件下的抗蛋白吸附实验数据图。
图6为本发明制备的PCSTD-Gd的T1弛豫时间的倒数随Gd浓度变化的线性关系图(a)和MR成像图(b)。
图7为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物的凝胶阻滞实验电泳图。其中泳道1为marker2000，泳道2为miR 21i，泳道3-8分别对应0.125、0.25、0.5、1、2、5:1氮磷(N/P)比下的纳米复合物。
图8为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物在不同N/P比下的水动力学直径图(a)和表面电势图(b)。
图9为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物在不同PCSTD-Gd浓度条件下处理三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)细胞24小时后的细胞活力图。
图10为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物在不同N/P下处理MDA-MB-231细胞4小时后，流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞吞噬能力直方图(a)和相对荧光强度统计图(b)。图11为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物在最佳N/P比下处理MDA-MB-231细胞4小时后，共聚焦显微镜检测细胞的形貌图。
图12为本发明制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物对MDA-MB-231中相关靶蛋白表达影响的蛋白质印迹(Western blot)试验结果图。
图13为本发明制备的PCSTD-Gd/DOX复合物在不同pH条件下的体外药物释放动力学曲线图。
图14为本发明制备的各种基于PCSTD-Gd的复合物以及PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物联合UTMD技术在不同DOX浓度条件下处理MDA-MB-231细胞24小时后的细胞活力图。
图15为本发明制备的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物联合UTMD技术处理3D细胞球6小时后，共聚焦显微镜拍摄的细胞球荧光图(a)及单个细胞球内的荧光强度分布图(b)。
图16为本发明制备的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物联合UTMD技术前后在小鼠原位乳腺癌模型中的MR成像图(a)和相应的肿瘤部位信噪比变化图(b)。
图17为联合UTMD技术的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物水溶液及其他对照组分别经尾静脉注射后的体内抗肿瘤效果。(a)为14天内的小鼠肿瘤相对体积变化图，(b)为14天内的小鼠体重变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是商购的，无需进一步纯化即可直接使用。G5.NH2、G3.NH2购自美国Dendritech公司；EDC·HCl、NHS、1,3-PS、Ad-COOH与β-CD购自百灵威科技有限公司(中国上海)；DOTA-NHS购自德国Macrocyclis公司；DMSO购自上海凌峰化学试剂有限公司；DOX·HCl购自Sigma-Aldrich公司；MDA-MB-231细胞(人源乳腺癌细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；4～6周龄BALB/c雌性裸鼠自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)；其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
下面结合具体实施例来对本发明进行详细说明。
实施例1
一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台的制备方法，参见图1所示，具体包括以下步骤：
(1)称取10mg DOTA-NHS和18.98mg G3.NH2，并分别溶解于5mL DMSO中，然后将DOTA-NHS溶液逐滴缓慢加入G3.NH2溶液中，室温磁力搅拌24h。将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物进行冻干，最后得到G3-DOTA，-20℃保存备用。
(2)称取0.8mg Ad-COOH、7.9mg EDC·HCl、4.74mg NHS并分别溶于5mL DMSO溶液中，然后将EDC·HCl和NHS溶液逐滴加入到Ad-COOH溶液中，室温搅拌3h，得到活化的Ad-COOH溶液。称取25.3mg G3-DOTA，溶解于5mL DMSO中，并将活化的Ad-COOH溶液逐滴加入到G3-DOTA溶液中，室温磁力搅拌3d。将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物进行冻干，最后得到Ad-G3-DOTA，-20℃保存备用。
(3)称取21.58mgβ-CD和31.15mg CDI分别溶解于5mL DMSO溶液中，然后将CDI溶液逐滴缓慢加入β-CD溶液中，室温磁力搅拌6h，得到活化的β-CD溶液。称取22.01mg G5.NH2溶解于5mL DMSO溶液中，然后将活化的β-CD溶液缓慢加到G5.NH2的溶液中，室温磁力搅拌60h。将得到的产物转移至截留分子量为8000-10000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物进行冻干，最后得到G5-CD，-20℃保存备用。
(4)称取14.61mg Ad-G3-DOTA和5.12mg G5-CD，分别溶解于5mL去离子水中，混合均匀，室温磁力搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为10000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物冻干，最后得到CSTD，置于-20℃保存。
(5)称取5.78mg CSTD，溶解于5mL去离子水中，将323μL的1,3-PS缓慢逐滴加入到CSTD的溶液中，室温磁力搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物冻干，最后得到PCSTD，置于-20℃保存。
(6)称取11.48mg实施例1步骤(5)中PCSTD和2.74mg的Gd(NO3)3·6H2O，并分别溶解于5mL超纯水中，然后将Gd(NO3)3·6H2O溶液逐滴缓慢加入到PCSTD的溶液中，室温磁力搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物冻干，最后得到PCSTD-Gd，置于-20℃保存。
或称取12.3mg实施例1步骤(4)中的CSTD和3.4mg Gd(NO3)3·6H2O，并分别溶解于5mL超纯水中，然后将Gd(NO3)3·6H2O溶液逐滴缓慢加入到CSTD的溶液中，室温磁力搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，在超纯水中透析3天(2L×9)，透析结束后将产物冻干，最后得到CSTD-Gd，置于-20℃保存。
(7)将实施例1步骤(6)中得到的PCSTD-Gd用DEPC水溶解，配置成2mg/mL的水溶液，然后用DEPC水溶解miR 21i，配制成264μg/mL的水溶液，按照不同N/P比(0.125、0.5、1、2、5、10、15、30)将PCSTD-Gd水溶液与1μg miR 21i进行混合后在室温下孵育，30min后得到PCSTD-Gd/miR 21i复合物，现配现用。
或称取1mg DOX·HCl溶解于300μL甲醇中并加入5μL三乙胺得到去质子化的DOX甲醇溶液，然后称取12.52mg实施例1步骤(6)中的PCSTD-Gd并溶解于5mL超纯水中，将DOX溶液与PCSTD-Gd混合，室温条件下敞口避光搅拌过夜，随后离心处理(8000rpm、15min)，取上清液进行冻干处理，得到PCSTD-Gd/DOX复合物。
(8)将实施例1步骤(7)中PCSTD-Gd/DOX复合物与miR 21i按照N/P＝15在室温下进行孵育，30min后得到PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物，即多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台。
对比例1
为表征实施例1步骤(1)中制备的G3-DOTA，需分别制备并利用1H NMR表征G3.NHAc和G3.NHAc-DOTA，具体包括以下步骤：
(1)称取10mg G3.NH2溶解于5mL的超纯水中，然后在室温搅拌条件下向G3.NH2溶液中缓慢滴加80μL三乙胺，30min后缓慢滴加5μL乙酸酐，继续搅拌24h后将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中、在PBS缓冲溶液中透析1天(2L×3),在蒸馏水中透析2天(2L×6)，然后进行冷冻干燥处理，得到G3.NHAc，-20℃保存备用。
(2)称取10mg G3-DOTA溶解于5mL的超纯水中，然后在室温搅拌条件下向G3-DOTA溶液中缓慢滴加60μL三乙胺，30min后缓慢滴加3μL乙酸酐，继续搅拌24h后将得到的产物转移至截留分子量为1000Da的透析袋中、在PBS缓冲溶液中透析1天(2L×3),在蒸馏水中透析2天(2L×6)，然后进行冷冻干燥处理，得到G3.NHAc-DOTA，-20℃保存备用。
(3)将对比例1步骤(1)和步骤(2)中制备的G3.NHAc和G3.NHAc-DOTA进行核磁表征，1H NMR具体结果和分析见实施例2。
实施例2
对实施例1步骤(2)～步骤(6)中制备的各个材料和对比例1中制备的G3.NHAc和G3.NHAc-DOTA进行核磁表征，1H NMR表征结果如图2所示：图2(a)和(b)分别为对比例1中制备的G3.NHAc和G3.NHAc-DOTA的1H NMR图，2.2-3.4ppm是G3的特征质子峰，1.9ppm是乙酰基的特征峰，根据每个图中特征峰的积分面积之比和差量计算法，计算出平均每个G3连接了3.4个DOTA分子。图2(c)为实施例1步骤(2)中制备的Ad-G3-DOTA的1H NMR图，2.2-3.4ppm是G3-DOTA的特征质子峰，1.6-1.9ppm是Ad的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出平均每个G3-DOTA连接了1.2个Ad分子。图2(d)为实施例1步骤(3)中制备的G5-CD的1H NMR图，2.3-3.2ppm是G5的特征质子峰，3.5-4.1ppm及5.0ppm是β-CD的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出平均每个G5连接了12.4个β-CD分子。图2(e)为步骤(4)中制备的CSTD的1H NMR图，1.6-1.9ppm是Ad的特征质子峰，3.5-4.1ppm是β-CD的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出平均每个CD对应着0.7个Ad分子，进而计算出每个G5-CD连接了7.4个Ad-G3-DOTA分子。图2(f)为步骤(5)中制备的PCSTD的1H NMR图，1.9ppm是1,3-PS的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出平均每个CSTD连接了48.2个1,3-PS分子。
实施例3
2D NOESY用于表征G5-CD/Ad-G3-DOTA超分子结构的形成，参见图3：化学位移3.5-4.1ppm处β-CD的内部质子基团与化学位移1.6-1.9ppm处的Ad基团出现了明显的相关交叉信号(灰色区域)，由此可以说明Ad基团与β-CD发生了相互作用，紧密结合。同时证明了主体单元G5-CD与客体单元Ad-G3-DOTA通过金刚烷与环糊精的主客体作用成功构建出了表面氨基的核壳结构树状分子G5-CD/Ad-G3-DOTA。
实施例4
对实施例1步骤(6)中制备的材料PCSTD-Gd用AFM进行表征，结果如图4所示，合成的PCSTD-Gd具有相对均匀的球形形态且单分散性良好(图4a)，PCSTD-Gd在AFM上测试的平均高度为14.0±1.5nm(图4b)。
实施例5
对实施例1步骤(6)中制备的PCSTD-Gd和对比例1中制备的CSTD-Gd进行抗蛋白吸附实验。将牛血清白蛋白水溶液(2mg/mL)按照1:1的体积比分别与不同浓度(0.25、0.5、1、2和4mg/mL)的CSTD-Gd或PCSTD-Gd水溶液进行混合，在37℃条件下放置4小时后离心(8000rpm，15min)收集上清液，并根据标准规范使用BCA定量试剂盒测量上清液中蛋白的含量。结果如图5所示，没有1,3-PS修饰的CSTD-Gd组，上清液中蛋白的含量随着材料浓度的增加而减少，这说明由于表面氨基基团的存在，CSTD-Gd吸附非特异性蛋白的能力随着材料浓度的增加而增加。而1,3-PS修饰后，PCSTD-Gd组上清液中蛋白的含量一直高于0.6mg/mL，而且蛋白含量随着材料浓度的增加变化浮动不大，这说明PCSTD-Gd由于1,3-PS的修饰而具有很好的抗非特异性蛋白吸附的能力。
实施例6
对实施例1步骤(6)中制备的PCSTD-Gd进行MR成像试验。分别配制Gd浓度为0.04、0.08、0.16、0.32和0.64mM的PCSTD-Gd水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T1弛豫效应。T1弛豫时间测完后，使用3.0T MAGNETOM VERIO临床磁共振系统进行样品的T1加权MR成像。结果如图6所示，PCSTD-Gd的r1为6.72mM-1s-1，远高于商业化造影剂
Figure BDA0004092996210000092
(4.56mM-1s-1)，而且PCSTD-Gd的MR成像信号也随着Gd浓度的增加而增强，这表明PCSTD-Gd具有良好的T1 MR成像性能。
实施例7
对实施例1步骤(6)中制备的PCSTD-Gd进行定氮实验。配置成2mg/mL的水溶液，遵循标准规范使用初级氨基氮(NOPA)检测试剂盒，最终测出每个PCSTD-Gd表面氨基数平均为83.8个。
对实施例1步骤(7)中制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有核酸染料的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固后放置于电泳槽中进行加样操作。其中，样品包括PCSTD-Gd溶液(2mg/mL)按照不同N/P比(0.125、0.25、0.5、1、2、5)与miR 21i(1μg/孔)混合并孵育30min后配制成PCSTD-Gd/miR 21i复合物，以及DNAmarker和单独(裸)的miR 21i为对照。在电压80V，时间40min的条件下进行电泳，然后用凝胶成像仪对PCSTD-Gd/miR 21i复合物在凝胶中的迁移能力进行分析。结果如图7所示，在N/P比大于等于1的时候，PCSTD-Gd能够完全将miR 21i压缩，阻滞miR 21i的迁移。
实施例8
对实施例1步骤(7)中制备的PCSTD-Gd/miR 21i复合物进行水动力学直径和表面电势表征，即制备不同N/P比(1、2、5、10、15、20、30)的PCSTD-Gd/miR 21i复合物，并用DEPC水进行稀释至终体积为1mL，用马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)进行表征。结果如图8所示，在不同的N/P比条件下，复合物的水动力学粒径都大致在200-300nm之间(图8a)，表面电势都在10-28mV之间(图8b)，这说明一定范围内的N/P比的改变并不能明显改变复合物的粒径和电势，粒径和电势总体上呈现稳定状态且都处于合适的基因传递范围，有利于被细胞吸附、内吞以及细胞内基因的传递。
实施例9
以MDA-MB-231细胞为模型细胞，检测不同浓度条件下实施例1中制备的PCSTD-Gd和PCSTD-Gd/miR 21i复合物对细胞活力的影响。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，按照5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔添加100μL含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％ FBS的DMEM培养基。细胞置于5％ CO2、37℃条件下培养过夜后，将每孔的培养基换成100μL含有不同PCSTD-Gd浓度的PCSTD-Gd或者PCSTD-Gd/miR 21i复合物的培养基，其中PCSTD-Gd浓度分别为0、100、200、500、1000、2000、3000nM，miR 21i添加量均为1μg/孔，然后继续培养细胞24h。弃去培养液，按照说明书程序使用CCK-8试剂盒进行细胞活力的检测。结果如图9所示，随着材料浓度的增加，细胞活力略有下降，但即使在浓度高达3000nM的情况下，细胞的活力仍在70％以上，说明了PCSTD-Gd具有良好的细胞相容性。与此同时，PCSTD-Gd与miR 21i复合后的毒性在一定程度上还有所降低，进而也验证了复合物良好的细胞相容性。
实施例10
以MDA-MB-231细胞作为模型细胞，选用FAM(一种荧光染料)标记的miR 21i，通过流式细胞仪检测不同N/P比条件下PCSTD-Gd/miR 21i复合物在细胞中递送miR 21i的效率。将MDA-MB-231细胞以1×105个/孔的细胞密度接种于12孔板中，每孔添加1mL DMEM完全培养基，并将孔板置于5％ CO2、37℃的培养箱中孵育过夜。然后培养基换成1mL含有不同N/P比的PCSTD-Gd/miR 21i复合物的DMEM完全培养基，其中N/P比分别为1、5、10、15和20，miR21i添加量均为1μg/孔。孵育4h后，用PBS缓冲溶液清洗细胞2遍，利用胰酶对细胞进行消化，离心(1000rpm，5min)收集细胞后，用适量PBS重悬。最后，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图10所示，和正常细胞组(对照组)相比，裸miR 21i组荧光强度略有上升，但仍然很低。而材料组荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为15的时候，绿色荧光强度最强。因此，在实验设计的N/P比条件下，PCSTD-Gd显示出了良好的递送miR 21i的效率，且在N/P比为15时递送效率最高。
实施例11
以MDA-MB-231细胞作为模型细胞，选用FAM标记的miR 21i，通过激光共聚焦显微镜检测最佳N/P比(N/P＝15)条件下PCSTD-Gd/miR 21i复合物在细胞中递送miR 21i的能力。将MDA-MB-231细胞以1×105个/孔的细胞密度接种于共聚焦显微镜专用皿中，每皿添加1mL DMEM完全培养基，并将皿置于5％ CO2、37℃的培养箱中孵育过夜。然后培养基换成1mL含有N/P＝15的PCSTD-Gd/miR 21i复合物的DMEM完全培养基，其中miR 21i添加量均为1μg/皿。孵育4h后，用PBS缓冲溶液清洗细胞2遍，并通过标准规范用戊二醛固定细胞和用DAPI对细胞核进行染色。最后，每孔添加300μL PBS，用激光共聚焦显微镜观察细胞的吞噬情况。结果如图11所示，与对照组相比，裸FAM-miR 21i组未见明显绿色荧光，PCSTD-Gd/miR 21i复合物组有很强的绿色荧光，且大部分在细胞核周围。因此，PCSTD-Gd能够成功将miR 21i传递到细胞质中，有利于后续癌细胞的基因治疗。
实施例12
以MDA-MB-231细胞作为模型细胞，通过Western Blot来检测细胞内相关蛋白的表达情况。将MDA-MB-231以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔添加2mL DMEM完全培养基，并将孔板置于5％ CO2、37℃的培养箱中孵育过夜。然后将每孔培养基换成含PBS缓冲液、裸miR 21i和PCSTD-Gd/miR 21i复合物的培养液，其中复合物的N/P比为15，miR21i添加量均为0.25μg/孔，每孔添加2mL培养液，继续培养48h。用PBS缓冲溶液清洗细胞2遍，利用胰酶对细胞进行消化，离心(1000rpm，5min)收集细胞后按照标准规范进行Western Blot实验。结果如图12所示，以PBS为空白对照组，GAPDH作为内参蛋白，单独miR 21i组的PTEN、PDCD4、Bax和Bcl-2的表达无明显变化，而PCSTD-Gd/miR 21i组中PTEN、PDCD4、Bax均有一定程度的升高，Bcl-2有一定程度的降低，这说明PCSTD-Gd/miR21i能够有效转染miR 21i，从而调控相关蛋白的表达，促进促凋亡蛋白PTEN、PDCD4、Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。
实施例13
将实施案例1步骤(8)中制备的PCSTD-Gd/DOX复合物进行载药量以及缓释效果的表征。将实施案例1步骤(8)中离心得到的去质子的DOX沉淀收集起来并重新溶解在甲醇中做紫外分光光度计(UV-vis)测试以得到其在480nm处的吸光值。相应测出DOX在甲醇中的标准曲线，进而计算出DOX沉淀的量，然后用初始DOX的加入量减去DOX沉淀量得到PCSTD-Gd/DOX复合物中DOX的负载量。通过计算，材料对DOX的包封率为84.04％，由此可知，平均1个PCSTD-Gd中包裹了12.6个DOX分子。
将实施例1步骤(8)中制备的PCSTD-Gd/DOX复合物溶解在水(2mg，1mL)中，分别置于分子量为1000的纤维素透析膜中，扎紧后悬浮于9mL的PBS(pH＝7.4)或醋酸缓冲液(pH＝6.5)中，然后将其置于37℃恒温摇床中振荡。在每个时间点下将1mL的缓冲外液取出并用UV-vis测试。与此同时，将1mL对应pH值的新鲜缓冲液加入其中。与此同时，利用UV-vis得到DOX的标准曲线，并将取得的不同pH条件下(pH＝6.5和pH＝7.4)的缓冲外液经UV-vis测试得到吸光值，由标准曲线计算得到缓释出的DOX的浓度，从而统计出PCSTD-Gd/DOX复合物在不同pH条件下(pH＝6.5和pH＝7.4)的缓释曲线。结果如图13所示，PCSTD-Gd/DOX在pH＝7.4的缓冲溶液中药物释放缓慢，48h内释放率不超过20％，在pH＝6.5的缓冲溶液中48h内DOX释放率达到近40％，这可能是由于DOX在酸性环境中会发生质子化，水溶性增加，进而导致DOX会更容易被释放出来。
实施例14
以MDA-MB-231细胞为细胞模型，检测不同DOX浓度下实施例1中制备的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD、PCSTD-Gd/DOX、PCSTD-Gd/DOX/miR 21i及Free DOX·HCl对细胞活力的影响。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，按照每孔5×103个/孔的细胞密度种于96孔板中，每孔添加100μL含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM培养基。细胞置于5％ CO2、37℃条件下培养过夜后，将每孔的培养基换成100μL含有不同DOX浓度的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD(每孔加入80μL含有不同DOX浓度的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物的培养基，再加入20μL的Sono Vue微泡悬浊液，并进行UTMD超声处理：0.4W/cm2，每孔30s)、PCSTD-Gd/DOX、PCSTD-Gd/DOX/miR21i及Free DOX·HCl的培养基，其中DOX浓度分别为0.5、1.25、2.5、5、10、25、50μg/mL，然后继续培养细胞24h。弃去培养液，按照说明书程序使用CCK-8试剂盒进行细胞活性的检测。结果如图14所示，所有组的MDA-MB-231细胞的活力都随着DOX浓度的增加而降低，而且在每种DOX浓度下，PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD组或者PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组的细胞活力均显著高于游离Free DOX组，这主要是因为PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD组和PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组需要一定时间释放DOX才能发挥其治疗功能，而大部分游离DOX则会更多更快的作用于癌细胞。不过，PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD组细胞活力明显低于PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组，这可能是由于超声诱导的声空化效应更有利于细胞吞噬PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物，从而增强了体外治疗效果。
实施例15
以MDA-MB-231细胞为模型细胞构建直径200μm左右的3D细胞球，检测实施例1中制备的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i及联合UTMD技术后PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物在肿瘤组织部位的渗透效果。首先将500μL预热的琼脂糖溶液(2％，w/v，无菌盐水)滴入3D培养皿中的每个模具中并通过移液管小心除去气泡。大概5分钟后，将固化的凝胶从模具中分离出来，放置在12孔板的每个孔中，并用DMEM培养基平衡15分钟以上。然后，移除每个孔的培养基，并将含有5×105个MDA-MB-231细胞的细胞悬浮液(190μL)缓慢添加到12孔板的每个凝胶中。静置10分钟以使细胞聚集后，将2.5mL新鲜DMEM培养基缓慢添加到每个孔中培养3-5天。当肿瘤球体达到适当的体积后，移除原培养基，加入含有PCSTD-Gd/DOX/miR 21i及PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD(每孔加入1600μL含有PCSTD-Gd/DOX/miR 21i的完全培养基，再加入400μL的Sono Vue微泡悬浊液，并进行UTMD超声处理：0.4W/cm2，每孔30s)的新鲜DMEM培养基6小时后，用PBS清洗三次，用移液枪将细胞球吹打到Confocal皿中，通过激光共聚焦显微镜的Z-stack扫描对3D细胞球不同截面的荧光强度变化进行检测和分析。如图15(a)所示，可以看到PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组的荧光随着扫描深度的增加，荧光越来越弱，在100μm的深度，荧光信号极其微弱，而PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD组在100μm深度时，仍然有较强的DOX的荧光。图15(b)的定量分析与上述结果一致。实验结果证明联合UTMD技术后，PCSTD-Gd/DOX/miR 21复合物的渗透能力变强。
实施例16
所有动物实验均经过东华大学动物伦理委员会批准，并严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4周雌性BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。首先，在裸鼠体内构建MDA-MB-231细胞的原位瘤模型，即将2×106个MDA-MB-231细胞接种到小鼠的乳房垫的位置，待肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为2组(每组3只)，具体分组为：PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组([Gd]＝5mM、100μL PBS)及联合UTMD技术的PCSTD-Gd/DOX/miR21i组([Gd]＝5mM、100μL PBS)。PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组通过尾静脉注射后，直接在不同时间点进行肿瘤的MR成像，而联合UTMD技术的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组则是通过尾静脉先注射100μL的PCSTD-Gd/DOX/miR 21i溶液后，再注射100μL的Sono Vue悬液，注射完毕后经1MHz、0.4W/cm2、超声处理2min，然后再于不同时间点进行肿瘤部位的MR成像。如图16(a)所示，与注射前相比，注射后30min内，两组中小鼠肿瘤部位的MR信号均逐渐增强，这说明无论有无UTMD技术的联合，PCSTD-Gd/DOX/miR 21i均可以随着血液流通在肿瘤部位富集并显示出MR信号。同时MR信号值定量分析结果图16(b)显示，注射90min后，两组中肿瘤部位信噪比(SNR)达到最大值，而且联合UTMD技术的实验组在各个时间点的SNR值均高于无UTMD技术组。这些结果说明PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物可以作为T1造影剂应用于体内肿瘤MR成像诊断，联合UTMD技术后还可进一步增强其MR成像效果。
实施例17
在裸鼠体内构建MDA-MB-231细胞的原位瘤模型后，将小鼠随机分为6组(每组5只)。具体分组如下：对照组(PBS、100μL)、PCSTD-Gd/miR 21i(N/P＝15、miR 21i＝0.25mgkg-1、100μL)、DOX(DOX＝5mg kg-1、100μL)、PCSTD-Gd/DOX(DOX＝5mg kg-1、100μL)、PCSTD-Gd/DOX/miR 21i(N/P＝15、DOX＝5mg kg-1、100μL)、PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD(N/P＝15、DOX＝5mg kg-1、100μL)，注射方式为尾静脉注射，其中PCSTD-Gd/DOX/miR 21i+UTMD组小鼠，在尾静脉注射PCSTD-Gd/DOX/miR 21i后经UTMD处理(尾静脉注射100μL Sono Vue悬液，经1MHz、0.4W/cm2、超声照射2min)。开始治疗的当天记为第0天，每周治疗两次，每2天记录一次老鼠体重和肿瘤尺寸。结果如图17所示，与空白对照组相比，各组小鼠的肿瘤体积均有减小，其中尤以PCSTD-Gd/DOX/miR21i+UTMD组治疗效果最为明显，PCSTD-Gd/DOX/miR 21i组效果次之。小鼠体重在治疗期间变化不大，仅单独的DOX组在治疗周期后体重略有下降。这些现象说明了运用多功能诊疗一体化核壳树状分子制备的基因和/或药物复合物具有良好的治疗效果，也说明了联合UTMD技术可以实现增强的化疗/基因治疗的联合治疗。

Claims (10)

1.一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台，其特征在于：所述纳米平台包括螯合钆离子和修饰两性离子的核壳树状分子PCSTD-Gd以及化疗药物阿霉素DOX和microRNA21基因抑制剂miR 21i。
2.根据权利要求1所述的纳米平台，其特征在于：所述PCSTD-Gd和DOX的摩尔比为1:10～1:20；所述PCSTD-Gd和miR 21i的N/P比为0.125:1～30:1。
3.一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第三代聚酰胺-胺树状大分子溶于二甲基亚砜DMSO中，然后在磁力搅拌条件下，逐滴加入同样溶于DMSO中的羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸酯DOTA-NHS进行反应，透析、冻干处理，得到G3-DOTA；
(2)将金刚烷乙酸Ad-COOH分散在DMSO中，然后在磁力搅拌条件下，逐滴加入1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基丁二酰亚胺NHS的DMSO溶液活化，将活化的Ad-COOH溶液缓慢加入到G3-DOTA溶液中反应，透析、冻干处理，得到Ad-G3-DOTA；
(3)将β-环糊精β-CD分散在DMSO中，逐滴加入羰基咪唑CDI的DMSO溶液活化，将活化的β-CD溶液加入到G5.NH2溶液中，继续反应，透析、冻干处理，得到G5-CD；
(4)将步骤(2)中Ad-G3-DOTA和步骤(3)中G5-CD分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到G5-CD/Ad-G3-DOTA核壳树状分子，即CSTD；
(5)将步骤(4)中CSTD溶于超纯水中，然后将两性离子1,3-丙烷磺内酯1,3-PS逐滴加入到CSTD溶液中，反应，透析、冻干处理，得到1,3-PS-CSTD，即PCSTD；
(6)将步骤(5)中PCSTD和硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到PCSTD-Gd；
(7)将步骤(6)中PCSTD-Gd溶于超纯水中，与甲醇溶解的去质子化的DOX·HCl溶液混合，敞口反应，离心处理，取上清液进行冻干处理，得到PCSTD-Gd/DOX复合物；
(8)将步骤(7)中PCSTD-Gd/DOX与miR 21i进行孵育，得到PCSTD-Gd/DOX/miR 21i复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中G3.NH2和DOTA-NHS的摩尔比为1:3～6；反应温度为室温，反应时间为24～30h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中Ad-COOH、EDC·HCl、NHS和G3-DOTA的摩尔比为1～2:20:20:1；活化温度为室温，活化时间为2～4h；反应温度为室温，反应时间为2～4d。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中β-CD、CDI和G5.NH2的摩尔比为25～30:250～300:1；活化温度为室温，活化时间为4～6h；反应温度为室温，反应时间为48～60h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中Ad-G3-DOTA与G5-CD的摩尔比为1:12～15；反应温度为室温，反应时间为48～60h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中1,3-PS与CSTD的摩尔比为1:90～100；反应温度为室温，反应时间为24-30h。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中PCSTD与Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:60～70；反应温度为室温，反应时间为24-30h。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中PCSTD-Gd核壳树状分子与DOX的摩尔比为1:10～20；敞口反应为避光敞口室温搅拌过夜，反应结束后离心的转速为7500～8500r/min，离心时间为8～20min；所述步骤(8)中PCSTD-Gd/DOX与miR 21i的孵育为：将PCSTD-Gd/DOX和miR 21i分别用焦碳酸二乙酯DEPC水溶解，然后按照不同的氮磷比将两种溶液混合均匀后于室温孵育20～30min。
CN202310157591.2A 2023-02-23 2023-02-23 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法 Pending CN116370492A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310157591.2A CN116370492A (zh) 2023-02-23 2023-02-23 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310157591.2A CN116370492A (zh) 2023-02-23 2023-02-23 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116370492A true CN116370492A (zh) 2023-07-04

Family

ID=86979611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310157591.2A Pending CN116370492A (zh) 2023-02-23 2023-02-23 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116370492A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ambekar et al. Recent advances in dendrimer-based nanoplatform for cancer treatment: A review
Sun et al. Dendrimer-based magnetic iron oxide nanoparticles: their synthesis and biomedical applications
Zhang et al. Dendrimer grafted persistent luminescent nanoplatform for aptamer guided tumor imaging and acid-responsive drug delivery
Shen et al. Dendrimer-based organic/inorganic hybrid nanoparticles in biomedical applications
Guo et al. Prostate cancer targeted multifunctionalized graphene oxide for magnetic resonance imaging and drug delivery
Taghavi Pourianazar et al. Bioapplications of poly (amidoamine)(PAMAM) dendrimers in nanomedicine
Wijagkanalan et al. Designing dendrimers for drug delivery and imaging: pharmacokinetic considerations
Zhu et al. Encapsulation of doxorubicin within multifunctional gadolinium-loaded dendrimer nanocomplexes for targeted theranostics of cancer cells
Huang et al. Chlorotoxin-modified macromolecular contrast agent for MRI tumor diagnosis
Mekuria et al. PAMAM dendrimer based targeted nano-carrier for bio-imaging and therapeutic agents
US20100119458A1 (en) Compositions Containing Metal Oxide Particles and Their Use
JP2011524446A (ja) ポリグリコールで修飾されたキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体、その調製方法およびその使用
CN111228520B (zh) 一种细胞膜包覆的超小四氧化三铁纳米团簇及其制备和应用
Song et al. Core–shell tecto dendrimers enable enhanced tumor MR imaging through an amplified EPR effect
CN108395531B (zh) 一种包裹纳米金颗粒的两性离子和吗啡啉修饰的聚酰胺-胺树状大分子的制备方法
Zhou et al. Synthesis and biomedical applications of dendrimers
CN113209106A (zh) 一种聚乙二醇-苯硼酸修饰的树状大分子包裹铜离子/替拉扎明复合物及其制备方法和应用
CN111420068A (zh) 聚乙二醇-树枝状聚赖氨酸/酸酐-顺铂复合物及其制备方法和应用
Wang et al. Hybrid dextran-gadolinium Nano-suitcases as high-relaxivity MRI contrast agents
Zhang et al. CD44/folate dual targeting receptor reductive response PLGA-based micelles for cancer therapy
Wang et al. Blood–brain barrier-crossing dendrimers for glioma theranostics
CN116370492A (zh) 一种多功能诊疗一体化核壳树状分子纳米平台及其制备方法
CN110302178B (zh) 一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用
CN113248721B (zh) 一种具有刚性内核的核-壳结构树状大分子及其制备方法
CN112237636B (zh) 一种合成两性离子化的双亲性树状大分子并用其包载抗癌药物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination