CN104884957B - 微阵列基板上的生化分子的分离方法 - Google Patents

微阵列基板上的生化分子的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在微阵列基板上分离生化分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供微阵列基板，所述微阵列基板上附着有根据各斑点单元而分类的不同种类的生化分子的簇，所述各斑点单元规则地布置在所述微阵列基板上；获得所述生化分子的簇中的所需簇所位于的个体斑点的位置信息；根据所述位置信息将用于施加能量的提取工具定位以分离所需簇；以及使用所述提取工具通过以接触或非接触的方式施加能量，从而从所述微阵列基板上分离该所需簇。

Description

微阵列基板上的生化分子的分离方法
技术领域
本发明涉及微阵列基板上的生化分子的分离方法，和所述分子的分离系统。
背景技术
微阵列合成技术是用于同时平行地合成各种不同生化分子的技术。各种生化分子固定在所合成微阵列的固体基板上，并保持数厘米(cm)至数微米(μm)的合适间隔。将所合成的生化分子文库以固定在固体基板上的状态使用或从所述基板上除去后以溶液状态使用。例如，将所合成的生化分子文库用于各种遗传信息分析，例如基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、全基因组关联研究(GWAS)和基因表达分析等，并且所述生化分子文库的应用作为关键要素通过shRNA文库制造和筛选以及基因合成等，已经促进了与基因功能分析相关的生命科学、生物技术和生化领域的开发。但是，在大多数领域未引入有效地分离构成合成文库的不同种类的分子的方法。因此，在通常使用合成文库的情况下不同种类的生化分子必须批次处理。目前，这对于拓展生化分子文库的应用而言是主要的障碍。
例如，2004年报道了使用在微阵列上合成的DNA文库组装基因的研究[JingdongTian等,Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips,Nature 432,1050-1054(2004)]。但是，由于溶液中混合的不同DNA序列种类的复杂性，难以将该研究放大为经济规模。对于生化分子文库中的DNA文库，当通过聚合酶链式反应(PCR)使用特异性引物选择性地扩增特定序列时，能够提供与分离不同种类的序列相同的效果。报道了通过此类方法进行的成功基因组装[Sriram Kosuri等,Scalable gene synthesisby selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips,NatureBiotechnology 28,1295-1299(2010)]。但是，将此类方法应用于所有不同序列在经济上是不可行的，并且该方法仅适用于DNA文库。即，不利的是，该方法不能应用于肽或蛋白文库。因此，本发明人提出了在微阵列上的合成生化分子中仅对存在于特定斑点上的所需生化分子进行选择性分离和收集的技术，以克服这种技术限制，并单独地应用不同种类的生化分子。
发明内容
技术方案
根据本发明的一个方面，以上和其他目标可以通过提供微阵列基板上生化分子的分离方法来实现，所述方法包括：提供微阵列基板，所述微阵列基板上附着有根据各个斑点单元(spot unit)而分类的不同种类的生化分子的簇，所述各个斑点规则地布置在所述微阵列基板上；获得所述生化分子的簇中的所需簇所位于的各个斑点的位置信息；根据所述位置信息将用于施加能量的提取工具定位以分离该所需簇；并使用所述提取工具通过以接触或非接触的方式施加能量，从而从所述微阵列基板上分离该所需簇。
根据本发明的另一方面，提供一种用于在微阵列上分离生化分子的系统，所述系统包括：配备有微阵列基板的载台(stage)，所述微阵列基板上附着有根据各斑点单元(spot unit)而分类的不同种类的生化分子的簇，所述各个斑点规则地布置在所述微阵列基板上；提取装置，所述提取装置用于以接触或非接触的方式施加能量，从而从所述微阵列基板上分离所述生化分子的簇中的所需簇；和控制装置，所述控制装置用于将所述微阵列基板的特定区域定位以使所述区域对应于所述提取装置，从而分离所需簇。
有益效果
本发明涉及单个地分离微阵列基板上的生化分子的方法，和用于该方法的系统。虽然已经不断地开发用于在微阵列基板上合成各种分子的技术，但是尚未开发出用于有效地分离所合成的分子的技术。因此，微阵列的使用受限制，并且不利的是其应用效率在特定情况下较低。将位于特定斑点中的基板部分与微阵列分离的效果与从文库选择性的分离特定生化分子的效果相同。随后，将选择性收集的生化分子以对于另外的后处理而言足够的物理间隔点成点的方式，或者以在分子间放置特定结构使所述分子不混合的方式，可以单独地使用文库组分。结果，减少了生化分子的复杂性，因此可以更容易地使用所述文库，由此增加化学反应的效率。所以，通过本发明能够进一步扩展微阵列的应用。并且在诸如靶向再测序和基因合成等之前已经使用的领域中能够进一步提高使用微阵列的频率。
附图说明
从以下具体实施方式结合附图会更清楚地理解本发明的以上和其他目的、特征和其他优点，其中：
图1是图示根据本说明书中公开的技术的一个实施方式的分离方法的工艺流程图；
图2是图示根据本说明书中公开的一个实施方式的分离方法的示意图；
图3图示根据本图示书中公开的一个实施方式的微阵列基板上的生化分子的分离方法。
图4是图示根据本图示书中公开的一个实施方式的用于在微阵列基板上分离生化分子的系统的示意图；
图5是图示微阵列上的生化分子的分离原理的示意图；
图6图示使用微阵列上的生化分子的分离系统提取所需生化分子的各种实施方式；
图7图示实验中使用的DNA序列的实施方式；
图8图示基板的连接有生化分子的部分，所述生化分子由于通过微阵列上的生化分子的分离系统所施加的能量而分离；
图9图示由微阵列上的合成生化分子结合的不同生化分子文库；
图10图示当基板的连接有生化分子的部分通过用于在微阵列基板上分离生化分子的系统所施加的能量而分离时，微阵列上的合成生化分子和由所述生化分子结合的其他生化分子文库的分离；
图11图示的结果证明，当使用所述系统分离微阵列上的生化分子，特别是DNA时，虽然进行脉冲激光照射，但是分离的DNA可以稳定地扩增而没有生化突变；
图12图示的结果证明，微阵列上的全部分子中只有所需生化分子可以被选择性地分离和扩增；
图13图示的结果证明，微阵列上的不同DNA序列中，仅所需DNA序列可以被选择性地分离，并且所分离的DNA序列与所需的DNA匹配；和
图14图示的结果证明，微阵列上的不同DNA序列中，仅所需DNA序列可以被选择性地分离，并且所分离的DNA序列与所需的DNA匹配。
具体实施方式
由于微阵列上的合成生化分子文库的物理坐标彼此邻近，因此难以通过常规方法单个地分离，该文库通常与其他文库类型一样被批次处理。本发明中公开的技术涉及用于通过微结构操作技术将微阵列基板的一部分选择性地与微阵列分离，从而单独地分离和收集生化分子。这是可行的，因为存在于微阵列上的所需生化分子以物理或化学方式与微阵列基板结合。因此，将具有特定斑点的基板部分与微阵列分离的效果与从文库中选择性分离特定生化分子的效果相同。
随后，将选择性收集的生化分子以可以进行另外的后处理的足够的物理间隔点成点，或者在分子间放置特定结构使所述分子不混合，可以单独地使用文库组分。
下文中，本发明会通过参照附图解释本发明的实施方式而详细地进行描述。出于说明目的，提供足以对本领域技术人员传递本发明范围的下述实施方式。因此，本发明不限于下述实施方式，并且可以通过其他实施方式规定。此外，在图中，可以夸大构成要素的宽度、长度和厚度等。通常，从观察者的角度对图进行解释，当提到一个要素在另一要素“上”时，其可以“直接”在另一要素上，或可以“间接”形成从而使得还存在中间要素。
根据本发明的一个实施方式，提供微阵列基板上的生化分子的分离方法。图1是图示根据本说明书中公开的技术的一个实施方式的分离方法的工艺流程图。在步骤S1中，不同种类的生化分子的簇以各斑点单元的形式附着在微阵列基板上，并且提供其上规则地布置有各个斑点的微阵列基板。表达“不同种类的生化分子”可以表示基于通常的生化分类而完全不同的生化分子，如核酸和蛋白质之间的关系。作为选择，表达“不同种类的生化分子”可以表示具有相似生化组成但是部分不同的生化分子，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶那样。作为选择，表达“不同种类的生化分子”可以表示具有不同序列的核酸分子，但不限于此。
表达“簇”是指具有相同生化结构或通过不完全化学反应等稍微修饰的结构的分子的集合。通常而言，将簇归类在斑点单元中，所述斑点可以具有1nm～5mm，优选100nm～1mm，更优选300nm～1mm，还更优选1μm～500μm，特别是5μm～100μm的直径或主轴。
表达“各斑点”可以具有优选以1:1的比例与所述簇对应的结构。所述斑点可以具有1nm～5mm，优选100nm～1mm，更优选300nm～1mm，还更优选1μm～500μm，特别是5μm～100μm的直径或主轴。
表达“规则地布置”是指布置的形状使得通过连接斑点中心画出等腰三角形、直角三角形、等边三角形、菱形、平行四边形、长方形、正方形、正五边形、正六边形、或正八边形至正三十边形，优选等边三角形、长方形、正方形、正六边形，更优选长方形、正方形或正六边形，但不限于此，并且包含具有规则性的所有设计。斑点之间的间距可以为1nm～5mm，优选100nm～1mm，更优选300nm～1mm,，还更优选1μm～500μm，特别是5μm～100μm。
通常而言，基板是指诸如玻璃和硅等的固态。但是在本发明中，基板包括凝胶，诸如聚丙烯酰胺和琼脂糖，并可作为更广义的概念使用。
微阵列基板上的生化分子可以包括核酸、肽、多肽、蛋白质、脂质体和其组合。此外，期望使用当施加能量时结构稳定并且可以使用经济的生化方法扩增的核酸。
核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、异核酸(XNA)、合成核酸、经修饰核酸和其组合。考虑到施加能量时其结构稳定性和所提取的生化分子的生物技术利用，优选使用DNA或RNA。
所述分子的生物技术利用可以包括DNA或RNA的扩增。DNA或RNA的扩增可以通过诸如聚合酶链式反应(PCR)等使用聚合酶的方法、体外转录、逆转录、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、细胞内融合、细胞内克隆或其组合进行。
核酸的3’末端可以通过连接物固定在微阵列基板上。连接物通过共价键稳定地固定分子。此外，当与将5'末端通过连接物固定在基板上的方法相比，将3'末端通过连接物固定在微阵列基板上的方法可以进一步使能够合成的核酸类型延伸。这是由于，在用于核酸合成的大多数亚磷酰胺单体中，根据化学合成方法将所合成的核酸的3'末端通过连接物固定在微阵列基板上。
该微阵列可以通过各种原位合成方法制造，例如喷墨打印[A.P.Blanchard等,High-density oligonucleotide arrays,Biosensors&Bioelectronics 11,687-690(1996)]、光刻[Stephen P.A.Fodor等,Light-directed,spatially addressableparallel chemical synthesis,Science 251,767-773(1991)]和电化学方法[DonaldD.Montgomery,US 6093302,Electrochemical solid phase synthesis]等。此外，微阵列可以通过下述方法制造：其中将不同种类分子中的每一种单独地放置在基板上的各个单独位置上的点成点方法[Mark Schena等,Quantitative monitoring of gene expressionpatterns with a complementary DNA microarray,Science 270,467-470(1995)]、大面积转移法或复制法[Haohao Lin等,Replication of a DNA microarray,JACS 127,11210-11211(2005),Haohao Lin等,Replication of a DNA microarray from zip codemasters,JACS 128,3268-3272(2006)]。在通过转移或复制制造的微阵列的情况下，微阵列基板的性质可以不同于原始微阵列的性质，由此当在提取步骤对其施加能量时可以有利地增加效率。此外，通过微阵列的复制，可以降低单位成本，并且可以有利地制造多个相同的斑点。
如上所述，不特别限制微阵列的类型，只要微阵列具有其中生化分子通过共价键或吸附等附着至基板表面的类型即可。但是，优选使用利用固相合成制造的微阵列，其中生化分子的单体连续地在固态载体上合成。在固相合成中，平行方法是可行的，合成中使用的试剂量可以最小化，因此在分离所合成的微阵列的各个斑点之后的扩增比通常的生化分子合成法更经济。例如，在纳摩尔尺度以上，在通过固相合成制造DNA微阵列后分离各DNA的方法比通过受控孔径玻璃(CPG)柱合成各DNA的方法更经济。
固相合成可以包括使用亚磷酰胺、FMOC或BOC等固相合成生化分子，优选使用亚磷酰胺固相合成核酸。在目前使用的固相合成方法中，由于使用亚磷酰胺固相合成核酸具有最高的偶联效率，所需生化分子可以正确地合成。此外，在从微阵列上分离核酸的情况下，本说明书公开的技术的效率增加，并且生化分子在其提取后的效率可以最大化。
可以将诸如其他分子或其他细胞等材料利用在微阵列上合成的生化分子通过偶联或吸附而引入微阵列。由于在微阵列上合成的生化分子可以具有不同的分子结构，可以基于因结构差异导致的化学特征区分不同的文库。因此，基于所述差异而分离微阵列的各个斑点，从而可以提供分离不同文库的效果。不同文库是指诸如核酸、经修饰核酸、蛋白质、肽或脂质体等生化分子的文库，诸如小分子等化学分子文库，病毒文库，或诸如大肠杆菌、酵母、白细胞、癌细胞和干细胞等细胞文库。此外，不同文库可以包括具有1aL～1μL体积的材料的文库。作为所需的在微阵列上合成的生化分子和不同文库的组合，存在核酸和核酸的组合，核酸和核酸结合蛋白的组合，核酸结合蛋白和核酸的组合，核酸和表面上展示有核酸结合蛋白的细胞的组合，以及核酸和表面上具有核酸结合蛋白的病毒的组合。以上组合列表具有利用其组成和其生化特征的知识进行分选的优点。核酸结合蛋白的实例包括锌指和转录激活子样效应子(TALE)等。更广义地说，核酸结合蛋白的实例包括经由DNA或RNA与DNA或RNA结合的RecA、Cas9、转座体。
微阵列基板可以是从模板复制的基板、其中包含牺牲层的基板、表面包被有牺牲层的基板、进行通过电磁场发生的相变的基板以及其组合。当在提取步骤对其施加能量时，这些基板可以具有有利改善的效率。期望将牺牲层放在微阵列基板上以增加生化分子的提取效率，并且同时，通过牺牲层吸附施加至生化分子的能量而使损伤最小化。玻璃可以用作通过降低透光率或增加吸光度以吸收能量的牺牲层。或者也可以使用通过降低透光率或增加吸光度以吸收能量的硅。
此外，可以在固体表面上涂布牺牲层诸如玻璃或硅等，并且内部存在诸如玻璃或硅等固体，但是本发明不限于此。展现通过电磁场发生的相变的基板是指通过电磁场而临时或永久液化、气化或转换成等离子体的固体基板。从模板复制的基板是指通过大面积转移或复制而制造的微阵列基板[Haohao Lin等,Replication of a DNA Microarray,JACS127,11210-11211(2005),Haohao Lin等,Replication of a DNA Microarray from ZipCode Masters,JACS 128,3268-3272(2006)]。
步骤S2中，获得在微阵列基板上点成点的生化分子的簇中所需簇的一条位置信息。虽然确定在微阵列基板上点成点的生化分子的位置信息的时间不受特别限制，但是可以优选在合成所述生化分子之前确定位置信息。虽然可以以诸如文档和计算机文件等各种类型提供位置信息，优选以计算机文件类型提供位置信息，从而与主要由计算机构成的控制装置一起相互工作。
另外，由于位置信息是虚构值，优选在步骤S3之前进行用于所需簇的实际斑点的搜索工序。在大多数情况下，由于微阵列是规则地布置的，当精确地设置对照点时，可以通过计算与对照点的距离而容易地确认实际斑点。对照点可以是微阵列基板的角、位于基板上的特定标记或特定斑点。此外，当搜索特定斑点时，还可以包括使用荧光分子的标记方法和通过显微镜的成像工序。
在步骤S3中，用于施加能量的提取工具根据位置信息分离所需簇。提取工具的实例包括下述S4步骤的能够以接触或非接触方式施加能量的各种装置。提取装置可以与可移动设备组合以提供移动性。可移动设备可以是自动马达，并且可以以优选1mm以下，更优选100μm以下，还更优选5μm以下的精度进行操纵。由于在大多数微阵列中斑点之间的间距为5μm～100μm，可以以特别是5μm以下的精度进行操纵的传动装置(gearing)可以在大多数微阵列中准确地分离所需簇。
接下来，在步骤S4中，以接触或非接触方式使用提取工具施加能量，从而从微阵列基板上分离所需簇。接触方式的实例包括移液和微量抓取(micro grabbing)，非接触方式的实例包括脉冲激光照射和超声波应用。优选的是，通过以非接触方式施加能量而进行存在于特定斑点上的生化分子的选择性收集，从而从微阵列基板上分离所需簇。在该情况下，可以防止交叉污染。
优选的是，可以通过非接触方式中的脉冲激光照射进行脉冲激光烧蚀或照射压力排出(ejection)。在该情况下，分离一部分微阵列基板，并且分离的基板的片段以与所述基板的相反方向行进。在这点上，由于片段的行进途径极为不同，因此可以更容易地收集片段。此外，根据一个实施方式，可以使用脉冲激光来切割生化分子与微阵列基板之间的连接物和生化分子等。
脉冲激光具有10nm～10,000nm，优选20nm～5,000nm，更优选100nm～2,000nm的波长。在包括可见光谱的范围内，电磁场对光学组件没有太大影响，能量可以透射至微阵列基板。此外，由于大多数商业脉冲激光在该范围内运行，可以容易地实现该系统，并且当使用利用牺牲层的基板时，可以无需进行显著的系统改造即可执行本发明公开的技术。
脉冲激光可以具有1as～1ms，优选1fs～100ns的脉冲持续时间。通过施加脉冲持续时间，当发生因脉冲激光导致的脉冲激光烧蚀时行进途径会更固定，因此可以更容易地进行收集。此外，通过施加脉冲持续时间，当发生脉冲激光烧蚀时，可以降低对微阵列基板上生化分子的伤害，由此当进行所分离生化分子的后处理时，可以增加效率。
从微阵列基板分离所需簇的步骤包括将所需簇移动至储器的工序。移动工序是贮存所分离生化分子以及必须与其他反应产物反应时使用所述分子所需的工序。储器可以包括制造成引起物理或化学反应或制造成观察所述反应的容器。此外，储器可以包括制造成贮存生化分子的容器。储器具有1aL～1L，优选1fL～10mL，更优选1pL～500μL的体积，并且此类体积对应于其中通过生化反应分离的生化分子的后处理可以最容易地进行的反应体积。此外，储器可以例如具有微孔阵列结构，其中各个孔的体积为1pL～1μL[David K.Wood等,Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays,PNAS(2010)]，从而通过减少所分离生化分子的化学反应过程中的反应体积而使试剂的浪费最小化。此外，通过使用微孔阵列结构，可以改善在某些反应中的反应速率和效率。
以将所述簇部分或全部地转移至至少一个储器的方式进行从微阵列基板分离所需簇的步骤。通过分离一部分所述簇，对应的生化分子可以使用至少一次，因此，可以减少所合成生化分子的数量。此外，可以从一个储器分离多种所需簇，因此，可以引起生化分子之间的化学反应。
根据本发明的一个实施方式的微阵列基板上的生化分子的分离方法还可以包括在分离步骤后扩增从微阵列基板分离的所需簇的步骤。存在于通常微阵列基板上的生化分子的量对于在通常使用的储器(其单位为μL)中进行化学反应可能是不足的。因此，根据生化分子的目的，可以通过在分离步骤后进行扩增步骤而拓展所分离生化分子的应用范围。所需簇可以优选是核酸，因为与其他生化分子或经由生化分子附着的其他文库相比，核酸的扩增更容易和更经济。扩增的核酸优选是DNA或RNA。DNA或RNA可以通过诸如聚合酶链式反应(PCR)等使用聚合酶的方法、体外转录、逆转录、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、细胞内融合、细胞内克隆或其组合进行扩增。
根据本发明一个实施方式的微阵列基板上的生化分子的分离方法还可以包括将从微阵列基板分离的所需簇或其化学反应产物测序，或者将其用于基因合成。所需簇可以是核酸，优选DNA。化学反应产物可以是扩增的生化分子，优选扩增的核酸，更优选扩增的DNA。
可以使用所分离的生化分子或分离后扩增的生化分子来制备用于靶向测序以及外显子组测序或全外显子组测序(WES)的捕获探针。所分离的生化分子或分离后扩增的生化分子优选是DNA或RNA。例如，当DNA分子存在于微阵列上时，可以分离并扩增所述DNA分子，并且将所扩增的DNA分子与gDNA通过转录等进行杂交，可以仅选择性地收集特定序列，通过分析所收集的序列，可以有效地进行靶测序或外显子组测序。具体而言，由于各个捕获探针是分开的，因此可以通过控制各个探针的浓度而有意地控制捕获效率。如果存在于微阵列上的DNA分子的量是足够的，可以无需扩增即可进行杂交后的工序。
可以使用扩增、连接、组装PCR、等温组装[Daniel G Gibson等,Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,Nature Methods 6,343-345(2010)]，和成对组装[William J.Blake等,Pairwise selection assembly forsequence-independent construction of long-length DNA,核酸Research 38,2594-2602(2010)]等的至少一种将分离的核酸组装到基因中。
图2是图示根据本说明书中公开的一个实施方式的分离方法的示意图。(a)表示微阵列基板上合成的不同种类的生化分子。将生化分子通过共价键或吸附等固定在微阵列基板上。如(b)中所示，当将脉冲激光通过聚光器或透镜照射至微阵列基板的所需位置时，发生脉冲激光烧蚀或照射压力排出，因此一部分微阵列基板从整个基板上分离。结果，分离的微阵列基板掉向储器，并且因为对应于所需位置的生化分子固定在分离的基板上，可以将所需生化分子分离至储器中。在(c)中表示的其他所需生化分子的情况下，也可以进行(b)。
图3图示根据本说明书中公开的一个实施方式的微阵列基板上的生化分子的分离方法。参照图3(a)，可以将一种生化分子全部分离到储器中。此外，参照(b-1)和(b-2)，可以将相同的生化分子如上所述分离到不同储器中。通过部分地分离所述簇，相关的生化分子可以使用至少一次，因此，可以减少所合成生化分子的数量。此外，多种生化分子可以如(c)所图示的那样同时分离到一个储器中或者如(d-1)和(d-2)所述通过时间间隔进行分离。通过将多种所需簇分离到一个储器中，可以引起生化分子间的化学反应。
根据本发明的另一实施方式，提供用于在微阵列上分离生化分子的系统。图4是图示根据本说明书中公开的一个实施方式的用于在微阵列上分离生化分子的系统的示意图。本发明提出的该系统包括：配备有微阵列基板的载台，所述微阵列基上板附着有根据各斑点单元而分类的不同种类的生化分子的簇，所述各个斑点规则地布置在微阵列基板上；提取装置，所述提取装置用于以接触或非接触的方式施加能量，从而从所述微阵列基板上分离所述生化分子的簇中的所需簇；和控制装置，所述控制装置用于将所述微阵列基板的特定区域定位以使所述区域对应于所述提取装置，从而分离所需簇。
根据一个实施方式，提取装置可以包括脉冲激光光源和聚光器。聚光器优选是用于收集脉冲激光能量并且同时用于将微阵列基板成像的光学透镜。脉冲激光可以准确地在所需时间点照射至基板上待分离的斑点，这通过使用诸如通常的计算机等控制装置控制脉冲激光发射而进行。光学透镜可以具有2X～100X，优选10X～40X的放大率。通过使用该放大率，适于分离的能量可以透射至微阵列基板并且防止透镜和微阵列基板相互接触，或防止脱离焦距。
根据一个实施方式，在微阵列上分离生化分子的系统中，载台、提取装置和控制装置中的至少一个可以以1mm以下、优选100μm以下、更优选5μm以下的精度操纵。由于大多数微阵列中斑点之间的间隔为5μm～100μm，在大多数微阵列中以5μm以下的精度操纵的载台、提取装置和控制装置可以准确地分离所需簇。
根据一个实施方式，所述系统还包括用于观察微阵列基板以分离所需簇的成像装置。成像装置可以由光学透镜、光源和图像传感器中的至少一个组成。光学透镜可以包括在提取装置中，并且必要时，可以另外单独地使用光学透镜。
光源的波长可以是10nm～10,000nm，优选50nm～2,000nm，更优选100nm～1,500nm。在波长范围内，可以使用荧光或可见光最容易地观察或测量微阵列。作为光源，例如可以使用卤素灯。
作为图像传感器，通常使用电荷耦合装置(CCD)，但是本发明不限于此。在步骤S2中，获得其中在微阵列基板上的所述生化分子的簇中的所需簇位于的个体位点的位置信息后，可以使用成像装置来确认所述斑点是否存在于所述位置中。此外，成像装置可用于确认在步骤S3中，用于施加能量的提取工具被准确地定位，从而根据所述位置信息分离所需簇。此外，可以使用成像装置来确认在步骤S4中，从微阵列基板分离的所需簇是否存在于储器内。
根据一个实施方式，还可以包括装备有用于收集分离的所需簇的储器的单独的载台。载台可以以1mm以下，优选100μm以下，更优选1μm以下的精度操纵。配备有储器的单独的载台可以有利于分离的生化分子的利用，并且具有1μm以下的精度的载台可以将生化分子分离到具有1pL～1μL微孔阵列结构的储器中。
图4图示用于在微阵列上分离生化分子的系统的一个实施方式。所述系统分成上部系统和下部系统。上部系统通过计算机控制，并且由上部载台(机动化XY载台)，与其下部相连的微阵列基板、脉冲激光和上部成像装置组成。
由远焦光学系统组成的上部系统可以通过光学透镜的上下轴移动来观察微阵列基板的斑点，并且同时，控制和确定脉冲激光的斑点位置。光学透镜还充当聚光器，这是因为成像面和脉冲激光斑点以相似的位置设置于其中。脉冲激光斑点是指其中脉冲激光能量通过聚光器集中的位置。当将脉冲激光斑点的位置输入算法时，通过将经由CCD传递的像素数据与实际微阵列上斑点的物理位置进行比较而提取各个相应生化分子存在的物理位置。当将具有所需特定生化分子的微阵列斑点的位置信息提供至配备有微阵列基板的上部载台时，脉冲激光斑点移动至相关斑点。同时，将下部载台和作为储器的PCR板(所配备的相关基板)定位成在Z轴方向上最接近上部基板，从而使得储器或PCR板的孔在下部位置连续地接收分离的微阵列片段。
将通过聚光器集中的脉冲激光束照射至微阵列基板，并通过因脉冲激光烧蚀或照射压而产生的膨胀压，使微阵列基板的相关斑点推向充当下部储器的PCR板。聚光器可以是光学透镜，并且例如具有2X～100X的放大率。下部系统具有在下部系统的向上方向上附着并充当储器的PCR管支架或PCR板，并且由成像装置和能够沿着Z轴方向移动的下部载台(机动化XYZ载台)构成。在下部成像装置中，能够使用可以穿透成像的储器，从而在收集从微阵列分离的片段时进行光学确认，或从而确定孔的物理参考位置。例如，储器的实例包括各种容器类型，例如由透明塑料材料制造的平底储器和平底PCR板。通过使用储器的平底，源自下部成像装置的光源的光的途径受影响较少，因此可以容易地进行成像。此外，由于微阵列特性，当通过上部成像装置进行观察时，仅通过微阵列基板的外观就可以容易地确认基板是否通过对微阵列基板施加足够的能量而分离。因此，可以使用用于提供成像装置的穿透光的下部成像装置。
例如，在其中基板分离的微阵列基板的情况下，可以使用光穿透的变化判断基板的分离。
图5是图示提取固体支持体的原理的示意图。参照图5，当通过光学透镜集中脉冲激光束时，脉冲激光烧蚀或照射压(辐射压排出)导致的膨胀压在脉冲激光斑点处起作用，因此，一些基板分离，并从微阵列基板释放。
可以使用各种方法利用脉冲激光来分离微阵列基板上的生化分子。其提取方法的实例包括对具有合成生化分子的微阵列基板、包含生化分子的单独微阵列基板或具有经由生化分子结合或吸附的另一文库的微阵列基板照射脉冲激光束。
图6图示使用微阵列基板上的生化分子分离系统提取生化分子或相应斑点的各种实例。参见图6，(a)是对位于微阵列基板的下部的生化分子的斑点在背部进行光照射并向下推的通常方式。在与(a)类似的(b)中，通过在生化分子和微阵列基板之间放置与生化分子的反应无关的牺牲区域并用集中的光照射该牺牲区域而使对生化分子的损伤最小化。在与(a)相同的(c)中，照射光从下部向上部方向行进，并且其上固定有生化分子的微阵列的片段移动至具有粘附性的新基板，由此片段和生化分子的斑点被固定，并且而不由于重力从其上掉落。(d)图示在一个试管中收集具有相同生化分子类型或不同种类生化分子的至少一个微阵列片段的方法。(e)图示在一个试管中收集各种微阵列片段的方法。(f)图示当其上固定有生化分子的微阵列基板是光学不透明的，因此不能进行背面入射时，对具有孔的前侧集中脉冲激光并提取至储器的方法，储器中可以进行穿透成像，并且储器位于与入射光的照射方向相同的方向。脉冲激光的集中斑点有意地在孔中心或微珠中心的外侧，以增加微珠的分离效率。(g)中，当微阵列基板为光学不透明时进一步引入诸如半透明基板等单独的基板以容易提取。单独的基板可以由粘合性的硬化性材料构成，以从微阵列基板转移其中合成了所需生化分子的斑点。其中合成有所需生化分子的斑点与单独的基板分离开，同时保持位置信息，然后可以通过与(a)～(e)相同的方法进行提取。另外，单独的基板包括从模板复制的基板、其中包含牺牲层的基板、表面包被有牺牲层的基板、进行通过电磁场发生的相变的基板以及其组合。基板具有在提取步骤中施加能量时效率增加的优点。优选的是，牺牲层可以放置在微阵列基板上，由此提取效率通过牺牲层的能量吸收而增加，并且基本上同时通过减少赋予生化分子的能量的总量而使对生化分子的损伤最小化。牺牲层可以是其中通过减少透射率或增加吸光度而增加能量吸收的玻璃，或者其中通过减少透射率或增加吸光度而增加能量吸收的硅。此外，可以将牺牲层涂布在诸如玻璃或硅等的固体表面上，并且可存在于诸如玻璃或硅等固体内，但是本发明不限于此。表述“进行通过电磁场发生的相变的基板”是指通过电磁场而临时或永久液化、气化或转换成等离子体的固体基板。表述“从模板复制的基板”是指通过大面积转移或复制而制造的微阵列基板[HaohaoLin等,Replication of a DNA microarray,JACS 127,11210-11211(2005),Haohao Lin等,Replication of a DNA Microarray from Zip Code Masters,JACS 128,3268-3272(2006)]。
除了上述实例之外，还有各种使用脉冲激光分离微阵列基板上的生化分子的方法。
图7图示本实验中的DNA序列的实例。为了在分离微阵列基板上的DNA之后扩增所分离的DNA，将通用序列附着至序列的两端，由此可以使用一个引物扩增不同的序列。通用序列是TGCGTGTCTCCGACTC的5'末端和CGCCAGTGTGCTGGAATT的3’末端。但是，即使当通用序列仅存在于5’末端、3’末端或不是序列末端的斑点部分处时，或者不存在通用序列时，本发明的技术也可以应用。
图8图示基板的连接有生化分子的部分，所述部分由于在微阵列上分离生化分子的系统施加的能量而分离。微阵列基板由玻璃构成，并且使用波长为532nm的脉冲激光照射，持续纳秒时间。用虚线圈标记的部分是通过用脉冲激光照射而部分分离的微阵列基板部分。
图9图示通过微阵列上的合成生化分子结合的不同生化分子文库。微阵列上合成的生化分子是DNA，并且不同的生化分子文库是在其5’末端连接有荧光素亚酰胺(FAM)的DNA，荧光素亚酰胺(FAM)是一种荧光素分子。微阵列上合成的DNA的一部分具有与不同的DNA文库的部分序列互补的序列。因此，在具有与不同的DNA文库互补的序列的斑点中产生荧光，由此可以证明不同的DNA文库经由合成的生化分子与微阵列结合。
图10图示了当基板的连接有生化分子的部分通过用于在微阵列上分离生化分子的系统施加的能量而分离时，微阵列上合成的生化分子和通过所述生化分子结合的其他生化分子文库的分离。当将左列的图与中间列的图比较时，可以确认当使用脉冲激光对基板的连接有生化分子的部分施加能量时，基板的一部分的荧光消失。另一方面，由于在除了所述基板部分的其他区域连续地观察到荧光，可以确认，由于照射至所述基板部分的脉冲激光导致所述基板部分从微阵列分离，并且包含基板上荧光分子的DNA也分离。可以根据右列的图确认微阵列基板的分离。
图11图示的结果证明，当使用所述系统分离微阵列上的生化分子，特别是DNA时，虽然进行脉冲激光照射，但是分离的DNA可以稳定地扩增而没有生化突变。图11中，仅使用与通用序列对应的引物进行对照的聚合酶链式反应。图11中，10X和1X表示用于分离微阵列基板上的DNA的脉冲激光照射的频率。图11中，100bp梯状带是以100bp单位分离的从100碱基对(bp)～1000bp的用于标准物设置的生化分子。诸如UV等具有特定波长的光引起诸如胸腺嘧啶二聚体等DNA损伤，并且当引起DNA损伤时，减少诸如聚合酶链式反应等生化反应的效率。从图11的结果可以确认，虽然脉冲激光以10倍(10X)进行照射，但是可以扩增自所需斑点分离的DNA分子，因此脉冲激光不引起严重的DNA损伤。该结果表明，脉冲激光能量仅集中至微阵列基板，不影响微阵列基板上的生化分子。
图12图示的结果证明，微阵列上的生化分子中，仅所需生化分子可以被选择性地分离和扩增。可以确认，无需成像，仅使用除了用荧光标记的对照点(1,1)、(1,150)和(100,1)之外的四个斑点(20,120)、(40,90)、(60,60)和(80,30)的位置信息就可以发现与所需生化分子对应的斑点，并且通过用脉冲激光照射而分离的所有四个斑点得到成功扩增。当使用激光照射在位于100 X 150阵列上的15,000个斑点中的彼此远离的四个斑点时，DNA从照射的斑点中分离，并且对分离的DNA进行扩增，这表明本说明书公开的技术可以实现。图12中，仅使用与通用序列对应的引物进行聚合酶链式反应。图12中，100bp梯状带是以100bp单位分离的从100碱基对(bp)～1000bp的用于标准物设置的生化分子。
图13图示的结果证明，微阵列上的不同DNA序列中，仅所需DNA序列可以被选择性地分离，并且所分离的DNA序列与所需的DNA序列相同。微阵列基板上的所需DNA可以通过生化分子分离而从基板分离，然后对扩增的DNA进行纯化，之后克隆，然后进行Sanger测序。大多述分离的DNA序列与所设计DNA中的一种DNA的序列以98％的比例相同，并且与其他DNA的序列不同。因此，可以确认，使用本说明书公开的方法可以选择性地分离微阵列基板上的所需DNA分子。由于缺失引起1个碱基错误，这在微阵列合成过程中最可能出现的错误。由于图13的实验中使用的DNA在其两侧具有通用序列，即使DNA序列不同，也可以使用一个引物组扩增DNA。通用序列包括5'末端的TGCGTGTCTCCGACTC和3’末端的CGCCAGTGTGCTGGAATT。不同的13个核苷酸(nt)，其通过13mer的条形码标出，存在于实验中使用的DNA序列的中部。图13的(55,1)、(95,1)和(85,1)表示通过照射脉冲激光从微阵列基板分离出的DNA斑点。图13的“探针编号”是当设计分离的DNA时为了便于随后工作而赋予的随机号码，各个“探针编号”对应于具体的DNA序列。从图13的结果可以确认，存在于微阵列基板上的三个不同斑点中的各DNA可以稳定地分离和扩增，并且扩增序列几乎与起始设计相同。
图14图示的结果证明，微阵列上的不同DNA序列中，仅所需DNA序列可以被选择性地分离，并且所分离的DNA序列与所需的DNA相同。微阵列基板上的所需DNA可以通过生化分子分离方法而从基板分离，然后对扩增的DNA进行纯化，之后克隆，然后进行Sanger测序。大多述分离的DNA序列与所设计DNA中的一种DNA的序列以98％的比例相同，并且与其他DNA的序列不同。因此，可以确认，使用本说明书公开的方法可以选择性地分离微阵列基板上的所需DNA分子。图14中，表述“提交(Query)”对应于DNA的设计序列，表述“检出(Sbjct)”对应于Sanger测序的结果。图14中，表述"ys2 1"表示分离的所需DNA的名称，并且是为了实验方便而随意指定的。图14中，DNA名称"ys2 1"下表示的DNA序列TGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCTGTCTTGTTCGCCAGTGTGCTGGAATT，是指分离的所需DNA的序列。
当将本说明书中公开的技术用于使用微阵列中合成DNA进行基因组装时，通过选择性分离和收集特定DNA片段，合成的DNA可用作组装反应材料，从而合成在微阵列上合成的DNA片段中的靶基因。因此，复杂性降低，由此增加组装效率和经济性。
本说明书公开的技术可以用于靶向测序以及制造用于外显子组或全外显子组测序(WES)的捕获探针。例如，当DNA分子存在于微阵列上时，可以分离所述分子，并通过扩增或转录等与gDNA杂交，可以仅选择性地收集特定序列，通过分析所收集的序列，可以有效地进行靶向测序或外显子组测序。
当本说明书公开的技术用于分离mRNA或cDNA文库时，在于微阵列上合成可以与mRNA或cDNA文库中的特定mRNA或cDNA杂交的特定探针序列之后，将各个mRNA或cDNA经由探针通过微阵列与mRNA或cDNA的反应固定在微阵列的特定位置上，可以通过分离其中合成了个体探针的斑点而单独地收集特定mRNA或cDNA。
本说明书公开的技术可用于收集无错误的寡核苷酸。例如，将具有任意DNA序列的随机DNA条码连接至各个寡核苷酸，并通过扩增连接后的序列，然后将一些扩增产物储存并对其中一些测序，可以发现具有无错误寡核苷酸的随机DNA条码[Hwangbeom Kim等,'Shot-gun DNA synthesis'for the high-throughput construction of large DNAmolecules,Nucleic Acid Research 40,e140(2012)]。当在微阵列上合成与随机DNA条码互补的探针时，所合成的探针与寡核苷酸反应，可以将无错误的寡核苷酸固定在各个特定斑点上。随后，当根据本技术分离其中合成各个探针的斑点时，可以选择性地分离寡核苷酸中的无错误寡核苷酸。
当使用本说明书公开的技术时，还可以分离DNA结合蛋白文库。当诸如转录激活子样效应子(TALE)和锌指等DNA结合蛋白与DNA微阵列反应时，收集反应后的微阵列的个体斑点，可以选择性地分离与特定DNA序列结合的蛋白质。
此外，当其中DNA结合蛋白的文库展示在病毒表面上的病毒文库或者其中DNA结合蛋白的文库展示在细胞表面上的细胞文库与DNA微阵列反应并且收集个体斑点时，可以获得产生特定DNA结合蛋白的各病毒或细胞。由于本说明书公开的技术与在微阵列上合成的特定适体组合使用，可以将该技术用于分离各个蛋白。
本说明书公开的技术可用于单独地分离在微阵列上平行合成的RNA分子文库或肽分子文库。
虽然已经出于说明目的公开了本发明的优选实施方式，本领域技术人员会意识到可以进行各种修改、添加和替换而不背离所附权利要求中公开的本发明的范围和精神。

Claims (24)

1.一种分离微阵列基板上的生化分子的方法，所述方法包括：
提供微阵列基板，所述微阵列基板上附着有根据各斑点单元而分类的不同种类的生化分子的簇，直接存在于微阵列上的所述生化分子以物理或化学方式与微阵列基板结合，所述各斑点规则地布置在所述微阵列基板上；
获得所述生化分子的簇中的所需簇所位于的个体斑点的位置信息；
根据所述位置信息将用于施加能量的提取工具定位以分离该所需簇；
使用所述提取工具以接触或非接触的方式施加能量，将微阵列基板的一部分选择性地与微阵列分离，从而从所述微阵列基板上分离出该所需簇；和
通过另外的结构对所选择性地分离的所需簇以不混合的方式收集，
所述微阵列基板是将彼此不同的生化分子文库在整个基板上平行地合成而配置的基板。
2.如权利要求1所述的方法，其中，用脉冲激光照射所述微阵列基板以施加能量。
3.如权利要求2所述的方法，其中，通过用所述脉冲激光照射进行脉冲激光烧蚀或照射压力排出。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述脉冲激光具有10nm～10,000nm的波长。
5.如权利要求2所述的方法，其中，所述脉冲激光具有1as～1ms的脉冲持续时间。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述脉冲激光具有1fs～100ns的脉冲持续时间。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述生化分子包括核酸、肽或其组合。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述肽是多肽。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述核酸包括DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA、XNA、合成核酸、经修饰核酸或其组合。
10.如权利要求7所述的方法，其中，所述核酸的3’末端经由连接物而固定在所述微阵列基板上。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述微阵列基板通过固相合成制造，以在所述微阵列基板的表面上连续地合成所述生化分子的单体。
12.如权利要求1所述的方法，其中，经由在所述微阵列上合成的所述生化分子将其他分子或其他细胞引入所述微阵列。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离包括将该所需簇转移至储器。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述分离通过将所述簇部分或全部地转移到至少一个储器而进行。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述基板包括从模板复制的基板、其中包括牺牲层的基板、表面包被有牺牲层的基板、进行通过电磁场发生的相变的基板、或其组合。
16.如权利要求2所述的方法，其中，照射所述脉冲激光来切断所述生化分子和所述微阵列基板之间的连结。
17.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将分离自所述微阵列基板的所需簇扩增。
18.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将分离自所述微阵列基板的该所需簇或其化学反应产物用于测序工序或基因合成工序。
19.一种用于在微阵列上分离生化分子的系统，所述系统包括：
配备有微阵列基板的载台，所述微阵列基板上附着有根据各斑点单元而分类的不同种类的生化分子的簇，直接存在于微阵列上的所述生化分子以物理或化学方式与微阵列基板结合，所述各斑点规则地布置在所述微阵列基板上；
提取装置，所述提取装置用于以接触或非接触的方式施加能量，将微阵列基板的一部分选择性地与微阵列分离，从而从所述微阵列基板上分离所述生化分子的簇中的所需簇；
控制装置，所述控制装置用于将所述微阵列基板的特定区域定位以使所述区域对应于所述提取装置，从而分离所需簇，和
另外的结构，所述另外的结构用于以不混合的方式收集所分离的所需簇，
所述微阵列基板是将彼此不同的生化分子文库在整个基板上平行地合成而配置的基板。
20.如权利要求19所述的分离生化分子的系统，其中，所述提取装置包括脉冲激光源和聚光器。
21.如权利要求19所述的分离生化分子的系统，其中，所述载台、所述提取装置和所述控制装置中的至少一个以1mm以下的精度操纵。
22.如权利要求19所述的分离生化分子的系统，其中，所述系统还包括用于观察所述微阵列基板从而分离该所需簇的成像装置。
23.如权利要求19所述的分离生化分子的系统，其中，所述系统还包括配备有储器的单独载台，所述储器用于收集分离出的所需簇。
24.一种分离微阵列基板上的生化分子的方法，所述方法包括：
提供微阵列基板，所述微阵列基板上附着有根据各斑点单元而分类的不同种类的生化分子的簇，直接存在于微阵列上的所述生化分子以物理或化学方式与微阵列基板结合，所述各斑点规则地布置在所述微阵列基板上；
获得所述生化分子的簇中的所需簇所位于的个体斑点的位置信息；
根据所述位置信息将用于施加能量的提取工具定位以分离该所需簇；
使用所述提取工具以接触或非接触的方式施加能量，将微阵列基板的一部分选择性地与微阵列分离，从而从所述微阵列基板上分离出该所需簇；和
通过另外的结构对所选择性地分离的所需簇以不混合的方式收集，
通过所述能量施加，所述所需簇从所述个体斑点向所述微阵列基板下面的方向分离而转移到所述另外的结构中，
所述微阵列基板是将彼此不同的生化分子文库在整个基板上平行地合成而配置的基板。
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