KR20170051384A - 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

시료가 적층된 기판을 제공하는 단계; 상기 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택하는 단계; 상기 분리대상 영역에 상당하도록 에너지원을 패턴화하는 단계; 및 상기 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지를 상기 분리대상 영역에 인가함으로써 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시켜 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법이 제공된다.

Description

기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법 {Method for selective sorting of specimens}

본 명세서에 개시된 기술은 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.

바이오 물질을 포함하는 시료에서 높은 순도의 물질이 필요할 때 선택적으로 분리하는 기술이 필요하다. 최근에는 레이저를 이용한 분리기술이 보급되어 분리 대상물질의 양이 제한적이거나 물질의 구별에 시각적인 판단이 필요할 경우라도 효율적인 마이크로 단위의 분리가 가능하게 되었다. 하지만 기술적으로 제한적인 경우가 많이 있으며, 특히 유전적으로 불균질한(heterogeneous) 암 조직 슬라이드에서, 특이적인 형태를 보이는 암 세포만 분리하여 분석하는 등의 작업을 수행하기는 힘들다.

상기 레이저를 이용한 분리기술은 광을 이용한 미세구조 조작 기술, 광을 이용한 미세구조 제작 기술, 레이저 캡쳐 미세절제(Laser Capture Microdissection) 기술 등으로 나눌 수 있다. 이중에서 광을 이용한 미세구조 조작 기술은 일례로 레이저, 펄스 레이저 등의 복사압, 열팽창, 식각, 광 핀셋(optical tweezing) 효과 등을 이용하여 미세 구조물에 물리, 화학적인 변화를 가하는 기술에 해당하고, 광을 이용한 미세구조 제작 기술은 빛에 반응하는 물질에 미세구조로 물리, 화학적인 변화를 가하는 기술에 해당하고, 레이저 캡쳐 미세절제 기술은 레이저를 이용하여 기판 상에 적층된 시료 혹은 기판을 절제 후 분리해내는 기술에 해당한다.

이들 분리기술에 따르면 레이저를 스폿에 집중시켜 분리 대상물질 주위를 태워 오려내는 방식으로 수행되는데, 태우는 방식으로 분리함에 따라 시료에 열적 손상(damage)에 의한 시료의 화학적 변형을 가져오게 된다. 특히 바이오 샘플을 분리하게 될 경우, 분리 후 DNA, RNA, 단백질 등을 분석하게 되는데 손상이 있는 경우 정확한 분석이 이루어질 수 없다.

또한 레이저 미세절단 과정에서 시료가 고정되어 있는 기판을 움직여 레이저로 인가하게 된다. 레이저의 경로를 미세하게 조절하여 물질이 고정된 판을 움직이지 않고 선택한 부위를 분리하는 기술도 있지만 경로 변형에 제한이 있어 크기가 큰 물질을 분리할 경우에는 기판 또한 위치를 조절하여야 한다. 이때 원하는 대상물질 주변에 레이저를 인가함에 있어 컴퓨터로 조절하는 전동 스테이지를 사용하지 않으면 오차가 발생하기 쉽고, 전동 스테이지를 사용하더라도 전동 스테이지의 속도에 따라 분리속도가 제한을 받게 된다. 또한 시료가 적층된 기판을 움직이면서 누적 오차가 발생하여 원치 않는 부분을 분리하거나 태울 수 있고, 오차의 누적이 적은 고가의 전동 스테이지를 사용하는 것은 가격 부담을 가중시킨다. 이에 목적 시료에 손상이 없으며, 신뢰성과 정확도, 신속성이 확보된 분리 기술이 필요한 실정이다.

[선행문헌 정보]

미국등록특허 제8722357호(등록일 2014/05/13)

미국등록특허 제8715955호(등록일 2014/05/06)

미국등록특허 제7968819호(등록일 2011/06/28)

BioTechniques, Vol. 2, No. 2 (1999)

Cellular and Molecular Biology, 44 (1998)

본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 시료가 적층된 기판을 제공하는 단계; 상기 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택하는 단계; 상기 분리대상 영역에 상당하도록 에너지원을 패턴화하는 단계; 및 상기 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지를 상기 분리대상 영역에 인가함으로써 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시켜 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법이 제공된다.

본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 바이오 물질 시료가 적층된 기판을 제공하는 단계; 상기 바이오 물질 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택하는 단계; 레이저 광원으로부터 빛 에너지를 추출하는 단계; 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료의 모양에 대응하도록 상기 레이저 광원으로부터 추출된 빛을 모양 변형(shape modulation)하는 단계; 상기 모양 변형된 빛이 상기 분리대상 영역에 일치하도록 상기 빛 에너지를 한 번에 인가하여 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시키는 단계; 및 상기 이탈된 상기 목적 시료를 별도의 대응 기판에 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법이 제공된다.

본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 시료가 적층된 기판을 지지하기 위한 기판지지 스테이지; 상기 시료 중 목적 시료를 분리하기 위한 광이 추출되는 레이저 광원부; 상기 목적 시료가 위치한 분리 대상영역의 형상에 따라 상기 레이저 광을 패턴화하기 위한 광형상 변조기; 및 분리된 상기 목적 시료를 수용하는 기판이 위치하는 시료수거 스테이지를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치가 제공된다.

도 1은 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법의 일 구현예를 나타낸 공정흐름도이다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다.
도 3은 본 명세서에 개시된 기술의 다른 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다.
도 4는 도 3의 구현예에서 희생층의 역할을 좀더 구체적으로 설명하기 위한 개략도이다.
도 5는 종래 레이저 미세절단방식(A)과 본 발명의 일 구현예에 따른 레이저 분리방식(B)을 비교한 것이다.
도 6은 광변조기에 의해 크기 조절된 직사각형 모양의 레이저 빔 스폿을 기판 상에 조사하였을 때 스폿 크기에 따라 희생층이 제거된 결과를 나타내는 실제 이미지이다.
도 7은 혈액 도말 표본(blood smear) (A)과 조직 부위(tissue section)(B)의 레이저 조사에 의한 분리 전후의 현미경 사진을 나타낸다.
도 8은 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다.
도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치를 나타낸 도면이다.

이하, 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 명세서에 개시된 기술은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 구성요소가 다른 구성요소 위에 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 바로 위에있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.

도 1은 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법의 일 구현예를 나타낸 공정흐름도이다.

도 1을 참조하면, 단계 S110에서 시료가 적층된 기판을 제공한다. 상기 시료는 이에 특정하는 것은 아니나, 배경 기술에 기술된 문제점과 관련하여 통상 상기 시료는 바이오 물질(bilological material)일 수 있다. 상기 바이오 물질은 자연에서 유래하거나 합성된 것들일 수 있다. 상기 바이오 물질은 구체적으로 조직, 혈액, 세포, DNA, RNA, 단백질, 엑소좀, 대사체(metabolite) 및 생검 검사물(biopsy specimen)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 통상적으로는 상기 바이오 물질은 수 um 내지 수백 um 크기의 세포 또는 조직일 수 있다.

상기 바이오 물질은 스탬핑(stamping), 롤링(rolling), 스미어(smear), 캐필러리(capillary), 미세유체 공학(microfluidics), 피펫팅 분산(pipetting dispensing) 등의 기법을 사용하여 기판 상에 제공될 수 있다.

상기 기판은 바이오 물질을 지지하기 위한 표면을 제공하는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 슬라이드 글래스, 마이크로 비드, 나노입자, 나노구조체, 모세관, 미세유체 지지체, 공극 구조체, 스폰지 구조체, 및 덴드리머로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 혹은 표면이 화학 관능기, DNA, RNA, 단백질 중 1이상으로 부분 또는 전체가 작용화된 기판일 수 있다. 상기 기판은 유리, 실리콘 또는 고분자 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 기판은 통상 슬라이드 글래스일 수 있다. 또는 상기 기판은 DNA나 단백질 등의 생체 시료가 집적된 마이크로어레이 기판일 수 있다.

상기 기판은 구체적인 예로 레이저 투광성 기판일 수 있고, 이때 상기 기판에 적용되는 레이저 광은 펄스 레이저 광을 포함하는 것일 수 있다.

상기 시료가 적층된 기판은 시료가 기판 상에 적층된 것이거나 필요에 따라서 일부 시료가 기판 내에 있는 것까지 포함할 수 있다.

단계 S120에서 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택한다. 상기 시료는 기판 상에 공유결합이나 흡착 등을 통해 고정되거나 고정되지 않은 채 적층되어 있을 수 있다.

상기 분리대상 영역은 다양한 방식으로 선택될 수 있다. 예를 들어 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보 등의 정보를 가지고 적층 시료 영역 중 원하는 영역을 선택할 수 있다.

단계 S130에서 분리대상 영역에 상당하도록 에너지원을 패턴화한다.

상기 에너지원은 초음파, 자외선, 가시광선, 적외선 및 전자빔을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 에너지원은 바람직하게는 자외선 영역의 레이저 광원일 수 있다. 상기 에너지원의 패턴화를 위해 예를 들어 광형상 변조기(Light Shape Modulator, LSM), 공간 광변조기(Spatial Light Modulator, SLM), 음향광학 변조기(Acousto-optic Modulator, AOM) 등의 다양한 변조기가 사용될 수 있다. 예를 들어 광형성 변조기를 사용할 때 레이저 광의 단면적을 렌즈를 이용하여 넓힌 다음 슬릿이나 마이크로미러 어레이를 이용하여 패턴을 조절할 수 있다.

상기 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지는 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료의 모양에 대응하도록 원래의 에너지 경로의 단면적이 모양 변형(shape modulation)된 것이다. 결국 모양 변형된 에너지를 이용하여 원하는 목적 시료를 선별하여 분리해낼 수 있다.

단계 S140에서 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지를 상기 분리대상 영역에 인가함으로써 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시켜 회수한다.

일 구현예로서, 패턴화된 상기 에너지의 인가는 상기 기판의 위치와 상기 에너지가 인가되는 위치의 상대적 이동없이 수행되는 것일 수 있다. 즉 예를 들어 대면적 패터닝을 위해 특별히 전동 스테이지 등을 이용하지 않고 렌즈 등을 사용하여 에너지 조사 범위를 넓힐 수 있다.

상기 에너지의 인가는 상기 목적 시료의 손상이 없도록 에너지의 파장, 크기, 인가 횟수 및 인가시간이 제어된 것일 수 있다. 예를 들어 상기 에너지의 인가를 통상 단 1회에 수행함으로써 목적 시료의 분리를 할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 에너지의 인가는 상기 분리대상 영역의 외곽선을 따라 전체적으로 균일한 에너지가 전달되도록 하여 상기 목적 시료의 이탈이 순간적으로 일거에 이루어지는 방식으로 이루어질 수 있다. 상기 분리대상 영역의 외곽선은 상기 분리대상 영역을 둘러싸는 폐쇄 경로(closed path)일 수 있다. 이 경우 예를 들어 한 번의 에너지 인가(single shot)에 의해 빠른 시간에 목적 시료를 분리해낼 수 있다. 특히 분리대상 영역이 대면적일 경우 본 방식을 사용하면 정확하고 신속하게 분리해낼 수 있어 바람직하다.

다른 구현예에서, 상기 에너지의 인가는 목적 시료가 차지하는 영역 전체에 대해 수행할 수 있다. 이 경우에는 목적 시료, 특히 바이오 물질에 직접 에너지가 인가될 경우 손상이 올 수 있으므로, 희생층을 기판과 시료 층 사이에 개재시키는 것이 바람직하다. 상기 희생층의 재료로는 에너지를 흡수할 수 있으며 상기 에너지의 인가에 의해 기판으로부터 쉽게 분리될 수 있는 재질이라면 특별히 제한되지 않는다.

상술한 바와 같이 본 명세서에 개시된 다양한 구현예에 따른 방식으로 시료에 에너지를 인가할 경우 목적 시료의 형상대로 한번에 이탈되므로 손상이 일어날 확률이 적어진다. 이는 레이저 미세절단과 같이 오려내는 방식과는 차이가 있다.

한편 바람직한 구현예에서, 상기 분리대상 영역의 위치와 패턴화된 상기 에너지가 인가되는 지점의 위치가 일치하도록 가이드하는 추가적인 가이드 빔(guide beam)을 상기 시료 층에 조사할 수 있다. 시료의 분리를 위해 사용되는 에너지가 높기 때문에 미리 가이드 빔을 사용하여 조사 위치 및 모양을 살펴보면 신뢰도와 정밀도가 높은 분리가 가능하다.

도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다. 도 2의 (가)를 참조하면, 광원으로부터 추출된 레이저 광이 광형상 조절기를 거치면서 모양 변형되고, 렌즈를 통해 확대된 모양 변형된 레이저가 바이오 물질에 인가되는 과정을 볼 수 있다. 좀더 구체적으로 도 2의 (나)를 참조하면, 패턴화하기 이전의 레이저 광의 경로에 대한 수직방향의 단면(원형으로 도시됨)과 패턴화한 이후의 레이저 광의 경로에 대한 수직방향의 단면(폐쇄 경로 형태로 도시됨)을 볼 수 있다. 이와 같이 기판 상에 적층된 시료의 층의 영역들 중 원하는 분리대상 영역의 외곽선의 형상(즉, 폐쇄 경로)대로 광을 변조하여 기판 위에 인가하면, 순간적인 일회의 광 조사(single shot)로도 정확하게 원하는 형상의 바이오 물질 시료를 분리해낼 수 있다.

상술한 방법에 따르면, 결국 분리대상 영역 전체가 아닌 분리대상 영역의 외곽선으로 정의되는 폐쇄 경로를 갖는 형상만을 선택하여 패턴화된 레이저를 인가함으로써 목적하는 바이오 물질 시료를 손상없이 선별 분리하는 잇점을 제공할 수 있다. 나아가 에너지의 인가시 분리대상 영역의 외곽선을 따라 전체적으로 균일한 에너지가 전달되도록 하여 분리대상 영역, 즉 목적 시료의 이탈이 일거에 이루어지게 한다.

도 3은 본 명세서에 개시된 기술의 다른 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다. 도 3을 참조하면, 하나 또는 다수의 관심 바이오 물질을 분리함에 있어, 변형된 레이저 광을 인가하되 관심 바이오 물질의 영역의 외곽선이 아닌 영역 내부에 해당하는 범위에 대해 레이저를 인가하는 방식이다. 이 경우에는 상술한 바와 같이 바이오 물질에 직접 레이저가 인가될 경우 열 손상이 올 수 있으므로, 희생층을 기판과 시료 층 사이에 개재시키는 것이 바람직하다.

도 4는 도 3의 구현예에서 희생층의 역할을 좀더 구체적으로 설명하기 위한 개략도이다.

상기 희생층은 에너지의 인가시 상기 분리대상 영역의 손상을 유발하지 않으면서 상기 분리대상 영역이 기판으로부터 분리되기에 충분한 에너지가 전달될 수 있도록 제어된 물질로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 희생층은 에너지를 흡수함으로써 분리 효율을 증가시킴과 동시에 목적 시료에 가해지는 에너지의 총량을 감소시킴으로써 목적 시료가 입는 손상을 최소화할 수 있다.

상기 희생층은 투광성 금속산화물 또는 투광성 플라스틱 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 희생층은 투광도를 감소시키거나 흡광도를 증가시켜 에너지의 흡수를 증가시킨 유리일 수 있고, 투광도를 감소시키거나 흡광도를 증가시켜 에너지의 흡수를 증가시킨 실리콘일 수 있다. 또한 상기 희생층은 유리나 실리콘 등 고체 표면에 코팅되어 있을 수 있고 유리나 실리콘 등 고체 내부에 존재할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 희생층을 구성하는 물질은 목적 시료의 위치에 레이저 광이 정확하게 인가되는지 확인하기 용이하도록 광학적 왜곡이 없는 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

예를 들어 목적 시료가 세포와 같은 바이오 물질일 경우 손상(damage)이 발생하지 않도록 상기 에너지는 적외선(infrared) 레이저일 수 있다. 이때 희생층은 적외선 파장의 레이저에 의하여 증발이 일어나면서도 가시광선은 투과시켜서 바이오 물질의 이미지 관찰에 방해를 주지 않는 것이 바람직하다. 상기 희생층은 바람직하게는 금속산화물로 이루어진 것일 수 있다. 상기 금속산화물은 예를 들면 인듐주석산화물(ITO), 인듐아연산화물(IZO), 아연산화물(ZnO), 인듐아연주석산화물(IZTO), 카드뮴주석산화물(CTO) 또는 인듐갈륨아연산화물(IGZO)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 에너지의 인가는 상기 희생층에 대해 직접 이루어지는 것이 목적 시료의 손상을 방지할 수 있어 바람직하다. 일례로 상기 에너지의 인가는 상기 목적 시료가 위치한 희생층 부위를 증발시킴에 충분한 에너지 밀도를 갖는 에너지가 인가됨에 따라 해당 희생층 부분의 전체 증발로 목적 시료가 기판으로부터 이탈될 수도 있으나, 목적시료가 위치한 희생층 전체를 증발시킬 필요없이 에너지원이 인가되는 희생층의 상층부 일부만 증발되고 잔류 희생층에 목적 시료가 적층된 채로 기판으로부터 이탈되는 것이 바람직하다.

인가되는 에너지의 파장대는 적외선, 가시광선, 자외선 영역일 수 있고, 레이저 펄스를 사용할 수도 있다. 유용한 에너지로서, 펄스 레이저는 10 내지 10,000nm 바람직하게는 20 내지 5,000nm, 더욱 바람직하게는 100 내지 2,000nm의 파장을 가질 수 있다. 대부분의 상용 펄스 레이저는 상기 범위에서 동작하기 때문에 시스템의 구현에 용이하며, 희생층을 이용한 기판에 적절할 수 있다.

상기 펄스 레이저는 1as 내지 1ms, 바람직하게는 1fs s지 100nm의 펄스 조사시간(pulse duration)을 가질 수 있다. 상기 펄스 조사시간에서 펄스 레이저로 인한 에너지 인가시 상기 기판 상의 목적 시료가 덜 손상을 받을 수 있다.

일례로 상기 펄스 레이저가 상기 기판의 원하는 지점에 인가되면 펄스 레이저 삭마 또는 복사압 배출이 일어나면서 희생층의 전부 혹은 상부층을 증발시키고 상기 희생층에 적재되어 있던 목적 시료가 희생층과 함께 혹은 단독으로 상기 전체 기판에서 분리되게 된다. 그 결과, 분리된 목적 시료는 펄스 레이저가 인가된 방향과 반대 방향으로 떨어지게 된다.

이후 분리된 시료를 가지고 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어 조직 절편 내 특정 암 세포의 유전자 분석을 위해 분리된 시료의 전체 게놈을 증폭하고 시퀀싱 라이브러리를 만들어 차세대 염기서열 분석기(next generation sequencer)로 서열 분석할 수 있다. 이와 같이 상기 방식으로 원하는 시료를 선별적으로 분리함으로써 조직 절편 내 특정 암 세포의 유전자 분석을 수행할 수 있다.

도 5는 종래 레이저 미세절단방식(A)과 본 발명의 일 구현예에 따른 레이저 분리방식(B)을 비교한 것이다. 도 5의 A를 참조하면, 슬라이드 글래스나 고분자 기판과 같은 기판(substrate) 상의 세포집단에 대해서 종래의 레이저 미세절단 방식으로 목적 세포를 분리하는 과정을 나타낸다. 이 경우 레이저 빔 스폿이 대상 세포를 스폿 직경 크기의 너비로 시료를 태우는 과정에서 손상 영역이 필연적으로 발생한다. 즉 목적 세포(target cell)를 오려내는 방식으로 분리하고 나면, 분리된 부분은 손상 영역을 가진 목적 세포일 확률이 커진다. 또한 레이저 스폿(spot)의 두께 때문에 목적 세포가 아닌 원치 않는 일반 세포(normal cell)의 일부도 함께 떨어져 나오게 되어 결론적으로 순수한 목적 세포의 분리가 되기 어렵다.

도 5의 B를 참조하면, 기판과 세포 사이에 희생층이 개재된 상태에서 모양 변형된 레이저를 조사하는 간접적 레이저 사출(indirect laser catapulting) 방식에 의해 목적 세포를 분리하는 것이다. 희생층을 사이에 두고 목적 세포 영역 내에 레이저를 조사하면 희생층의 존재로 목적 세포 영역의 손상없이 희생층의 증발과 함께 목적 세포가 떨어져 나올 수 있다. 이때 레이저 1회 인가에 의해 목적 세포가 목적 세포의 세포벽 부위를 따라 절단되면서 세포집단으로부터 일거에 분리되어 나오기 때문에 다른 일반 세포 영역이 혼재되거나 손상된 영역을 포함하는 일이 발생하지 않게 된다.

도 6은 광변조기에 의해 크기 조절된 직사각형 모양의 레이저 빔 스폿을 기판 상에 조사하였을 때 스폿 크기에 따라 희생층이 제거된 결과를 나타내는 실제 이미지이다. 도 6에서, 좌측은 광변조기로 크기 조절된 레이저 빔 스폿의 모양이고, 우측은 실제로 기판 위에 희생층을 적층 후 레이저 빔을 조사하였을 때의 결과이다. 우측 하단은 A-B 절단선을 따라 절개하였을 때의 단면도이다.

도 7은 혈액 도말 표본(blood smear) (A)과 조직 부위(tissue section)(B)의 레이저 조사에 의한 분리 전후의 현미경 사진을 나타낸다. 도 7에서, 각 A 및 B 좌측 사진은 목적 시료 분리 전 사진이고 우측 사진은 목적 시료 분리 후 사진이다. 도 7의 A는 점선 영역의 하나의 목적 세포가 선별적으로 분리되는 과정을 나타내고, 도 7의 B는 조직 부위 중에서 원하는 다수의 영역들이 분리되는 과정을 나타낸다.

도 8은 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 구현예에 따른 바이오 물질의 분리방법을 나타낸 공정개략도이다. 도 8을 참조하면, 앞서 도 4에서 설명한 바와 같이 비관심 대상의 바이오 물질 영역을 제외하고 분리하고자 하는 바이오 물질의 영역 내에 들어오도록 레이저 광을 모양 변형하여 인가하는 방식 또는 도 3과 같이 원하는 영역의 외곽선 모양대로 절단하는 방식으로 원하는 바이오 물질을 분리한다. 여기서, 본 구현예에서는 별도의 가이드 빔을 사용하여 레이저가 조사되는 위치 및 모양을 미리 살펴볼 수 있도록 하는 방법을 나타낸다.

즉 분리대상 영역에 에너지가 인가되는 지점의 위치와 일치하도록 별도의 가이드 빔을 두고 이를 레이저 광과 마찬가지로 광형상 변조기를 관통하도록 가이드한다. 상기 가이드 빔은 패턴화된 에너지를 인가하기 전에 미리 또는 인가하는 도중에 조사될 수 있으며, 분리대상 영역에 손상을 가져오지 않도록 낮은 에너지 및 조사 시간을 갖는 것이 바람직하다.

도 8을 참조하면, 하프 미러(half mirror)를 이용해 레이저가 통과하는 광경로에 수직하게 위치시키고, 레이저가 조사될 부분을 표시할 기준광을 반사시킴으로써, 레이저와 같은 경로로 진행하게 한다. 이때 광형상 변조기를 거쳐 변형된 레이저 광의 모양 및 조사 위치를 가이드 빔을 통해 미리 알 수 있다. 조사된 가이드 빔의 기판 상 투영 위치와 패턴화된 에너지원의 기판 상 위치가 소정의 거리만큼 서로 다른 경우 이격된 위치를 서로 조정할 수 있다. 그 결과 정확한 시료의 분리가 가능하게 된다.

상기 기판으로부터 이탈된 목적 시료의 회수는 회수 용기로서 별도의 대응 기판 혹은 저장용기(reservoir)로 상기 목적 시료가 전이되는 과정으로 수행될 수 있다. 상기 대응 기판 혹은 저장 용기로의 전이는 분리한 목적 시료를 분리하고 기타 반응에 사용하기 위해 필요한 과정이다. 상기 대응 기판은 다양한 형태를 갖을 수 있으며, 일례로 이탈된 목적 시료를 수용하기 위한 복수의 웰(well)들을 구비할 수 있다. 상기 저장 용기는 물리적 혹은 화학적 반응을 일으키거나 이를 관측할 목적으로 제작된 용기를 포함할 수 있다. 또한 상기 저장용기는 상기 목적시료의 보관을 위해 제작된 용기를 포함할 수 있다.

도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치를 나타낸 도면이다. 도 9를 참조하면, 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치(200)는 시료가 적층된 기판을 지지하기 위한 기판지지 스테이지(210), 분리된 목적 시료를 수거하기 위한 시료수거 스테이지(220), 상기 시료를 상기 기판으로부터 분리하기 위한 광이 추출되는 레이저 광원부(230), 상기 시료 중 목적 시료가 위치한 분리 대상영역의 형상에 따라 상기 레이저 광을 패턴화하기 위한 광형상 변조기(240), 및 패턴화된 상기 레이저 광이 도달하는 기판 상의 위치와 동일한 위치에 가이드 빔을 조사하는 가이드 광원부(250)를 포함한다.

기판지지 스테이지(210)는 시료가 적층된 기판을 X, Y, Z 축으로 움직여 분리하고자 하는 시료의 위치로 이동하는 것이 바람직하다.

시료수거 스테이지(220)는 분리된 시료를 수거할 수 있는 기판(예를 들어 웰플레이트 또는 기타 저장 용기 등)을 X, Y, Z 축으로 움직여 레이저로 분리된 시료를 수거할 수 있는 위치로 이동하는 것이 바람직하다.

레이저 광원부(230)는 시료를 분리할 수 있는 대역(자외선, 가시광선, 적외선 등)의 레이저를 조사한다. 이때 시료를 분리하면서 영향을 주지 않을 정도의 에너지의 크기가 제어되는 것이 바람직하다. 레이저는 연속 레이저 또는 펄스 레이저일 수 있는데, 펄스 레이저의 경우 시료 분리에 충분한 에너지를 가할 수 있는 펄스의 길이를 선택하는 것이 바람직하다.

광형상 변조기(240)는 지나가는 레이저 광과 가이드 빔을 목적 시료의 위치와 크기에 맞추어 모양을 제어하는 것이 바람직하다. 슬릿을 이용하여 레이저 광과 가이드빔의 진행방향을 차단하여 모양을 조절할 수도 있고, 디지털 마이크로미러 디바이스(DMD)를 이용해 필요한 빛만 반사시켜 모양을 조절할 수도 있다. 렌즈를 이용하여 레이저 광과 가이드 빔의 모양을 키우거나 줄일 수도 있다. 레이저 광과 가이드 빔을 동시에 조사할 경우 가이드 빔과 레이저 광의 진행방향이 동일하여 같은 모양의 빛이 겹쳐서 출력되는 것이 바람직하다.

가이드 광원부(250)는 레이저 광원부(230)에서 나오는 레이저와 광경로가 동일하게 진행되는 가이드 빔이 나와 레이저가 시료에 조사되는 위치와 크기를 실시간으로 볼 수 있도록 한다. 예를 들어 하프 미러(half mirror)를 이용하여 레이저와 가이드빔이 동일한 광경로로 진행하게 조절할 수 있다. 이때 인가되는 광원은 목적 시료에 영향을 주지 않을 정도로 에너지의 크기가 제어되는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이 본 명세서에 개시된 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법에 따르면, 빛을 단 한번 조사함으로써 바이오 물질을 분리할 수 있어 분리 속도가 획기적으로 증가할 수 있다. 또한 물질을 고정한 스테이지의 세밀한 움직임이 필요없어 전동 스테이지나 광경로 변형 장치와 같은 비싼 추가 장치가 필요없다. 또한 전동 스테이지의 움직임에 기인한 오차가 없어 분리의 정확도가 증가한다. 또한 희생층을 사용하거나 분리대상 영역의 외곽선을 따라 일거에 분리함으로써 바이오 물질에 대한 손상이 거의 없다. 더욱이 추가적인 가이드 빔을 이용해 레이저로 조사할 부분을 미리 확인할 수 있어 분리방법의 신뢰도와 정밀도가 매우 높다.

본 명세서에 개시된 기술은 이미 상용화된 레이저를 이용한 세포 분리 기술보다 훨씬 높은 쓰루풋(throughput)과 분리 효율을 가지므로 암진단, 바이오마커 발굴에 적합한 관련 기술들을 가속화시킬 수 있다.

이상에서 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 명세서에 개시된 기술의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 기술을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (21)

1. 시료가 적층된 기판을 제공하는 단계;
   상기 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택하는 단계;
   상기 분리대상 영역에 상당하도록 에너지원을 패턴화하는 단계; 및
   상기 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지를 상기 분리대상 영역에 인가함으로써 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시켜 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 에너지원을 패턴화하는 단계는 상기 분리대상 영역의 외곽선의 모양대로 패턴화하는 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
3. 제2 항에 있어서,
   상기 분리대상 영역의 외곽선은 상기 분리대상 영역을 둘러싸는 폐쇄 경로(closed path)인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
4. 제1 항에 있어서,
   패턴화된 상기 에너지의 인가는 상기 기판의 위치와 상기 에너지가 인가되는 위치의 상대적 이동없이 수행되는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
5. 제1 항에 있어서,
   상기 에너지의 인가는 상기 목적 시료의 손상이 없도록 에너지의 크기, 인가횟수 및 인가시간이 제어된 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
6. 제1 항에 있어서,
   상기 에너지의 인가는 상기 분리대상 영역의 외곽선을 따라 전체적으로 균일한 에너지가 전달되도록 하여 상기 목적 시료의 이탈이 일거에 이루어지는 방식으로 이루어지는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
7. 제1 항에 있어서,
   상기 분리대상 영역의 위치와 패턴화된 상기 에너지가 인가되는 지점의 위치가 일치하도록 가이드하는 가이드 빔을 상기 시료 층에 조사하는 단계를 더 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
8. 제7 항에 있어서,
   상기 가이드 빔은 상기 패턴화된 에너지를 인가하기 전 또는 인가하는 도중에 인가되는 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
9. 제1 항에 있어서,
   상기 기판은 투광성 재질로 이루어진 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
10. 제1 항에 있어서,
    상기 시료는 바이오 물질인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
11. 제1 항에 있어서,
    상기 패턴화된 에너지원은 레이저 광원인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
12. 제1 항에 있어서,
    상기 에너지의 인가는 상기 시료가 적층된 상기 기판의 면의 반대면에 대해 수행하는 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
13. 제1 항에 있어서,
    상기 시료의 층과 상기 기판 사이에 희생층이 더 개재하되,
    상기 희생층은 상기 에너지의 인가시 상기 분리대상 영역의 손상을 유발하지 않으면서 상기 분리대상 영역이 상기 기판으로부터 분리되기에 충분한 에너지가 전달될 수 있도록 제어된 물질로 이루어진 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
14. 제13 항에 있어서,
    상기 희생층은 투광성 금속산화물 또는 투광성 플라스틱 재질로 이루어진 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
15. 제13 항에 있어서,
    상기 패턴화된 에너지원으로부터 추출된 에너지를 상기 분리대상 영역에 인접한 상기 희생층의 일부분에 포커싱함으로써 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 희생층과 함께 상기 기판으로부터 이탈시켜 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
16. 제1 항에 있어서,
    상기 회수는 별도의 대응 기판으로 상기 목적 시료가 전이되는 방식으로 이루어지는 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
17. 바이오 물질 시료가 적층된 기판을 제공하는 단계;
    상기 바이오 물질 시료의 층의 영역들 중 하나 이상의 원하는 분리대상 영역을 선택하는 단계;
    레이저 광원으로부터 빛 에너지를 추출하는 단계;
    상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료의 모양에 대응하도록 상기 레이저 광원으로부터 추출된 빛을 모양 변형(shape modulation)하는 단계;
    상기 모양 변형된 빛이 상기 분리대상 영역에 일치하도록 상기 빛 에너지를 한번에 인가하여 상기 분리대상 영역에 해당하는 목적 시료를 상기 기판으로부터 이탈시키는 단계; 및
    상기 이탈된 상기 목적 시료를 별도의 대응 기판에 회수하는 단계를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
18. 제17 항에 있어서,
    상기 목적 시료의 이탈이 일거에 일어나는 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
19. 제17 항에 있어서,
    상기 바이오 물질 시료의 층과 상기 기판 사이에 희생층이 더 개재하되, 상기 희생층은 상기 레이저 광원에 대해 투광성인 재질로 이루어진 것인 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 방법.
20. 시료가 적층된 기판을 지지하기 위한 기판지지 스테이지;
    상기 시료 중 목적 시료를 분리하기 위한 광이 추출되는 레이저 광원부;
    상기 목적 시료가 위치한 분리 대상영역의 형상에 따라 상기 레이저 광을 패턴화하기 위한 광형상 변조기; 및
    분리된 상기 목적 시료를 수용하는 기판이 위치하는 시료수거 스테이지를 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치.
21. 제20 항에 있어서,
    패턴화된 상기 레이저 광이 도달하는 기판 상의 위치와 동일한 위치에 가이드 빔을 조사하기 위한 가이드 광원부를 더 포함하는 기판으로부터 시료를 선택적으로 분리하는 장치.

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