CN102037351A - 分离并离析细胞、囊泡、纳米颗粒和生物标记的离体多维系统 - Google Patents

分离并离析细胞、囊泡、纳米颗粒和生物标记的离体多维系统 Download PDF

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Abstract

公开了装置与技术，它们涉及多维动电、介电电泳、电泳和流体力和作用的结合以供在高传导率(离子)强度的生物样品和缓冲液内分离细胞、纳米囊泡、纳米粒状物和生物标记(DNA、RNA、抗体、蛋白质)。在所公开的实施方案中，连续和/或脉冲的介电电泳(DEP)力，连续和/或脉冲的场DC电泳力，微电泳和受控流体的结合与电极阵列一起使用。特别地，使用具有腔室的DEP装置和合适地成比例的相对较大电极阵列装置(它结合流体、电泳和DEP力)使得能更加直接、快速和有效地分析较大和/或临床相关体积的血液、血清、血浆或其他样品。本发明能产生“无缝”的取样-反馈诊断系统和装置。所述的装置和技术也可进行分子、聚合物、纳米组分和中等规模实体辅助自组装成三维较高阶的结构。

Description

分离并离析细胞、囊泡、纳米颗粒和生物标记的离体多维系统
相关申请的交叉参考
本申请要求2008年4月3日提交的标题为“Ex-Vivo Multi-Dimensional System for the Separation and Isolation of Cells，Vesicles，Nanoparticles and Biomarkers”的美国临时申请No.61/042228的权益，其公开内容在此通过参考全文引入。
关于在联邦资助研究和开发下进行的发明的权利的声明
这一研究工作得到NIH Grant/Contract CA119335支持。美国政府可在本发明中具有一定的权利。
发明背景
在生物分子研究和临床诊断中，重要且具有挑战的是分离并鉴定在复杂流体样品，例如血液、血浆、血清、唾液和尿液内的稀有细胞、细菌、病毒和生物标记(例如DNA、RNA、抗体、其他蛋白质等)。另外，生物纳米技术的来临导致许多药物传输方法，所述方法涉及包封药物和成象试剂在纳米囊泡和纳米颗粒内。这些方法意味着同样重要的是鉴定并分离保留在血液流体内的残留的纳米囊泡和纳米颗粒。各种物理、电子和生物技术和装置可用于从复杂样品，例如血液中样品分离和离析特定细胞、纳米囊泡和生物分子。这些技术和装置包括离心、凝胶过滤、亲和结合、DC电泳和掺入到芯片实验室内的各种结合物，微流体装置，和采样-反馈(sample-to-answer)系统。
许多这些常规技术(或其结合)是相对耗时的工艺，它们不是没有问题和局限性。特别地，离析稀有细胞(癌细胞、胎细胞和干细胞)，数量少的细菌和病毒或数量非常少的特异性抗体、蛋白质、酶、DNA和RNA分子仍然困难。在临床诊断情况下，稀有细胞和生物标记的检测也可受到样品大小的局限，即从非常虚弱的患者、老年人和婴儿中可抽取仅仅相对小量的血液。因此，低效或要求高度稀释初始样品的制样过程常常不能或无法可靠地在较低浓度范围内离析细胞和其他与疾病有关的标记。对于早期检测癌症、残余(residual)疾病、在母亲血液内的胎儿细胞/DNA/RNA，和在血液内检测细菌和病毒(脓毒性感染)，以及检测数量少的病原体(例如细菌、病毒等)和在大体积的空气、水中或食品内的生物恐怖试剂检测来说，这尤其是问题。
交流电的动电技术涉及使用AC场掌控(manipulate)细胞和纳米颗粒，该技术提供一些特别吸引人的装置来分离细胞[参见参考文献2-5]，生物标记(DNA[参考文献5-8]，蛋白质[参考文献9]和最终药物传输的纳米囊泡[参考文献10]。这些技术可分成三种不同的现象：(1)AC电渗，它是由于在电极上的表面电荷导致的表面流体流动；(2)电热流，它是由于电场产生的热梯度导致在溶液内的整体(bulk)流动；和(3)介电电泳(DEP)，它是在AC电场内颗粒和介质之间的电介质差产生的颗粒的诱导运动[参考文献10]。遗憾的是，DEP和相关的动电效应的大多数常规形式的问题是，限制了这些技术用于临床相关制样和诊断中的有效性。
首先，就速度和选择性控制来说，有效的DEP分离通常必须在数量级为＜10-100mS/m的相对低的传导率下进行[参考文献11]。另外，当溶液的离子强度增加和传导率大于10mS/m时，在正或DEP高场区域内(通常在电极周围或电极上)离析所需实体/分析物，例如纳米颗粒或DNA生物标记的能力更加困难。因此，离子强度在100-200mM范围内的生物样品，例如血液或血浆(传导率：～500-1000mS/m)在DEP分离之前，必须显著大地稀释和/或加工[参考文献13、14]。仅这一点就常常限制了涉及检测稀有细胞或数量少的生物标记的DEP临床诊断的有用性。在其中样品(1ml血液)必须稀释100-1000倍的情况下，意味着必须加工非常大的样品体积，这可能是极其耗时的。若首先通过物理装置，例如离心或过滤浓集细胞，然后在低传导率的缓冲液内稀释，则这些方法不仅耗时，而且高成本，并引起对样品的显著干扰。在其中DEP可用于干细胞分离的情况下，稀释到低的离子强度的较少生理类型的缓冲液可导致敏感干细胞的干扰，且可影响它们进一步的分化。从血液中离析DNA、RNA和蛋白质生物标记对于将来临床诊断，尤其监控癌症的化疗[参考文献15]、后遗疾病[参考文献16]和早期诊断癌症[参考文献17]也是重要的。
尽管DEP用于分离DNA和蛋白质，但在使用DEP进行血液内DNA检测中确实存在问题和局限性。第一个问题还是，在DEP分析之前，需要稀释和/或加工血液样品。在临床相关的无细胞循环血液内DNA和RNA生物标记的情况下，重要的是发现并测量DNA/RNA的含量，其大小和基本组成(突变和多态现象)[参考文献17-19]。涉及或要求离心、过滤和洗涤工序的样品加工，由于在该过程中正常细胞受损或溶解，这可引起DNA分子释放以及临床相关的DNA剪切成较小的碎片。胞外DNA片段的释放和加工损坏临床相关的DNA大大地牺牲并限制了使用这些工序的诊断价值。这一样品加工也是高度低效的，多达60％血液内的DNA且超过90％的RNA可在该工序过程中损失[17]。
第二个问题是，用于DNA、蛋白质和纳米颗粒分离的大多数DEP分离装置或者使用多项金微电极(由在电极之间非常小的距离，小于或等于6微米，产生的)充当颗粒阱；或者使用在它们之间隔开6-8微米或更少的城堡状金微电极阵列[参考文献18-19]。通常通过溅射金到玻璃基底材料上，制备这些金微电极阵列装置。还存在涉及使用纳米电极的许多DEP方法[20]。这些方法的问题是阵列固有地具有低的流通量，因为捕获DNA或其他生物分子的实际空间相对小，且当离纳米电极的距离增加(例如，＞10nm)时，电场效应显著下降，若这类装置放大用于制样(例如，加工1-10ml血液)，则可通过电极附近有限的DEP场询问(interrogate)的实际样品面积意味着大多数DNA会漏失，或者要求极长的样品加工时间。若设计装置以限制流体在纳米电极的数十纳米以内流动，则加工时间极长，或者要求大规模(x-y维度)的装置。存在各种其他问题，其中包括由于其他动电效应和渗滤力导致不受控制的流体旋涡流动。在其他DEP应用中，使用圆形铂微电极(50微米-80微米的直径)和约200微米的间隔并用多孔水凝胶罩面涂布的阵列还用于进行从血液中DEP分离细菌，和分离癌细胞[参考文献13、14]。再者，对于这些DEP分离来说，离心血液样品并将小部分的细胞再悬浮在低离子强度的缓冲液内[参考文献13、14、24-26]。
AC动电技术的第三个一般问题是，所得灵敏度vs特异性之比常常没有足够高到可进行重要或临床相关的分离。对于使用介电电泳(DEP)的细胞分离来说，难以在百万分之一的比值下进行有效的稀有细胞分离。由于许多早期疾病诊断要求稀有细胞或低含量生物标记的检测，因此重要的是能尽可能改进灵敏度vs特异性之比。一般地，大多数DEP装置没有合适地成比例放大，以应对稀有细胞或低水平生物标记的离析和检测的临床现实性，其中对于简单的统计原因来说，可能需要1-10ml血液的相对大的样品。当设计用于大样品的DEP装置时，它们通常低效，且不能在高传导率条件下操作，因此要求进一步的样品稀释。
AC动电技术的第四个问题是在复杂的生物样品(例如血液、血浆、血清等)内进行分析物和生物标记的有效和高度选择分离方法，所述分析物和生物标记包括稀有细胞、细菌、病毒、DNA、RNA和蛋白质，其中所有实体可具有尺寸范围2-3个数量级的大小差别，且仍然需要实现大小和组成更加类似的各实体之间的有效分离。一个重要的实例是分离DNA纳米颗粒(20-50kb)，高分子量DNA(5-20kb)，中间分子量DNA(1-5kb)和较低分子量DNA(0.1-1kb)。
AC动电(DEP)装置和技术的最后和最严重的问题是引入电化学，其中在较高传导率溶液内(＞100mS/m)，在较低AC频率下(＜20kHz)，和在较高电压下(＞20V pt-pt)，所述问题变得更加突出。正如这一文献的详细说明部分所示，这一电化学可引起许多副作用，其中包括起泡、加热、流体湍流、电极劣化和活泼的分析物破坏。这些副作用大大地限制了总的DEP装置的性能，阻止在DEP高场区域内特定实体(细胞、纳米颗粒、DNA和蛋白质)的蓄积、分离和检测，并干扰在DEP低场区域内细胞和分析物离析。
使用其他类型的AC动电装置分离细胞和纳米颗粒，但在高传导率溶液中没有证明是可行的。关于AC动电和DEP装置不可行的最具有说服力的争论之一是下述事实：与DC电泳(它宽泛地用于生物研究和临床诊断)不同，DEP无法用于任何实际应用中。期望进行具有高性能特征的介电电泳，它允许在高传导率生物样品和缓冲液内分离。
发明概述
本发明的实施方案涉及新型的样品制备，取样-反馈和关注点系统、装置、方法和技术，它们涉及多维AC动电和介电电泳(DEP)、DC电泳、装置上(on-device)的微电泳和流体技术的独特结合以供分离和鉴定稀有细胞、细菌、病毒、药物传输纳米囊泡和纳米颗粒，细胞的细胞器和结构(核、线粒体、液泡、叶绿体、cylomicrons等)，无细胞的循环DNA/RNA生物标记和其他与疾病有关的细胞纳米颗粒(例如，被癌细胞、疾病或受损细胞释放到血液、淋巴或器官内的部分降解的细胞组分)、抗体、抗体复合物(complex)、蛋白质、酶和直接在血液或其他生物样品或缓冲液内的药物以及治疗剂。在所公开的实施方案中，借助掺入具有覆盖多孔结构的坚固电极(微尺寸和/或大尺寸)的阵列的新型隔室(chambered)装置和其他装置，使用连续和/或脉冲动电/介电电泳(DEP)力，连续和/或脉冲场DC电泳力，装置上微电泳尺寸分离和受控的流体流动(外部泵送和/或DC/AC动电驱动)的结合，其中使用所述多孔的覆盖结构，进行复杂的样品分离，生物分子分离和诊断分析。
本说明书首先公开了新型的动电DEP装置和系统，其中将电极置于单独的腔室内，并通过使AC DEP场穿过孔隙或孔穴结构，在内部腔室内，产生正DEP区域和负DEP区域。可使用各种几何形状，形成所需的正DEP(高场)区域和DEP负(低场)区域以用于携带细胞、纳米颗粒和生物标记分离。这种孔隙或孔穴结构可包含多孔材料(水凝胶)(或用其填充)，或者可覆盖有多孔膜类结构。通过将电极分隔成单独的腔室，这种孔隙/孔穴结构的DEP装置基本上消除了在DEP工艺过程中在内部分离腔室内的任何电化学作用，加热或无序的流体运动(参见图1和图2)。
本说明书还公开了坚固电极的成比例放大的部分(sectioned)(x-y维度)阵列和有策略地放置(x-y-z维度)的辅助电极布局的用途，它们结合了DEP、电泳和流体力，以便可在较高离子强度/传导率条件下更加直接分析临床相关体积的血液、血清、血浆或其他样品。本说明书公开了用一层或更多层多孔材料层(天然或合成的多孔水凝胶、膜、受控的纳米孔隙材料和薄的电介质层状材料)覆盖坚固的电极结构(例如，铂、钯、金等)，减少在电极上或其附近的任何电化学(电解)反应的作用，加热和无序的流体运动，并仍然允许有效地分离细胞、细菌、病毒、纳米颗粒、DNA和其他生物分子(图3-8)。除了使用AC频率交叉点实现较高分辨率分离以外，也可使用装置上(阵列上)的DC微电泳以供辅助分离。例如，分离DNA纳米颗粒(20-50kb)，高分子量DNA(5-20kb)，中间分子量DNA(1-5kb)和较低分子量DNA(0.1-1kb)碎片(图9-12)。装置可再分部(sub-sectioned)的事实意味着可在这一装置上同时进行不同血液细胞、细菌和病毒和DNA的顺流分离(图13-16)。
本发明的实施方案还涉及使用温度控制以提供更加选择和有效的细胞分离(例如癌细胞和干细胞)。在一个方面中，本发明的实施方案因此涉及体外制样，无缝取样-反馈，芯片实验室和关注点(POC)诊断系统，它可用于监控和/或分析血液中的癌细胞、细菌、病毒、纳米囊泡(药物传输)、纳米颗粒、高分子量DNA纳米颗粒、细胞的细胞器、蛋白质、抗体和抗体复合物，以及疾病和新陈代谢状态的各种其他临床相关的生物标记。这种离体系统和装置可通过AC电场监控或扫描血液，并分离、离析、高度浓集、检测分析物和临床相关实体。可使用该系统选择收集这些实体以供更加复杂的分析，其中包括，但不限于免疫化学；DNA/RNA探针杂交；聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增技术(SDA)和用于基因分型(genotyping)、序列分析、基因表达的其他技术，所有这些都在相同的样品腔室内(无缝的取样-反馈)，或者借助相关的分析装置和/或收集系统。根据本发明构造的新型装置可以是关注点(POC)无缝取样-反馈系统，它允许在未稀释的血液样品上快速地进行快速分子诊断。本发明的另一新型装置可以是离体癌症化疗监控系统，其允许从患者中截流(shunt)血液，快速分析(测量生物标记DNA、药物或药物传输纳米囊泡水平和离析癌细胞)，然后在最小稀释或物理/化学干扰样品的情况下，返回到患者体内(借助闭合回路)。这种离体系统也可用于监控其他治疗、疾病和患者处置，尤其在紧急的护理情形下。
与大多数以前的DEP分离所使用的那些相比，所公开的体现本发明的系统、装置、方法和技术允许在较高传导率(＞100mS/m)离子强度条件下，在较低AC(DEP)频率(＜20kHz)下，和在较高场强(＞20V pk-pk)下进行细胞、纳米颗粒和生物标记实体的分离。更具体地，不仅可在较高离子强度条件下，而且可直接在复杂的生物样品，包括血液、血浆、血清和未稀释的缓冲液内进行DEP分离，其中可在DEP高场区域内离析纳米级(500纳米-5纳米)分析物和实体，而可在电极之间的DEP低场区域内离析较大的实体(细胞、微粒等)。
新的装置减轻了使用城堡状DEP电极阵列(它是目前分离纳米颗粒和生物分子的优选方法)发生的电化学、加热和无序流动的作用。在另一方面中，装置和方法可使用在分部阵列中坚固的多电极的更加宏观规模的布局，它不仅允许更加快速和有效地询问较大的样品体积，而且基本上允许数量非常少的癌细胞、细菌、病毒、纳米颗粒和纳米粒状物和非常低浓度的DNA、RNA生物标记和抗体复合物从含非常大数量正常细胞的复杂样品，即血液中离析。基本上使用“合适地成比例放大”的电极的宏观系统改变了在百万个细胞中寻找一个特定细胞(或其他实体)的方法成为在一千个细胞中寻找一个特定细胞的方法，即在许多子组的电极上铺开样品，从而产生平行的归档的分选装置。这一分离方法可应用于处理血液，并从蛋白质以及细胞中除去较小尺寸的DNA、RNA和较高分子量的DNA。电极尺寸(10-100微米直径，和隔开20-100微米)和使用较少稀释的样品的能力的结果是，可在成比例放大的阵列装置(它具有2-100个阵列分部)中，以快速和高流通量的方式完成分离过程，其中所述阵列中的每一分部可含有100-1000个单独的电极。该装置还引入在x-y-z维度上有策略地放置的辅助电极。
此处所述的实施方案表明，可使用所公开的阵列装置和系统，在较低频率范围内(10-50kHz)，基于直径小于或等于约500纳米的每一纳米粒状物固有的Clausius Mossotti因子效应(以及其他AC动电现象)，从较大尺寸的实体(细胞和微米尺寸的颗粒)中分离出纳米颗粒和细胞的纳米粒状物。本说明书还公开了当在联合流体流动中使用AC动电效应时，该方法将释放过量的热累积。本说明书进一步公开了当流体流动和DC电泳与AC动电效应结合时，细胞和蛋白质二者可有效地向下游移动到所示装置的下部阵列部分，而高度荷负电的DNA纳米粒状物和DNA分子可在装置上部的阵列部分的上游浓集。因此，可使用所述装置的不同阵列部分，进行更加选择性的分离方法，例如多通路进行红细胞、白细胞，癌细胞分离；在下部阵列部分上除去蛋白质；在中间阵列部分内分离细菌、病毒、纳米颗粒和纳米囊泡；和在该装置的上部阵列部分上分离DNA纳米粒状物和DNA分子。
最后，本说明书还公开了具有分离电极腔室和孔隙/孔穴结构，从而导致独立的分离腔室的装置，以及用纳米多孔材料(1纳米到1毫米厚度)覆盖的坚固电极阵列装置，它们可用于进行同时或随后的辅助尺寸分离过程。例如，若可使用所述装置的上部阵列部分浓集DNA组分中的复杂混合物，则可使用AC动电效应和DC电泳力的结合，实现DNA纳米粒状物从高分子量DNA(5-50kb)，中间分子量DNA(1-5kb)和较低分子量DNA(0.1-1kb)中二级分离。另外，所述实施方案允许在纳米多孔层内使用DC微电泳，进行各种DNA片段的尺寸分离。
附图简述
图1示出了新型的动电DEP装置，其中将电极置于单独的腔室内，并通过流经孔结构，在内部腔室内产生DEP场。
图2示出了图1所示的新型动电DEP装置的表面孔隙/孔穴几何形状。
图3示出了根据本发明构造的电极布局，其中显示了例举的流体流动和样品。
图4阐述了图1的电极布局，其中根据本发明脉动冲击电极。
图5示出了图1的电极布局，其中选择激活电极，实现较好的分离结果。
图6示出了在应用结合的脉冲AC DEP/DC电泳/受控流体流动之前，血液样品分离过程的更加详细的流程图。
图7示出了在结合的脉冲AC DEP/DC电泳/受控流体流动的初始阶段的血液样品。
图8示出了在结合的脉冲AC DEP/DC电泳/受控流体流动的最终阶段的血液样品。
图9示出了在上部阵列部分上，荧光染色的DNA纳米粒状物、非常高分子量DNA和中间-较低分子量DNA的选择和分离的结合的脉冲AC DEP和DC电泳。
图10示出了在上部阵列部分上，荧光染色的DNA纳米粒状物、非常高分子量DNA和中间-较低分子量DNA的选择和分离的初始结合的脉冲AC DEP和DC电泳。
图11示出了在上部阵列部分上，荧光染色的DNA纳米粒状物、非常高分子量DNA和中间-较低分子量DNA的选择和分离的最终结合的脉冲AC DEP和DC电泳。
图12示出了DNA纳米粒状物和非常高分子量DNA的除去，和阵列上DC电泳尺寸分离中间和低分子量DNA的碎片。
图13示出了在装置的下部阵列部分上，施加到红和白血细胞上的初始脉冲的AC DEP。
图14示出了在装置的下部阵列部分上，施加到红和白血细胞上的最终脉冲的AC DEP。
图15示出了在装置的中间阵列部分上分离细菌、病毒和纳米囊泡的初始脉冲的AC DEP。
图16示出了在装置的中间阵列部分上分离细菌、病毒和纳米囊泡的最终脉冲的AC DEP。
图17A-H示出了在中间和高传导率条件下，60nm和200nm纳米颗粒的DEP分离。
图18A-D示出了在中间和高传导率条件下，200nm纳米颗粒的DEP分离。
图19A-H示出了在中间和高传导率条件下，DEP分离60nm和200nm纳米颗粒的3D荧光强度图象。
图20A-D示出了在高传导率条件下，DEP分离60nm纳米颗粒的真实图象和3D强度图象。
图21A-B示出了对于60nm和200nm纳米颗粒来说，纳米颗粒荧光强度增加vs传导率增加的图表。
图22示出了对于60nm和200nm纳米颗粒来说，作为传导率的函数，实验结果vs理论DEP的相交曲线的图表。
图23A-H示出了在增加的传导率下，在未涂布和水凝胶罩面涂布的铂电极上，DEP分离200nm纳米颗粒的真实图象和3D强度图象(表明电极变暗)。
图24A-F示出了在不存在纳米颗粒的情况下，在高传导率DEP之后，电极损坏的光学显微和SEM图象。
图25A-H示出了在高传导率DEP之后，200nm纳米颗粒的电极损坏和熔融的SEM图象。
图26A-C示出了在高传导率DEP之后，60nm纳米颗粒和电极损坏的荧光和SEM图象。
图27示出了包括步骤1的在血液内无缝取样-反馈高分子量DNA过程。
图28示出了包括步骤2的在血液内无缝取样-反馈高分子量DNA过程。
图29示出了包括步骤3的在血液内无缝取样-反馈高分子量DNA过程。
图30示出了包括步骤4的在血液内无缝取样-反馈高分子量DNA过程。
图31示出了包括步骤5的在血液内无缝取样-反馈高分子量DNA过程。
图32示出了采用复杂样品的无缝取样-反馈过程。
图33示出了采用PCR和免疫分析的分析法的无缝取样-反馈的复杂样品过程。
图34示出了采用PCR和免疫分析的分析法以及检测的无缝取样-反馈的复杂样品过程。
详细说明
本文献教导了新型的样品分离和取样-反馈系统、装置、方法和技术，它们以独特的方式结合了多维AC动电学，其中包括介电电泳(DEP)，DC电泳，微电泳，和流体学，可使用它们，从相关体积的高传导率(离子强度)的生物和临床样品和缓冲液，其中包括，但不限于，血液、血浆、血清、尿液、淋巴流体、唾液、活组织检查的样品、细胞培养物(干细胞)、细菌和发酵培养物中分离并鉴定细胞、纳米囊泡和纳米粒状物，细菌和/或病毒，以及多种疾病的其他临床相关的生物标记。尽管本发明所公开的实施方案能在没有稀释样品(血液、血浆、生物缓冲液)的情况下直接进行DEP分离细胞、纳米颗粒和其他分析物，但这些实施方案不排除使用所公开的装置和方法用于部分稀释的样品或缓冲液，或者用于经历过其他制样工序的样品。
使用具有确定直径和分隔距离的坚固电极的新型多腔室装置和电极阵列装置允许在高传导率(离子强度)溶液内进行可行的DEP。设计这些新型的DEP装置，其方式使得在高传导率条件下由于增加的电化学导致发生的起泡、加热和其他副作用没有降低效率，或者妨碍从复杂生物样品和高离子强度的缓冲液中分离、浓集和检测特定分析物或实体。对于大多数具有问题的AD动电和介电电泳分离装置来说，在高传导率条件下进行DEP分离成为主要的问题和局限性[参考文献1-28]。甚至当使用具有水凝胶罩面涂布电极的微阵列装置，短时间可实现一定程度的高传导率的DEP分离时，这种装置作为样品分离工具和诊断装置是不可行的[参考文献13、14、24-28]。
为了更好地阐述这一DEP传导率的局限性，此处所述的最初的第一实例示出了在低传导率的缓冲液内DEP分离纳米颗粒。这一实例涉及在MilliQ水(5.5μS/m)中，从10微米的颗粒中分离60nm DNA衍生的纳米颗粒。在10kHz AC下，在10V的峰到峰电压(peak-to-peak)(pk-pk)下，进行分离。图17a示出了在施加AC电场之前，在白光下的初始条件，其中在微电极阵列上具有10微米颗粒的无规分布。在红色荧光检测下的初始条件示出了在微阵列上红色荧光雾度，如根据60nm DNA衍生的荧光纳米颗粒预期的一样(参见图7b)。在施加AC DEP场仅仅30秒之后，大多数10微米颗粒以非常有序的布局浓集到负DEP低场区域内(参见图17c)。在施加AC场1分钟之后，60nm DNA衍生的纳米颗粒在微电极上的正DEP高场区域上浓集(参见图17d)。在微电极上的高荧光强度与周围区域内降低的荧光强度表明大多数纳米颗粒在高场区域内浓集。下一个实例表明在0.01×TBE(1.81mS/m)内，在3kHz AC下，在10V pk-pk下进行的与10微米颗粒混合的200nm纳米颗粒的DEP分离。初始的白光视野表明在施加场之前，10微米颗粒的无规分布(图17e)，和绿色荧光视野表明在高场区域内200nm纳米颗粒没有累积(图17f)。在小于10分钟内，10微米颗粒在低场区域内浓集(图17g)，和200nm纳米颗粒在正DEP高场区域内高度浓集(图17h)。这些低传导率的DEP结果通常与文献中引证并根据经典DEP理论预期的其他低传导率的纳米颗粒分离[参考文献11-14]一致。
下一组DEP实例表明在传导率大于100mS/m的缓冲溶液内，分离60nm DNA衍生的纳米颗粒、200nm纳米颗粒和10微米颗粒。对于1×TBE(0.109S/m)来说，在施加AC场20分钟之后，在白光条件下200nm纳米颗粒和10微米颗粒的分离表明10微米颗粒在低场区域内浓集(图18a)。在绿色荧光下，200nm纳米颗粒在正DEP高场区域内在微电极之上浓集(图18b)。对于在1×PBS(1.68S/m)内进行的DEP实验来说，在20分钟之后，10微米颗粒在低场区域内浓集(图18c)。在除去一些小的气泡之后和在增加的增益(gain)下，针对高传导率1×PBS缓冲液实验来说，拍摄绿色荧光20分钟图象(图18d)。该图象表明200nm纳米颗粒在四个微电极的正DEP高场区域内浓集。然而，微电极显示出显著的变暗和两个微电极起泡。200nm纳米颗粒主要在这四个微电极上浓集的观察结果与它们产生略高的场的事实一致。
使用60nm DNA衍生的纳米颗粒进行的在1×PBS缓冲液内的高传导率实验也得到类似的结果，即仍然观察到60nm纳米颗粒在三个微电极上的正DEP高场区域内浓集。使用MATLAB，用数学模型进行荧光图象的进一步分析，产生三维峰，所述三维峰较好地阐述了荧光纳米颗粒在高场区域内浓集。对于采用60nm DNA衍生的纳米颗粒进行的1×TBE实验来说，3D荧光数据表明从时间点0分钟(图19a)、2分钟(图19b)、8分钟(图19c)和16分钟(图19d)的显著增加。类似地，在1×PBS中，对于200nm纳米颗粒来说，3D荧光数据也表明从时间点0分钟(图19e)、8分钟(图19f)、16分钟(图19g)时和20分钟之后(图19h)的增加。
对于在1×PBS内60nmDNA衍生的纳米颗粒来说，仍然存在与在荧光图象内观察到的浓集(图20a)。3D荧光图象数据还表明从0分钟(图20b)到8分钟(图20c)和到20分钟(图20d)的类似的荧光增加。由于如图20a所示，微电极之一失活(第三行，第二栏)，电场图案轻微改变。使用MATLAB，针对在1×TBE，0.1×PBS(0.177S/m)和1×PBS的缓冲液内的实验，在0、0.5、1、2、4、8、16和20分钟的时间点处编辑总的荧光数据。图表(图21a)中示出了60nm DNA衍生的纳米颗粒的结果，和图表(图21b)中示出了200nm纳米颗粒的结果。这些实例表明随着时间流逝，荧光纳米颗粒浓度增加。更重要的是，这些实例还表明当缓冲液的传导率增加时，荧光纳米颗粒的总浓度显著下降，即需要长得多的时间在较高传导率条件下浓集实体。
图22示出了对于Clausius-Mossotti因子的真实部分(Re(K(ω)))vs 60nm DNA衍生的纳米颗粒和200nm纳米颗粒的传导率的理论曲线和实验结果范围。该图表表明，对于在这些实例中所使用的传导率来说，理论(Re(K(ω)))值应当为负，因此纳米颗粒应当在低场区域内累积。尽管如此，实际结果表明纳米颗粒的累积继续在高场区域内。遗憾的是，在这些高传导率条件(＞100mS/M)下，发生气泡、电极变暗和电极故障，并要求长得多的DEP时间，这导致相对低效的分离。
已发现，这些DEP有关的副作用是由于当使用含有钠(Na+)和氯化物(Cl-)电解质的较高离子强度的缓冲液时出现增加的电化学活性所致[参考文献29-30]。这些效果的更好理解需要开发更加可行和坚固的DEP装置以供分子诊断应用。在此处所述的实例中示出了清楚地证明在高传导率条件下，微电极/纳米颗粒/电解质装置不良相互作用的进一步的实例。这些实例涉及在不同传导率(离子强度)条件下，在具有水凝胶的铂微电极结构上(图23A-F)和在不具有水凝胶层的铂微电极结构上(图23G-H)，进行从10微米球分离和检测200nm黄-绿色荧光聚苯乙烯纳米颗粒。对所有缓冲液(0.01×TBE，1×TBE，1×PBS)的结果显示200nm纳米颗粒绿色荧光分离和浓集进入微电极上的DEP高场区域，而10μm球浓集进入到微电极之间的低场区域。再者，对于0.01×TBE来说，200nm纳米颗粒的浓度似乎最高，和当缓冲液的离子强度增加到1×PBS时下降(参见图23B、23D、23F和23H)。纳米颗粒的浓集更多在具有水凝胶的微电极中心处出现，而对于未涂布的微电极来说，在外部周边浓集(图23A、23C、23E、23G)。在最高的缓冲液传导率(1×PBS)下，水凝胶罩面涂布的微电极(图23E)和未涂布的微电极二者显示出电极的显著变暗(图23G)。
尽管在这些附图中没有示出，但在4分钟DEP之后，在1×PBS缓冲液内，在水凝胶罩面涂布和未涂布的微电极上均观察到增加的微气泡。尽管如此，但微气泡在未涂布的微电极上更加突出。此外，在1×PBS缓冲液中，当AC电压增加到高于20V pk-pk时，在几乎所有电极上出现无序起泡。尽管可在水凝胶罩面涂布和未涂布的铂微电极二者上观察到纳米颗粒的浓集和变暗，但未涂布的微电极提供机会来使用扫描电镜(SEM)分析电化学作用和验证纳米颗粒的浓集与粘合。
在下一组实施例中，在高传导率的1×PBS缓冲液内，在不存在纳米颗粒的未涂布的微电极上进行DEP。洗涤微电极阵列，干燥，然后使用SEM成象。图24A首先示出了未活化的对照微电极，和活化微电极(图24B)在3000Hz，10V pk-pk下10分钟DEP之后的光学显微图象。清楚地观察到活化的微电极显著变暗。图24C和24D示出了相同未活化和活化的微电极的SEM图象。在SEM图象中清楚地观察到活化微电极的显著损害和降解。图24E和24F是微电极的SAEM图象的较高放大倍数，且甚至更加清楚地示出了在微电极周围出现的铂层的劣化(图24F)。
在存在200nm纳米颗粒的高传导率1×PBS缓冲液内，进行类似的DEP实例。图25首先示出了在3000Hz、10V pk-pk下，在高传导率1×PBS缓冲液内2分钟DEP之后，未活化的对照微电极的SEM图象。没有活化的对照微电极显示出在该结构上无规分布的仅仅数个200nm纳米颗粒。图25B示出了对照微电极边缘的SEM图象的较高放大倍数，其中一些纳米颗粒无规地捕获在铂微电极边缘之间的区域内。图25C示出了微电极的SEM图象，它在存在200nm纳米颗粒的情况下活化2分钟。数量大的纳米颗粒浓集并粘附到微电极上，特别是在边缘处。特写镜头(图25D)更好地显示出纳米颗粒的浓集团簇，且表明在微电极边缘处铂的某种劣化。图25E和25F示出了在采用200nm纳米颗粒，DEP 5分钟之后，活化微电极的图象。再者，清楚地观察到200nm纳米颗粒的浓集和团簇，但铂微电极结构出现更加严重的损坏和劣化。图25G是图25D的微电极边缘的较高放大倍数的SEM图象，再次表明纳米颗粒的团簇。最后，图25H是劣化微电极的较高放大倍数的图象(参见图25F)，从而表明纳米颗粒团簇点缀在熔融或熔化的纳米颗粒团簇之间。这些熔融的纳米颗粒团簇是在较长DEP活化时间之后腐蚀性的电化学活性(热、H+和OH-)的结果。
另一组实例涉及在高传导率1×PBS缓冲液内，在不具有水凝胶的微电极结构上，进行DEP分离和检测40nm红色荧光纳米颗粒与10微米球。图26A是在DEP活化之前，微电极的红色荧光图象，显示40nm纳米颗粒没有浓集。图26B是在10,000Hz、10V pk-pk下DEP活化4分钟之后，微电极的红色荧光图象，它清楚地表明在微电极周边上40nm纳米颗粒的浓集。图26C是SEM高放大倍数的图象，显示损坏的微电极和40nm纳米颗粒的团簇。
这些实例清楚地表明当在高传导率条件下(＞100mS/m)进行DEP时，电化学活性增加。这一非常腐蚀性的电化学引起微电极的微小起泡和变暗。更重要的是，它表明发生显著的微电极劣化，这将最终导致电极故障，且它表明当DEP活化时间增加时，这一微电极破坏增加。在劣化的微电极结构上聚苯乙烯纳米颗粒熔融的事实暗示发生显著大的加热，尽管DEP是AD动电工艺。这些结果可有助于DC电解反应，所述DC电解反应将产生O2、H2、H+、OH-、热和气泡。在1×PBS缓冲液内，钠(Na+)、钾(K+)和氯化物(Cl-)电解质的存在也可导致在DEP过程中在微电极表面上存在的总的腐蚀条件。除了高传导率以外，大多数生物和临床样本和缓冲液具有相对高的钠(Na+)、钾(K+)和氯化物(Cl-)浓度。这些结果清楚地证明为何经典DEP(使用不那么坚固的溅射金电极)仅仅可在低传导率条件下进行(参考文献29、30)，即电极将在数秒内被破坏。
尽管水凝胶罩面涂布的铂微电极确实允许在高传导率条件下分离纳米颗粒，但由于下述原因，它们仍然不适合于任何实际应用。首先，突出的无规起泡和电极故障使得该装置本身对于使用血液的任何类型的取样-反馈分子诊断来说不可靠。在涉及从血沉棕黄层和全血中分离纳米颗粒的进一步实验中，观察到起泡、电极变暗和电极故障。尽管纳米颗粒可在高场区域内被离析，但它们难以通过流体洗涤除去，表明不利的加热可使它们熔融到阵列表面上。第二，对于生物样品分离和随后的分子分析(例如PCR、免疫分析等)来说，这一加热和腐蚀性电化学将严重损坏细胞、DNA、蛋白质和大多数其他分析物。第三，为了改进分离效率(增加所浓集的分析物的总量)，要求较长的DEP时间，这将产生甚至更加负面的作用。第四，若使用较高的AC电压(例如20Vpt-pt)增加浓集速度，则这还会引起甚至更多的起泡和电化学作用。经典DEP装置和传导率局限性的基本原因的这一发现提供创建更加可行的DEP制样装置和新型的“无缝”取样-反馈诊断系统的机会。这些新型的DEP装置允许在血液、血浆、血清和大多数其他生物样品和缓冲液内稀有细胞、纳米颗粒和各种重要的疾病生物标记直接离析、浓集和检测。
本说明书接下来公开了连续和/或脉冲的动电/介电泳(DEP)力，连续和/或脉冲的DC电泳力，装置上(阵列上)的微电泳尺寸分离，和受控流体流动(外部泵送和/或DC/AC动电驱动)与本发明新型装置的结合，它可用于进行复杂的制样，从而导致特定的分析物分离和浓集，和随后分子诊断分析与检测。这可包括，但不限于(1)DEP分离和检测标记的分析物和/或随后在DEP分离之后，使用免疫化学和配体结合技术，检测未标记的分析物，所述分析物包括荧光抗体、非荧光抗体、抗体衍生的纳米颗粒、抗体衍生的微球、抗体衍生的表面(在DEP装置上的具体位点)，生物素/链霉抗生物素和各种凝集素；(2)预-DEP或后-DEP使用一般和/或特定的彩色染色料、荧光染料、荧光纳米颗粒、量子点用以检测特定细胞、细菌、病毒、DNA、RNA、核、膜、细胞的细胞器和细胞的纳米粒状物(重要的是，牢记DEP固有地是“较少标记”的技术，且细胞、纳米颗粒与其他分析物可通过它们的交叉频率鉴定；利用标记增加检测灵敏度，鉴定单独的实体，和进行更加详细的分析)；和(3)通过荧光探针原位杂交，后分析细胞、核、DNA和RNA(FISH等)；和(4)使用细胞、核、DNA和RNA的众所周知的分子分析方法，其中包括，但不限于，PCR、RCA、SDA和其他表型、测序和基因表达技术，所有这些可在其中发生DEP分离的相同的分隔隔室内进行。
上述实例不排除在装置的另一分离腔室内进行随后的分析或者移动分析物到样品收集管内以供装置外分析、储存或归档(archiving)样品。另外，可用于分析的其他类型的检测技术包括，但不限于，放射性同位素、色度、化学发光、电化学或用于生物传感或纳米传感分析物、生物分子和被离析的细胞的其他方法。此处所述的装置和方法可被视为真实的“无缝”取样-反馈诊断系统，它可与未稀释的血液或其他复杂临床或生物样品一起使用。以下更加详细地描述使用此处例举的DEP装置的无缝取样-反馈方法。
图27示出了在无缝取样-反馈诊断中的第一步，其中血液样品直接施加到该装置上，和在这一情况下，使用DEP进行非常低浓度的高分子量(hmw)DNA和/或RNA与未稀释全血样品的分离。然而，应当注意，可分离、浓集并检测几乎任何分析物，其中包括，但不限于，稀有细胞、纳米颗粒、细胞的纳米粒状物、抗体、免疫复合物、蛋白质和RNA；且样品可包括，但不限于，血浆、血清、尿液和唾液。
图28示出了在取样-反馈诊断过程中的第二步，其中在引起血细胞(红和白)向负(DEP)低场区域移动和hmw DNA(RNA)在正(DEP)高场区域内浓集的合适AC频率和电压下施加DEP(在该附图中，圆顶结构表示DEP高场强度区域)。
图29示出了第三步，其中使用简单的流体洗涤，从DEP阵列装置中除去血细胞，同时hmw-DNA(RNA)保持在DEP高场区域内高度浓集。同样在本发明公开内容的范围内的是，使用连续、脉冲或间歇的流体流过DEP装置，以便加工较大样品体积，和作为减少加热的装置，所述减少加热在较高传导率的溶液中，在较低AC频率(＜20kHz)下和在高电压(＞20V pt-pt)下更加突出。
图30示出了该工艺的下一步，其中涉及通过添加DNA(RNA)特异的荧光染料(例如，CyberGreen、OliGreen、溴乙啶、TOTO、YOYO、吖啶橙等)，原位标记DNA(RNA)。在这一方法中，合适的荧光染料溶液在DEP装置上冲刷，使DNA或RNA染色。在染色进行的同时，可通过维持DEP场，使DNA/RNA保持在原地。可通过使用epifluorescent检测系统，检测并量化荧光染色的DNA/RNA(图31)。荧光检测系统和装置是分析微阵列装置的分子生物和临床诊断学领域众所周知的，且各种系统可商购。
同样在本发明公开内容范围内的是：(1)使用其他分子分析检测方法和技术，其中包括，但不限于，PCR，具有分子信标的实时PCR、RCA和SDA；(2)在DEP分离工艺过程中，杂交样品DNA/RNA，以捕获固定到DEP装置的特定位点上的探针(DNA、RNA、pNA等)以供随后使用荧光报告探针分析/检测；(3)从DEP浓集位点中释放DNA/RNA，使用PCR、RT-PCR、RCA或SDA扩增它，变性，然后使用位点选择的DC电泳再杂交扩增子，以捕获在DEP装置上固定的探针，供随后使用荧光报告探针分析/检测；(4)采用序列特异性DNA/RNA/pNA探针，使用荧光原位杂交；(5)释放DNA/RNA并通过DEP或电泳(DC场)将其传输到装置上的另一特定位置；和(6)释放DNA/RNA并(通过流体流动)移动到装置的另一腔室内或者到样品收集管以供进一步分析或储存。
图32示出了可如何使用取样-反馈装置，进行从全血中稀有细胞、细菌、病毒、细胞的纳米粒状物或CNP(细胞膜、核、hmw-DNA、hmw-RNA、液泡、内质网、线粒体等)、蛋白质、抗体复合物和其他生物标记的更加复杂的DEP分离。图33示出了分子分析方法，可使用该方法鉴定在装置上浓集的特定分析物；这些方法包括，但不限于，荧光染色、荧光免疫分析、FISH和PCR、RCA和SDA工序。最后，图34示出了使用众所周知的荧光和其他检测技术来对细胞、细菌、病毒、CNP和抗体复合物进行最终检测。
本发明的公开内容进一步公开了独特的方法，其中可使用所述方法提高此处所述的取样-反馈装置和系统的分析和诊断能力。在DNA和RNA离析和检测的情况下，尽管可使用DEP有效地离析和浓集hmw-DNA/RNA，但较低分子量的DNA和RNA(＜10kb)更加难以通过DEP离析。在这一情况下，可获得双链ds-DNA特异性抗体和单链的ss-DNA特异性抗体，其中可使用它们标记较低分子量的DNA和RNA，从而产生较大的纳米结构(＞5nm)。这些较大的DNA-抗体复合物可更加有效地通过DEP离析和浓集。
另外，可使用此处所述的装置，实施各种新的抗体试验。更具体地，DEP从较大抗体复合物中分离单一抗体的能力意味着可开发许多单和双抗体分析，其中可通过DEP从临床样品中分离较大抗体-抗原复合物的形成。在这些情况下，荧光抗体和/或次级抗体可直接加入到样品中，施加DEP，且仅仅荧光标记的抗体-抗原复合物在DEP高场区域内浓集以供随后检测。可针对小分子抗原，其中包括，但不限于，药物、激素、代谢物和肽类，以及针对较大抗原，其中包括，但不限于，蛋白质、酶和其他抗体，使用这种DEP基抗体分析。同样在本发明说明书范围内的是能实施许多其他类似的DEP分析，所述分析基于较大复合物的形成，其中包括，但不限于，检测细菌、病毒、噬菌体、纳米颗粒，使用与抗体结合的选择性配体的CNP，生物素/链霉抗生物素、凝集素、蛋白质、酶、肽类、枝状体、适配子、量子点、荧光纳米颗粒、碳纳米管和针对选择性标记检测目的而设计的其他纳米实体。最后，除了在DEP装置上连接或固定DNA/RNA/pNA捕获探针以外，也可将各种其他结合实体固定到DEP装置上，其中包括，但不限于，抗体、生物素/链霉抗生物素、凝集素、蛋白质、酶、肽类、枝状体和适配子。在DEP场关闭之后，这种固定的配体提供分析物选择结合到DEP装置上。
应当注意，此处所述的新型DEP装置能实施所有这些方法，因为下述事实：这些新型DEP装置消除或大大地减少了不利的起泡、加热和电化学作用，否则在其他情况下将损坏或破坏固定所使用的大多数生物分子(例如，DNA、RNA、抗体、蛋白质等)，以及在装置上在特定DEP高场位点上离析并浓集的用于检测和分析的分析物和生物标记。
第一说明书部分更加详细地公开了新型动电DEP装置和系统，其中将电极置于单独的腔室内，并通过使AC DEP场穿过孔隙或孔穴结构，在内部样品腔室中产生正DEP区域和负DEP区域。可使用各种几何形状形成所需的正DEP(高场)区域和DEP负(低场)区域以供在样品腔室内携带细胞、纳米颗粒和生物标记分离物。这种孔隙或孔穴结构可用多孔材料(琼脂或聚丙烯酰胺水凝胶)填充或者用多孔膜类结构(纸张、纤维素、尼龙等)覆盖。覆盖结构的这种多孔膜的厚度可以是1微米到1毫米，但更优选10微米-100微米；和孔度范围为1纳米-100微米，但更优选10纳米-1微米。通过将电极分隔在单独的腔室内，这些独特的DEP装置基本上消除了在DEP工艺过程中在内部样品腔室中出现的影响分析物分离的任何电化学作用，加热或无序的流体运动。这些具有腔室的装置可在非常高的AC电压(＞100V pt-pt)下操作，除了DEP以外，也可使用它们在样品腔室内进行DC电泳传输和电泳。一般地，这些装置和系统可在范围为1000Hz-100mHz的AC频率下，在范围可以是1V-2000V pt-pt的电压和1V-1000V的DC电压下，在10微升/分钟-10ml/分钟的流速和1℃-100℃的温度范围内操作。图1和图2中示出了具有腔室的装置。可生产这种装置使其具有各种孔隙和/或孔穴结构(纳米级、微米级和甚至宏观级)，且可包含可控制、局限或防止细胞、纳米颗粒或其他实体扩散或传输到内部腔室的膜、凝胶或过滤材料。然而，AC/DC电场、溶质分子、缓冲液和其他小分子可流经该腔室。
图1和2代表可根据本发明构造的具有腔室的装置的最基本的变体。本发明的装置将能预见各种结构。这些装置包括，但不限于，多个电极和具有腔室的装置，允许产生可再构造电场图案的装置，结合DC电泳和流体工艺的装置；制样装置，制样和诊断装置(它包括随后的检测和分析，芯片实验室装置，关注点诊断和其他临床诊断系统或变体)。图1是根据此处的教导构造的样品加工装置的示意图，并示出了装置100包括在外壳106内的多个电极102和含电极的腔室104。装置的控制器108独立地控制电极102，正如此处进一步描述的。
图2示出了具有6个电极腔室104的装置100的顶视图，其中每一电极腔室具有至少一个坚固的铂电极。图2示出了用一个主要的中心分离腔室110构造的装置，所述分离腔室110具有用水凝胶填充的尺寸变化的18个孔隙/孔穴结构112的布局(内部腔室也具有覆盖孔隙或孔穴的多孔膜)。以6个孔隙/孔穴结构为一组，三组排列孔隙/孔穴结构。尽管分离腔室110的上部部分不具有物理分离能力，但下部部分分成9个单独的隔室(用浅的虚线表示)。这些隔室每一个与电极腔室流体接触，但彼此不接触。当施加AC DEP场到电极上时，电场流过孔隙112，从而在孔隙结构之上产生正的DEP高场区域，和在孔隙结构之间产生负的DEP低场区域。可借助入口220和出口222从装置中添加样品和取出。该装置可具有额外的入口224和出口226。图1和2所示的装置代表仅仅高传导率DEP腔室装置的一种形式；应当理解可生产具有较大数量孔隙/孔穴和不同几何形状的数量大的不同类型装置。
另一装置实施方案涉及使用具有确定直径和分隔距离的坚固电极的电极阵列，所述电极阵列将较少引起电化学作用和加热，所述电化学作用和加热是当前的动电和介电电泳分离装置的问题。合适的结构和罩面涂布坚固电极(例如铂、钯和金)可减少在分离工艺上电化学产品的副作用，并便于施加高得多的电压，这可大大地改进分离时间。此外，当前的装置具有相对低的流通量，和通过下述过程，此处所述的这一实施方案克服了该问题：提供使用多个平行部分的阵列，并允许装置用作一个大的分离区域，然后转换(switch)到独立地受控的分离区，从而导致全部系统的灵敏度和选择性增加。在其他常规的系统中观察到第三个问题是不能分离尺寸和组成相对类似的样品组分。根据此处所述的说明，通过在DEP阵列装置本身上直接提供可进行辅助分离过程，这种微电泳的装置，克服了这一问题。
与正的DEP力相比，负的介电电泳(DEP)力相对弱；于是经历负DEP的实体可通过流体流动除去，而经历正DEP的实体保持在原地。在目前描述的实施方案中，通过在相反方向上使用流体和DC电泳力，DNA片段和高度荷电的DNA纳米颗粒可从血液和其他样品内的细胞和蛋白质中分离。按照这一方式，使用多AC频率，脉冲的DC电泳，和微电泳，可实现DNA纳米粒状物和DNA片段的更加全面的尺寸分离。
允许在高传导率条件(血液、血浆、血清等)下进行DEP的这种新型系统和装置的商业用途可包括许多研究和临床诊断应用，例如关注点诊断，治疗和药物监控，环境和水供应监控，和生物恐怖试剂检测。可使用这一系统，检测许多分析物和生物，例如稀有细胞(癌细胞、胎儿细胞、造血干细胞)、细菌、病毒、DNA/RNA和DNA纳米粒状物生物标记，药物传输纳米囊泡以及正常或异常蛋白质。
建立实验AC DEP和DC电泳分离系统(在以下的实验部分中进一步描述的实验室台面变体)，并进行实验，完善(refine)新的原型装置。在这些装置(如上所述)上获得的结果导致关于为何经典DEP局限于低传导率溶液的重要发现。
使用具有直径大致约1-1000微米的电极且分隔距离为10-5000微米并用5-100微米厚的水凝胶(琼脂、聚丙烯酰胺)或多孔膜层罩面涂布的平面、平行且坚固铂电极阵列产生较少的加热和电化学问题，因为电场线没有象它们在其他经典的常规DEP系统中一样高度集中，和更重要的是，DEP高场累积区域实际上与实际的电极表面相隔一定距离。与以前的电极设计的一个重要区别是没有使用溅射的铂或金电极，它们因电化学容易劣化和破坏，尤其在较高场强和高溶液传导率下。由固体铂或金材料，其中包括线材或棒材，构造新型装置用电极。第二个区别是，可通过改变一个大的分离问题成更加可控得多的许多单独的分离问题，改善在百万个相对类似实体(细胞、纳米颗粒、生物标记)中分离一个独特实体的分离效率。通过使用多个部分的阵列和受控的平行分类过程，此处所述的装置将实现这一效果。这通过在大的阵列装置中使用10-100或更多个电极的单独控制的阵列子组来实现，所述大的阵列装置允许复杂的生物样品(血液)在整个阵列装置上分布，分离各组分成较小的分离部分(区域)以供进一步分离和离析所需的分析物或实体。将复杂的样品分离问题分解成较小的部分，保持最有希望的方式解决灵敏度vs特异性的问题，即该方法允许快速和较高的总的样品流通量，以及相对较长的询问(分离)时间以供分离和鉴定样品内独特的细胞或其他实体。最后的问题可通过生产多维归档分类装置来克服。这一解决方法依赖于下述事实：负的DEP是比正DEP弱的力，和可通过受控的流体流动，使遇到负DEP的细胞或其他实体运动，而遇到正DEP的分析物或实体保持在DEP高场区域内浓集。通过以相对方向使用受控的流体流动和脉冲的DC电泳，可在复杂的生物样品中从细胞和蛋白质中分离DNA/RNA和荷电的纳米粒状物(这是DEP分离细胞和DNA的另外的固有能力)。
结合受控的流体流动和脉冲的DC电泳与使用多AC频率，即在初始电极阵列子组上捕获CNP和hmw-DNA/RNA纳米粒状物的低频，和在其他电极阵列子组上捕获渐变地较大的颗粒的细胞(细菌和病毒)的较高AC频率，可通过尺寸获得大多数细胞和实体的完全分离。视需要，可转变电极成不同频率以供局部发生更精细的分离，同时维持总体上完全的尺寸分离。
我们描述了复杂生物样品(血液、血浆、血清)直接施到其内的分离系统，所述分离系统涉及具有平面、坚固的铂电极阵列结构和辅助电极的装置，以便来自一个或更多个功能发生器的受控的AC信号产生介电电泳力，和受控的DC电源产生电泳力。装置的入口和出口还便于在控制的流速下流体(水、缓冲液等)控制流过该系统。该系统还包括光学、epifluorescent显微镜和数码照相机以供监控、检测、量化和记录在装置上发生的分离工艺(视觉和荧光)。该装置最终是多个平行归档分类的系统，它能通过控制动电作用，介电电泳力，电泳力，微电泳和流体流动来实施。应当注意，这种新型的多区域取样-反馈工艺是可能的，因为下述事实：新型DEP装置消除或大大地降低了常规装置遇到的不利的起泡、加热和电化学作用。
图3示出了平面铂电极阵列装置300的仅仅一个变体，它包括样品流体可流经其中的外壳302。通过大箭头表示流体流经该装置的图案，该箭头代表理想的样品从附图顶部的入口端304流动到底部的出口端306和侧面的分析物出口308。该装置包括多个AC电极310。为了简单地描述起见，图3中仅仅描述了一些电极310，但应当理解，在附图中所有小的空心圆形代表类似结构的电极。在附图右侧示出了电极中一个放大的3×3阵列312，以表明在装置300内的样品流体。该样品由微米化尺寸的实体或细胞314(在放大视图中所示的最大实心圆形)、较大的纳米粒状物316(中间尺寸实心圆形)和较小的纳米粒状物或生物分子318(最小尺寸的圆形)组成。较大的纳米粒状物316可代表高分子量DNA，核小体或CNP或在样品内分散的细胞碎屑。较小纳米粒状物318可代表蛋白质，较小的DNA、RNA和细胞碎片。在该附图中，平面电极阵列装置300是60×20的电极阵列，它可分部分成可单独地控制但同时操作的三个20×20的阵列。为了电泳的目的，在附图上方的辅助DC电极320可接通到正电荷上，而在该附图底部处的DC电极322可接通到负电荷上。可按照连续和/或脉冲两种方式使用每一受控AC和DC系统(例如，可在相对短的时间间隔处脉冲接通和断开各自)。沿着样品流一侧的平面电极阵列324当用纳米多孔材料覆盖时，可用于产生DC电泳力以及AC DEP。另外，可在x-y-z维度上，使用在阵列内的平面电极和/或辅助电极，在纳米孔层内进行微电泳分离工艺。一般地，可在范围为1000Hz-100mHz的AC频率内，在范围可以是约1V-2000V pk-pk的电压下，在1V-1000V的DC电压下，在10微升/min-10毫升/min的流速下，和在范围为1℃-100℃的温度内，操作这些装置和系统。控制器108(图1)独立地控制每一电极310、320、322、324。控制器可通过例如插座和插头连接(未示出)，外部连接到装置100上，或者可与装置外壳一体。为了阐述的便利，电极的电引线在该附图中没有示出。
可认为，在样品中的细胞和颗粒和其他实体均匀地分布在整个电极阵列上，尽管在附图中示出了仅仅放大的3×3电极部分312。流体流速使得它产生的力大于较大颗粒遇到的负DEP，但弱于较大颗粒遇到的正DEP。
图4示出了脉冲接通和断开的顶部320和底部322DC电极(1秒接通，接着1秒断开)，从而提供推动DNA、RNA和小的纳米粒状物朝向位于该附图顶部的正DC电极320的简单的电泳脉冲。60×20电极阵列在视觉上被分成独立受控的三个不同的部分或子阵列。调谐顶部20个AC电极阵列行402到较低频率的AC场，以确保通常朝向电极运动(这是由于在较低频率下，正DEP和AC动电现象所致)的较小的实体在这些电极处捕获，而较大的细胞和实体在这些频率下遇到负DEP，通过恒定的流体流动，移动到该装置的下部部分。AC电极的中间20行404保持大的亚微米颗粒(例如病毒)，同时允许微米尺寸的颗粒和细胞流过。最后，AC电极中最后的20行406可视需要微调到高的AC频率下，然后可使用它来捕获所需的细胞和微米大小的颗粒。
图5示出了用于离析“在百万内的一个细胞”，即稀有细胞检测的分离装置。通过使用完全的电极阵列，可多通路化和平行化(parallelize)分离问题，使之更加简单。这可通过仅仅按需要尽可能多地活化电极阵列来实现，以实现较好的分离。通过将阵列有效地分成可通过光学检测(即epifluoresence)来分析的具体的分离区域，一旦所有的细胞均匀地分布，应当可从它周围的所有细胞中分离出遇到正DEP的一个特定的细胞。在图5中，中间尺寸的实心圆形502代表10微米的一种特定种类的细胞，例如淋巴细胞，红血细胞，和类似物，且在AC电极的第三部分406中的AC电极506上所示的单一实心圆形504表示不同于样品内的其他502类型的唯一的“百万内的一个细胞”，这也是遇到正介电电泳和因此容易地与其他细胞区分的唯一细胞。使用仅仅介电电泳，应当可从未区分的502细胞类型中分离出唯一的“百万内的一个细胞”504类型的细胞。若存在足够数量的AC电极将分离问题分成较小的更加容易可分离和可分析的组块(chunk)，则这可更加容易实现。一旦细胞类型的分离问题以这一方式展开，则若一次分析仅仅电极的某些部分，例如图5所示的3×3阵列，则应当可寻找到感兴趣的唯一的颗粒504。另外，温度控制可有效地提供更多选择和有效的细胞分离(例如分离癌细胞和干细胞)。
图6示出了在采用结合的脉冲AC DEP/DC电泳/控制流体流动之前，血液样品分离过程的更加详细的流程图。图6图示了在复杂样品，例如血液内发现的宽泛的潜在诊断和生物标记实体中的一些，其中所述血液中的实体可包括红血细胞和白血细胞，细菌，病毒，纳米囊泡，DNA/RNA纳米粒状物，一类DNA和RNA碎片和蛋白质。图6还图示了直接在AC电极310上的被中等密度的纳米孔层604、低密度纳米孔层606和高密度纳米孔层608覆盖的平面铂阵列电极310。
图7示出了在结合的脉冲AC DEP/DC电泳/受控的流体流动的初始阶段中的血液样品。在图7中，使用整个阵列装置300，进行总的分离过程，所述分离过程始于在每一个电极子阵列部分402、404、406(分别为上部、中间、下部)内浓集不同组的实体。
图8示出了在结合的脉冲AC DEP，DC电泳，受控的流体流动的最后阶段中的血液样品。在图8中，不同的实体在它们合适的电极阵列部分402、404、406中浓集。在这一实例中，DNA纳米粒状物和较小的DNA片段在上部阵列部分402中示出；细菌、病毒和纳米囊泡在中间阵列部分404中示出；和细胞与蛋白质在下部阵列部分408中示出。
图9示出了AC电极阵列的放大视图，其中结合的脉冲AC DEP和DC电泳在上部阵列部分402上选择并分离荧光染色的DNA的纳米粒状物、非常高分子量DNA和中间较低分子量DNA。由于这些实体在上部阵列部分内浓集并离析，因此它们可用合适的DNA荧光染料试剂选择染色，和可进行二级分离过程。
图10示出了AC电极阵列的放大视图，它在上部阵列部分402上具有初始结合的脉冲AC DEP和DC电泳选择并分离荧光染色的DNA的纳米粒状物、非常高MW的DNA和中间-较低MW的DNA。这一初始过程将引起DNA纳米粒状物开始在中间纳米孔层之上浓集，所述中间纳米孔层的孔度排除这些非常大的DNA实体；而更多中间和较低分子量的DNA片段被输送到较低纳米孔密度层内。
图11示出了AC电极阵列的放大视图，它具有最终结合的脉冲ACDEP和DC电泳在上部阵列部分402上选择和微电泳分离荧光染色的DNA的纳米粒状物、非常高MW的DNA和中间-较低MW的DNA。在装置300的操作中的这一点处，DNA纳米粒状物和非常高分子量DNA在中间密度的纳米孔层604之上充分地浓集并离析，而更多中间和较低分子量的DNA片段在内部较低密度的纳米孔层606内浓集，
图12示出了在除去DNA纳米粒状物和非常高MW DNA和阵列上DC电泳尺寸分离中间和低MW DNA片段之后，AC电极阵列的放大视图。可在装置300的另一部分上进一步分析DNA纳米粒状物和非常高MWDNA，同时，可在纳米孔层604、606、608内通过微电泳，尺寸分离更多中间和较低分子量的DNA片段。图12示出了一些AC电极310a荷正电和其他AC电极310b荷负电。
图13示出了AC电极阵列的放大视图，其具有在装置300的下部阵列部分406上应用到红和白血细胞上的初始脉冲的AC DEP。在这一方法中，可在装置的另一组件上除去和/或分析在样品内的蛋白质，同时，可通过在下部阵列部分406上，通过AC DEP，进一步分离和区分细胞和其他微米尺寸的实体。
图14示出了电极阵列的放大视图，其具有在装置300的下部阵列部分406上应用到红和白血细胞上的最终脉冲的AC DEP。在装置操作的这一点处，红和白血细胞在DEP高和低场区域内分离，随后可除去红细胞，并进一步区分白细胞，即开始分离癌细胞的过程。
图15示出了AC电极阵列的放大视图，其具有初始脉冲的AC DEP以供在装置300的中间阵列部分404上分离细菌、病毒和纳米囊泡。图15的附图是可如何使用可独立地受控的阵列装置300的子部分进行额外重要的分离过程的实例。
图16示出了电极的放大视图，其具有最终脉冲的AC DEP以供在装置300的中间阵列部分404上分离细菌、病毒和纳米囊泡。再者，应当牢记在中间阵列部分上的这一分离过程可与在其他阵列子部分上进行的其他分离过程同时和独立地进行；例如可在上部阵列部分上发生DNA片段分离，而同时在其他(下部)阵列部分上发生细胞分离。
最后，平行的复用电极阵列可与归档的细胞等级联合使用，在电极行内产生确定的区域，其中尺寸类似但具有不同介电性能的特定颗粒可被捕获。可利用动电、介电电泳、电泳和流体力和多种效应的各种诊断和治疗应用全部彼此联合将增加装置的分离灵敏度和效率。最重要的是，仅仅当动电、电泳和流体力和多种效应在合适的比例和受控的电极阵列装置上独特地结合时，才实现这些高性能和临床有用的分离工艺。除了这类分离以外，介电电泳(它是一种无损失的、潜在标记较少的平行分离方法)可与更加常规的分离方法联合使用，所述更加常规的分离方法涉及很多的制样以及样品较大的损失，例如场流分级，荧光辅助的细胞分级(FACS)或磁辅助的细胞分级，以实现在应用中使用时，甚至更大程度的细胞和纳米颗粒分离。
关于所述实施方案中的其他方面，应当指出当标记(光学荧光、发光、电化学、磁性等)加入到待分离的细胞、纳米颗粒和生物标记中时，此处所述的复用(multiplexing)甚至更加有效，因为该标记有助于影响实体的尺寸、传导率和可检测性。
目前，以上所述的DEP分离装置是处于早期的实验数据阶段中。使用以上所述的接收生物材料以供分离的电极阵列结构，构造原型系统，所述生物材料包括细胞、纳米颗粒和hmw-DNA。利用在控制合适的软件程序下操作的功能发生器，实现在阵列结构内电极子组的选择给予能量，所述合适的软件程序可在常规的计算机，例如桌面或工作站计算机上执行。可使用这一装置控制单独的电极。原型系统具有相关的epifluorescent显微镜以供监控和记录分离实验(参见以下额外说明的实验部分)。
各种分离和离析应用包括稀有细胞的检测以供从血液、其他人体流体或任何缓冲液中分离成人干细胞，例如造血祖细胞；在血液、其他人体流体或其他缓冲液内的细胞、蛋白质和DNA/RNA碎片之间的初步分离，其目的是检测癌症和其他诊断；从血液、其他人体流体或其他缓冲液中分离癌细胞以供研究、诊断以及治疗目的。同样预见的是用于环境监控和快速检测病原体和生物恐怖试剂。最后，同样预见的是，可使用在本发明中所述的系统、装置和技术，分离、离析和纯化各种非生物的实体，所述各种非生物的实体除了包括药物纳米颗粒和纳米囊泡以外，还包括：量子点、金属纳米颗粒，碳纳米管(CNT)，纳米线材，和甚至微米和亚微米CMOS装置和组件；基本上可在含水或混合溶剂体系内悬浮或增溶的任何大分子或纳米组分都可按所示实施方案使用本文所述技术处理。我们还预见这些新装置将引导自组装DNA和其他生物衍生的纳米颗粒、纳米组分和中尺度的物体。这可导致新的DNA原型和测序技术($1000基因组)和纳米/微米生物/化学传感器应用，其中包括高度集成的细胞大小的“Fantastic Voyage”装置(由相同名称的电影启发)，所述装置可置于血流内，进行诊断、治疗传输，体内显微外科手术，即除去凝血和斑块，修复动脉粥样硬化的动脉等，以及纳米电子、纳米光学、光致电压、燃料电池、电池、纳米材料和许多其他非均相的集成应用。
使用此处所述的装置和技术，可提供取样-反馈结果，其中分离操作导致保持至少一类生物材料在电极子部分之一处，而样品流体的其余部分从装置中洗涤掉，结果试剂进入到样品加工装置内，接着使引入的试剂与被保持的生物材料在样品加工装置内反应。如上所述，该试剂可包括荧光染料、抗体或类似物。可利用取样-反馈过程，进行如上所述的各种任务，其中包括PCR操作和类似任务。
以上参考目前优选的实施方案描述了本发明，以便可表达本发明的含义。然而，存在此处没有具体地描述，但本发明可采用的装置、系统和分离装置的许多结构和排列。本发明因此应当不被视为限制到此处所述的特定实施方案上，相反，应当理解本发明相对于一般的生物分离系统具有宽泛的应用。落在所附权利要求范围内的所有改性、变化或等价排列和实施装置因此应当被视为在本发明的范围内。
实验部分
缓冲液和传导率测量
浓缩的5x Tris Borate EDTA(TBE)缓冲溶液获自USB Corporation(USB，Cleveland，Ohio，USA)，并使用去离子的Milli-Q超纯水(55nS/cm)，稀释到下述浓度：0.01x TBE，0.1x TBE和1x TBE。Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(1x PBS)溶液获自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并使用Milli-Q水稀释到0.1x PBS。采用Accumet Research AR-50传导率计(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ，USA)，使用2池(范围：10-2000μS)和4池(范围：1-200mS)的电极，进行传导率测量，并被调整到合适的传导率标准。测量下述缓冲液的传导率：0.01x TBE-18.1μS/cm；0.1x TBE-125μS/cm；1x TBE-1.09mS/cm；0.1x PBS-1.77mS/cm；和1xPBS-16.8mS/cm。
颗粒、纳米颗粒和DNA的衍生化
具有NeutrAvidin涂布表面的荧光聚苯乙烯纳米颗粒(FluoSpheres)购自Invitrogen(Invitrogen，San Diego，CA，USA)。纳米颗粒的直径为0.04μm(40nm)和0.2μm(200nm)。40nm聚苯乙烯纳米颗粒是红色荧光(ex：585/em：605)，和200nm聚苯乙烯纳米颗粒是黄-绿色荧光(ex：505/em：515)。较大的10.14μm的羧化聚苯乙烯颗粒获自Bangs Labs(Bangs Labs，Fishers，IN1 USA)。生物素化DNA低聚核苷酸序列获自Trilink Bio Technologies(Trilink，San Diego，CA，USA)。衍生40nm纳米颗粒所使用的单链的51mer DNA低聚核苷酸的序列为：[5]′-生物素-TCA GGG CCT CAC CAC CTA CTT CAT CCA CGTTCA CTC AGG GCC TCA CCA CCT[3]′。第二单链23mer DNA低聚核苷酸的序列为：[5]1-生物素-GTA CGG CTG TCA TCA CTT AGA CC[3]｀。用生物素化的DNA低聚核苷酸衍生40nm NeutrAvidin纳米颗粒通过如下步骤进行：首先，在不同浓度Tris Borate EDTA(0.01x，0.1x，1xTBE)或磷酸盐缓冲的盐水(0.1x，1x PBS)缓冲液中悬浮纳米颗粒；将针对51mer ss-DNA序列来说，用量为400∶1(DNA：40nm纳米颗粒)比值，而针对23mer ss-DNA序列来说，用量为6500∶1(DNA：40nm纳米颗粒)比值的ss-DNA低聚核苷酸加入到该混合物中；一旦添加DNA，则在高速度下涡流溶液20秒，然后允许反应约20分钟。对于40nm DNA衍生的纳米颗粒实验来说，通过添加0.5μL原料溶液到299μL合适的缓冲液内，制备DNA纳米颗粒混合物。对于200nm纳米颗粒实验来说，将0.5μL原料溶液加入到299μL合适的缓冲液内。最后，将1μL 10.14μm聚苯乙烯颗粒原料溶液加入到该样品中，然后缓慢地混合样品约10秒。该样品准备用于施加到微阵列操作盒装置上。
DEP微电极阵列装置
这些研究所使用的微电极阵列装置获自Nanogen(San Diego，CA1USA，NanoChip
Figure BPA00001256923000311
100 Cartridges)。在阵列上的圆形微电极的直径为80微米，且由铂制造。微阵列用10微米厚的多孔聚丙烯酰胺水凝胶层罩面涂布。在形成20微升样品腔室的微流体操作盒内密闭微阵列，所述样品腔室在用玻璃窗覆盖的阵列之上。与各单独微电极的电连接外扣到操作盒的底部上。仅仅用9个微电极的3×3子组来进行DEP。以棋盘格寻址图案形式施加交流(AC)电场到9个微电极上。在这一棋盘格寻址图案中，每一微电极具有与其最邻近的相邻微电极的相对偏压。前面讨论了由这一图案产生的不对称电场分布的相应计算机模型[27]。这一模型表明正DEP场的最大值(高场区域)存在于微电极处(上)和负DEP场的最小值(低场区域)存在于电极之间的区域内。一般地，对于低传导率溶液中的DEP来说，预期60nm DNA和200nm纳米颗粒在微电极上的正或高场区域内浓集[28]，和10微米颗粒在微电极之间的负或低场DEP区域内浓集[29]。针对5x5微电极组，进行前述模型的计算。在每一实验之前，在5分钟的跨度内用200微升合适的缓冲液冲刷微阵列操作盒。允许操作盒静置5分钟，然后用200微升缓冲液再洗涤2次。然后将总计150微升含有纳米颗粒混合物的样品溶液缓慢地注射到操作盒内，操作盒内最终的样品体积保持约20微升。
实验装置、测量、荧光和SEM分析
使用(在我们实验室中设计并构造)定制的转换系统，控制微阵列装置，所述定制的转换系统便于对施加到100个微电极每一个上的电压单独控制。使用Agilent 33120A Arbitrary Function Generator (Agilent，Santa Clara，CA，USA)，设定微电极在合适的AC频率和电压下。在10V峰值到峰值(pk-pk)下，AC频率范围为1000Hz-10,000Hz。所有实验所使用的波形为正弦。在JenaLumar epifluorescent显微镜(Zeiss，Jena，Germany)中，使用合适地激发和发射的滤光器(绿色荧光Ex 505nm、Em 515nm；红色荧光Ex 585nm、Em 605nm)，使用10x PL Fluotar物镜，观察实验。使用Optronics 24-bit RGB CCD照相机(Optronics，Goleta，CA，USA)，捕获背景光和荧光图象二者。使用与桌面计算机相连的Canopus ADVC-55影像撷取卡(Canopus，San Jose，CA，USA)，使用Adobe Premiere Pro(Adobe Systems Inc，San Jose，CA，USA)或Windows Movie Maker，处理图象数据。在0分钟、30秒、1分钟、2分钟、4分钟、8分钟、16分钟和20分钟的时间点处，通过输入影像的单独的荧光图象框到MATLAB(Mathworks，Natick，MA，USA)中，分析最终的荧光数据。使用Excel创建图表，其中的数据通过MATLAB分析微电极上的荧光强度读数而收集。使用下述数据生成图表：σp(对于200nm)＝18mS，σp(对于40nm+DNA)＝50mS Ks＝0.9nS，εp＝2.55ε0。r＝30nm & r＝100nm.f＝3kHz.。在DEP实验的结论之后，FCOS微阵列具有全部从其表面上除去的流体，并使用Phillips XL 30扫描电镜(SEM)观察。使用SEM描绘在微阵列表面上最终纳米颗粒层的图象。
在本说明书中参考文献包括下述：
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Claims (18)

1.分离样品流体内的生物材料的样品加工装置，该装置包括：
至少一个入口，所述入口接收样品流体流并导引样品流体流到电极阵列上；和
至少一个出口，所述出口接收来自电极阵列的样品流体流；
其中电极阵列包括多个电极，其构造使得至少一个子部分的电极可荷电不同于其余子部分的电极，从而根据不同荷电的电极，建立电极的不同荷电的介电电泳(DEP)力区域，并根据不同荷电的DEP力区域，引发生物材料的分离。
2.权利要求1的样品加工装置，其中电极阵列包括：
分布在入口和出口之间的装置的平面区域内的多个交流(AC)电极；
与AC电极相邻排列的多个直流(DC)电极。
3.权利要求2的样品加工装置，其中DC电极延伸到AC电极的平面区域外侧。
4.权利要求2的样品加工装置，其中AC至少一个子部分的电极接收与其余AC电极不同电流频率的AC电流。
5.权利要求1的样品加工装置，其中电极由耐受电解作用导致的腐蚀的坚固材料构造。
6.权利要求1的样品加工装置，其中多孔材料的贴面层位于电极上，以便多孔材料耐受电解作用导致的腐蚀。
7.权利要求1的样品加工装置，进一步包括分析物流体经其导引离开装置的至少一个分析物出口。
8.分离生物材料的系统，该系统包括：
权利要求1的样品加工装置；和
为样品加工装置的电极选择性提供能量和引发生物材料的分离而构造的控制器。
9.权利要求8的系统，进一步包括相关的检测系统以供监控分离过程和分析生物材料中的分离的生物组分。
10.分离生物材料的方法，该方法包括：
接收生物材料到具有电极阵列的样品加工装置内，所述电极阵列具有多个电极，其构造使得至少一个子部分的电极可荷电不同于其余子部分的电极，从而根据不同荷电的电极，建立电极的不同荷电的介电电泳(DEP)力区域；
给电极选择性提供能量，并根据不同荷电的电极，建立电极的不同荷电的DEP力区域；和
根据不同荷电的DEP力区域，分离生物材料成在样品加工装置的分析物出口处接收的至少一个分离的分析物组分，和生物材料的其余组分。
11.权利要求10的方法，进一步包括监控分离过程并分析分离的生物组分。
12.权利要求10的方法，其中分离包括保持至少一类生物材料在电极子部分之一处，该方法进一步包括：
引入试剂到样品加工装置内；和
使引入的试剂与被保持的生物材料在样品加工装置内反应。
13.权利要求12的方法，其中该试剂包括荧光染料。
14.权利要求12的方法，其中该试剂包括抗体。
15.权利要求12的方法，其中反应包括对被保持的生物材料进行PCR操作。
16.分离生物材料的系统，该系统包括：
两个或更多个分离电极腔室结构，其中各自具有电极，所述电极腔室结构组被具有孔隙(出孔、孔穴)的内部腔室结构隔开，所述孔隙允许电场从外部电极腔室穿过内部腔室，在其内接收生物材料的内部腔室的入口，从内部腔室中接收生物材料的分离组分的至少一个分析物出口，和接收生物材料其余组分的另一出口；
给电极选择性供应能量和引发生物材料的分离而构造的控制器，以及用以监控分离过程并分析分离的生物组分的相关检测系统。
17.分离生物材料的方法，该方法包括：
接收生物材料到内部腔室结构内，所述内部腔室结构具有外部电极腔室结构，接收生物材料的入口，从内部腔室中接收生物材料的分离组分的至少一个分析物出口，接收生物材料的其余组分的出口，和监控分离过程并分析分离的生物组分的相关检测系统；给电极选择性供应能量；和
分离生物材料成在内部腔室结构的分析物出口处接收的至少一种分离的分析物组分，和生物材料的其余组分。
18.权利要求11-15任何一项的方法，其中使用所述方法，进行分子、聚合物、纳米组分，其中包括DNA和蛋白质衍生的纳米颗粒、量子点、纳米管和类似物，和中等规模组分的辅助自组装成较高阶的三维结构、材料和装置。
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