EA044641B1 - Соединение, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера - Google Patents

Description

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно, к доставке (транспортировке) терапевтических ферментов, что может быть использовано в медицине. Настоящее изобретение относится к соединению, содержащему терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, при этом транспортный элемент представляет собой Fabфрагмент иммуноглобулина IgG, специфичного к эпитопу в рецепторе инсулина, к применению указанного соединения для получения фармацевтической композиции для лечения заболеваний и к применению указанного соединения для лечения и профилактики заболеваний, в частности, лизосомных болезней накопления, в том числе, для лечения и профилактики недостаточности соответствующего фермента, характерной для соответствующей лизосомной болезни накопления, таких как мукополисахаридоз, в частности, мукополисахаридоз I и II типов.

Предшествующий уровень техники

Применение ферментов в терапии известно из уровня техники давно. Современная медицина все шире использует терапевтические ферменты в самых различных отраслях медицины вследствие их высокой активности и специфичности. В настоящее время наметились следующие направления энзимотерапии (Казанская Н.Ф. и др., 1984): 1) устранение дефицита ферментов с целью компенсации врожденной или приобретенной функциональной недостаточности; 2) удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых осколков; 3) лизис тромбов; 4) комплексная терапия злокачественных новообразований; 5) детоксикация организма.

Применение терапевтических ферментов для устранения дефицита ферментов с целью компенсации врожденной или приобретенной функциональной недостаточности практикуется уже давно. Лечение врожденных дефицитов ферментов, которых описано более 150, является важной проблемой заместительной терапии. Такие наследственные заболевания, как гликогенозы, липидозы, мукополисахаридозы и другие лизосомные болезни накопления преимущественно лечат путем внутривенного введения рекомбинантных аналогов соответствующих нативных ферментов.

Лизосомные болезни накопления - группа редких (орфанных) наследственных метаболических заболеваний, обусловленных отсутствием или недостаточностью лизосомных ферментов, участвующих в расщеплении сложных молекул.

В настоящее время (Новиков П.В., 2014) выделяют следующие группы лизосомных болезней накопления: 1) мукополисахаридозы; 2) липидозы (сфинголипидозы - GM1- и GM2-ганглиозидозы, болезнь Гоше, галактосиалидоз, гранулематоз Фарбера, лейкодистрофии, болезнь Ниманна-Пика типы A и B и др.); 3) муколипидозы, 4) гликопротеинозы (фукозидоз, сиалидоз, маннозидоз, болезнь накопления гликогена II типа - болезнь Помпе, болезнь Данон и др.); 5) нейрональные цероидные липофусцинозы; 6) другие болезни накопления (болезнь Ниманна-Пика тип C, болезнь Вольмана, болезнь накопления холестерина, цистиноз, болезнь Сала, пикнодизостоз и др.).

Мукополисахаридозы (МПС) - группа, объединяющая девять (I - IX, с промежуточными формами 14) метаболических заболеваний, обусловленных более чем 40 генетическими нарушениями, приводящими к отсутствию или функциональной недостаточности ряда лизосомальных ферментов, участвующих в гидролитическом расщеплении гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Гликозаминогликаны олигосахариды, принимающие участие в формировании костей, хрящей, связок, роговицы, кожи, соединительной ткани и синовиальной жидкости (Burrow T. A. et al., 2013).

У пациентов, страдающих мукополисахаридозом, наблюдается недостаточность или отсутствие, как минимум, одного из 11 ферментов катаболизма гликозаминогликанов, что с течением времени приводит к постепенному накоплению этих углеводов в клетках, жидкостях организма, в т.ч. и в соединительной ткани. В результате, перманентное накопление мукополисахаридов приводит к повреждению клеток, дисфункциям тканей и органов, наиболее часто проявляющимся в гипретензионно-гидроцефальном синдроме, гепатоспленомегалии, сердечно-сосудистой недостаточности, костно-суставных осложнениях, функциональных расстройствах центральной нервной системы (ЦНС) вплоть до тяжелых когнитивных расстройств и деменций (табл. 1) (Burrow T. A. et al., 2013).

- 1 044641

Таблица 1

Характеристика различных синдромов МПС

Синдром	Дефект фермента	Дефектная хромосома, тип наследования	Клиника, лабораторные данные	Неврологичес кая составляющая
Гурлер (МПС-1-Н)	a-L-идуронидаза	Хромосома 4, аутосомнорецессивный тип	Дети умирают в возрасте 6-10 лет от сердечной и легочной декомпенсации. В моче повышен уровень гепаран- и дерматан-сульфатов (Connock et al. 2006).	Есть
Шейе (МПС-1-S)	a-L-идуронидаза (неполный)	Хромосома 4, аутосомнорецессивный тип	Мягкий вариант, нормальный интеллект, нормальная статура. Живут до 30 лет. В моче повышен уровень гепаран- и дерматан-сульфатов (Connock et al. 2006, Pastores et al. 2007).	Нет
Хантер (МПС II)	Идуронат-2сульфатаза	Сцепленный сХхромосомой, рецессивный тип	Болеют мальчики. Умственное развитие снижено. Живут до 3040 лет. Нет помутнения роговицы. Нет дорзолюбального горба. Характерна прогрессирующая глухота, гирсутизм. В моче повышен уровень гепаран- и дерматан-сульфатов (Wraith et al. 2008, da Silva et al. 2016, Burrow and Leslie 2008).	Есть
Санфилиппо (МПС-Ш)	Тип А — сульфамидаза. Тип В — b-Nацетиллюкозаминидаза Тип С — ацетилKoAглюкозамини-Nацетилтрансфераза Тип Д — a-Nацетилглюкозамин-6фосфатаза	Хромосомы 12 и 17, аутосомнорецессивный тип	Выраженная ретардация интеллекта, макроцефалия, очень агрессивное поведение. Относительно слабые скелетные изменения. Висцеромегалия появляется в школьном возрасте. Клинически типы не могут быть	Есть

- 2 044641

			дифференцированы. В моче — гепарансульфат (Valstar et al. 2008).
Моркио (МПС-IV)	N-ацетилгалактозамин-6сульфатаза (тип А) и Ьгалактозидаза (тип В)	Хромосомы 3 и 16, аутосомнорецессивный	Нормальный интеллект. Сильно выраженная деформация скелета. Помутнение роговицы. Меньшая степень поражения ЦНС. Первые клинические признаки появляются на 2-3-м году жизни. Умирают в возрасте 20-35 лет. Кератансульфат в моче (Northover, Cowie and Wraith 1996).	Нет
МаротоЛами (МПС-VI)	N-ацетилгалактозамин-4сульфатаза	Хромосома 5, аутосомнорецессивный	Незначительная задержка роста, выраженный горб, нормальный интеллект, слабое поражение лица. Дерматан-сульфат в моче (Garrido et al. 2008).	Нет
Слая (МПС-VII)	Ь-глюкуронидаза	Хромосома 7, аутосомнорецессивный	Варьирует ментальное развитие, выраженный горб, гепатоспленомегалия, слабое поражение лица. Дерматансульфат в моче.	Есть

Мукополисахаридоз I типа вызывается дефицитом фермента лизосом, a-L-идуронидазы. Этот недостаток приводит к накоплению мукополисахаридов, особенно дерматансульфата, в тканях и органах. Накопление избыточного сульфата дерматана приводит к постепенному развитию многочисленных морфологических аномалий в тканях и органах. Мукополисахаридоз I типа характеризуется аутосомнорецессивным типом наследования.

На сегодняшний день разработаны два эффективных метода лечения МПС I типа: трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) и ферментная заместительная терапия (ФЗТ).

ТГСК применяется для лечения только тяжелых форм МПС I типа - синдрома Гурлер, что позволяет корректировать недостаточность фермента a-L-идуронидазы и, в свою очередь, приводит к значительному улучшению состояния пациента, хотя некоторые тяжелые осложнения заболевания полностью не регрессируют. ТГСК должна быть проведена как можно раньше, до появления грубых неврологических расстройств. Несмотря на улучшение состояния пациента, ТГСК сопровождается высоким риском серьезных посттрансплантационных осложнений и является сложной многоэтапной высокозатратной процедурой.

ФЗТ безопасна, хорошо переносится больными, не вызывает тяжелых нежелательных явлений и приводит к разложению негидролизованного субстрата. Возможные редкие реакции на введение препарата обусловлены образованием антител против введенного белка, но они не постоянны и, как правило, быстро купируются стандартными лекарственными средствами. Принцип ФЗТ основан на восстановлении уровня энзиматической активности, достаточной для гидролиза накопленных субстратов и для предотвращения их дальнейшего накопления.

Препарат Альдуразим (MHH: ларонидаза) (Джензайм, США) предназначен для ФЗТ больным с тремя клиническими вариантами I типа мукополисахаридоза (IH, IH/S и IS типы или синдромы Гурлер, Гурлер-Шейе и Шейе), а также детям с синдромом Гурлер до проведения ТГСК (во время поиска родственного/неродственного донора) и в течение 3-6 месяцев после ТГСК до стабилизации состояния ребенка; наряду с этим, Альдуразим показан больным, страдающим синдромом Гурлер, после проведенной ТГСК в тех случаях, когда уровень донорского фермента a-L-идуронидазы сохраняется на низких значениях.

Ларонидаза (Байомарин Фармасьютикал Инк., США) - рекомбинантная форма человеческой a-Lидуронидазы, производится с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием клеточной

- 3 044641 культуры яичника китайского хомячка. Установлено, что после внутривенного введения ларонидаза быстро покидает системный кровоток и поглощается клетками посредством маннозо-6-фосфатных рецепторов (M6PR), поступая в лизосомы. Препарат вводится внутривенно (в дозе 100 Ед/кг массы тела), в течение 3-4 ч 1 раз в неделю.

Ларонидаза представляет собой рекомбинантный белок из 628 аминокислотных остатков с молекулярной массой приблизительно 83 кДа. Ее молекула содержит 6 участков, связывающихся через аминогруппу с разными по структуре олигосахаридами, в том числе включающими остатки маннозо-6фосфатов (M6P) (Rodney J.Y. Ho, Biotechnology and biopharmaceuticals: transforming proteins and genes into drugs. - Wiley-Blackwell, 2013, p. 380). Установлено, что молекула ларонидазы не проникает через гематоэнцефалический барьер (физиологический барьер между периферическим кровообращением и головным мозгом, который образован плотными соединениями плазматических мембран эндотелиальных клеток капилляров мозга, создающими плотный барьер, ограничивающий перенос молекул в мозг, даже очень малых молекул; далее также указывается как ГЭБ) и, таким образом, не замедляет и не предотвращает развитие нарушений со стороны центральной нервной системы (ЦНС), характерных для мукополисахаридоза I типа (Pastores G.M. et al., 2007).

Мукополисахаридоз II типа (МПС-II, синдром Хантера), в отличие от всех остальных форм мукополисахаридозов, имеющих аутосомно-рецессивный тип наследования, представляет собой единственную форму мукополисахаридозов с X-сцепленным рецессивным типом наследования. МПС II - гетерогенная по клиническим проявлениям, прогрессирующая патология лизосомального накопления, возникающая вследствие недостаточности фермента идуронат-2-сульфатазы (идурсульфазы). Данный фермент в норме участвует в деградации мукополисахаридов дерматан-сульфата и гепаран-сульфата за счет гидролитического отщепления O-связанной сульфатной группы. Соответственно, в случае МПС II основной патогенетический механизм связан с прогрессирующим накоплением дерматан- и гепаран-сульфатов в лизосомах.

Наиболее частыми клиническими симптомами МПС-П являются задержка умственного развития, увеличенный язык, характерные патологии лицевого скелета, алопеция, аномалии развития зубов, рестриктивное заболевание легких, гепатоспленомегалия, патология клапанов сердца, костно-суставные патологии, тяжелая низкорослость. Также, часто наблюдаются прогрессирующие неврологические расстройства, сопровождающиеся гидроцефалией и повышенным внутричерепным давлением. Смертельный исход обычно наступает в течение второй - третьей декады жизни, чаще всего, по причине дыхательной и/или сердечной недостаточности. Важно подчеркнуть, что заболевание протекает с вовлечение в патологический процесс нервной системы, в том числе со снижением интеллекта.

На сегодняшний день имеется два принципиальных способа лечения МПС II - ФЗТ и симптоматическая терапия (включает в себя применение гепатопротекторов, сердечно-сосудистых и противовоспалительных средств, витаминов и препаратов, улучшающих антиоксидантную защиту). ТГСК для лечения МПС II, в отличие от мукополисахаридоза I типа, не эффективна.

Элапраза (МНН: идурсульфаза) (Шайер, США) - медицинский продукт, представляющий рекомбинантную идуронат-2-сульфатазу человека. Этот фермент отвечает за гидролиз C2-сульфатных эфирных связей остатков идуроновой кислоты, входящей в состав глюкозаминогликанов (мукополисахаридов) дерматан-сульфата и гепаран-сульфата (Burrow T. A. et al., 2013). Обычный режим введения Элапразы 0,5 мг/кг веса тела, раз в неделю; введение осуществляется путем внутривенной инфузии в течение 3 часов (время инфузии может быть постепенно сокращено до 1 ч).

Идурсульфаза содержит две дисульфидные связи и восемь N-связанных сайтов гликозилирования, занятых сложными высокоманнозными олигосахаридами. Присутствие в олигосахаридных цепях остатков M6P позволяет рекомбинантному ферменту связываться с M6P-рецепторами на поверхности целевых клеток, что приводит к интернализации указанного фермента в клетки и его интернализации в лизосомы, где он и обеспечивает деградацию лизосомальных мукополисахаридов (Muenzer J., et al., Genet. Med. 2006 Aug; 8(8):465 - 473).

При проведении ФЗТ продолжительность жизни больных с синдромом Хантера увеличивается в несколько раз. Несмотря на это, Элапраза также не проникает через гематоэнцефалический барьер, в результате при использовании ФЗТ Элапразой пациенты погибают в возрасте 20 лет от нейродегенеративных последствий, при этом во второй декаде жизни больные, получающие Элапразу, как правило, испытывают большие сложности в обучении и нуждаются в помощниках даже в бытовой жизни (da Silva E. M. et al., 2016; Wraith J.E. et al., 2008).

Таким образом, общим недостатком всех существующих на сегодняшний день препаратов, используемых для ФЗТ мукополисахаридозов I и II типов, является их неспособность проникать через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему, что ограничивает эффективность применения данных препаратов у больных с поражением нервной системы, ассоциированным с мукополисахаридозом, включая мукополисахаридоз I и II типов.

При многих болезнях лизосомного накопления есть потребность в улучшенной интернализации фермента в клетки определенных периферических тканей (мышцы диафрагмы в болезни Помпе, печень и селезенка в болезни Хантера, почки в болезни Фабри и т.д.) (Hawkes C. et al., 2004).

- 4 044641

Таким образом, актуальна задача разработки терапевтического соединения, которое могло бы использоваться для лечения лизосомной болезни накопления, такой как МПС I типа или МПС II типа, и которое сохраняло бы функциональные свойства соответствующего терапевтического фермента, при этом демонстрируя высокую активность и улучшенную способность транспортироваться к лизосомам клеток тканей различных органов, в том числе, к лизосомам клеток нервной ткани, и позволяло бы достичь значительного улучшения качества и продолжительности жизни больных МПС I и II типов.

Преимущества изобретения

Вышеуказанные задачи успешно решаются в настоящем изобретении, которое относится к соединению, предназначенному для лечения лизосомной болезни накопления, содержащему терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, при этом указанный транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичного к эпитопу в рецепторе инсулина. Изобретение основано на неожиданном открытии того, что транспортный элемент, представляющий собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичный к эпитопу в рецепторе инсулина, соединенный непосредственно или при помощи линкера с терапевтическим ферментом, приводит неожиданно к улучшению способности фермента транспортироваться к лизосомам различных органов и тканей, в том числе, к лизосомам клеток нервной ткани, и одновременно ферментативная активность соединения остается на высоком уровне. Благодаря этому неожиданному эффекту достигается прогресс в области ферментной заместительной терапии лизосомных болезней накопления, таких как мукополисахаридоз I и II типов, и увеличение продолжительности, и улучшение качества жизни субъектов, страдающих лизосомными болезнями накопления и нуждающихся в терапии. Соединение согласно настоящему изобретению также обеспечивает расширение арсенала средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, в частности, лизосомных болезней накопления, таких как мукополисахаридоз, в частности, мукополисахаридоз I и II типов.

Кроме того неожиданно было обнаружено увеличение ферментативной активности соединения, содержащего транспортный элемент, представляющий собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичный к эпитопу в рецепторе инсулина, соединенный непосредственно или при помощи линкера с терапевтическим ферментом, в сравнении с терапевтическим ферментом без транспортного элемента; а также, что введение соединения, содержащего транспортный элемент, представляющий собой Fabфрагмент иммуноглобулина IgG, специфичный к эпитопу в рецепторе инсулина, соединенный непосредственно или при помощи линкера с терапевтическим ферментом обеспечивает более высокую степень замещения активности терапевтического фермента в мозге человека в сравнении с соединениями, содержащими Mab-фрагмент.

Краткое описание изобретения

Настоящее краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения с той целью, чтобы вкратце обозначить предмет и сущность настоящего изобретения. Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения.

Первым объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, при этом транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичного к эпитопу в рецепторе инсулина.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, при этом транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичного к эпитопу в рецепторе инсулина, и способен транспортировать указанный фермент через гематоэнцефалический барьер.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, при этом транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичного к эпитопу в рецепторе инсулина, и способен транспортировать указанный фермент через гематоэнцефалический барьер, при этом терапевтический фермент и транспортный элемент, соединены друг с другом при помощи линкера. Линкер может представлять собой пептидный линкер, содержащий одну или более аминокислот. Линкер может представлять собой пептидный линкер, содержащий одну или более аминокислот, выбранных из глицина, серина и лейцина.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, где иммуноглобулин IgG представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где транспортный эле- 5 044641 мент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, где иммуноглобулин IgG представляет собой IgG1.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG1, состоящий из легких цепей иммуноглобулина IgG1 к рецептору инсулина (SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 и 11) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3). В частном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, где транспортный элемент представляет собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG1, состоящий из легкой цепи иммуноглобулина IgG1 к рецептору инсулина SEQ ID NO: 2 и тяжелой цепи SEQ ID NO: 3.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где терапевтический фермент применяется для лечения лизосомной болезни накопления, в том числе, для лечения ферментной недостаточности, характерной для данной лизосомной болезни накопления.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где терапевтический фермент применяется для лечения лизосомной болезни накопления с неврологической составляющей, в том числе, для лечения ферментной недостаточности, характерной для данной лизосомной болезни накопления.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где терапевтический фермент для лизосомной болезни накопления с неврологической составляющей выбран из группы, состоящей из идуронат-2-сульфатазы и a-L-идуронидазы.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где терапевтический фермент для лизосомной болезни накопления с неврологической составляющей выбран из группы, состоящей из идуронат-2-сульфатазы, фрагмента идуронат-2-сульфатазы, имеющего активность идуронат2-сульфатазы, или аналога идуронат-2-сульфатазы.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, где терапевтический фермент для лизосомной болезни накопления с неврологической составляющей выбран из группы, состоящей из a-L-идуронидазы, фрагмента a-L-идуронидазы, имеющего активность a-L-идуронидазы, или аналога a-L-идуронидазы.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, в котором указанный линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий одну или более аминокислот.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, в котором указанный линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий одну или более аминокислот, выбранных из глицина, серина и лейцина.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, в котором указанный транспортный элемент способен транспортировать указанный фермент к лизосомам клеток тканей.

В конкретном варианте объектом настоящего изобретения является соединение, предназначенное для лечения лизосомной болезни накопления, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, в котором указанный транспортный элемент способен транспортировать указанный фермент к лизосомам клеток нервной ткани.

Еще одним объектом изобретения является соединение для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2-сульфатазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа II, представленное первой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11, и второй аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14 или 15. В частном варианте объектом настоящего изобретения является соединение для лечения или профи- 6 044641 лактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2-сульфатазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа II, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и

SEQ ID NO: 4.

Следующим объектом изобретения является соединение для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2-сульфатазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа II с неврологической составляющей, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4.

Следующим объектом изобретения является соединение для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2-сульфатазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа II с неврологической составляющей, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5.

Еще одним объектом изобретения является соединение для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности a-L-идуронидазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа I, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6.

Следующим объектом изобретения является соединение, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности a-L-идуронидазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа I.

Следующим объектом изобретения является соединение, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности a-L-идуронидазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа I с неврологической составляющей.

Следующим объектом изобретения является соединение, представленное аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности a-L-идуронидазы) у субъекта, имеющего мукополисахаридоз типа I с неврологической составляющей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для получения фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, включающие введение указанному субъекту указанное соединения в эффективном количестве.

В конкретном варианте изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики ферментной недостаточности у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз, при этом соединение вводят указанному субъекту в эффективном количестве, предпочтительно, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

В конкретном варианте изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2сульфатазы) у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз типа II с неврологической составляющей, при этом соединение вводят указанному субъекту в эффективном количестве, предпочтительно, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

В конкретном варианте изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности a-Lидуронидазы) у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз типа I с неврологической составляющей, при этом соединение вводят указанному субъекту в эффективном количестве, предпочтительно, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2сульфатазы) у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз типа II, при этом соединения, представленного аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, для получения фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединения, содержащего терапевти

- 7 044641 ческий фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера, для лечения или профилактики ферментной недостаточности (недостаточности идуронат-2сульфатазы) у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз типа II, при этом соединения, представленного аминокислотнымиой последовательностямиью SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, для лечения или профилактики ферментной недостаточности у субъекта.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаемый в настоящем изобретении подход можно использовать и для лечения других лизосомальных болезней накопления, в частности, для лечения других типов мукополисахаридоза, таких как мукополисахаридоз III типа (синдром Санфилиппо), включая мукополисахаридоз IIIA типа, IIIB типа, IIIC типа и IIID типа; мукополисахаридоз IV типа (синдром Моркио), включая мукополисахаридоз IVA типа и IVB типа; мукополисахаридоз VI типа (синдром Марото-Лами), мукополисахаридоз VII типа (синдром Слая) и мукополисахаридоз IX типа. В этих случаях в качестве соответствующего терапевтического фермента вместо a-L-идуронидазы или идуронат-2-сульфатазы используют иной терапевтический фермент, с недостаточностью которого сталкиваются больные соответствующей формой мукополисахаридоза: гепарансульфамидазу - при мукополисахаридозе IIIA типа, N-ацетилглюкозаминидазу - при мукополисахаридозе IIIB типа, гепаран-aглюкозаминид-N-ацетилтрансферазу - при мукополисахаридозе IIIC типа, N-ацетилглюкозамин-6сульфатазу - при мукополисахаридозе IIID типа, галактоза-6-сульфатсульфатазу - при мукополисахаридозе IVA типа, β-галактозидазу - при мукополисахаридозе IVB типа, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу - при мукополисахаридозе VI типа, β-глюкуронидазу - при мукополисахаридозе VII типа и гиалуронидазу - при мукополисахаридозе IX типа. Аминокислотные последовательности указанных терапевтических ферментов можно получить при помощи любой из ряда компьютерных программ, известных в данной области техники, например, BLAST или FASTA и т.д. Как в BLAST, так и в FASTA доступны оффлайни онлайн-поиск (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 - 7-60, веб-сайт Национального центра биотехнологической информации на веб-сайте Национального института здравоохранения).

Предлагаемый в настоящем изобретении подход, в альтернативных вариантах осуществления изобретения, может быть также применен и для лечения лизосомных болезней накопления, не относящихся к мукополисахаридозам, путем использования вместо a-L-идуронидазы или идуронат-2-сульфатазы иного лизосомального фермента, с недостаточностью сталкиваются больные соответствующей лизосомной болезнью накопления. В отдельных неограничивающих вариантах осуществления настоящего изобретения, предлагаемый подход может быть, в частности, применен для лечения нарушений обмена аминокислот, таких как цистиноз; для лечения нарушений обмена углеводов, таких как болезни накопления гликогена, в частности, болезнь Помпе; нарушений обмена сфинголипидов и других болезней накопления липидов, в частности, GM₂ ганглиозидоза, включая болезнь Сандхоффа и болезнь Тау-Сакса; других ганглиозидозов, в частности, GM1 ганглиозидоза и муколипидоза IV; других сфинголипидозов, в частности, болезни Фабри, болезни Гоше, болезни Краббе, болезни Ниманна-Пика, синдрома Фарбера, метахромной лейкодистрофии и множественной сульфатазной недостаточности; липофусциноза нейронов, в частности, болезни Баттена, Билыповского-Янского, Куфса, Шпильмейера-Фогта; других нарушений накопления липидов, в частности, болезни Вольмана, а также для лечения нарушений обмена гликопротеинов, включая муколипидоз II (I-клеточную болезнь), муколипидоз III (псевдолиподистрофию Гурлер), и для лечения дефектов деградации гликопротеинов, включая аспартилглюкозаминоурию, фукозидоз, маннозидоз и сиалидоз.

В этих случаях к транспортному элементу вместо a-L-идуронидазы или идуронат-2-сульфатазы присоединяют непосредственно или при помощи линкера, аминокислотную последовательность соответствующего фермента, с недостаточностью которого сталкиваются больные соответствующей лизосомной болезнью накопления.

Наиболее предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже. При этом указанные предпочтительные варианты приводятся лишь для целей иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.

На фиг. 1 показана репрезентативная авторадиограмма самца яванского макака, зарегистрированная через 2 ч после однократного внутривенного введения [¹²⁵I]- HIR-Fab-IDS с номинальным уровнем дозы 0,0020 мг/кг массы тела.

На фиг. 2 показана репрезентативная авторадиограмма самца яванского макака, зарегистрированная через 2 ч после однократного внутривенного введения [¹²⁵I]-HIR-Mab-IDS с номинальным уровнем дозы 0,0015 мг/кг массы тела.

На фиг. 3 показана репрезентативная авторадиограмма самца яванского макака, зарегистрированная через 2 ч после однократного внутривенного введения [¹²⁵I]-IDS (контроль) с номинальным уровнем дозы 0,0010 мг/кг массы тела.

- 8 044641

Подробное описание

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем описании, используют то же значение, какое обычно понимается средним специалистом в данной области техники (например, в молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, химии белков, биохимии, органической химии, иммунологии, микробиологии, генетике и т.д.).

В контексте настоящего описания термин соединение понимается в самом широком смысле как по меньшей мере одна молекула, представляющая собой конъюгат, слитый белок, белковый конструкт, белковый комплекс и т.д.

Как используется в настоящем описании, под термином содержащий понимают соединение, включающие перечисленные элементы, не исключая другие.

В настоящем описании термины терапевтический фермент и фермент являются синонимами и относятся к ферменту для лечения заболеваний, возникающих вследствие отсутствия, дефицита, нарушений функций фермента и так далее, при этом субъекта, страдающего заболеваниями, можно лечить посредством ФЗТ, введения фермента и так далее. В частности, фермент может представлять собой фермент для лечения заболеваний, которые могут возникать вследствие отсутствия, дефицита и нарушений функций лизосомного фермента, но, не ограничиваясь таковым.

Терапевтический фермент, который входит в состав соединения по настоящему описанию, охватывает любой фермент, который обладает терапевтическим эффектом в отношении лизосомной болезни накопления, включая, без ограничения, β-глюкозидазу, β-галактозидазу, галактозо-6-сульфатазу, кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, галактоцереброзидазу, арилсульфатазу A, β-гексозаминидазу A, β-гексозаминидазу B, гепарин-N-сульфатазу, a-D-маннозидазу, β-глюкуронидазу, Nацетилгалактозамин-6-сульфатазу, лизосомную кислую липазу, а-М-ацетилШ-глюкозаминидазу (NAGLU), глюкоцереброзидазу, бутирилхолинэстеразу, хитиназу, глутаматдекарбоксилазу, липазу, уриказу, ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов, нейтральную эндопептидазу, миелопероксидазу, ацетил-CoA-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-б-сульфатазу, галактозамин-6сульфатазу (GALN), гиалуронидазу, а-фукозидазу, β-маннозидазу, a-нейраминидазу (сиалидазу), Nацетил-глюкозамин-1-фосфотрансферазу, муколипина-1, a-N-ацетил-галактозаминидазу, N-аспартил-βглюкозаминидазу, LAMP-2 (связанный с лизосомами мембранный белок 2), цистинозин, сиалин, церамидазу, кислую β-глюкозидазу, галактозилцерамидазу, NPC1 (белок болезни Ниманна-Пика типа С1), катепсин A, SUMF-1 (модифицирующий сульфатазу фактор-1), лизосомную кислую липазу (LIPA) и трипептидилпептидазу 1.

В частности, терапевтический фермент охватывает такие ферменты как агалсидаза, имиглюцераза, галсульфаза, идуронат-2-сульфатаза и a-L-идуронидаза. Наиболее предпочтительно, терапевтический фермент представляет собой идуронат-2-сульфатазу или a-L-идуронидазу.

Однако настоящее описание также может охватывать любой терапевтический фермент, без ограничения, независимо от типа или происхождения фермента.

В настоящем описании термин идуронат-2-сульфатаза, а также идурсульфаза, IDS, ИДС, I2S подразумевает рекомбинантный аналог лизосомного фермента идуронат-2-сульфатазы, в норме гидролизирующего О-связанную сульфатную группу мукополисахаридов - дерматан- и гепарансульфатов. В настоящем изобретении термин идуронат-2-сульфатаза можно использовать взаимозаменяемо с термином идурсульфаза.

В контексте настоящего описания термины HIR-Fab-IDS, а также rIDS-FAB-HI, rHI-FAB-IDS, rIDS-FAB-HIR и rHIR-FAB-IDS являются синонимами и обозначают гибридный рекомбинантный белок идуронат-2-сульфатазы, ковалентно соединенный с Fab-фрагментом моноклонального антитела к инсулиновому рецептору человека. В контексте настоящего описания HIR-Fab-IDS подразумевает, не ограничиваясь таковым, идуронат-2-сульфатазу с фрагментом моноклонального антитела к инсулиновому рецептору человека. В частных (неограничивающих) вариантах настоящего изобретения, варианты HIR-Fab-IDS, представлены первой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11, и второй аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14 или 15. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения HIR-Fab-IDS представлено первой аминокислотной последовательность SEQ ID NO: 2 и второй аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

В контексте настоящего описания HIR-Mab-IDS - гибридный рекомбинантный белок идуронат-2сульфатазы, ковалентно соединенный с полноразмерным моноклональным антителом к инсулиновому рецептору человека. В частных (неограничивающих) вариантах настоящего изобретения, варианты HIRMab-IDS представляют собой варианты согласно патентному документу США US8834874 B2, 16.09.2014. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения HIR-Mab-IDS представлено аминокислотной последовательностью продукта по проекту AGT-182 компании ArmaGen Technologies Inc.

В настоящем описании термин a-L-идуронидаза, а также идуронидаза, ларонидаза, IDUA подразумевает фермент, задействованный в гидролизе гликозаминогликанов, таких как дерматансульфат

- 9 044641 и гепарансульфат. В настоящем описании термин a-L-идуронидаза можно использовать взаимозаменяемо с термином ларонидаза. Дефицит (генетически обусловленная недостаточность) идуронидазы, имеющая место при мукополисахаридозе типа I, приводит к постепенному накоплению в клетках и тканях организма гликозаминогликанов - гепарансульфата и дерматансульфата.

HIR-Fab-IDUA, а также rIDUA-FAB-HI, rHI-FAB-IDUA, rIDUA-FAB-HIR, rHIR-FAB-IDS гибридный рекомбинантный белок a-L-идуронидаза, ковалентно соединенный с Fab-фрагментом моноклонального антитела к инсулиновому рецептору человека. В частных (неограничивающих) вариантах настоящего изобретения, варианты HIR-Fab- IDUA, представлены первой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11, и второй аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 6,7.

HIR-Mab-IDUA - гибридный рекомбинантный белок a-L-идуронидаза, ковалентно соединенный с полноразмерным моноклональным антителом к инсулиновому рецептору человека.

Терапевтические ферменты, которые могут входить в состав соединений по настоящему изобретению, могут находиться в своей нативной форме, а также в форме фрагментов, состоящих из частей ферментов, или аналогов ферментов, в которых возникла вариация, выбранная из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации некоторых аминокислот и их комбинации, без ограничения, при условии, что они обладают такой же ферментативной активностью, как и нативные формы соответствующих терапевтических ферментов. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления изобретения, могут использоваться фрагменты ферментов, обладающие активностью нативных форм соответствующих ферментов. Аналогами ферментов, без ограничения, считаются те ферменты, которые, имеют различные характеристики гликозилирования и степень гликозилирования, обусловленные экспрессией известного фермента в различных хозяевах, а также различную степень замен конкретных аминокислотных остатков соответствующего фермента относительно стандартной последовательности, где степень замен не является 100% заменой. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления изобретения, могут использоваться аналоги a-L-идуронидазы, известные из патентов US 5932211 A, 03.08.1999, US 6153188 A, 28.11.2006 и US6541254 B1, 01.04.2003, а также аналоги идуронат-2сульфатазы. Специалисту в данной области понятно, что могут использоваться и другие фрагменты и аналоги ферментов a-L-идуронидазы и идуронат-2-сульфатазы, обладающие активностью нативных форм соответствующих ферментов, которые известны из уровня техники в настоящее время или станут известны впоследствии.

Ферменты можно получать традиционными для данной области техники методами, например, посредством генетической рекомбинации в клетках животных, Е. coli, дрожжей, насекомых, растений и в живых животных и так далее, с использованием различных экспрессирующих векторов, хорошо известных специалисту в данной области. Способы получения не ограничиваются указанными и включают в себя также другие способы получения ферментов, известные специалисту в данной области. Неограничивающие примеры таких способов получения ферментов в клетках различных организмов, а также неограничивающие примеры экспрессирующих векторов см. в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2001. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, ферменты получают в клетках млекопитающих. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения, ферменты получают в клетках яичника китайского хомячка.

В отдельных предпочтительных воплощениях изобретения, ферменты могут быть коммерчески доступными ферментами. Кроме того, ферменты могут включать аминокислотную последовательность, которая обладает гомологией по меньшей мере 80%, более конкретно, 90% и еще более конкретно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% или выше с указанными выше ферментами или их аналогами, и ферменты могут быть получены из микроорганизмов при помощи рекомбинантной технологии или могут быть приобретены из коммерческих источников, без ограничения.

В настоящем описании термин гомология означает степень сходства с аминокислотной последовательностью белка дикого типа или нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислоты, и охватывает последовательности, которые имеют указанную выше степень сходства последовательностей, выраженную в процентах, с аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению. Гомологию можно определять путем сравнения двух заданных последовательностей невооруженным глазом или можно определять при помощи биоинформационного алгоритма, который позволяет анализировать гомологию путем выравнивания рассматриваемых последовательностей для сравнения. Гомология между двумя заданными аминокислотными последовательностями может быть указана в процентах. Существуют эффективные автоматизированные алгоритмы, которые можно применять в программных модулях GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA пакета программ Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI, США). Алгоритм выравнивания, автоматизированный в указанных модулях, включает алгоритмы выравнивания последовательностей Нидлмана и Вунша, Пирсона и Липмана, а также Смита и Ватермана. Другие алгоритмы, которые можно применять для выравнивания последовательностей и определения гомологии, автоматизированы в про- 10 044641 граммах FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST и CLUSTAL W. Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты и их аналоги, могут быть взяты в известной базе данных, такой как GenBank NCBI, не ограничиваясь ей.

В некоторых вариантах реализации изобретения транспортный элемент соединения содержит Fabфрагмент иммуноглобулина IgG1, состоящий из первой аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 2.

В конкретных вариантах реализации изобретения транспортный элемент соединения содержит Fabфрагмент иммуноглобулина IgG1, состоящий из первой аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% или более идентичную SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, представленное первой аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 2, и второй аминокислотной последовательностью, по меньшей мере идентичной SEQ ID NO: 4, применяемое для лечения или профилактики недостаточности лизосомального фермента у субъекта, имеющего мукополисахаридоз II типа.

В конкретных вариантах реализации изобретения соединение, представленное первой аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80% или более идентичную SEQ ID NO: 2, и второй аминокислотной последовательностью, по меньшей мере идентичной SEQ ID NO: 4, применяемое для лечения или профилактики недостаточности лизосомального фермента у субъекта, имеющего мукополисахаридоз II типа.

Термин аминокислота обозначает группу карбокси-а-аминокислот либо встречающихся в природе, т.е. которые непосредственно или в виде предшественника могут кодироваться нуклеиновой кислотой, либо не встречающихся в природе. Индивидуальные встречающиеся в природе аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, состоящими из трех нуклеотидов - так называемых кодонов или триплетов оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном.

Термин аминокислота в том виде, в котором он используется в пределах настоящего описания, обозначает встречающиеся в природе карбокси-а-аминокислоты, включающие следующие: аланин (трехбуквенный код: Ala, однобуквенный код: A), аргинин (Arg, R), аспарагин (Asn, N), аспарагиновая кислота (Asp, D), цистеин (Cys, C), глутамин (Gln, Q), глутаминовая кислота (Glu, E), глицин (Gly, G), гистидин (His, H), изолейцин (Ile, I), лейцин (Leu, L), лизин (Lys, K), метионин (Met, M), фенилаланин (Phe, F), пролин (Pro, P), серин (Ser, S), треонин (Thr, T), триптофан (Tip, W), тирозин (Tyr, Y) и валин (Val, V). Примеры аминокислот, не встречающихся в природе (непротеиногенных аминокислот), включают, Aad (альфа-аминоадипиновая кислота), Abu (аминомасляная кислота), Ach (альфааминоциклогексан-карбоновая кислота), Acp (альфа-аминоциклопентан-карбоновая кислота), Acpc (1аминоциклопропан-1-карбоновая кислота), Aib (альфа-аминоизомасляная кислота), Aic (2-аминоиндан-2карбоновая кислота; также именуемая 2-2-Aic), 1-1-Aic (1-аминоиндан-1-карбоновая кислота), (2аминоиндан-2-карбоновая кислота), аллилглицин (аллилGly), аллоизолейцин (allo-Ile), Asu (альфааминосубериновая кислота, 2-аминооктандиовая кислота), Bip (4-фенил-фенилаланин-карбоновая кислота), BnHP ((2S,4R)-4-гидроксипролин), Cha (бета-циклогексилаланин), Cit (цитруллин), циклогексилглицин (Chg), циклопентилаланин, бета-циклопропилаланин, Dab (1,4-диаминомасляная кислота), Dap (1,3диаминопропионовая кислота), п-(3,3-дифенилаланин-карбоновая кислота), 3,3-дифенилаланин, ди-нпропилглицин (Dpg), 2-фурилаланин, гомоциклогексилаланин (HoCha), гомоцитруллин (HoCit), гомоциклолейцин, гомолейцин (HoLeu), гомоаргинин (HoArg), гомосерин (HoSer), гидроксипролин, Lys(Ac), (1) Nal (1-нафтилаланин), (2) Nal (2-нафтилаланин), 4-MeO-Apc (1-амино-4-(4-метоксифенил)циклогексан-1-карбоновая кислота), нор-лейцин (Nle), Nva (норвалин), оматин, 3-Pal (альфа-амино-3пиридилаланин-карбоновая кислота), 4-Pal (альфа-амино-4-пиридилаланин-карбоновая кислота), 3,4,5,F3-Phe (3,4,5-трифтор-фенилаланин), 2,3,4,5,6,F5-Phe (2,3,4,5,6-пентафтор-фенилаланин), Pqa (4оксо-6-(1-пиперазинил)-3(4Н)-хиназолин-уксусная кислота (CAS 889958-08-1)), пиридилаланин, хинолилаланин, саркозин (Sar), тиазолилаланин, тиенилаланин, Tic (альфа-амино-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин3-карбоновая кислота), Tic(OH), Tle (трет-бутилглицин) и Tyr(Me), но не ограничиваются ими.

Термин аминокислотная последовательность относится к полипептидам, имеющим аминокислотные последовательности, которые в некоторой степени отличаются от полипептида с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. Обычно варианты аминокислотной последовательности будут обладать по меньшей мере примерно 70%-ной идентичностью последовательности с полипептидом с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. В одном воплощении вариант имеет примерно 80% или более идентичности последовательности с полипептидом с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. В одном воплощении вариант имеет примерно 90% или более идентичности последовательности с полипептидом с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. В одном воплощении вариант имеет примерно 95% или более идентичности последовательности с полипептидом с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. В одном воплощении вариант имеет

- 11 044641 примерно 98% или более идентичности последовательности с полипептидом с нативной последовательностью соответствующего терапевтического фермента. Варианты аминокислотной последовательности обладают заменами, делециями и/или вставками в определенных положениях в пределах аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности соответствующего терапевтического фермента. Аминокислоты обозначаются традиционными названиями, однобуквенными и трехбуквенными кодами.

Термин первая аминокислотная последовательность, используемый в данном изобретении, относится к аминокислотной последовательности иммуноглобулина IgG в общем, к легкой цепи иммуноглобулина IgG, в частности. В частных (неограничивающих) вариантах первая аминокислотная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность иммуноглобулина IgG1, аминокислотную последовательности легкой цепи иммуноглобулина IgG1, фрагмент аминокислотной последовательности легкой цепи иммуноглобулина IgG1, выбранную из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11. В конкретном воплощении первая аминокислотная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи иммуноглобулина IgG - SEQ ID NO: 2.

Термин вторая аминокислотная последовательность, используемый в данном изобретении, относится к аминокислотной последовательности иммуноглобулина IgG в общем; к тяжелой цепи иммуноглобулина IgG, к фрагменту тяжелой цепи иммуноглобулина IgG, к фрагменту тяжелой цепи иммуноглобулина IgG, соединенного с последовательностью фермента непосредственно или при помощи линкера, в частности. В частных (неограничивающих) вариантах вторая аминокислотная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность иммуноглобулина IgG1, аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи - SEQ ID NO: 3, представляет собой фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы, выбранный из SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14 или 15.

Термин транспортный элемент, используемый в данном изобретении, относится к веществу, которое способно переносить, транспортировать, доставлять терапевтический фермент к лизосомам клеток различных тканей. В частности, но, не ограничиваясь таковым, транспортный элемент будет специфически взаимодействовать с эпитопом, антигеном, рецептором или мишенью таким образом, чтобы обеспечивать эффективную доставку к лизосомам клеток нервной ткани. Таким эпитопом, антигеном, рецептором или мишенью в контексте настоящего описания может являться инсулиновый рецептор человека или его часть, через который осуществляется доставка лекарственного средства, пептида или белка в том числе через ГЭБ.

Иммуноглобулин является тетрамерной молекулой, в контексте настоящего описания понятие полноразмерное антитело. В иммуноглобулине природного происхождения каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну легкую (примерно 25 кД) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кД). N-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область длиной примерно от 100 до 110 или более аминокислот, главным образом, ответственных за узнавание антигена. Часть карбоксильного конца каждой цепи определяет константную область, главным образом, ответственную за эффекторную функцию.

В контексте настоящего описания понятие антитело применяют в его наиболее широком смысле и оно включает, в частности, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антитела при условии, что они обладают требуемой биологической активностью.

В контексте настоящего описания фрагменты антител содержат часть интактного антитела, которая сохраняет способность связываться с антигеном. Примерами фрагментов антител являются Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты; димерные антитела (диабоди); линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител, такие, например, как одноцепочечные Fab, scFv и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В результате расщепления антител папаином образуется два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых Fab-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточный Fc-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться.

Fab-фрагмент, Fab, FAB является моновалентным фрагментом, который содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи и также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен тяжелой цепи. В контексте настоящего описания транспортный элемент содержит аминокислотную последовательность Fab-фрагмента иммуноглобулина IgG, где иммуноглобулин IgG представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин IgG представляет собой IgG1. В конкретном воплощении транспортный элемент содержит аминокислотную последовательность Fab-фрагмента иммуноглобулина IgG1, состоящую из первой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11, и второй аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В более конкретном воплощении транспортный элемент содержит аминокислотную последовательность Fab-фрагмента иммуноглобулина IgG1, состоящую из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

В контексте настоящего описания термин линкер относится к химическому линкеру или одноце- 12 044641 почечному пептидному линкеру, который соединяет терапевтический фермент и транспортный элемент соединения, предлагаемого в настоящем изобретении. Линкер соединяет, например, одновалентный связывающий элемент содержит CH2-CH3-домен Ig и sFab, мишенью которого является рецептор инсулина,

т.е. линкер соединяет sFab с C-концом CH3-CH2-домена Ig.

В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер представляет собой химический линкер. Можно применять одноцепочечные пептидные линкеры, содержащие от одной до двадцати аминокислот, сцепленных пептидными связями. В конкретных вариантах осуществления изобретения аминокислоты выбирают из двадцати встречающихся в естественных условиях (протеиногенных) аминокислот. В других конкретных вариантах осуществления изобретения одну или несколько аминокислот выбирают из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления настоящего изобретения, одну или несколько аминокислот выбирают из глицина, серина и лейцина.

В конкретных вариантах осуществления изобретения указанный линкер представляет собой одноцепочечный пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 1 аминокислоты, предпочтительно, из 1-2 аминокислоты. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления настоящего изобретения, аминокислотная последовательность линкера может состоять более чем из 1-2 аминокислот, например, из 3 или 15 аминокислот.

Соединение терапевтического фермента и транспортного элемента можно осуществлять с непосредственно или с использованием разнообразных химических линкеров, известных в уровне техники. В отдельных предпочтительных (неограничивающих) вариантах осуществления изобретения, соединение терапевтического фермента и транспортного элемента может быть осуществлено с использованием разнообразных бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (SPDP), суkцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональных производных сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат-HCl), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидилсуберат), альдегидов (таких как глутаровый альдегид), бисазидосоединений (таких как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производных бисдиазония (таких как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активных соединений фтора (таких как 1,5- дифтор-2,4-динитробензол). Специалисту в данной области понятно также, что для целей настоящего изобретения могут быть использованы и другие известные из уровня техники химические и пептидные линкеры, не указанные явным образом в настоящем описании.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкер может представлять собой расщепляемый линкер, который облегчает высвобождение терапевтического фермента после транспортировки соединения в клетки и ткани. Например, можно применять неустойчивый в кислой среде линкер, чувствительный к действию пептидаз линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari R. и др., Cancer Res. 52, 1992, сс. 127-131; US 5208020, Chari Ravi J. et al., 04.05.1993). Специалисту в данной области понятно также, что для целей настоящего изобретения могут быть использованы и другие известные из уровня техники расщепляемые линкеры, облегчающие высвобождение терапевтического фермента после проникновения соединения в клетки и ткани центральной нервной системы.

Термин эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антигенсвязывающим белком, в том числе антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, представляют собой подгруппу структурных эпитопов и имеют те остатки, которые непосредственно способствуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, которые состоят из нелинейных аминокислот, другими словами, конформационные эпитопы состоят из непоследовательных аминокислот. Эпитопы могут включать детерминанты, которые являются химически активными поверхностными группировками молекул, такими как аминокислоты, боковые сахарные цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, а также они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. В контексте настоящего описания эпитоп представляет собой эпитоп в рецепторе инсулина, представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, описанный в работах Zhang B, Roth RA. (1991) Proc Natl Acad Sci U S A.; 88(21):9858-9862 и S A Prigent, K K Stanley, and K Siddle. (1990) J. Biol. 1991.

Рецептор инсулина (HIR) представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой примерно 320000 Да), который состоит из двух а субъединиц и двух β субъединиц, связанных дисульфидными мостиками (α субъединицы расположены внеклеточно и содержат инсулинсвязывающий домен) и участвует в регуляции всасывания и распределения глюкозы, а также синтезе и накоплении жиров, белков и углеводов в организме человека. Рецепторы инсулина и их внеклеточный инсулинсвязывающий домен (ECD) широко известны в данной области техники как структурно, так и функционально. Под локализацией рецепторов инсулина чаще всего понимают поверхности клеток инсулинчувствительных тканей, таких как клеток соединительных тканей, скелетных мышц, клеток жировой ткани, клеток печени и т.д. Смотри, например, Yip et al. (2003), J Biol. Chem. 278 (30): 27329-27332; и

- 13 044641

Whittaker et al. (2005), J Biol Chem, 280 (22): 20932-20936. В одном из воплощений HIR в данном документе является человеческим инсулиновым рецептором, содержащим аминокислотную последовательность, указанную в Kasuya et al. (Biochemistry 32 (1993) 13531-13536).

Рецептор инсулина экспрессируется практически повсеместно и использование подобного пути доставки может существенно увеличить биодоступность рекомбинантного фермента и увеличить эффективность терапии. Доставка в ткани мозга осуществляется за счет трансцитоза через капиллярный эндотелий ЦНС, посредством взаимодействия с рецептором инсулина человека.

В периферических тканях и тканях мозга (Hawkes C. et al., 2004), экспрессирующих M6PR, интернализация химерной молекулы может осуществляться обоими путями: взаимодействием антитело - HIR и фермент - M6PR. При этом адресная доставка в лизосомы происходит посредством взаимодействия с M6P рецепторами. Интернализация посредством HIR (человеческого инсулинового рецептора) приводит к попаданию в эндосомы раннего порядка и последующего трансцитоза. Помимо доставки работоспособного фермента в ЦНС, при многих болезнях лизосомного накопления есть потребность в улучшенной интернализации определенными периферическими тканями (мышцы диафрагмы в болезни Помпе, печень и селезенка в болезни Хантера, почки в болезни Фабри и т.д.).

Термин специфичный обозначают то, что молекула, имеющая отношение к термину, может образовывать комплекс со специфическим участком другой молекулы. Связывание может быть выявлено методами анализа in vitro, как, например, методом плазмонного резонанса (BIAcore, GE-Healthcare, Уппсала, Швеция). Специфичное взаимодействие молекулы с сайтом связывания другой молекулы (аффинность образования комплекса) определяется по показателям k_a (константа скорости для ассоциации соединений с образованием комплекса), k_D (константа диссоциации, диссоциации комплекса) и K_D(k_D/k_a). Связывание или специфичное связывание означает аффинность связывания (K_D) примерно 10^-7 М или менее, в одном воплощении - от примерно 10^-8 до примерно 10^-13 М, в одном воплощении - от примерно 10^-9 до примерно 10^-13 М.

Термин лизосома обозначает клеточный органоид, один из видов везикул, который содержит ряд ферментов (кислых гидролаз), способных расщеплять макромолекулы либо самой клетки (например, когда перерабатываются структурные компоненты клетки), либо захваченные извне. Унаследованные дефекты или недостатки лизосомальных ферментов (или других лизосомальных компонентов) могут привести к накоплению недеградированных метаболитов. Гликозаминогликаны (ранее называвшиеся мукополисахаридами) являются обычными полисахаридами поверхности клеток и внеклеточного матрикса и структур. Дефициты ферментов, препятствующие разрушению гликозаминогликана, вызывают накопление фрагментов гликозаминогликана в лизосомах и вызывают обширные изменения костей, мягких тканей и ЦНС.

Активность фермента (ферментов) по изобретению может быть измерена с применением любого подходящего теста. Обычно определение pH и определение температуры может быть адаптировано к рассматриваемому ферменту. Примеры тестируемых величин pH составляют pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. Примеры тестируемых температур составляют 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 или 95°C. Предпочтительные величины pH и температуры находятся в физиологическом диапазоне, таком как величины pH 4, 5, 6, 7 или 8 и температура 30, 35, 37 или 40°C. Например, протеазная активность может быть измерена с применением любого теста, в котором применяется субстрат, который включает пептидные связи, имеющие отношение к специфичности рассматриваемой протеазы.

Примеры подходящих тестов ферментов включены в экспериментальную часть, в частности, см. пример 2. Как используется в настоящем описании, под термином активность понимают ферментативная активность, специфическая активность, ферментативная специфическая активность; удельная активность в зависимости от контекста описания.

Термин гематоэнцефалический барьер или ГЭБ относится к физиологическому барьеру между периферическим кровотоком и головным мозгом и спинным мозгом, который формируется в результате плотных контактов в эндотелиальных плазматических мембранах капилляров головного мозга, создающих плотный барьер, который ограничивает транспорт молекул в головной мозг, даже очень малых молекул, таких как мочевина (60 Да). ГЭБ в головном мозге, барьер между кровью и спинным мозгом в спинном мозге и гематоретинальный барьер в сетчатке представляют собой непрерывные капиллярные барьеры в ЦНС и в настоящем описании они в целом обозначены как гематоэнцефалический барьер (далее также указывается как ГЭБ). ГЭБ включает также барьер между кровью и спинномозговой жидкостью.

Фармацевтическая композиция относится к смеси одного или более чем одного из соединений, описанных здесь, или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств, с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

Термин эффективное количество соединения, например, в фармацевтической композиции, относится к количеству, которое является эффективным в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата (эффекта) у субъекта,

- 14 044641 подвергаемого лечению, при разумном соблюдении польза/риск.

Термин фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества (соединения, агента и т.д.), который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант. В частных (неограничивающих) вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтически приемлемый носитель вводят совместно с соединением.

Фармацевтические композиции, которые содержат соединения, применяемые согласно настоящему изобретению, приготавливают с целью хранения путем смешения с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16е изд., под ред. Osol A., 1980), предпочтительно, в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для субъектов в применяемых дозах и концентрациях и они включают буферы, такие как фосфатный, цитратный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции, применяемые в настоящем описании, при необходимости могут содержать также более одного действующего вещества (лекарственного средства), активного в отношении лизосомной болезни накопления, необязательно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Тип и эффективные количества таких лекарственных средств зависят, например, от количества соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, присутствующего в композиции, и клинических параметров субъектов.

Введение доз заявляемого терапевтического соединения можно осуществлять любым пригодным для этого путем, хорошо известным специалисту в данной области, например, путем инъекций, таких как внутривенные, внутримышечные или подкожные инъекции. Выбор конкретного пути введения терапевтического соединения осуществляется специалистом в данной области и зависит, в частности, от того, является ли введение кратковременным или длительным. Специалисту в данной области понятно, что для введения доз заявляемого терапевтического соединения могут быть использованы и другие пути введения, известные из уровня техники, например (без ограничения), интратекальное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение, трансдермальное введение, ингаляционное введение, трансбуккальное введение, интраназальное введение, пероральное введение, сублингвальное введение или трансназальное введение (Felice B.R., Wright T.L., Boyd R.B. Safety Evaluation of Chronic Intrathecal Administration of Idursulfase-IT in Cynomolgus Monkeys. - Toxicol Pathol. 2011 Aug;39(5):879-9, WO 2011/044542 A1).

В контексте настоящего описания можно рассматривать различные схемы введения доз, включая, но не ограничиваясь только ими, одноразовые или многократные введения в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.

Субъект, индивидуум или пациент является млекопитающим. Млекопитающие включают, но, не ограничиваясь ими, домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, таких как обезьяны, в частности, высшие обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления субъект или пациент является человеком.

В контексте настоящего описания термин лечение (и его грамматические вариации, такие как лечить или процесс лечения) относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики или в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые соединения применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.

- 15 044641

Термин ЦНС или центральная нервная система относится к комплексу нервных тканей, которые контролируют функцию организма, и включают головной мозг и спинной мозг.

В настоящем описании термин лизосомная болезнь накопления (LSD, от англ. lysosomal storage disease; также может указываться как лизосомальная болезнь накопления) относится к редкому генетическому заболеванию, приводящему к потере лизосомных функций, описанных выше, вследствие частичной или полной утраты активности одного из лизосомных ферментов. В этом случае для восполнения фермента, активность которого полностью или частично утрачена, или недостающего фермента, необходима ФЗТ. В настоящем описании термин лизосомная болезнь накопления взаимозаменяемо используют с термином лизосомное расстройство накопления (также может указываться как лизосомальное расстройство накопления). Лизосомные болезни накопления можно классифицировать в зависимости от дефекта или дефицита фермента на: (i) сфинголипидоз, (ii) мукополисахаридоз, (iii) болезнь накопления гликогена, (iv) муколипидоз, (v) олигосахаридоз, (vi) липидоз, (vii) нарушение лизосомного транспорта и так далее.

Далее лизосомные болезни накопления будут описаны более подробно в соответствии с их классификацией.

В настоящем описании термин сфинголипидоз относится к генетически обусловленному синдрому недостаточности лизосомного фермента, гидролизующего боковые углеводные цепи или боковые холиновые цепи сфинголипидов. Заболевания классифицируют в зависимости от распределения каждого запасаемого липида, так, сюда входят болезнь Краббе, вызванная дефицитом галактоцереброзидазы, болезнь Фабри, вызванная дефицитом α-галактозидазы A, болезнь Ниманна-Пика, вызванная дефицитом сфингомиелиназы, болезнь Гоше, вызванная дефицитом глюкоцереброзидазы, болезнь Тау-Сакса, вызванная дефицитом гексозаминидазы A и так далее, и они являются заболеваниями, которые наследуются по аутосомно-рецессивному типу, за исключением болезни Фабри, которая представляет собой генетическое заболевание, сцепленное с X-хромосомой.

В настоящем описании термин мукополисахаридоз (MPS) относится к синдрому с генетической недостаточностью гидролазы мукополисахаридов, вызванному дефицитом фермента, разлагающего углеводные цепи, сульфатазы, ацетилтрансферазы и так далее. Основным симптомом мукополисахаридоза (MPS) является избыточная секреция мукополисахаридов с мочой. В настоящее время MPS классифицируют на 6 типов, среди которых заболевание I типа включает синдром Гурлер и синдром Шейе, II тип включает синдром Хантера, III тип включает синдром Санфилиппо типов A, B, C и D; IV тип включает синдром Моркио A и B; VI тип включает синдром Марото-Лами и VII тип включает синдром Слая.

В настоящем описании термин болезнь накопления гликогена (также известная под названием гликогеноз) относится к заболеванию с врожденным нарушением метаболизма углеводов, вызванному накоплением гликогена, и подразделяется на подтипы I-VII. Подтипами болезни накопления гликогена, ассоциированной с лизосомной болезнью накопления (LSD), являются типы II (болезнь Помпе) и III b (болезнь Данона).

Подробное описание лизосомных болезней накопления, приведенных в настоящем описании, а также раскрытых в табл. 1, приведено в: The Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases (Scriver's OMMBID), Part 16 (David L. Valle, Stylianos Antonarakis, Andrea Ballabio, Arthur L. Beaudet, Grant A. Mitchell, McGraw-Hill Education, 2007).

Мукополисахаридоз типа I (МПС I) представляет собой наследственное метаболическое заболевание, вызванное дефектом фермента a-L-идуронидазы (IDUA), функция которого заключается в том, чтобы расщеплять кислые мукополисахариды -гепарансульфат и дерматансульфат. Недостаточный уровень IDUA приводит к патологическому накоплению указанных мукополисахаридов в тканях и органах больного, например, в сердце, печени и центральной нервной системе. Симптомы, включая нейродегенерацию и задержку умственного развития, появляются в детстве и, из-за повреждения органов, может произойти ранняя смерть. Генетический дефицит расщепления углеводов, лизосомального фермента αL-идуронидазы вызывает лизосомную болезнь накопления, известную как мукополисахаридоз типа I (МПС I). МПС I (MPS I) в тяжелой форме широко известный как синдром Гурлер, и связанный с множеством проблем, такими как задержка умственного развития, помутнение роговицы, грубые черты лица, сердечные заболевания, заболевания дыхательных путей, увеличение печени и селезенки, грыж, и скованность суставов. Пациенты, страдающие от синдрома Гурлер, обычно умирают в возрасте до 10 лет. При средней форме, известной как синдром Гурлер-Шейе, как правило, психические функции сильно не затрагиваются, но и физические проблемы могут привести к смерти в подростковом возрасте или в возрасте от двадцати до двадцати девяти лет. Синдром Шейе представляет собой легкую форму МПС I. Он совместим с нормальной продолжительностью жизни, но скованность суставов, помутнение роговицы и болезни сердечных клапанов взывают серьезные проблемы.

Мукополисахаридоз типа II (МПС II) или синдром Хантера представляет собой X-сцепленное наследственное метаболическое расстройство, обусловленное недостаточностью фермента идуронат-2сульфатазы (I2S). I2S локализуется в лизосомах и играет важную роль в катаболизме гликозаминогликанов (ГАГ) гепаран- и дерматансульфата. В отсутствие фермента эти субстраты накапливаются в клетках,

- 16 044641 в конечном счете вызывая застой, а затем гибель клеток и разрушение тканей. В связи с распространенной экспрессией фермента у пациентов с MPS II поражаются различные типы клеток, органов и систем. Характерной клинической особенностью этого заболевания является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к когнитивным нарушениям (например, снижению IQ). Кроме того, МРТ-сканирование больных выявило повреждения белого вещества, расширение периваскулярных пространств в паренхиме головного мозга, ганглиях, мозолистом теле и стволе мозга, атрофию и вентрикуломегалию (Wang et al. Molecular Genetics and Metabolism, 2009). Болезнь обычно проявляется в первые годы жизни органомегалией и скелетными аномалиями. Некоторые больные испытывают прогрессирующую потерю когнитивных функций, причем большинство больных умирают от осложнений, связанных с заболеванием, в первом или втором десятилетии жизни (Raluy-Callado M. et al. Orphanet J Rare Dis. 2013; 8: 101;).

В контексте настоящего описания термин неврологическая составляющая относится к заболеванию или нарушению, которое поражает ЦНС и/или этиология которого связана с ЦНС. Примерами заболеваний или нарушений ЦНС являются (но, не ограничиваясь только ими) невропатия, амилоидоз, рак, глазное заболевание или нарушение, вирусная или микробная инфекция, воспаление, ишемия, нейродегенеративное заболевание, эпилептический припадок, нарушения поведения и лизосомная болезнь накопления. Конкретными примерами неврологических нарушений являются (но, не ограничиваясь только ими) нейродегенеративные заболевания (включая, но, не ограничиваясь только ими, болезнь (диффузных) телец Леви, постмиелитический синдром, синдром Шая-Дрейджера, оливопонтоцеребеллярную атрофию, болезнь Паркинсона, мультисистемную атрофию, стриатонигральную дегенерацию), тауопатии (включая, но, не ограничиваясь только ими, болезнь Альцгеймера и супрануклеарный паралич), прионные заболевания (включая, но, не ограничиваясь только ими, бычью спонгиформную энцефалопатию, скрепи, синдром Крейтцфельдта-Якоба, куру, болезнь Герстманна-Штросслера-Шейнкера, хроническую изнуряющую болезнь и фатальную семейную бессонницу), бульварный паралич, болезнь двигательных нейронов и гетеродегенеративные нарушения нервной системы (включая, но, не ограничиваясь только ими, болезнь Канавана, болезнь Гентингтона, нейронный цероидный липофусциноз, болезнь Александера, синдром Туретта, синдром курчавых волос Менкеса, синдром Коккейна, синдром ГаллерворденаШпатца, болезнь Лафоры, синдром Ретта, гепатолентикулярную дегенерацию, синдром Леша-Найхана и синдром Унферрихта-Лундборга), деменцию (включая, но не ограничиваясь только ими, болезнь Пика и спиноцеребеллярную атаксию), рак (например, рак ЦНС и/или головного мозга, включая метастазы в головной мозг, образующиеся от рака в какой-либо области организма).

Соединения, предлагаемые в изобретении, можно применять в терапии либо индивидуально, либо в комбинации с другими средствами. Например, предлагаемое соединение, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные линкером, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. В конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой терапевтическое средство, эффективное в отношении лечения того же самого неврологического нарушения, для которого применяют соединение, предлагаемое в изобретении, или другого неврологического нарушения. Примерами дополнительных терапевтических средств являются, без ограничения ими, различные описанные выше неврологические лекарственные средства, включая ингибиторы холинэстеразы (такие как донепезил, галантамин, ровастигмин и такрин), антагонисты NMDA-рецептора (такие как мемантин), ингибиторы агрегации пептида амилоида бета, антиоксиданты, модуляторы у-секретазы, имитаторы фактора роста нервной ткани (NGF) или агенты для генной терапии NGF, агонисты PPARy, ингибиторы HMS-CoA-редуктазы (статины), ампакины, блокаторы кальциевого канала, антагонисты ГАМК-рецептора, ингибиторы киназы гликогенсинтазы, иммуноглобулин, предназначенный для внутривенного введения, агонисты мускаринового рецептора, модуляторы никотинового рецептора, средства активной или пассивной иммунизации против пептида амилоид бета, ингибиторы фосфодиэстеразы, антагонисты рецептора серотонина и антитела к пептиду амилоиду бета. Такие указанные выше комбинированные терапии включают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или в различные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение соединения, содержащего терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенных линкером, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта.

Некоторые определенные выше термины могут встречаться более чем один раз, и в таком случае каждый термин должен определяться независимо от другого.

Далее подробно будут описаны приведенные в качестве примера осуществления настоящего изобретения. При этом каждое из объяснений и осуществлений, приведенных в качестве примера в данном документы, может быть справедливо и для других объяснений и приведенных в качестве примера осуществлений. Таким образом, все комбинации различных факторов, описанных в данном документе, входят в объем настоящего изобретения. Более того, объем настоящего изобретения не ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.

- 17 044641

Примеры осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой к следующим Примерам.

Однако описанные ниже Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены ограничивать это изобретение.

Пример 1. Получение.

Для получения соединений культивировали и очищали клетки животных, в которые был введен экспрессирующий вектор для клеток животных.

Конструирование экспрессирующих векторов.

Аминокислотные последовательности первая LC-HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 и 11) и вторая HC-HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14, 15)) для получения вариантов HIR-FAB-IDS, включая сигнальный пептид MDWTWRVFCLLAVAPGAHS, были конвертированы в нуклеотидные последовательности. Для синтеза гена с последующим клонированием в вектора pCLN-1 к 5'-концу последовательностей были добавлены: сайт рестрикции HindIII и последовательность Kozak. К 3'-концу последовательностей были добавлены 2 стоп-кодона и сайт рестрикции XbaI.

Оптимизацию нуклеотидной последовательности по кодонному составу для клеток китайского хомячка проводили с помощью ресурсов: http://gcua.schoedl.de и http://www.kazusa.or.jp. Синтез легкой и тяжелой цепи LC-HIR-FAB-IDS и HC-HIR-FAB-IDS был осуществлён в GenArt (США) и переданы в составе векторов pRA1675 и pRA1673 (содержащие гены LC-HIR-FAB-IDS и HC-HIR-FAB-IDS, соответственно).

Последовательности HC-HIR-FAB-IDS, LC-HIR-MAB из плазмид pRA1675 и pRA1673 клонировали в экспрессионный вектор pCLN-1 по сайтам HindIII/XbaI с получением векторов pGNR-055-007 (pCLN-1HC-HIR-FAB-IDS) и pGNR-055-008 (pCLN-1- LC-HIR-FAB-IDS). Полученные вектора линеаризовали по сайтам BspHI/PvuI.

Векторы по настоящему изобретению конструировали в соответствии с методами молекулярной биологии, хорошо известными в данной области техники. Смотрите Brown T, Gene Cloning (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., Recombinant DNA, 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Alberts B, et al., Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing Inc., New York, NY, US, 2008); Innis M, et al., Eds., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc., San Diego, CA, US, 1990); Erlich H, Ed., PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification (Stockton Press, New York, NY, US, 1989); Sambrook J, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989); Bishop T, et al., Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., Maximizing Gene Expression (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US, 1987); Davis L, et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, US, 1986), Schleef M, Ed., Plasmid for Therapy and Vaccination (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001).

Получение моноклоналъной клеточной линии.

Родительская клеточная линия CHO-S. Клетки культивировали при 37°C, 5% CO2, 70% влажности, в среде BalanCD CHO Growth A (Invitrogen). Стабильную трансфекцию проводили на приборе NEON (Invitrogen) по стандартному протоколу для клеток CHO с использованием двух линеаризованных плазмид pCLN-1-HC-HIR-FAB-IDS и pCLN-1- LC-HIR-FAB-IDS. Соотношение ДНК для проведения трансфекции использовали эквимолярное.

Через 48 ч был проведен рассев трансфицированных пулов на минипулы в 96-луночные планшеты в среду BalanCD CHO Growth A, содержащую 600 мкг/мл селективного антибиотика неомицина. Минипулы культивировали в стационарных условиях 10 дней при 37°C, 5% CO2, 70% влажности, после чего был проведен ряд скринингов по продуктивности с помощью ИФА. Лидерный минипул был клонирован в полутвердую среду ClonaCell Flex (STEMCELL) для роста отдельных колоний, используя 6-ти луночные планшеты. Планшеты инкубировали 10 дней при 37°C, 5% CO2, 70% влажности.

В ходе скрининга определялась концентрация целевого белка HIR-FAB-IDS, секретируемого в культуральную жидкость. Определение проводилось методом сэндвич ИФА, с использованием вместо первичных антител фрагмента рекомбинантного инсулинового рецептора человека (5 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,6), в качестве вторых антител использовались конъюгированные с пероксидазой хрена крысиные антитела к идуронат-2-сульфатазе (в разведении к 1:10000). Проявляли раствором тетраметилбензидина, реакцияю останавливали 0,5 М серной кислотой.

По результатам скрининга 6-ти лун. планшетов были выбраны 20 лидерных минипулов с продуктивностью от 0,4 до 2,1 мг/л, которые были перенесены в колбы для адаптации к суспензионному культивированию. Для адаптации к суспензионному культивированию, было проведено 3 пассажа, после чего 20 минипулов были заморожены.

Отбор клонов проводили в автоматическом режиме с помощью робота ClonePix (Molecular Devices) в 96-ти луночные планшеты. Полученные клоны подвергались скринингу. Для этого моделировался 7дневный процесс культивирования в режиме batch, в котором клоны оценивались по следующим параметрам динамики жизнеспособности культуры, динамики плотности жизнеспособных клеток, концентрация целевого HIR-FAB-IDS, зависимость волюметрической продукции от кумулятивной плотности

- 18 044641 клеток.

Культивирование клеток продуцента.

Культивирование клеток продуцента, экспрессирующего HIR-FAB-IDS, проводилось в периодическом режиме с подпиткой (фед-батч) с использованием питательной среды BalanCD CHO Growth A (Irvine Scientific) и нутриентной добавки BalanCD CHO Feed 2 (Irvine Scientific) в течение 12 суток в биореакторе с верхнеприводной мешалкой при температуре 37°C и pH 6,9. После процесса культивирования культуральная жидкость осветлялась путём глубинной фильтрации и передавалась на выделение.

Выделение и очистка.

Выделение и очистку проводят при помощи стандартных технологий выделения, очистки белков. Соединение можно выделить или очистить любым способом, известным в данном уровне техники, для выделения или очистки белка, например с помощью хроматографии (например, ионообменной, высокоэффективной жидкостной хроматографии, с помощью аффинности, с использованием белка A и сортирующей по размеру колоночной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной техники выделения или очистки белков.

Пример 2. Определение уровня ферментативной активности Fab-фрагмента антитела к инсулиновому рецептору, соединенного с аминокислотной последовательностью идуронат-2-сульфатазы.

Специфическую активность HIR-FAB-IDS и HIR-MAB-IDS определяют флуориметрическим методом используя 4-мутилумбеллиферил-Ь-идуронид-2-сульфат (4-MUS) (Moscerdam Substrates, Нидерланды) (Voznyi YV et al., 2001; Tolun AA, et al., 2012; 9. Johnson BA et al., 2013; Azadeh M et al., 2017). В процессе проведения анализа субстрат гидролизуется идуронат-2-сульфатазой с получением 4мутилумбеллиферил-Ь-идуронид (MUBI), которая гидролизуется идуронидазой (IDUA, Альдуразим, Джензайм, США) до 4-метилумбеллиферила (4-MU), который детектируют флуориметрически, используя следующие настройки флуориметра: возбуждение флуоресценции при длине волны 450 нм и детекции флуоресценции при длине волны 365 нм. Калибровочную кривую строят по стандартному раствору 4-MU (Sigma-Aldrich, США). В ходе анализа смесь сначала инкубируют при 37°C, значении водородного показателя pH=4,5 в течение 4 часов, затем добавляют IDS в количестве 12 мкг и дополнительно инкубируют смесь при 37°C в течение 24 ч. Инкубацию останавливают добавлением 0,2 мл 0,5 М карбоната натрия pH=10,3. HIR-FAB-IDS проявляет специфическую ферментативную (идуронат-2-сульфатазную) активность в отношении субстрата 4-MU-aIdoA-2S (4-метилумбелиферил а-Ь-идопиранозидуронат-2сульфат).

Приборы и оборудование.

1. Термостатируемый шейкер PST-60 HL-4 (BioSan, Латвия или аналогичный).

2. Многофункциональный ридер Spectra Max M3 (Molecular Devices, США или аналогичный).

3. Программное обеспечение для многофункционального ридера Soft Max Pro (Molecular Devices, США или аналогичное).

4. Весы аналитические ML 204 (Mettler Toledo, Швейцария или аналогичного качества).

5. 96-луночный черный планшет с несорбирующей поверхностью (Corning, США, кат. № 3916 или аналогичный).

Реактивы.

4-метилумбеллиферона натриевая соль (Sigma-Aldrich, кат. № M1508 или аналогичного качества).

2. Рекомбинантная a-L-идуронидаза человека (R&D SYSTEM, кат. № 4119-GH или аналогичного качества).

3. 4-метилумбеллиферил a-L-идопиранозидуроновой кислоты 2-сульфат натриевая соль, 0,5 мг/флакон (USBiological, кат. № 017551 или аналогичного качества).

4. Натрия ацетат безводный (AppliChem Panreac, кат. № 141633.1211 или аналогичного качества).

5. Кислота уксусная (Fluka, кат. № 49199 или аналогичного качества).

6. Бычий сывороточный альбумин (Sigma, кат. № A7030 или аналогичного качества).

7. Натрия карбонат (Sigma-Aldrich, кат. № S7795 или аналогичного качества).

8. Натрия бикарбонат (Sigma-Aldrich, кат. № S6297 или аналогичного качества).

9. Свинца диацетата тригидрат (Aldrich, кат.№ 467863 или аналогичного качества).

10. Натрия фосфат двузамещенный дигидрат (Sigma-Aldrich, кат. № 71643 или аналогичного качества).

11. Кислота лимонная безводная (AppliChem Panreac, кат. № 141808 или аналогичного качества).

Приготовление растворов.

Раствор для разведения образцов, pH (5,5 ± 0,2). Около 4,1 г натрия ацетата безводного и 0,5 г бычьего сывороточного альбумина помещают в химический стакан вместимостью 1 л, растворяют в 700 мл воды очищенной. Доводят pH раствора до значения (5,5 ± 0,2) кислотой уксусной. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок годности - 3 мес при температуре от 2 до 8°C.

Раствор для разведения субстрата, pH (5,00 ± 0,05). В химический стакан вместимостью 500 мл по- 19 044641 мещают 4,1 г натрия ацетата безводного, 1,9 г свинца диацетата тригидрата, прибавляют 450 мл воды очищенной, перемешивают до растворения. Доводят pH раствора до значения (5,00 ± 0,05) кислотой уксусной (около 1,1 мл). Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, объем раствора доводят водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок годности - 3 мес при температуре от 2 до 8°C.

Раствор субстрата (1,25 ммоль/л). 0,83 мл раствора для разведения субстрата вносят во флакон, содержащий субстрат (4-метилумбеллиферил a-L-идопиранозидуроновой кислоты 2-сульфат натриевая соль), аккуратно перемешивают. Полученный раствор делят на аликвоты по 0,2 мл и замораживают.

Срок годности - 3 мес при температуре не выше минус 70°C.

Раствор рекомбинантной a-L-идуронидазы человека. Во флакон, содержащий рекомбинантную aL-идуронидазу человека (10 мкг) прибавляют 400 мкл воды очищенной, перемешивают. Полученный раствор делят на аликвоты по 0,1 мл и замораживают.

Срок годности - 3 мес при температуре не выше минус 70°C.

0,1 М раствор кислоты лимонной. Около 19,2 г кислоты лимонной безводной помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 900 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм.

Срок годности - 3 мес при температуре от 15 до 25°C.

0,2 М раствор натрия фосфата двузамещенного. Около 35,6 г натрия фосфата двузамещенного дигидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 900 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм.

Срок годности - 3 мес при температуре от 15 до 25°C.

Фосфатно-цитратный буферный раствор, pH (4,5 ± 0,1). В мерной колбе вместимостью 100 мл смешивают 55,0 мл 0,1 М раствора кислоты лимонной и 45,0 мл 0,2 М раствора натрия фосфата двузамещенного и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Срок годности - 3 мес при температуре от 15 до 25°C.

0,5 М раствор натрия бикарбоната. Около 42,0 г натрия бикарбоната помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 900 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Срок годности - 6 мес при температуре от 15 до 25°C.

0,5 М раствор натрия карбоната. Около 53,0 г натрия карбоната помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 900 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Срок годности - 6 мес при температуре от 15 до 25°C.

Стоп-раствор, pH (10,8 ± 0,5). В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 900 мл 0,5 М раствора натрия карбоната и 100 мл 0,5 М раствора натрия бикарбоната, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Срок годности - 6 мес при температуре от 15 до 25°C.

Исходный раствор 4-метилумбеллиферона натриевой соли (100 мкмоль/мл). В мерную колбу объемом 50 мл помещают около 1,0 г (точная навеска) 4-метилумбеллиферона натриевой соли, прибавляют 30 мл воды очищенной, перемешивают, доводят водой очищенной до метки. Раствор делят на аликвоты по 2,0 мкл.

Срок годности - 6 мес при температуре не выше минус 18°C.

Рабочий стандартный раствор 4-метилумбеллиферона натриевой соли (50 нмоль/мл).

Аликвоту исходного раствора 4-метилумбеллиферона натриевой соли выдерживают в водяной бане в течение 5 мин при температуре 37°C. Готовят последовательные разведения по следующей . схеме:

№ раствора	Исходный р-р 4-MUa	Раствор №2	Стоп-раствор	Концентрация, нмоль/мл
1	100	-	9900	1000
2	-	500	9500	50

^а 4-MU - 4-метилумбеллиферона натриевой соли.

Разведения рабочего стандартного раствора 4-метилумбеллиферона натриевой соли. Готовят разведения рабочего стандартного раствора 4-метилумбелиферона натриевой соли по следующей схеме:

- 20 044641

№№ разведения	Объем рабочего стандартного раствора (50 нмоль/мл), мл	Объем стоп-раствора, мл	Концентрация, нмоль/мл
1	0	5,00	0,0
2	0,05	4,95	0,5
3	0,10	4,90	1,0
4	0,15	4,85	1,5
5	0,20	4,80	2,0
6	0,25	4,75	2,5
7	0,30	4,70	3,0
8	0,35	4,65	3,5
9	0,40	4,60	4,0

Разведения испытуемого образца. Испытуемый образец разбавляют раствором для разведения образцов до концентрации 1 мг/мл, исходя из фактического содержания HIR-FAB-IDS, указанного в сертификате. Затем готовят последовательные разведения по следующей схеме:________________

№ пробирок	Концентрация HIRFABIDS, нг/мл	Объем раствора, мкл
Раствор HIRFABIDS (1 мг/мл)	№ пробирки	Раствор для разведения образцов
1	2	3	4	5	6	7
1	100000	100	-	-	-	-	-	-	-	900
2	10000		100	-	-	-	-	-	-	900
3	1000			100	-	-	-	-	-	900
4	100				100	-	-	-	-	900
5	10					100	-	-	-	900
6	5						100	-	-	100
7	2,5							100	-	100

Все разведения хранят во льду до начала испытания.

В дальнейших исследованиях используют растворы из пробирок № 5-7.

Проведение анализа.

1-я ферментативная реакция.

В лунки планшета вносят по 10 мкл каждого разведения испытуемого образца (в 2-х повторностях), в качестве раствора сравнения используют раствор для разведения образцов. Прибавляют по 20 мкл раствора субстрата (4-метилумбеллиферил a-L-идопиранозидуроновой кислоты 2-сульфат натриевая соль). Закрывают планшет пленкой, инкубируют в термостатируемом шейкере в течение 4 часов при температуре (37,0 ± 0,2)°С и скорости перемешивания 250 об/мин. Планшет должен быть защищен от света в течение всего времени инкубации.

2-я ферментативная реакция.

По окончании инкубации вносят в лунки планшета по 20 мкл фосфатно-цитратного буферного раствора для остановки Пой ферментативной реакции. Затем в каждую лунку добавляют по 10 мкл раствора рекомбинатнной a-L-идуронидазы, аккуратно перемешивают. Закрывают планшет пленкой, инкубируют в термостатируемом шейкере в течение 22-26 часов при температуре 37°С и скорости перемешивания 250 об/мин. Планшет должен быть защищен от света в течение всего времени инкубации.

Для остановки реакции в каждую лунку с инкубируемой смесью вносят 200 мкл стоп-раствора.

В пустые лунки планшета вносят по 260 мкл разведений рабочего стандартного раствора 4метилумбеллиферона натриевой соли.

В лунках планшета измеряют сигнал флуоресценции при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны детекции 460 нм.

Оценка результатов.

На основании результатов измерений сигнала флуоресценции в лунках с разведениями рабочего стандартного раствора 4-метилумбеллиферона натриевой соли, строят график линейной зависимости между сигналом флуоресценции и концентрацией 4-метилумбеллиферона натриевой соли (нмоль/мл). Используя уравнение линейной функции, рассчитывают концентрацию 4-метилумбеллиферона, наработанного в ходе реакции в лунках с разведениями испытуемых образцов и раствором сравнения (нмоль/мл).

Специфическую активность А, в Ед/мкг, для каждого разведения испытуемых образцов рассчиты

-21 044641 вают по формуле:

А = 0,26 X (m — m₀) X 1000 240 X С X 0,01 где: m - концентрация 4-метилумбелиферона, наработанного в ходе реакции в лунках с данным разведением испытуемого образца (среднее значение по 2-м повторностям), нмоль/мл;

mo - концентрация 4-метилумбелиферона, наработанного в ходе реакции в лунках с раствором сравнения (среднее значение по 2-м повторностям), нмоль/мл;

0,26 - финальный объем разведений рабочего стандартного раствора и испытуемого образца, внесенных в лунки планшета для измерения сигнала флуоресценции, мл;

240 - время 1 -й ферментативной реакции, мин;

C - содержание HIR-Fab-IDS в каждом из приготовленных разведений испытуемого образца, нг/мл; 0,01 - объем разведений испытуемого образца, внесенного в 1-ю ферментативную реакцию, мл; 1000 - коэффициент пересчета нг в мкг.

Итоговое значение специфической активности для испытуемого образца вычисляют как среднее значение специфической активности, вычисленной по каждому разведению.

Полученные результаты определения ферментативной активности вариантов HIR-FAB-IDS и HIRMAB-IDS в сравнении с препаратом Элапраза представлены в табл. 2.

Таблица 2

Оценка идуронат-2-сульфатазной активности вариантов HIR-FAB-IDS и HIR-MAB-IDS против немодифицированного фермента идуронат-2-сульфатазы (Элапраза)

Наименование образцов	Активность, ЕД (нмоль/мин)/мкг
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4)	27,0
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5)	20,0
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO: 12)	25,2
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO: 13)	30,2
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14)	27,5
HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 15)	23,4
HIR-MAB-IDS	11,0
HIR-MAB-IDS (AGT-182)	0,85 (51,7+-7
(значение взято из патента на AGT-182 US8834874 В2, Fig.12 пример 4, стр. 35)	нмоль/час/мкг) US8834874B2
Элапраза (Шайер Хьюман Генетик Терапиз Инк., США)	14,6

Как видно из результатов, представленных в табл. 2, препарат HIR-FAB-IDS проявляет специфическую ферментативную (идуронат-2-сульфатазную) активность в отношении субстрата 4-MU-aIdoA-2S (4-метилумбелиферил α-L-идопиранозидуронат-2-сульфат) 27,0 Ед/мкг. При этом свободный рекомбинантный фермент идуронат-2-сульфатазы проявляет активность 14,6 Ед/мкг. Полноразмерное антитело к инсулиновому рецептору, соединенного с аминокислотной последовательностью идуронат-2-сульфатазы (HIR-MAB-IDS), проявляет меньшую специфическую активность (11,0 Ед/мкг), в сравнении с HIR-FABIDS.

В результате проведенных исследований было показано, что идуронат-2-сульфатаза в составе HIRFAB-IDS сохраняет основные функциональные (ферментативные) свойства на уровне свободного рекомбинантного фермента. При этом удельная активность HIR-FAB-IDS выше, чем для препарата Элапраза и HIR-MAB-IDS (AGT-182).

Таким образом, обнаружено увеличение ферментативной активности соединения, содержащее транспортный элемент, представляющий собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичный к эпитопу в рецепторе инсулина, соединенный непосредственно или при помощи линкера с терапевтическим ферментом, в сравнении с терапевтическим ферментом без транспортного элемента, и с терапевтическим ферментом с транспортным элементом, представленным MAB.

Пример 3. Анализ взаимодействия модифицированных Fab-фрагментов антител к инсулиновому рецептору с инсулиновым рецептором человека и мыши.

Для выполнения количественной оценки взаимодействия с инсулиновым рецептором полноразмерных рекомбинантных моноклональных антител, вариантов Fab-фрагментов, а также их модификаций с IDS, используют метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в формате сэндвич (Kim C, Seo J, Chung Y et al., 2017). Метод основан на связывании белков HIR-MAB (83-14 Mab), HIR-MAB-IDS и HIR-FAB-IDS с фрагментом белка инсулинового рецептора человека (Human Insulin Receptor protein fragment (Abcam cat#ab200510)) или инсулиновым рецептором мыши (mInsR, R&D Systems, Inc., кат. № 7544-MR).

Процесс детекции осуществляется после инкубации комплекса инсулинового рецептора человека и исследуемого белка с вторичными антителами - конъюгированные с пероксидазой хрена Fabспецифичные антитела козы к иммуноглобулину человека (Anti-Human IgG (Fab specific)- Peroxidase

- 22 044641 (Sigma-Aldrich, cat#A0293)).

В качестве положительного контроля использовали ранее описанные мышиные антитела к инсулиновому рецептору человека (INSR/Insulin Receptor alpha Antibody 83-14 AHR0221 Life technologies, cat#AHR0221) и к инсулиновому рецептору мыши (Mouse Anti-Human Insulin Receptor Clone 83-14 mAb Cell sciences, cat# МАП). Детекцию осуществляют с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена поликлональных антител козы к иммуноглобулину мыши (Goat pAb to Ms IgG (HRP) Abeam, cat# ab97023).

Полученные результаты определения взаимодействия тестируемых молекул с инсулиновым рецептором человека и мыши представлены в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Связывание модифицированных Fab-фрагментов антител к инсулиновому рецептору с инсулиновым рецептором человека (Abeam cat#ab200510)

№	Наименование образца	EC50, нг/мл	Связывание с рецептором от антитела 83-14 mAb , %
1	INSR/Insulin Receptor alpha Antibody 83-14 (Life technologies, cat#AHR0221)	32,15	102
2	Mouse Anti-Human Insulin Receptor Clone 83-14 mAb (Cell sciences, cat#MAIl)	33,10	100
3	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4)	24,31	136
4	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5)	50,25	66
5	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO: 12)	120,55	27
6	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO: 13)	60,35	55
7	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14)	35,10	94
8	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 15)	155,67	21
9	HIR-MAB-IDS	26,19	126

Таблица 4

Связывание модифицированных Fab-фрагментов антител к инсулиновому рецептору с инсулиновым рецептором мыши (R&D Systems, Inc., кат. № 7544-MR)

№	Наименование образца	EC50, нг/мл	Связывание с рецептором, %
1	INSR/Insulin Receptor alpha	>800	0
	Antibody 83-14
2	Mouse Anti-Human Insulin Receptor Clone 83-14 mAb	>800	0
3	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4)	>800	0
4	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5)	>800	0
5	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO: 12)	>800	0
6	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO: 13)	>800	0
7	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14)	>800	0
8	HIR-FAB-IDS (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 15)	>800	0
9	HIR-MAB-IDS	>800	0

Таким образом, продемонстрировано, что HIR-FAB-IDS специфично взаимодействует с внеклеточным доменом альфа субъединицы инсулинового рецептора человека, но при этом не взаимодействует с внеклеточным доменом инсулинового рецептора мыши. Связывание Fab-фрагментов антител к инсулиновому рецептору с инсулиновым рецептором человека сопоставимо с контрольным антителом (83-14 mAb) и превышает связывание с аналогичным полноразмерным антителом к инсулиновому рецептору (HIR-MAB-IDS).

Взаимодействие HIR-FAB-IDS с инсулиновым рецептором человека принципиально для обеспечения активного трансцитоза молекулы к лизосомам клеток, в общем, через ГЭБ, в частности.

Пример 4. Анализ распределения в тканях радиоактивно меченых Fab-фрагментов антитела к инсу-23 044641 линовому рецептору, соединенного с аминокислотной последовательностью идуронат-2-сульфатазы

[¹²⁵I]-HIR-Fab-IDS (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4), [¹²⁵I]-HIR-Mab-IDS, [¹²⁵I]-IDS (контроля) после внутривенного введения у яванского макака.

Подопытным животным в левую бедренную вену однократно вводили соответствующую молекулу испытуемого вещества в целевой дозе 2 мл/кг массы тела путем внутривенной болюсной инъекции в течение 1-2 мин. Целевой уровень радиоактивной дозы составлял 1 МБк/кг массы тела животного для всех исследуемых молекул.

Животное, получившее испытуемое вещество, подвергали седации путем внутримышечной инъекции кетамина гидрохлорида перед внутривенным введением избыточной дозы Долетила (пентаборбитона натрия). Животных гуманно эвтаназировали через 2 часа после введения испытуемого вещества. Во время седации у каждого животного из цефалической вены отбирали 2 мл крови, которую центрифугировали для получения плазмы. Концентрация радиоактивности измерялась в плазме крови животных. После подтверждения наступления смерти каждое животное быстро замораживали в смеси твердого диоксида углерода в гексане. После полного замораживания тела помещали в форму, содержащую 2% (вес/объем) водной карбоксиметилцеллюлозной пасты. Выполняли несколько продольных сагиттальных срезов (номинально 30 мкм) не меньше, чем на 5 уровнях тела и, при необходимости, 3 уровнях головы для каждой особи.

Срезы, закрепленные на ленту Filmolux 610 (Neschan), лиофилизировали в настольной сублимационной сушилке GVD03 (Girovac Ltd) и накладывали на рентгенографические пластины FUJI (тип BASMS, Raytek Scientific Ltd). Стандарты крови, меченные изотопом [¹²⁵I] с соответствующей активностью, также подготовленные в виде срезов с номинальной толщиной 30 мкм, накладывали на рентгенографические пластины.

После проявления в свинцовом ящике с медным покрытием в течение 7 дней рентгенографические пластины обрабатывали с помощью радиографической системы FUJI FLA-5000 (Raytek Scientific Ltd). Электронные изображения были проанализированы с использованием системы анализа изображений на базе ПК (программное обеспечение Seescan 2, LabLogic Ltd). Стандарты [¹²⁵I], включенные в каждую авторадиограмму, использовались для построения калибровочных кривых в диапазоне концентраций радиоактивности.

Концентрацию радиоактивности в плазме определяли методом гаммаметрии.

Данные концентрации в тканях регистрировались в виде нг эквивалентов [¹²⁵I] HIR-Fab-IDS [¹²⁵I] HIR-Mab-IDS и [¹²⁵I]-IDS (контроль).

Результаты были выражены тремя значимыми числами с не более чем двумя знаками после запятой. Таблицы данных были созданы компьютером, и отдельные данные были надлежащим образом округлены.

[¹²⁵I] HIR-Fab-IDS, [¹²⁵I] HIR-Mab-IDS и [¹²⁵I]-IDS (контроль) вводили самцам яванского макака однократно внутривенно с номинальным уровнем дозы 0,0020 мг/кг, 0,0015 мг/кг и 0,0010 мг/кг массы тела. Эвтаназия животного выполнялась через 2 ч после введения каждого препарата, после чего животные были заморожены для исследований методом авторадиографии всего тела.

После внутривенного введения препараты абсорбировались и широко распределялись по тканям организма, и на момент забоя все исследуемые ткани подверглись его воздействию. Нижний предел количественной оценки составлял 0,2, 0,03 и 0,097 нг эквивалента препарата/г для всех измерений концентрации в тканях животного, соответственно.

Концентрации радиоактивности в плазме и крови животного, получавшего [¹²⁵1] HIR-Fab-IDS, составили 2,55 и 3,11 нг экв/г, соответственно (соотношение кровь: плазма 1,22). Количественно определяемые уровни радиоактивности присутствовали в некоторых областях мозга, включая продолговатый мозг (1,09 нг экв/г), кору головного мозга (1,03 нг экв/г), мозжечок (0,908 нг экв/г), гипоталамус (0,869 нг экв/г), древовидное вещество мозжечка (0,799 нг экв/г), мост (0,793 нг экв/г) и мозговое вещество (0,562 нг экв/г); соотношение ТП составляло от 0,22 до 0,43.

Концентрации радиоактивности в плазме и крови животного, получавшего [¹²⁵I] HIR-Mab-IDS, составляли 2,13 и 1,86 нг экв/г, соответственно (соотношение кровь: плазма 0,87). Количественно определяемые уровни радиоактивности присутствовали в ряде областей мозга животного. Эти области включали продолговатый мозг (0,803 нг экв/г), древовидное вещество мозжечка (0,606 нг экв/г), мозжечок (0,494 нг экв/г), кору головного мозга (0,453 нг экв/г), мост (0,438 нг экв/г)), мозговое вещество (0,288 нг экв/г) и гипоталамус (0,279 нг экв/г), соотношения концентрации TP составляли от 0,13 до 0,38

Концентрации в плазме и крови животного, получавшего [¹²⁵I] IDS, составляли 0,910 и 0,753 нг экв/г, соответственно (соотношение кровь: плазма 0,83). Количественно определяемые уровни радиоактивности присутствовали во всем мозге (0,113 нг экв/г), но концентрации были ниже предела количественной оценки (0,097 нг экв/г) во всех исследованных областях: продолговатом мозге, коре головного мозга, мозжечке, гипоталамуса, древовидном веществе мозжечка, мосту и мозговом веществе. Концентрации в тканях ЦНС были значительно ниже, чем в плазме и крови.

Эти результаты свидетельствуют о том, что вещества, связанные с HIR-Fab-IDS, a также с HIRMab-IDS, по сравнению с веществом, связанным с IDS, проникали через гематоэнцефалический барьер,

- 24 044641 ткани ЦНС подвергались воздействию исследуемого вещества или его меченых метаболитов, и радиоактивность, передаваемая через кровь, незначительно влияла на определение концентрации в тканях ЦНС (фиг. 1 и 2). При этом HIR-Fab-IDS демонстрировал более широкое распределение в ткани организма по сравнению с молекулой HIR-Mab-IDS (табл. 5, фиг. 3).

Необходимо отметить, что в примере 10 изобретения US8834874 B2 (AGT-182 или HIR-MAB-IDS) эффективность проникновения в головной мозг человека оценивают на уровне 1 % от введенной дозы на 1000 грамм мозговой ткани на основании экспериментальных данных проникновения AGT-182 (HIRMAB-IDS) в мозг на макаках-резусах. При этом утверждается, что при таком уровне проникновения, ожидается достижение 20% от идуронат-2-сульфатазной (IDS) активности в мозге человека, что позволит элиминировать накопление гликозаминогликанов в мозге больного человека.

С учетом полученных данных по проникновению в мозг яванских макак (таблица 5), можно сделать вывод о том, что настоящее соединение проникает почти в 2 раза лучше в мозг яванской макаки, чем AGT-182 (HIR-MAB-IDS), так - 0,84 нг экв/г HIR-FAB-IDS против 0,43 нг экв/г для HIR-MAB-IDS. Это соответственно означает, что HIR-FAB-IDS проникает с 2% эффективностью в мозг человека. С учетом расчетов, указанных в примере 10 изобретения US 8834874 B2, ожидается достижение 40% от идуронат2-сульфатазной активности в мозге человека, без учета увеличенной активности HIR-FAB-IDS в сравнении с HIR-MAB-IDS (AGT- 182), см. табл. 2.

Если учесть факт увеличения удельной активности HIR-FAB-IDS над HIR-MAB-IDS (AGT- 182), показанный в примере 2, табл. 2-27 Ед/мкг для настоящего соединения и 11 Ед/мкг для противопоставляемого, а также большее проникновение в мозг: 27/11=в 2,4 удельная идуронат-2-сульфатазная активность выше, 0,84/0,43= в 1,95 раза большее проникновение в мозг, то получается 20% восстановление IDS активности в мозге больного при терапии HIR-MAB-IDS (AGT- 182) и 20%*2,4*1,95=93,6% восстановление идуронат-2-сульфатазной активности в мозге больного МПС II типа от уровня активности IDS в мозге здорового человека. Таким образом, настоящее изобретение позволит практически полностью восстановить ферментативную функцию IDS в мозге больного человека, в то время как противопоставляемое AGT-182 (HIR-MAB-IDS) только на 20% (93% vs 20%).

Таким образом, обнаружено, что введение соединения, содержащее транспортный элемент, представляющий собой Fab-фрагмент иммуноглобулина IgG, специфичный к эпитопу в рецепторе инсулина, соединенный непосредственно или при помощи линкера с терапевтическим ферментом, обеспечивает более высокую степень замещения активности терапевтического фермента в мозге человека в сравнении с соединениями, содержащими Mab.

- 25 044641

Таблица 5

Концентрации радиоактивности в тканях яванского макака после однократного внутривенного введения [¹²⁵I]- HIR- Fab-IDS с номинальным уровнем дозы 0,0020 мг/кг массы тела

Ткань	Концентрации радиоактивности в тканях
	[125I] HIR-Fab-IDS (SEQ ID NO:2 и SEQ ГО NO:4)	[125I] HIR-Mab-IDS (AGT-182)	[125I]-IDS
Плазма	2,55	2,13	0,91
Кровь	3,11	1,86	0,75
Кора надпочечника	18,3	5,29	4,47
Мозговое вещество надпочечника	11,5	2,17	3,26
Стенка аорты	3,29	1,96	BLQ
Костный мозг	6,37	3,26	4,39
Периост	3,32	BLQ	0,95
Бурый жир	2,51	0,97	0,54
Бульбоуретральная железа	0,98	BLQ	0,60
Слизистая оболочка слепой кишки	1,72	0,19	0,25
Придаток яичка	3,09	0,31	0,53
Кора почки	10,1	4,25	4,33
Мозговое вещество почки	6,37	2,39	1,70
Слизистая оболочка толстой кишки	1,42	0,41	0,24
Печень	21,4	7,63	18,0
Легкое	4,15	1,10	2,35
Мышцы	0,51	0,09	0,28
Миокард	3,78	0,91	1,25
Слизистая оболочка носа	1,18	0,61	0,72
Стенка пищевода	1,53	0,51	0,48
Поджелудочная железа	2,68	0,70	0,69
Слизистая оболочка прямой кишки	1,15	0,39	0,27
Слюнные железы	1,01	0,23	0,82
Семенные железы	2,08	BLQ	BLQ
Кожа	1,20	0,20	0,39
Слизистая оболочка тонкой кишки	3,14	0,62	1,62
Спинной мозг	0,57	0,41	0,17
Селезенка	17,9	10,4	11,6
Яички	1,34	0,18	0,41
Язык	0,92	0,30	0,64
Трахея	0,65	0,32	0,45
Стенка мочевого пузыря	7,30	3,49	4,18
Мозг (весь)	0,84	0,43	0,11
Кора мозга	1,03	0,45	BLQ
Мозговое вещество	0,56	0,29	BLQ
Мозжечок	0,91	0,49	BLQ
Г ипоталамус	0,87	0,28	BLQ
Продолговатый мозг	1,09	0,80	BLQ
Мост	0,79	0,44	BLQ
Древовидное вещество мозжечка	0,80	0,61	BLQ
Эпифиз	1,03	0,39	BLQ
Г ипофиз	0,80	0,60	BLQ

NA - не применимо;

BLQ - концентрация ниже нижнего предела количественного определения.

В настоящем описании представлены соединения, содержащие терапевтические ферменты, проявляющие свою специфическую ферментативную активность в указанных соединениях, и транспортные элементы, способные взаимодействовать с инсулиновым рецептором, при этом обладают способностью транспортировать терапевтические ферменты к лизосомам тканей, в том числе через ГЭБ к лизосомам нервной ткани. Таким образом, соединения проявляют высокую активность и улучшенную способность

- 26 044641 транспортироваться к лизосомам клеток тканей различных органов, в том числе к лизосомам клеток нервной ткани, что предполагает использование настоящего изобретения для ферментативной заместительной терапии для лечения или профилактики у субъекта с лизосомной болезнью накопления.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ МБЦ ГЕНЕРИУМ <120> СОЕДИНЕНИЕ, СОДЕРЖАЩЕЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ И ТРАНСПОРТНЫЙ ЭЛЕМЕНТ, СОЕДИНЕННЫЕ ДРУГ С ДРУГОМ НЕПОСРЕДСТВЕННО ИЛИ ПРИ ПОМОЩИ ЛИНКЕРА <130> GNR-055 <160> 7 <170> PatentIn версия 2.0 <210> 1 <211> 124 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Эпитоп в рецепторе инсулина, распознаваемый иммуноглобулином IgG <400> 1

Met Glu Glu 1

Ala Leu Lys

Lys Phe Ser 35

Glu Pro Tyr

Phe Tyr Lys 65

Asp Ala Cys

Leu Arg Ser

Arg Gly Leu

115

Val Ser 5

Thr Asn

Tyr Ile

Trp Pro

Glu Ala

Gly Ser 85

Asn Asp

100

Lys Pro

Gly Thr Lys Gly Arg Gln Glu Arg Asn Asp Ile 1015

Gly Asp Gln Ala Ser Cys Glu Asn Glu Leu Leu 2530

Arg Thr Ser Phe Asp Lys Ile Leu Leu Arg Trp 4045

Pro Asp Phe Arg Asp Leu Leu Gly Phe Met Leu 5560

Pro Tyr Gln Asn Val Thr Glu Phe Asp Gly Gln 70 7580

Asn Ser Trp Thr Val Val Asp Ile Asp Pro Pro 9095

Pro Lys Ser Gln Asn His Pro Gly Trp Leu Met 105110

Trp Thr Gln Tyr Ala Ile Phe

120 <210> 2 <211> 214 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Легкая цепь иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина <400> 2

Asp Ile 1

Glu Arg

Leu Tyr

Tyr Ala

Ser Arg 65

Glu Asp

Thr Phe

Pro Ser

Gln Met

Val Ser

Trp Leu 35

Thr Ser

Ser Gly

Phe Val

Gly Gly

100

Val Phe

Thr Gln 5

Leu Thr

Gln Gln

Ser Leu

Ser Asp

Asp Tyr 85

Gly Thr

Ile Phe

Ser Pro

Cys Arg

Gly Pro

Asp Ser 55

Tyr Ser

Tyr Cys

Lys Met

Pro Pro

Ser Ser

Ala Ser 25

Asp Gly

Gly Val

Leu Thr

Leu Gln

Glu Ile

105

Ser Asp

Leu Ser

Gln Asp

Thr Ile

Pro Lys

Ile Ser 75

Tyr Ser

Lys Arg

Glu Gln

Ala Ser

Ile Gly

Lys Arg 45

Arg Phe

Ser Leu

Ser Ser

Thr Val

110

Leu Lys

Leu Gly 15

Gly Asn

Leu Ile

Ser Gly

Glu Ser

Pro Trp 95

Ala Ala

Ser Gly

- 27 044641

115 120125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn SerGln

145 150 155160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser LeuSer

165 170175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 3 <211> 221 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина <400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 15

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 2025

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro 3540

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser 5055

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp 6570

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 85

Ala Arg Glu Trp Ala Tyr Trp Gly Gln 100105

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115120

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130135

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145150

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180185

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195200

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210215

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 30

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 45

Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80

Lys Ser Ala Val Tyr Phe Cys 90 95

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 125

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

140

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

155 160

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

170 175

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 190

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 205

Lys Thr His Leu

220 <210> 4 <211> 748 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы <400> 4

- 28 044641

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 15

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 20

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Arg 3540

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly 5055

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 6570

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser 85

Ala Arg Glu Trp Ala Tyr Trp Gly 100

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115120

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130135

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145150

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195200

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210215

Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr

225230

Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser 245

Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln 260

Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala

275280

Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp 290295

Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly 305310

Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr 325

Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr 340

Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser 355360

Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu 370375

Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly 385390

Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu 405

Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His 420

Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr 435440

Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly 450455

Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu 465470

Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val 485

Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr 500

Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln 515520

Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala 530535

Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala 545550

Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1015

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 2530

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 45

Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 7580

Glu Lys Ser Ala Val Tyr Phe Cys 9095

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

105110

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

125

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 140

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 155160

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 170175

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

185190

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 205

Asp Lys Thr His Leu Ser Ser Ser 220

Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile 235240

Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu 250255

Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe

265270

Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser 285

Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn 300

Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr 315320

Met Ser Val Gly Lys Val Phe His 330335

Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser

345350

Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr 365

His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val 380

Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr 395400

Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro 410415

Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr 425430

Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala 445

Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro 460

Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser 475480

Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln 490495

Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu

505510

Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala

525

Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala 540

Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr

555 560

- 29 044641

Val Pro

Pro Tyr

Arg Gln

Ala Gly

610 Phe His 625 Arg Phe

Glu Leu

Trp Asn

Ser Ile

690 Pro Asp 705 Tyr Phe

Ser Gln

Gly Arg

Leu Asp

580 Ser Met 595

Leu Ala

Val Glu

Arg Asp

Ile Ala

660 Ser Asp 675

Arg Thr

Glu Phe

Val Asp

Gly Gly 740

Thr Ala Ser 565

Pro Phe Asp

Asp Leu Val

Gly Leu Gln 615

Leu Cys Arg 630

Leu Glu Glu 645

Tyr Ser Gln

Lys Pro Ser

Ile Asp Tyr 695

Leu Ala Asn 710

Ser Asp Pro 725

Asp Leu Phe

Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe 570575

Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly 585590

Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu

600605

Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser 620

Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe 635640

Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg 650655

Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln 665670

Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr 680685

Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn 700

Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu 715720

Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp 730735

Gln Leu Leu Met Pro

745 <210> 5 <211> 760 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы средством глицин-серинового линкера по<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu 1 510

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 2025

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 3540

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr 5055

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 6570

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Lys 8590

Ala Arg Glu Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100105

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115120

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130135

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145150

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165170

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180185

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195200

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210215

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225230

Leu Val Lys

Tyr Thr Phe

Gln Gly Leu 45

Lys Tyr Asn 60

Ser Ser Ser 75

Ser Ala Val

Thr Leu Val

Pro Leu Ala 125

Gly Cys Leu 140

Asn Ser Gly 155

Gln Ser Ser

Ser Ser Leu

Ser Asn Thr

205

Thr His Gly 220

Ser Ser Glu

235

Pro Gly Ala 15

Thr Asn Tyr 30

Glu Trp Ile

Glu Lys Phe

Thr Ala Tyr 80

Tyr Phe Cys 95

Thr Val Ser 110

Pro Ser Ser

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

160

Gly Leu Tyr 175

Gly Thr Gln 190

Lys Val Asp

Gly Gly Gly

Thr Gln Ala

240

- 30 044641

Asn Ser

Leu Arg

Asn Ile

Ala Gln 290 Arg Arg 305

Val His

Gly Tyr

Ser Asn

His Pro 370 Asp Gly 385

Val Pro

Gln Leu

Val Gly

Gln Lys 450

Val Pro 465

Arg Gln

Pro Ile

Ser Val

Asp Asp 530

His Gly 545

Phe Asp

Thr Ala

Pro Phe

Asp Leu 610

Gly Leu 625

Leu Cys

Leu Glu

Tyr Ser

Lys Pro 690

Ile Asp 705

Leu Ala

Ser Asp

Asp Leu

Thr

Pro

Asp 275 Gln

Pro

Ala

Val

His 355 Ser

Glu

Glu

Leu

Tyr 435 Leu

Asp

Arg

Pro

Ser 515 Leu

Trp

Val

Ser

Asp 595 Val

Gln

Arg

Glu

Gln 675 Ser

Tyr

Asn

Pro

Phe 755

Thr

Ser 260 Gln

Ala

Asp

Gly

Thr 340 Thr

Ser

Leu

Gly

Glu 420 His

Tyr

Gly

Glu

Val 500 Tyr

Gln

Ala

Ala

Leu 580 Ser

Glu

Val

Glu

Asp 660 Tyr

Leu

Arg

Phe

Leu 740 Gln

Asp 245 Leu

Leu

Val

Thr

Asn 325 Met

Asp

Glu

His

Thr 405 Lys

Lys

Pro

Leu

Asp 485 Asp

Leu

Leu

Leu

Thr 565 Pro

Ala

Leu

Pro

Gly 645 Pro

Pro

Lys

Tyr

Ser 725 Gln

Leu

Ala

Gly

Ala

Cys

Thr 310 Phe

Ser

Asp

Lys

Ala 390 Leu

Met

Pro

Leu

Pro 470 Val

Phe

Asp

Ala

Gly 550 His

Glu

Ser

Val

Pro 630 Lys

Tyr

Arg

Asp

Thr 710 Asp

Asp

Leu

Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp 250255

Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro 265270

Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe 280285

Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly 295300

Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg 315320

Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn 330335

Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser 345350

Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr 360365

Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro 375380

Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp 395400

Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile 410415

Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala 425430

His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe 440445

Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu 455460

Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile 475480

Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly 490495

Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala 505510

Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu 520525

Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp 535540

Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn 555560

Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg 570575

Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp 585590

Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met 600605

Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala 615620

Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu 635640

Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp 650655

Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala 665670

Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp 680685

Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr 695700

Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe 715720

Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp 730735

His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly 745750

Met Pro

760 <210> 6

- 31 044641 <211> 850 <212> Protein <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека, единенный с последовательностью ?-Ъ-идуронидазы <400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 1015

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr AsnTyr

2530

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

4045

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr AlaTyr

70 7580

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ala Val Tyr PheCys

9095

Ala Arg Glu Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105110

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

145 150 155160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr

165 170175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu Ser Ser Glu

210 215220

Ala Pro His Leu Val Gln Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp ProLeu

225 230 235240

Arg Arg Phe Trp Arg Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro HisSer

245 250255

Gln Ala Asp Gln Tyr Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala

260 265270

Tyr Val Gly Ala Val Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His

275 280285

Trp Leu Leu Glu Leu Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu

290 295300

Ser Tyr Asn Phe Thr His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu ArgGlu

305 310 315320

Asn Gln Leu Leu Pro Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser GlyHis

325 330335

Phe Thr Asp Phe Glu Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu

340 345350

Val Ser Ser Leu Ala Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His

355 360365

Val Ser Lys Trp Asn Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp

370 375380

Phe Asp Asn Val Ser Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr TyrAsp

385 390 395400

Ala Cys Ser Glu Gly Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg LeuGly

405 410415

Gly Pro Gly Asp Ser Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp

420 425430

Gly Leu Leu Arg His Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu

435 440445

Ala Gly Val Arg Leu Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg

450 455460

Ser Ser Ile Ser Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile со- 32 044641

465

Arg Gln Leu

Ala Asp Pro

Val Thr Tyr 515

Leu Leu Leu 530

Asn Asp Asn 545

Thr Leu Thr

Gln Leu Leu

Leu Asp Glu 595

Leu Asp Ser 610

Gln Gly Pro 625

Asp Asp Thr

Leu Arg Gly

Leu Asp Asn 675

Arg Pro Val 690

Glu Asp Pro 705

Leu Thr Leu

Val Cys Ala

Ala Leu Pro 755

His Val Gly 770

Asp Gly Lys 785

Leu Phe Val

Val Arg Ala

Val Pro Tyr 835

Asn Pro

850

Phe Pro

485 Leu Val 500 Ala Ala

Ala Asn

Ala Phe

Ala Arg

565 Arg Lys 580

Glu Gln

Asn His

Ala Asp

Arg Ala

645

Val Pro 660

Gly Leu

Phe Pro

Val Ala

Arg Pro

725 Arg Pro 740

Leu Thr

Ser Lys

Ala Tyr

Phe Ser

805 Leu Asp 820

Leu Glu

470 Lys Phe

Gly Trp

Met Val

Thr Thr

535 Leu Ser 550

Phe Gln

Pro Val

Leu Trp

Thr Val

615 Ala Trp 630 His Pro

Pro Gly

Cys Ser

Thr Ala

695 Ala Ala 710

Ala Leu

Glu Lys

Gln Gly

Cys Leu

775 Thr Pro 790 Pro Asp

Tyr Trp

Val Pro

475480

Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu 490495

Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp 505510

Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn

520525

Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser 540

Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg 555560

Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val 570575

Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu 585590

Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val 600605

Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro 620

Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser 635640

Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg 650655

Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr 665670

Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly 680685

Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala 700

Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg 715720

Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His 730735

Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg 745750

Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu

760765

Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln 780

Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn 795800

Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg 810815

Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro 825830

Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly 840845 <210> 7 <211> 872 <212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека единенный с последовательностью ?-L-идуронидазы посредством глицин-серинового кера < 400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

5 10 15

Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

25 30

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile солин- 33 044641

3540

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr 5055

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 6570

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Lys 8590

Ala Arg Glu Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100105

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115120

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130135

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145150

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165170

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180185

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195200

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210215

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225230

Val Gln Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp 245250

Arg Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro 260265

Tyr Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn 275280

Val Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg 290295

Leu Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg 305310

Thr His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu 325330

Pro Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser 340345

Glu Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys 355360

Ala Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu 370375

Asn Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His 385390

Ser Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr 405410

Gly Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg 420425

Ser Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu 435440

His Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr 450455

Leu Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly 465470

Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln 485490

Pro Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn 510515

Val Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg 525530

Ala Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His 540545

Asn Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu 555560

Phe Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala 575580

Arg Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro 590595

Lys Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu

Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Ser Ser Thr Ala Tyr 80

Ala Val Tyr Phe Cys 95

Leu Val Thr Val Ser 110

Leu Ala Pro Ser Ser 125

Cys Leu Val Lys Asp 140

Ser Gly Ala Leu Thr

160

Ser Ser Gly Leu Tyr 175

Ser Leu Gly Thr Gln 190

Asn Thr Lys Val Asp 205

His Gly Gly Gly Gly 220

Glu Ala Pro His Leu

240

Leu Arg Arg Phe Trp 255

Ser Gln Ala Asp Gln 270

Ala Tyr Val Gly Ala 285

His Trp Leu Leu Glu 300

Leu Ser Tyr Asn Phe

320

Glu Asn Gln Leu Leu 335

His Phe Thr Asp Phe 350

Leu Val Ser Ser Leu 365

His Val Ser Lys Trp 380

Asp Phe Asp Asn Val

400

Asp Ala Cys Ser Glu 415

Gly Gly Pro Gly Asp 430

Trp Gly Leu Leu Arg 445

Glu Ala Gly Val Arg 460

Arg Ser Ser Ile Ser

480

Ile Arg Gln Leu Phe 500

Glu Ala Asp Pro Leu 520

Asp Val Thr Tyr Ala 535

Asn Leu Leu Leu Ala 550

Ser Asn Asp Asn Ala

570

Arg Thr Leu Thr Ala 585

Val Gln Leu Leu Arg 600

Leu Leu Asp Glu Glu

- 34 044641

605 610615

Gln Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val Leu Asp Ser Asn 620 625630

His Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro Gln Gly ProAla

635 640 645650

Asp Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp ThrArg

655 660665

Ala His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg Leu Arg Gly Val 670 675680

Pro Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr Leu Asp Asn Gly 685 690695

Leu Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly Arg Pro Val Phe 700 705710

Pro Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala Glu Asp ProVal

715 720 725730

Ala Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg Leu Thr LeuArg

735 740745

Pro Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His Val Cys Ala Arg 750 755760

Pro Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu 765 770775

Thr Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser 780 785790

Lys Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly LysAla

795 800 805810

Tyr Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe ValPhe

815 820825

Ser Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu 830 835840

Asp Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu 845 850855

Glu Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro 860 865870 < 210> 8 <211> 214 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Легкая цепь иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина LFR1 < 400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Asn 20 2530

Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 4045

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GlnPro

70 7580

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Ser ProTrp

9095

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn SerGln

145 150 155160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser LeuSer

165 170175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

- 35 044641

210 < 210> 9 < 211> 214 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Легкая цепь иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина LFR2 < 400> 9

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr ProLys

5 1015

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly GlyAsn

2530

Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu LeuIle

Lys Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe SerGly

5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu GluAla

70 7580

Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Ser ProTrp

9095

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn SerGln

145 150 155160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser LeuSer

165 170175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 10 <211> 214 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> Легкая цепь иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина LFR3 <400> 10

Asp

Ile

Gln

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asp

Ile

Gly

Gly Asn

Leu

Tyr

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Val

Leu

Ile

Tyr

Ala

Thr Ser

Ser

Leu

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Tyr Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

a laAla

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

a spAsn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu Leu

Ser Ser

Lys Ser

Ala Pro

Asp Val

Tyr Thr

Glu Lys

Lys Ser

His Phe

Lys Asn

Val Tyr Arg Gly

Ala Glu

Cys Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

<210> 11 <211> 214 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> Легкая цепь иммуноглобулина IgG к рецептору инсулина LFR4

- 36 044641 <400> 11

Glu Ile Val Leu Leu Ser Cys Arg Gly Gln Ala Pro Arg Phe Ser Gly Glu Asp Phe Ala Gly Thr Arg Leu Ser Asp Glu Gln Pro Arg Glu Ala Glu Ser Val Thr Leu Ser Lys Ala Leu Ser Ser Pro

Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Asp Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Glu Ile Lys Arg Leu Lys Ser Gly Lys Val Gln Trp Glu Gln Asp Ser Asp Tyr Glu Lys Val Thr Lys Ser

Ala Thr Leu Ser Ile Gly Gly Asn Tyr Ala Thr Ser Thr Asp Phe Thr Leu Gln Tyr Ser Thr Val a laAla Thr Ala Ser Val Lys Val a spAsn Lys Asp Ser Thr His Lys Val Tyr Phe Asn Arg Gly

Leu Ser Pro Gly Leu Tyr Trp Tyr Ser Leu Asp Ser Leu Thr Ile Ser Ser Ser Pro Trp Pro Ser Val Phe Val Cys Leu Leu Ala Leu Gln Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Cys Glu Val Glu Cys

Glu Arg Ala Thr Gln Gln Lys Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Glu Pro Thr Phe Gly Gln Ile Phe Pro Pro Asn Asn Phe Tyr Gly Asn Ser Gln Ser Thr Leu Thr Thr His Gln Gly <210> 12 <211> 748 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы HFR1 <400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Trp

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu GlyCys

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu SerSer

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val AsnHis

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys ThrHis

Leu Ser Ser Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu LeuIle

Ile Val a spAsp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro

Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala

Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu

Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr

Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser

Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser

Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu

Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr

Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala

Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr

Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro ProVal

Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn IleSer

Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr PheAla

Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp LeuGln

Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly GluHis

Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile PheTyr

Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr LeuAsp

Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu ValGlu

Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro ArgCys

Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe

Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala

Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu

Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp

Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu

Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly

Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro <210> 13 <211> 748 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 37 044641 <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека, со единенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы HFR2 <400> 13

Gln Val Gln Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Lys Gly Asn Glu Lys Phe Leu Gln Met Asn Ala Tyr Trp Gly Val Phe Pro Leu Leu Val Lys Asp Ser Gly Val His Val Val Thr Val Lys Pro Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ile Val Asp Asp Asn Ile Asp Gln Val Cys Ala Pro Tyr Asp Phe Asn Phe Lys Glu Asn Ser Asn His Thr Glu Lys Tyr Glu Leu Cys Pro Val Glu Gln Ala Ile Val Gly Tyr His Pro Leu Glu Asn Ala Tyr Asn Pro Val Pro Tyr Gly Ser Val Ser Tyr Leu Ala Asn Ser Gly Glu Trp Ala Val Pro Gly Arg Pro Phe Asp Ser Leu Val Ser Leu Pro Val Pro Ser Arg Phe Arg Asp Tyr Ser Gln Tyr Lys Asp Ile Lys Val Gly Phe Asn Tyr Phe Val Asp Asp Leu Phe Gln

Val Glu Ser Gly Ser Gly Phe Thr Leu Glu Trp Val Lys Gly Arg Phe Gly Leu Arg Ala Gln Gly Thr Leu Ala Pro Ser Ser Tyr Phe Pro Glu Thr Phe Pro Ala Pro Ser Ser Ser Thr Lys Val a

Glu Thr Gln Ala Leu Arg Pro Ser Leu Ala Ser His Ser Arg Val Ser Ser Tyr Trp Arg Gly Tyr Val Thr Asp Asp Ser Pro Asn Thr Lys Thr Asp Val Leu Asp Gln Leu Leu Glu Lys Pro His Ile Ile Thr Leu Ala Trp Met Asp Ile Pro Ile Pro Val Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ile Ala Lys Tyr Ser Asn Thr Ala Ser Leu Ala Ser Gln Leu Phe Pro Thr Leu Phe His Val Glu Leu Glu Glu Asp Pro Arg Pro Ser Ile Met Gly Tyr Pro Asp Glu Phe Ser Asp Pro Leu Leu Leu Met Pro

Gly Gly Val Val Phe Ser Asn Tyr a laTrp Ile Tyr Thr Ile Ser Arg Glu Asp Thr Ala Val Thr Val Ser Lys Ser Thr Ser Pro Val Thr Val Val Leu Gln Ser Leu Gly Thr Gln spLys Arg Val Glu Asn Ser Thr Thr Leu Gly Cys Tyr Ser Leu Leu Phe Phe Leu Thr Gly Val His Ala Gly Met Ser Val Gly Tyr Ser Trp Ser Cys Arg Gly Pro Val Pro Glu Gly Lys Met Lys Thr Pro Phe Arg Tyr Pro Asp Pro Glu Arg Gln Arg Glu a spPhe Gln Arg Val Gly Arg Leu Phe Thr Ser Asp Phe Asp Val a

Pro Glu Ala Gly Met Glu Pro Gly Ala Gly Leu Ala Leu Cys Arg Glu Pro Tyr Leu Pro Asp Ile Pro Gln Ser Ile Arg Thr Leu Ala Asn Phe Gln Asp His Asn

Gln Pro Gly Arg Asp Ile His Trp Pro Gly Asp Gly Asp Asn Ser Lys Val Tyr Tyr Cys Ser Ala Ser Thr Gly Gly Thr Ala Ser Trp Asn Ser Ser Gly Leu Tyr Thr Tyr Ile Cys Pro Lys Ser Cys Asp Ala Leu Asn Gly Asp Lys Leu Gln Asn Ala Phe Arg Arg Pro Asp Asn Phe Ser Thr Lys Val Phe His Phe Pro Pro Tyr Asp Gly Glu Leu Thr Leu Pro Asp Ser Ala Ser Pro Pro Lys Glu Phe Val Pro Asp Gly Asp Val Gln Ala Lys Ile Arg Gln Leu Ser Ala Leu His Gly Trp Ala laThr His Val Pro

Glu Lys Leu Phe Arg Gln Ser Met Gly Leu Gln Val Gly Lys Asn Leu Gly Asn Pro Arg Trp Asn Ser Asp Ile Asp Tyr Arg Ser Asp Ile His Met Tyr Asn Asp

Ser Leu Arg Leu Val Arg Gln Ala Ser Thr Lys Tyr Asn Thr Leu Tyr Ala Arg Glu Trp Lys Gly Pro Ser Ala Leu Gly Cys Gly Ala Leu Thr Ser Leu Ser Ser Asn Val Asn His Asp Lys Thr His Val Leu Leu Ile Val a rgSer Pro Ala Gln Gln Ala Thr Thr Arg Leu Ile Pro Gln Tyr Pro Gly Ile Ser His Pro Ser Ser His Ala Asn Leu Lys Gln Ser Thr Phe Phe Leu Ala Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Val Leu Asn Ile Ser Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Leu Gly Glu His Leu Ile Phe Tyr Pro Tyr Leu Asp Asp Leu Val Glu Pro Pro Arg Cys Leu Lys His Phe Glu Leu Ile Ala Lys Pro Ser Leu Tyr Thr Val Trp Ala Gly Glu Leu Ser Gln Gly Gly <210> 14 <211> 748 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы HFR3 <400> 14

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Tyr

Asp

Phe

Thr

Asn

Tyr

Asp

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Gly

Trp

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Ser

Thr

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Lys

Glu

Trp

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Leu

Ser

Ser

Ser

Glu

Thr

Gln

Ala

Asn

Ser

Thr

Thr

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Leu

Leu

Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Leu

Arg

Pro

Ser

Leu

Gly

Cys

Tyr

Gly

Asp

Lys

Leu

Val

Arg

Ser

Pro

- 38 044641

Asn Ile Asp Gln Val Cys Ala Pro Tyr Asp Phe Asn Phe Lys Glu Asn Ser Asn His Thr Glu Lys Tyr Glu Leu Cys Pro Val Glu Gln Ala Ile Val Gly Tyr His Pro Leu Glu Asn Ala Tyr Asn Pro Val Pro Tyr Gly Ser Val Ser Tyr Leu Ala Asn Ser Gly Glu Trp Ala Val Pro Gly Arg Pro Phe Asp Ser Leu Val Ser Leu Pro Val Pro Ser Arg Phe Arg Asp Tyr Ser Gln Tyr Lys Asp Ile Lys Val Gly Phe Asn Tyr Phe Val Asp Asp Leu Phe Gln

Leu Ala Ser His Ser Arg Val Ser Ser Tyr Trp Arg Gly Tyr Val Thr Asp Asp Ser Pro Asn Thr Lys Thr Asp Val Leu Asp Gln Leu Leu Glu Lys Pro His Ile Ile Thr Leu Ala Trp Met Asp Ile Pro Ile Pro Val Leu Asp Thr Gln Thr Ile Ile Ala Lys Tyr Ser Asn Thr Ala Ser Leu Ala Ser Gln Leu Phe Pro Thr Leu Phe His Val Glu Leu Glu Glu Asp Pro Arg Pro Ser Ile Met Gly Tyr Pro Asp Glu Phe Ser Asp Pro Leu Leu Leu Met Pro

Ser Leu Leu Phe Phe Leu Thr Gly Val His Ala Gly Met Ser Val Gly Tyr Ser Trp Ser Cys Arg Gly Pro Val Pro Glu Gly Lys Met Lys Thr Pro Phe Arg Tyr Pro Asp Pro Glu Arg Gln Arg Glu a spPhe Gln Arg Val Gly Arg Leu Phe Thr Ser Asp Phe Asp Val a

Pro Glu Ala Gly Met Glu Pro Gly Ala Gly Leu Ala Leu Cys Arg Glu Pro Tyr Leu Pro Asp Ile Pro Gln Ser Ile Arg Thr Leu Ala Asn Phe Gln Asp His Asn

Gln Asn Ala Phe Arg Arg Pro Asp Asn Phe Ser Thr Lys Val Phe His Phe Pro Pro Tyr Asp Gly Glu Leu Thr Leu Pro Asp Ser Ala Ser Pro Pro Lys Glu Phe Val Pro Asp Gly Asp Val Gln Ala Lys Ile Arg Gln Leu Ser Ala Leu His Gly Trp Ala laThr His Val Pro

Glu Lys Leu Phe Arg Gln Ser Met Gly Leu Gln Val Gly Lys Asn Leu Gly Asn Pro Arg Trp Asn Ser Asp Ile Asp Tyr Arg Ser Asp Ile His Met Tyr Asn Asp

Ala Gln Gln Ala Thr Thr Arg Leu Ile Pro Gln Tyr Pro Gly Ile Ser His Pro Ser Ser His Ala Asn Leu Lys Gln Ser Thr Phe Phe Leu Ala Gln Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Val Leu Asn Ile Ser Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Leu Gly Glu His Leu Ile Phe Tyr Pro Tyr Leu Asp Asp Leu Val Glu Pro Pro Arg Cys Leu Lys His Phe Glu Leu Ile Ala Lys Pro Ser Leu Tyr Thr Val Trp Ala Gly Glu Leu Ser Gln Gly Gly <210> 15 <211> 748 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Фрагмент VH-CH1 тяжелой цепи антитела к инсулиновому рецептору человека, соединенный с последовательностью идуронат-2-сульфатазы HFR4 <400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Trp

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

Val Phe Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Thr Ala Ala Leu GlyCys

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuThr

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu SerSer

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val AsnHis

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys ThrHis

Leu Ser Ser Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu LeuIle

Ile Val a spAsp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro

Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala

Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu

Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr

Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser

Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser

Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu

Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr

Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala

Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr

Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro ProVal

Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn IleSer

Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr PheAla

Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp LeuGln

Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly GluHis

Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile PheTyr

Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr LeuAsp

Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu ValGlu

Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro ArgCys

Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe

Claims (7)

1. Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение HIR-Fab-IDS, образованное первой аминокислотной последовательностью LC-HIRFab-IDS, выбранной из SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10 или 11, и второй аминокислотной последовательностью HC-HIR-Fab-IDS, выбранной из SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14 или 15.
2. 2. Соединение по п.1, образованное первой аминокислотной последовательностью LC-HIR-Fab-IDS, представленной в SEQ ID NO: 2, и второй аминокислотной последовательностью HC-HIR-Fab-IDS, представленной в SEQ ID NO: 4.
3. 3. Соединение по п.1, образованное первой аминокислотной последовательностью LC-HIR-Fab-IDS, представленной в SEQ ID NO: 2, и второй аминокислотной последовательностью HC-HIR-Fab-IDS, представленной в SEQ ID NO: 5.
4. 4. Применение соединения по пп.1-3 для получения фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
5. 5. Применение соединения по пп.1-3 для лечения или профилактики недостаточности лизосомального фермента у субъекта, имеющего лизосомную болезнь накопления, где указанное применение включает введение указанному субъекту указанного соединения в эффективном количестве.
6. 6. Применение по п.5, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз.
7. 7. Применение по п.5, где лизосомная болезнь накопления представляет собой мукополисахаридоз типа II с неврологической составляющей.

   -