JP5317983B2 - 細胞観察をともなった細胞液捕獲と成分分析法および細胞液捕獲・分析装置 - Google Patents
細胞観察をともなった細胞液捕獲と成分分析法および細胞液捕獲・分析装置 Download PDFInfo
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Description
図1の写真200は、アレルギー反応を担うラット肥満細胞の、カルシウムイオノフォアで刺激後の顆粒放出数の経時変化を捉えたものである。この様な一連のビデオ画像から顆粒の放出(破裂)だけを、当該細胞を顕微鏡観察したビデオ画像の連続時間差像解析を行って捉えた一例が写真201であり、右はその結果、同じ培養皿で培養して生育条件がまったく同じ細胞に関して、顕微視野内での異なった細胞での顆粒放出数の時間変化を示す。この様に、同じ環境の、同じ刺激の中にいる細胞でも、すぐに多くの顆粒を放出するものもあれば、なかなか顆粒を放出しないものも存在する。つまり細胞1ヶ1ヶには個性があると言える。その様な真実は細胞をビデオ顕微鏡で観察記録し、解析して初めて分かった事であった。
他には、複数のアフィニティー・マイクロカラムで生体液中の複数の生体分子を特異的に抽出し、それを質量分析計で分析するシステムがある(特許文献2)。
例えば、iPS万能細胞のように、再生医療をめぐり、細胞分化因子の探索は非常に重要であるが、多くは低分子であるその因子の網羅的解析法は、従来は多細胞集団系でしか達成できていなかった。しかし分化する細胞は、全部ではなく、細胞集団の中でも一部であることを我々は顕微観察で知っており、本発明は、その分化の進行度を形態から観察しながら、形態学的に見て分化した細胞のみを選択的にその場で分子分析できる手段をはじめて与えることになる。
またMALDI−TOF法は、最近TOF−TOF法やイオントラップ−TOF法の装置が市販されるようになり簡易MS/MS分析が可能となってきたが、分子同定力に乏しく、定量性に乏しく、また細胞1ヶにマトリックスを添加して、そのマトリックスが結晶化するプロセスでどこに細胞が存在しているか分からず、ましてや、そのサンプルプレートを質量分析計内にセットしてテレビカメラで、ミクロンオーダーで細胞1ヶの場所をレーザーで狙い撃ちするのも容易ではなく、また、細胞のある状態を見ながら、その瞬間と思っても、その後細胞を取り出し、MALDIサンプルプレートに乗せている操作の間にどんどん細胞の状態が変わり、最後に飽和濃度に近い有機分子溶液であるマトリックス添加で、何が起こっているか、含まれている細胞成分が生きた細胞内に存在した時からどう変化しているのかは誰もわからない。
分子同定に必要なMS/MS分析などが可能な前記質量分析計に分子をイオン化導入することが出来、かつMS/MS分析のように、分子一種づつ選び逐次分子を壊して(コリジョンセルに導入して)そのフラグメントスペクトルを取得するには、すべての分子種を分析する間、試料内分子のイオン化を継続させている必要がある。しかし、細胞1ヶの体積わずか1ピコリッターでは、従来のエレクトロスプレーイオン化法では、あっと言う間に試料は無くなり、少なくとも数分は欲しい試料イオン化持続時間が確保できない。
顕微鏡を用いて細胞の動態を観察することに並行して、前記細胞の特定の領域に対して、先端部が前記特定の領域の大きさに対応する口径であるナノスプレーイオン化細管を挿入するステップと、
前記特定の領域内の細胞成分を前記チップの先端部から採取して前記先端部に留める採取ステップと、
イオン化補助溶媒を前記ナノスプレーイオン化細管の後端側から導入するステップと、
質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加することにより、前記細胞成分をナノスプレーイオン化して前記質量分析装置に試料として導入するステップと、
前記質量分析装置において試料として導入された前記細胞成分を質量分析するステップとを備えた方法が提供される。
質量分析の対象となる細胞成分を含む細胞の動態を観察するための顕微鏡と、
前記細胞の細胞成分を採取するために前記細胞の大きさ以下の口径である先端部とイオン化補助溶媒を導入するための後端部とを有するナノスプレーイオン化細管であって、質量分析の対象となる前記細胞成分をイオン化することが可能なナノスプレーイオン化細管と、
試料導入口を有し、試料として導入されたイオン化後の細胞成分を質量分析する質量分析装置と、
前記質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加する電場印加部とを備え、
顕微鏡で観察している細胞内に侵入して特定の領域の細胞成分を前記ナノスプレーイオン化細管の先端部から採取すると共に前記ナノスプレーイオン化細管の後端側からイオン化補助溶媒を導入した後に、前記質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加することにより、前記質量分析装置に前記細胞成分をイオン化して試料として導入して質量分析するシステムが提供される。
口径が前記細胞内の特定領域以下の大きさである先端部と、
イオン化補助溶媒を導入するための後端部と、
前記ナノスプレーイオン化細管内部で先端まで延びる溶媒親和性表面を持つ溶媒経路細線とを備え、
前記ナノスプレーイオン化細管の外面は疎水性であり、
前記先端部の外面もしくは内面の少なくとも一方は導電性であるか、又は、導入されたイオン化溶媒まで後端側から内部に延びる導電性細線が挿入可能であり、質量分析装置との間に電界を印加できるように構成されているナノスプレーイオン化細管が提供される。
細胞状態間でうごめいている分子の動態、再生医療などの細胞分化因子の高速探索、細胞分化制御、細胞増殖因子の発見や制御法、がん細胞など細胞種の分子診断や分子探索、細胞種の同定、皮膚などの生体組織からの侵出液など、針をちょっと皮膚に刺す時に出てくるわずかな血液のみで臨床検査を行ったり、肝臓細胞1ヶで個人の薬物代謝を調べオーダーメイド医療を可能としたり、植物をちょっと刺してその内部の成分を探索したり、従来は1種類の化合物で医薬品を設計していたが、漢方処方に見られる多成分での協調作用によるより自然な医薬品作用の分子メカニズムの解明や複数協調型医薬化合物の探索や開発を可能にしたりなど、様々な人類の生命と健康に資する分析が高速に展開することとなる。
さらに一般的化学品製造産業等において、例えば、有機半導体、有機導電体、有機光学材料のように高純度が要求される製品の製造管理、あるいは食品添加物等の健康面での品質保証が重要な製品の製造過程において、微量の副生物が、物理化学的性能または安全性等の要求品質に悪影響を与えるような製造工程では、そのような副生物の監視、製造管理、品質管理など、微小域での分子検出と解析が可能となる。
一方スペクトル204は、1細胞の細胞質側を選択的に本発明手法で確立したイオン化細管で採取し、ナノスプレーイオン化法で質量分析装置に導入して得られたスペクトルである。その一部を拡大したスペクトル209にはm/z205のトリプトファン、210にはm/z221には5−ハイドロキシトリプトファン、そしてここにまた208にはm/z177のセロトニンと思われるピークが検出されている。
本発明では、この結果を得るまで、細胞観察、試料成分採取までで30分、測定に30分と最短で1時間程度で分子同定できる事になり、その結果の明快さとともに、従来とは比べものにならない位の短時間で分析できる特徴がある。
図15は、異なった細胞種間での1細胞質量スペクトルの比較で、細胞種の判別ができるかを試みたものである。異なった5種類の細胞種で捉えた細胞質のスペクトルと細胞の顕微像を示す。これだけではその差が明瞭でないので、これらのスペクトルを元に主成分解析を行った。7種類のセルラインの細胞を1つづつ本手法で分析し、そのスペクトルを主成分解析した例である。図15の122に各細胞の形態像とそのスペクトルそして、その主成分解析の結果もたらされる2次元スコアープロットでは第1主成分と第2主成分への各ピークの構成寄与を2次元的にプロットしたもので、このプロットにすると、おのおのの細胞種はあるゾーンを占めるクラスターを形成することがわかった。これにより、細胞種の分類、逆に言えば、細胞ごとに細胞内にある低分子の種類の分布は異なることがわかった。このことは本手法が細胞の分化にかかわる分子成分や細胞周期の確認など、細胞内分子変化と状態を結びつける事もできる方法であることを示している。図15の123は、そのスペクトル中の各ピーク(図中の各点が各ピークに相当)の分布を2次元ローディングプロットで示している。中心ゾーンは共通性の高い分子ピーク、周辺に行くほど特異性の高いピークであり、これより、どのピークが細胞種特異的なものかを示すことができ、その後、MS/MS解析に進むピークの判別にも使用できることが分かった。
図19は、ゼラニウムの葉と茎の1細胞に、直接顕微鏡下で、ナノイオン化細管を差し込み、その成分を捉えた結果を示す。画像239は、葉っぱの部分の顕微鏡画像であり、拡大すると緑色の細胞のみでなく、白色のクロロフィルの少ない細胞も混在している事が分かった。その白色細胞にイオン化細管を差し込んで細胞内成分を前述と同様に分析したスペクトルが240である。一方、ゼラニウムの茎(画像241)は更に容易で、242の様なスペクトルを得た。こうして得たスペクトルの各ピークに対し、t-検定を行った結果が表243であり、葉っぱに特異的な分子ピーク(左カラム)や、茎に特異的なピーク(右カラム)が多数存在していることが分かった。その中で、図19の244に示すように、m/z178.70のピークを示す分子は茎に特異的に存在する成分であり、図19の245に示すように、m/z311.17のピークを示す分子は葉に特異的に存在する成分であることが分かった。この様に、本発明は植物に対しても直接的に細胞内分子同定と探索に使用できる事が検証できた。
図20は、本発明で細胞内外での物質移動や物質代謝を追跡する手法を提示したものである。例えば細胞外液に標識化分子あるいは追跡可能な同位体分子(以下、標識分子と総称)85を加え、本手法では質量分析法によりその質量のマスシフトなどの特異性を指標に追跡することができる。標識分子85は細胞内に取り込まれ、細胞内に移動し細胞内液に存在するもの88、あるいは細胞内小器官に取り込まれた標識化分子86あるいはそれ自身が追跡用同位体分子として分布し、本手法でその局在が検出されたり、膜に取り込まれたり、または膜に結合した標識化分子あるいは追跡用同位体分子87として、膜成分捕獲の際に検出されたり、細胞内に移動する間に代謝ないし修飾された標識化分子あるいは追跡用同位体分子88として検出されたり、細胞内小器官に取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子89あるいはその代謝物89’として検出されたり、あるいは核内に移行ないし取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子90として検出されたり、細胞外液に分泌あるいは再放出された代謝ないし修飾された標識化分子あるいは追跡用同位体分子91として検出される。これにより細胞内外の物質代謝や分子移動などの様子が1細胞で解明できることになる。
更に、細胞内成分あるいは血液など体液中の特定成分と結合することにより消失する成分を上記と同様な方法で、被結合分子を僅かに試料溶液に添加することで、その結合成分の濃度や結合成分の分布や結合率の評価を行うことができる。標識化合物の利用は、本手法の可能性を更に大きく拡げると期待される。
本発明でいう導電性細管とは、内面、外面または両側あるいは材料そのものが導電性表面を有するもので、導電性表面とは、イオン化細管材料そのものが導電性であっても、また導電性物質をコーティングまたは塗布あるいは化学処理であってもよい。また導電性を持つ領域は細管全部でなくても良く、先端部分が広く覆われていれば、それ以外は電圧印加のために電気的に接触する部位から先端部分まで電気的につながっていればそれでも良い。導電性材料としては、導電性金属、導電性有機材料が挙げられるが、それらに限定されるものではなく、また導電性コーティングをする方法としては蒸着、スパッタリング、塗布等が挙げられるが、それらに限定されるものでもない。
ここでいう疎水性表面とは、細管材料に疎水性物質を塗布したものであってもよく、化学的に疎水性官能基を有する化合物を、直接、またはスペーサーを介して結合したものであってもよい。疎水性物質としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、脂肪酸エステル等々が挙げられるがこれらに限定されない。疎水性官能基としては、オクタデシル基、ドデシル基、ヘキシル基、置換基を有するフェニル基およびナフチル基などが挙げられるが、これらに限定されない。
この場合、細胞成分をイオン化細管1の先端から吸引した後、この分子親和性のある繊維状あるいは鎖状充填物質59に成分を捕捉させ、その後分析対象以外の成分を洗い出すための溶液をイオン化細管1の先端部からの吸引もしくは前記細管の後端側からの注入により洗い出し、イオン化を妨げる塩の脱塩も行い、その後、イオン化細管1の後端側から捕捉成分を溶出するイオン化補助溶媒を導入し、選択的な分子群検出を高感度に達成することができる。図35では、イオン化細管1内に分子親和基を表面に持つ樹脂68を充填あるいはリング状に先端内面に配置した例である。前記と同じ洗浄、溶出を行うことで、選択的な分子群濃縮と脱塩ができる。
この様にして細管1の内面を修飾することで、より効率的な分子濃縮が可能となる。この内面修飾するゾーンはチップ内面全面でも先端にしか細胞成分液は捕捉されないので構わないが、好ましくは前述の理由により、先端付近の限局された部分のみが良く、目的・状況に応じて使い分けることが望ましい。勿論、この様な内面修飾されたイオン化細管も外面は疎水コートや親水コートなど施され、細胞にスムーズに挿入される様に加工され、また、細胞に近づくまで、イオン化細管の内部を加圧して、途中細胞培地の成分が先端内に混入しない配慮もなされるべきである。また液体含有組織に形成された穴から細胞内又は組織内成分を漏出させることにより質量分析の対象となる細胞成分を前記先端部から採取する際にも、ナノスプレーイオン化細管の先端内面に分子親和基を結合させたものは、特異的な成分をイオン化細管の先端で捕獲するのには好都合である。
さらに従来の質量分析計の制御あるいはデータ解析システムの中に含まれていない機能として、この図の様に、ナノスプレー時間が超微量試料の場合、長くて5−10分という短時間であり、その時間内に出来るだけ多くのMS/MS分析で分子同定する為に、最初の1分で全体のスペクトルをとりながら、同時に、比較すべきスペクトルがすでにある場合はそのデータとの比較統計解析(t−検定など)をコンピューターが背後で同時に進めて、残りの貴重なスプレー時間に、今度は自動的にあるいは表示して判断を仰ぐ形式にして、ほぼリアルタイムに分子同定のためのMS/MS分析あるいは、分子同定力の高い高分解能質量分析に迅速に持ちこめる機器制御およびデータ解析ソフトウエアーを考案した。同時にパブリックでインターネットを通して検索できるMSバンクデータベースにすぐにアクセスして、そのスペクトルを自動的に、そのデータバンクのデータ形式に変換して検索をかけ、その結果を得るソフトウエアーとした。
こうしてこの方法で、図55の様に、細胞を薬物処理する前と後でTICを比較し、ある溶出時間でのスペクトルの比較を行うと、明らかに異なる分子ピークが見られている。
図57も同様で、細胞を最後に溶解したのち、ウエルの下部からナノスプレーニードル149を突き刺して、それに高圧電場を印加してナノスプレーを引き起こすところが相違点である。細胞破砕には超音波などを使用してもよい。
図58は、この様にしたウエルをサンプルプレート150内に配して、その下部145または149から次々にルーティーンでナノスプレーを引き起こし、質量分析するものである。
図61は、図59で示したセルソーターと質量分析計を合体したシステムの1例である。これにより、セルソーターで得られる細胞の形態や表面マーカーを反映するスキャッタグラムとデンシトグラムおよび同時に質量分析で得られた各細胞の属性を示す主成分解析結果およびMSスペクトルを同時に得ることができる。
図63は選ばれたリンパ球のポジティブモードでのMSスペクトルから割り出された主成分解析結果184により3つの細胞タイプグループがあることがわかり、それらの平均MSスペクトル185が得られた。
また、細胞内や生体組織中の細胞内の様々な分子メカニズムの解明の高速化は、医薬品候補分子も含め新分子の発見、新生命現象の発見の高速化をもたらし、医療や診断あるいはバイオ応用を大きく展開し加速することができる。例えば、再生医療などの万能細胞の細胞分化因子の高速探索、細胞分化制御、細胞増殖因子の発見や制御法、がん細胞など細胞種の分子診断や分子探索、細胞種の同定など様々な分析が高速に展開することとなる。
さらに一般的化学品製造産業等において、例えば、ナノテクノロジーの微小域分子機構の解明や、有機半導体、有機導電体、有機光学材料のように高純度が要求される製品の製造管理、あるいは食品添加物等の健康面での品質保証が重要な製品の製造過程において、微量の副生物が、物理化学的性能または安全性等の要求品質に悪影響を与えるような製造工程では、そのような副生物の監視、製造管理、品質管理など、微小域での分子検出と解析が可能となる。
1´ ナノスプレーイオン化細管(試料溶液電極挿入型)
2 質量分析装置
3 試料溶液または細管後端からさらにイオン化補助溶媒を添加した混合液
4 高圧電圧(この場合はポジティブモードの例でありチップ側が+)
5 ナノスプレー
6 細管表面の金属コーティング部
7 ナノスプレーイオン化細管本体部(この例は絶縁体)
8 細胞
9 顕微鏡ステージ
10 捕捉した細胞液
11 対物レンズ
12 ビデオカメラ
13 吸引操作
14 溶液挿入電極部
15 シャーレ
16 細胞培養液
17 モニター
18 コンピューター
19 シャーレ内培養細胞のビデオ顕微画像
20 画面内細胞の標的細胞内液から得られた質量スペクトル
21a 細胞aから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトル
21b 細胞bから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトル
22 21aから21bの差分として得られた質量スペクトルピーク
23 22で得られたピークを親ピークとして選択し得たMS/MSスペクトル
24 質量スペクトルピーク名
25 m/z値
26 t−検定値
27 ある状態に属する11ヶの細胞群(27)に特異的に見つかったm/z値のスペクトルピークを示す、それぞれの細胞から測定された各スペクトルピーク強度
28 27とは異なった状態に属する6ヶの細胞群(28)に見られる、27と同じm/z値のスペクトルピーク強度
29 細胞からナノスプレー細管チップ1で細胞内液を捕獲する時の顕微ビデオ像
30 細胞Aから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトル
31 細胞Bから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトル
32 細胞Aから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトルと細胞Bから捕獲した細胞内液から得られた質量スペクトル間でのt−検定の結果
33 細胞Aで特異的に検出された分子ピークの1つm/z=112.0909のMS/MS解析の結果得られたフラグメントスペクトル
34 細胞Aで特異的に検出された分子ピークm/z=112.0909のMS/MS解析の結果決定されたヒスタミンの化学構造
35 細胞刺入ナノスプレーイオン化細管を細胞位置まで駆動するホルダーのX-Y-Z駆動ステージ(この図では電動型、手動のギア粗動・微動型もあり)
35´細胞ホールド用細管を細胞位置まで駆動するホルダーのX-Y-Z駆動ステー
36 細胞刺入ナノスプレーイオン化細管を細胞位置まで駆動するホルダーの軸方向アクチュエーター(この図では電動型、他に手動のピストン駆動型もあり)
36´細胞ホールド細管を細胞位置まで駆動するホルダーの軸方向アクチュエーター
37 細胞刺入ナノスプレーイオン化細管を細胞位置まで駆動する軸方向アクチュエータによる細胞刺入および吸引後引き戻し移動方向
37´細胞ホールド細管を細胞位置まで駆動する軸方向アクチュエータによる細胞刺入および吸引後引き戻し移動方向
38 細胞刺入ナノスプレーイオン化細管ホルダー駆動制御装置
38´細胞ホールド用細管
39 細胞刺入ナノスプレーイオン化細管ホルダー駆動用端末(この図ではジョイスティック、他にピストン駆動型回転体もあり)
40 細胞成分吸引駆動用チューブ
41 細胞成分吸引用ピストン(注射器でも代用可)
42 細胞成分吸引用ピストン駆動装置
43 ナノスプレーイオン化細管先端検出用対物レンズ1
44 ビデオカメラ1
45 ナノスプレーイオン化細管先端検出用対物レンズ2
46 ビデオカメラ2
47 ナノスプレーイオン化細管先端検出用モニター
48 ナノスプレーイオン化細管先端指定位置マーク(モニター画面上)
49 制御用コンピューター
50 吸引・送液ポンプ
51 吸引チューブ
52 送液チューブ
53 導電性材料
54 ナノスプレーイオン化細管外面コーティング
55 外面免コートナノスプレーイオン化細管(54)の細胞刺入部
56 試料溶媒親和性細心材(溶媒経路細線)
57 導電性細心材
58 内面コーティング
59 繊維状あるいは鎖状充填物質
60 刷毛状に表面結合した物質
61 疎水性物質表面結合体あるいはコーティング
62 陽イオン性物質表面結合体あるいはコーティング
63 陰イオン性物質表面結合体あるいはコーティング
64 抗体などの受容体結合表面
65 抗原あるいは基質などの結合表面
66 酵素などの結合表面
67 核酸類の結合表面
68 61から67の様な表面結合体をもつ充填剤あるいは分子ふるい充填剤
69 フリット材
70 分子捕捉溶液
71 ミクロピペット
72 溶出溶媒とイオン化補助溶媒の混合液
73 ウエル型ナノスプレー部
74 バーナーあるいはトーチ
75 温浴(PCRの場合はサーマルサイクラー)
76 補足した細胞液に処理用の添加試液を加えたもの
77 PCR増幅、熱変性などの処理をする試料液
78 PCR増幅、熱変性などの処理をした試料液
79 放電
80 細胞液などの捕捉試料液に溶出・イオン化溶媒を加えたもの
81 ピンセット
82 レーザー
83 ミラー
84 シリンドリカルレンズ
85 細胞外液に加えた標識化分子あるいは追跡可能な同位体分子
86 細胞内に移動し細胞内液に存在するもの、あるいは細胞内器官に取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子
87 膜に取り込まれたないし結合した標識化分子あるいは追跡用同位体分子
88 細胞内に移動する間に代謝ないし修飾された標識化分子あるいは追跡用同位体分子
89 細胞内器官に取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子
89’ 細胞内器官に取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子の代謝物
90 核内に移行ないし取り込まれた標識化分子あるいは追跡用同位体分子
91 細胞外液に分泌あるいは再放出された代謝ないし修飾された標識化分子あるいは追跡用同位体分子
92 RBL−2H3細胞の本手法により捉えた細胞質成分の質量スペクトル
93 92の○印で囲んだ部分の拡大スペクトル
94 RBL−2H3細胞の本手法により捉えた細胞内顆粒内成分の質量スペクトル
95 94の○印で囲んだ部分の拡大スペクトル
96 m/z 400.2のMS/MSスペクトル
97 96のスペクトルを示す分子であるキナクリン分子の分子構造式
98 MSスペクトルピーク強度補正の為の基準ピークとして使用できる溶媒スペクトルとその中で基準ピークとして使用する特異ピーク(拡大図)
99 超微量の吸引体積を計測する方法
100 顕微鏡で得たナノスプレーイオン化細管先端に捕獲した部分の拡大図
101 超微量の吸引試料に微量溶媒添加などにおける希釈率評価法
102 微量添加液をナノスプレーイオン化細管後部から添加する手法
103 微量添加液をナノスプレーイオン化細管先端部から吸引する手法
104 102あるいは103の手法により形成された先端部内液部の顕微鏡拡大図
105 吸引操作を簡単にする為に吸引装置への簡易結合部を一部に形成したナノスプレーイオン化細管
106 105と吸引ピストンシリンジ(41)あるいは吸引ポンプを振動を伝えないで結合するチューブセットの1例
107 105により試料吸引・イオン化溶媒添加後、ナノスプレーイオン化細管による質量分析計への試料導入をするための装置の1例(クランプ式)
108 ステロイド処理前の細胞のフラクション毎のマススペクトル(3次元表示)
109 ステロイド処理後の細胞のフラクション毎のマススペクトル(3次元表示)
110 108と109のスペクトル群から差分を取り、処理前から減少したピーク群をt-検定法(群への属性の統計的評価)で調べたもの。95%処理前に特異的なピーク群の一覧
111 108と109のスペクトル群から差分を取り、処理後増加したピーク群をt-検定法(群への属性の統計的評価)で調べたもの。95%処理前に特異的なピーク群の一覧
112 111で見つかったm/z302.3のピークが、ステロイド処理前の場合のどこで見つかったか、処理前のTIC(総イオンクロマトグラフィー)中の見つかった位置の表示
113 その時のMSスペクトル(ピークは小さい)
114 113の拡大図
115 111で見つかったm/z302.3のピークが、ステロイド処理後の場合のどこで見つかったか、処理前のTIC中の見つかった位置の表示
116 その時のその時のMSスペクトル(ピークは大きい)
117 t-検定の図(処理後に増加していることが分かる)
118 m/z 302.3のピークのMS/MSスペクトル
119 データバンクにあるDihydrosphingosine標準のMS/MSスペクトル
120 Dihydrosphingosineの構造
121 m/z302.3のピーク強度と、そのレスポンス関数(時間変数)との合致性を調べる回帰分析(この関数に則って変化していることを裏付ける)
122 7種の細胞タイプの1細胞質量スペクトルとその主成分解析によるスコアープロット
123 122における各スペクトルピークの主成分解析によるローディングプロット
124 本手法のデータ処理システムの作業内容と連携図
125 液漏れとめO−リング
126 加圧ポンプ
127 ナノLCポンプ
128 ナノLC用サンプルインジェクター
129 ナノLC用分離(前処理濃縮カラムも可能、あるいは両者の連結も可能)
130 ナノLC用検出器
131 ナノLC用ナノスプレーエミッター
132 ナノインジェクション加圧シリンジ
133 1細胞マイクロ分離チップ
134 1細胞成分分離用マイクロチャンネル(ゲルや樹脂が入っていても良い)
135 1細胞成分濃縮泳動ゾーン
136 試料導入口
137 電極槽
138 ナノスプレー用導電部
139 1細胞マイクロ分離キャピラリー
140 異なる状態の細胞によるナノ分離例(a)ステロイド処理前 (b)ステロイド処理後
141 それぞれで得られたMS部分スペクトル
142 細胞培養を兼ねた細胞成分解析用ウエル
143 細胞培養液
144 細胞捕捉用フィルター
145 導電コーティングされたあるいは導電性の底部と中心突起管部
146 細胞液溶出イオン化溶媒あるいはそれぞれをステップを追って注入
147 細胞内成分溶出イオン化溶液
148 セプタム膜(仕切り膜)
149 ナノスプレー針(142のウエル底に突き刺し、セプタム膜(148)を破り、細胞内成分溶出イオン化溶液をナノスプレーする導電性細管)
150 細胞培養を兼ねた細胞成分解析用ウエルプレート
151 送液ポンプ
152 シースフロー用送液ポンプ
153 シースフロー
154 原子吸光あるいはICPプラズマ導入用ネブライザー
155 セルソーターの細胞検出部
156 セルソーター検出部レーザー光源
157 レーザー光源ストッパー
158 前方レーザー小角散乱光
159 前方レーザー小角散乱光検出器
160 セルソーター内を1ヶずつ流れる細胞
161 シースフロー
162 先端荷電電極
163 荷電された液滴に細胞1ヶが入っている
164 タイミングパルサー駆動装置
165 1細胞含有荷電液滴を形成するための高圧パルス(細胞の特性検出結果に基づいて+あるいは−あるいは無荷電とする)
166 落ちてくる細胞含有荷電液滴のタイミングに合わせて、ポジティブ高圧パルスあるいはネガティブ高圧パルスをパルスナノスプレーあるいはパルス電極あるいはパルスレーザーに信号として送る
167 イオン化溶媒のパルスナノスプレー装置
168 空間パルス電場印加用電極
169 パルスイオン化レーザー
170 細胞含有液滴がパルス波により微細な液滴になって、質量分析計に導入される
171 +荷電細胞含有液滴の落下タイミングに合わせたポジティブ高圧パルス
172 ポジティブモード専用質量分析計
173 −荷電細胞含有液滴の落下タイミングに合わせたネガティブ高圧パルス
174 ネガティブモード専用質量分析計
175 +荷電細胞含有液滴がパルス波により微細な+荷電液滴に
176 −荷電細胞含有液滴がパルス波により微細な−荷電液滴に
177 セルソーター
178 セルソーターおよび質量分析計の制御・データ解析システム
179 セルソーターによるスキャタグラムおよびデンシティーグラムなどのモニター
180 質量分析計から同時に得られた主成分解析結果およびMSスペクトル表示モニター
181 パーソナルコンピューター
182 血球のスキャッタグラム
183 リンパ球のみを選んで、蛍光マーカーのデンシトグラム
184 選ばれたリンパ球のポジティブモードでのMSスペクトルから割り出された主成分解析結果(3つのグループがあることがわかる)
185 主成分解析でグループ分けされた3群のそれぞれのMSスペクトル
200 アレルギー細胞のアレルギー応答における顆粒放出の瞬間のビデオ顕微画像(下は明視野像で捉えたもので矢印の顆粒が下右図では消失している、上は顆粒内に蛍光物質を取り込ませてその消失を見たもの、矢印の顆粒(左)が消失している(右))
201 図200下図の様な明視野像のビデオ画像連続差像解析図の一つ、顆粒消失の瞬間の画像内で動きのある顆粒のみが差像で抽出されている。
202 図201の様な画像解析により、顕微鏡視野内の同じ条件の細胞の顆粒のはじた数の経時変化を調べた図
203 RBL−2H3細胞の顆粒1ヶに含まれる成分の質量スペクトル
204 RBL−2H3細胞1ヶの細胞質に含まれる成分の質量スペクトル
205 RBL−2H3細胞の顆粒1ヶに含まれる成分の内、m/z 112(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
206 RBL−2H3細胞の顆粒1ヶに含まれる成分の内、m/z 156(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
207 RBL−2H3細胞の顆粒1ヶに含まれる成分の内、m/z 177(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
208 RBL−2H3細胞1ヶの細胞質に含まれる成分の内、m/z 177(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
209 RBL−H3細胞1ヶの細胞質に含まれる成分の内、m/z 205(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
210 RBL−2H3細胞1ヶの細胞質に含まれる成分の内、m/z 221(下にt−値記載)付近のスペクトル拡大図
211 RBL−2H3細胞1ヶに含まれる成分の内、m/z 156のピークに対するMS/MSスペクトル
212 RBL−2H3細胞1ヶに含まれる成分の内、m/z 112のピークに対するMS/MSスペクトル
213 RBL−2H3細胞1ヶに含まれる成分の内、m/z 205のピークに対するMS/MSスペクトル
214 RBL−2H3細胞1ヶに含まれる成分の内、m/z 221のピークに対するMS/MSスペクトル
215 RBL−2H3細胞1ヶに含まれる成分の内、m/z 177のピークに対するMS/MSスペクトル
216 本発明による1細胞分析から得られた細胞内でのトリプトファン代謝物とヒスチジン代謝物の細胞内局在の模式図
217 本発明による1細胞および1顆粒直接分子解析で得られたヒスチジン代謝物の1顆粒内での代謝マップ
218 RBL−2H3細胞をカルシウムイオノフォアで刺激した時の顆粒放出の画像
219 RBL−2H3細胞をカルシウムイオノフォアで刺激した時、細胞外成分を捕獲した時のスペクトル
220 219において、ヒスタミンのピーク付近の拡大図とヒスタミンの構造式
223 P19細胞のレチノイン酸による細胞分化誘導前の形態と1細胞試料採取
224 P19細胞のレチノイン酸による細胞分化誘導後の神経分化細胞の形態とそこからの選択的1細胞試料採取
225 P19細胞のレチノイン酸による細胞分化誘導前の1細胞質量スペクトル
226 P19細胞のレチノイン酸による細胞分化誘導後の1細胞質量スペクトル
227 上記分化誘導前後で、分化後に特異的なt−値を示すピークのm/zとt-値
228 227のスペクトルピークのMS/MSスペクトルと同定分子構造
229 上記m/z118.1ピーク強度の分化ステップ依存性
230 HepG2の1細胞採取ビデオ観察画像
231 薬物キナクリンの薬物代謝過程
232 1細胞で捉えられたキナクリンの薬物代謝物のスペクトル
233 耳たぶから刺入針を使った血液1滴採取
234 刺入針(金属製)
235 血液
236 添加したイオン化補助溶媒
237 血液直接採取後の本発明による質量スペクトル測定結果
238 比較のためイオン化補助溶媒のみのスペクトル
239 植物(ゼラニウム)葉の顕微鏡拡大図と1細胞直接試料詐取の様子
240 植物(ゼラニウム)葉1細胞直接試料詐取による本発明により検出した質量スペクトル
241 植物(ゼラニウム)茎の顕微鏡拡大図と1細胞直接試料詐取の様子
242 植物(ゼラニウム)茎1細胞直接試料詐取による本発明により検出した質量スペクトル
243 t−検定による葉特異的ピークと茎特異的ピークの探索表
244 葉および茎でのm/z178の局在の様子
245 葉および茎でのm/z311の局在の様子
246 安定同位体導入ヒスチジン
247 安定同位体導入ヒスチジン含有培地で放置したラット肥満細胞の質量スペクトル
248 ヒスチジンとその同位体ピーク(安定同位体注入後1分)
249 ヒスチジンとその同位体ピーク(安定同位体注入後10分)
250 ヒスチジンとその同位体ピーク(安定同位体注入後60分)
251 ヒスチジン代謝物の一つヒスタミンとその同位体ピーク(安定同位体注入後1分)
252 ヒスチジン代謝物の一つヒスタミンとその同位体ピーク(安定同位体注入後10分)
253 ヒスチジン代謝物の一つヒスタミンとその同位体ピーク(安定同位体注入後60分)
254 溶媒経路細線を中にもつナノスプレーイオン化細管(細管)による1細胞試料測定時のトータルイオンクロマトグラフィー(TIC)
255 溶媒経路細線のない市販ナノスプレーイオン化細管(細管)による1細胞試料測定時のトータルイオンクロマトグラフィー(TIC)
256 先端に補足された細胞成分液の中で、添加イオン化補助溶媒により沈殿した高分子成分から低分子成分がイオン化補助溶媒のスプレーによる先端への移動とともに抽出溶離されて行く様子
257 先端に補足された細胞成分液の中で、先端内面の分子親和基に補足されていた分子成分がイオン化補助溶媒のスプレーによる先端への移動とともに抽出溶離されて行く様子
258 先端に補足された細胞成分液の中で、先端に配置された樹脂表面の基との分子親和性で補足されていた分子成分がイオン化補助溶媒のスプレーによる先端への移動とともに抽出溶離されて行く様子
259 印加する高圧直流電圧
260 印加する高圧パルス電圧
261 印加する高圧直流バイアスに重なった正弦波電圧
262 印加する高圧直流バイアス重なった矩形波電圧
263 印加する高圧直流バイアスに重なったのこぎり波電圧
264 MALDI−TOF用サンプルプレート
265 1細胞内成分液のスポットあるいはナノスプレースポッティングの後、レーザー脱離イオン化用マトリックス溶液の添加
266 1細胞成分のMALDI−TOF質量スペクトル
Claims (21)
- 細胞の動態を観察しながら、前記細胞を構成し又は前記細胞から出された細胞成分を採取してリアルタイムに質量分析する方法であって、
顕微鏡を用いて細胞の動態を観察することに並行して、前記細胞の特定の領域又は前記細胞から出された細胞成分の特定の領域に対して、先端部が前記特定の領域の大きさ以下の口径であるナノスプレーイオン化細管を挿入するステップと、
前記特定の領域内の細胞成分を前記ナノスプレーイオン化細管の先端部から採取して前記先端部に留める採取ステップと、
イオン化補助溶媒を前記ナノスプレーイオン化細管の後端側から導入するステップと、
質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加することにより、前記細胞成分をナノスプレーイオン化して前記質量分析装置に試料として導入するステップと、
前記質量分析装置において試料として導入された前記細胞成分を質量分析するステップとを備えた方法。 - 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部は、0.1から100μmの口径である請求項1に記載の方法。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の内面又は外面の少なくとも一方は、導電性であり、又は、
前記ナノスプレーイオン化細管の後端側から前記ナノスプレーイオン化細管の先端部へ延びる導電性細線を備えている請求項1又は2に記載の方法。 - 脂溶性を内部に持つ細胞膜を隔壁として持つ細胞を分析対象とする場合、前記ナノスプレーイオン化細管の外面は、疎水性であり、
親水性素材で形成された細胞膜や細胞壁を隔壁として持つ細胞を分析対象とする場合、前記ナノスプレーイオン化細管の外面は、親水性である請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。 - 前記ナノスプレーイオン化細管の前記先端部の内面は、分子特異的な捕捉を行うように分子親和基を結合させた構造になっている請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部が観察中の細胞に近づくまでの間に、細胞培養液を含む周辺成分が前記先端部に混入しないように前記ナノスプレーイオン化細管内部を外側から加圧し、前記ナノスプレーイオン化細管の先端部が観察中の細胞に到達した後に、前記加圧を解除し、前記先端部から質量分析の対象となる細胞成分を吸引により採取する請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。
- 液体含有組織に形成された穴から細胞内又は組織内成分を漏出させることにより質量分析の対象となる細胞成分を前記先端部から採取する請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部の3次元位置を制御するマニュピレータであって、前記ナノスプレーイオン化細管の後端側に取り付けられた状態で観察対象の細胞と前記質量分析装置との間に配置されるマニュピレータを備え、
前記マニュピレータは、前記細胞成分の採取時には、観察している細胞の質量分析の対象となる採取位置まで前記先端部を誘導し、前記質量分析装置への前記細胞成分の導入時には、前記質量分析装置の試料導入口へ前記先端部を誘導する請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。 - 前記採取ステップは、
空間的位置が異なる複数の細胞成分、細胞の経時的変化ごとの細胞成分、又は細胞に対して複数の異なる処理を行ったときの細胞の処理前と処理後の細胞成分を、前記ナノスプレーイオン化細管の先端部から採取し、
前記質量分析するステップは、
空間的に、経時的に、又は処理前後で異なる複数の細胞成分の各々の質量スペクトルを導出し、導出された各々の質量スペクトル間の差を抽出することにより、顕微鏡により観測された細胞の中での空間的及び時間的な相違に関連する分子を評価ないし特定することを含む請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。 - 前記質量分析するステップは、
既知の質量スペクトルを予めコンピュータに記憶し、
試料として導入された細胞成分の質量スペクトルをナノスプレーイオン化中に導出し、
前記細胞成分の前記質量スペクトルと前記既知の質量スペクトルとの差を抽出して前記細胞成分を解析し、
質量フィルタにより抽出された前記細胞成分内の特定の分子に対して高次の質量分析を実行することにより、分子を同定することを含む請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。 - 細胞の動態を観察しながら、前記細胞を構成し又は前記細胞から出された細胞成分を採取してリアルタイムに質量分析するシステムであって、
質量分析の対象となる細胞成分を含む細胞の動態を観察するための顕微鏡と、
前記細胞の特定領域の細胞成分を採取するために前記特定領域の大きさ以下の口径である先端部とイオン化補助溶媒を導入するための後端部とを有するナノスプレーイオン化細管であって、質量分析の対象となる前記細胞成分をイオン化することが可能なナノスプレーイオン化細管と、
試料導入口を有し、試料として導入されたイオン化後の細胞成分を質量分析する質量分析装置と、
前記質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加する電場印加部とを備え、
顕微鏡で観察している細胞内に侵入して特定の領域の細胞成分を前記ナノスプレーイオン化細管の先端部から採取すると共に前記ナノスプレーイオン化細管の後端側からイオン化補助溶媒を導入するように構成されており、前記質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加することにより、前記質量分析装置に前記細胞成分をイオン化して試料として導入して質量分析するシステム。 - 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部は、0.1から100μmの口径である請求項11に記載のシステム。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の内面又は外面の少なくとも一方は、導電性であり、又は、
前記電場印加部は、前記ナノスプレーイオン化細管の後端部から前記ナノスプレーイオン化細管の先端部へ延びる導電性細線を備えている請求項11又は12に記載のシステム。 - 脂溶性を内部に持つ細胞膜を隔壁として持つ細胞を分析対象とする場合、前記ナノスプレーイオン化細管の外面は、疎水性であり、
親水性素材で形成された細胞膜や細胞壁を隔壁として持つ細胞を分析対象とする場合、前記ナノスプレーイオン化細管の外面は、親水性である請求項11から13のいずれか1つに記載のシステム。 - 前記ナノスプレーイオン化細管の前記先端部の内面は、分子特異的な捕捉を行うように分子親和基を結合させた構造になっている請求項11から14のいずれか1つに記載のシステム。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部が観察中の細胞に近づくまでの間に、細胞培養液を含む周辺成分が前記先端部に混入しないように、前記ナノスプレーイオン化細管は、内部が外側から加圧され、前記ナノスプレーイオン化細管の先端部が観察中の細胞に到達した後に、前記加圧が解除され、前記先端部から質量分析の対象となる細胞成分を吸引により採取するようになっている請求項11から14のいずれか1つに記載のシステム。
- 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部の3次元位置を制御するマニュピレータであって、前記ナノスプレーイオン化細管の後端側に取り付けられた状態で観察対象の細胞と前記質量分析装置との間に配置されるマニュピレータをさらに備え、
前記マニュピレータは、細胞成分の採取時には、観察している細胞内の質量分析の対象となる細胞成分の位置まで前記先端部を誘導し、前記質量分析装置への前記細胞成分の導入時には、前記質量分析装置の試料導入口へ前記先端部を誘導する請求項11から14のいずれか1つに記載のシステム。 - 前記ナノスプレーイオン化細管の先端部は、
空間的位置が異なる複数の細胞成分、細胞の経時的変化ごとの細胞成分、又は細胞に対して複数の異なる処理を行った場合における細胞の処理前と処理後の細胞成分を採取し、
前記質量分析装置は、
空間的に、経時的に、又は処理前後で異なる複数の細胞成分の各々の質量スペクトルを導出し、導出された各々の質量スペクトル間の差を抽出することにより、顕微鏡により観測された細胞の中での空間的及び時間的な相違に関連する分子を評価ないし特定する請求項11から14のいずれか1つに記載のシステム。 - 前記質量分析装置は、
既知の質量スペクトルを予めコンピュータに記憶し、
試料として導入された細胞成分の質量スペクトルをナノスプレーイオン化中に導出し、
前記細胞成分の前記質量スペクトルと前記既知の質量スペクトルとの差を抽出して前記細胞成分を解析し、
質量フィルタにより抽出された前記細胞成分内の特定の分子に対して高次の質量分析を実行することにより、分子を同定することを含む請求項11から14のいずれか1つに記載のシステム。 - 細胞を構成する細胞成分を採取すると共に質量分析のために前記細胞成分をナノスプレーイオン化することが可能なナノスプレーイオン化細管であって、
口径が前記細胞内の特定領域以下の大きさである先端部と、
イオン化補助溶媒を導入するための後端部と、
前記ナノスプレーイオン化細管内部で先端まで延びる溶媒親和性表面を持つ溶媒経路細線とを備え、
前記ナノスプレーイオン化細管の外面は疎水性であり、
前記先端部の外面もしくは内面の少なくとも一方は導電性であるか、又は、導入されたイオン化溶媒まで後端側から内部に延びる導電性細線が挿入可能であり、質量分析装置との間に電界を印加できるように構成されているナノスプレーイオン化細管。 - 生体組織を構成する細胞成分を採取して質量分析する方法であって、
先端部が前記細胞の大きさ以下の口径であるナノスプレーイオン化細管の前記先端部を前記細胞に差し込むステップと、
前記細胞の細胞成分を試料として前記ナノスプレーイオン化細管の先端部から採取するステップと、
前記細胞成分を前記ナノスプレーイオン化細管の先端部に溜めた状態で、イオン化補助溶媒を前記ナノスプレーイオン化細管の後端側から導入するステップと、
質量分析装置の試料導入口と前記ナノスプレーイオン化細管との間に電場を印加することにより、前記細胞成分をイオン化して前記質量分析装置に試料として導入するステップと、
前記質量分析装置において試料として導入された前記細胞成分を質量分析するステップとを備えた方法。
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