CN115406871A - 用于对样品进行成像和消融的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于对样品进行成像和消融的系统。一种成像/消融装置包括光学组件、样品台和接收器。所述光学组件能够消融所述样品内的感兴趣区域。在消融期间从所述光学组件传播的激光基本上在与消融羽流朝向所述接收器的行进方向相同的方向上传播。包括至少一个参考激光器和光电检测器的激光聚焦检测单元产生至少一个实时检测信号，所述至少一个实时检测信号指示消融期间所述样品的一种或多种特性和/或指示从物镜到所述样品台或所述样品的表面的距离。与所述激光聚焦检测单元耦合的控制器实时动态地控制消融激光器的一个或多个参数和/或所述物镜的位置和/或所述接收器相对于所述样品的位置，以提高MS成像质量。

Description

用于对样品进行成像和消融的系统和方法
技术领域
本公开总体上涉及用于对样品进行成像和消融的系统、装置和方法。特别地，本公开涉及用于对生物样品进行成像和消融的系统、装置和方法，其能够进入亚细胞水平的细微之处并且能够将消融的目标转移到接收器，而不会过度降解目标，以允许额外的下游分析。
背景技术
“组学”领域寻求表征、量化或以其他方式分析与目标生物或生物群的结构、功能或动力学相关的生物分子集。每个组学领域都与相关“组”的研究有关。组学领域包括以下领域：基因组学，是对基因组的研究；表观基因组学，是对基因组支持结构的研究，包括DNA结合剂和DNA的化学修饰；转录组学，是对目标生物产生的一组RNA分子的研究，包括mRNA、miRNA、rRNA和tRNA；蛋白质组学，是对目标生物产生的蛋白质的补体的研究；和代谢组学，是对通过目标生物的细胞过程产生的代谢物集合的研究。
“多组学”(有时也称为综合组学)涉及对一个或多个此类组的分析。多组学分析的目标是收集和/或分析复杂的生物数据，例如，以能更好地确定疾病标志物的方法发现各种组之间的关联，能够更好地理解基因型、表型、和特定条件下的环境影响之间的划分，并更深入了解各种组相互调节和影响的方式。
然而，进一步推进多组学领域仍然存在一些挑战。特别是，当沿从基因组到转录组再到蛋白质组和代谢组的基因型到表型路径移动时，化学多样性和复杂性水平呈指数增长。随着复杂性增加，获得和分析相关生物分子的难度也随之增加。
此外，目标生物分子所在的相关感兴趣区域通常处于亚细胞水平。因此，以允许对生物分子进行有效下游分析的方式获得目标生物分子是具有挑战性的。然而，诸如激光消融电喷雾电离(LAESI)等传统方法，包括皮秒红外LAESI(PIR LAESI)，不允许收集亚细胞水平的生物分子。在LAESI中，激光消融材料被来自电喷雾离子源的纳米级液滴电离，然后传输到质谱仪进行分析。然而，传统的LAESI系统具有导致低数值孔径(NA)光学器件的固有空间限制。用于样品消融的低数值孔径光学器件导致大的消融光斑尺寸。例如，最小光斑尺寸通常比整个活细胞大得多，而且根本不足以小到允许对感兴趣的亚细胞区域进行靶向消融。
直接访问活细胞的细胞内和/或细胞间生物材料也是在实时条件下有效分析此类细胞的生化方面的关键。然而，获得用于进一步下游分析的目标细胞材料的常规方法通常依赖于固定并且通常是干燥样品。例如，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI TOF)使用基质电离分子成分。要固定样品，就需要使MALDI TOF与活细胞监测不兼容。
因此，一直需要以允许对所获得的材料进行有效下游分析的方式在亚细胞水平从活细胞获得细胞材料的系统、装置和方法。可以在WO2021/104855A1，US2021/0118661A1, US2015/0018807A1,US8199321B2,WO2014/079802A2,W.Muller等人，新定制设计的与两体 积激光消融池耦合的ArF准分子LA-ICPMS系统的初始性能指标，J.Anal.At.Spectrom., 2009,24,209–214,K.Fowble等人，“实时成像中的激光消融直接分析”的开发，质谱分析：沿在植物组织中导致阿托品和东莨菪碱合成的生物合成级联的代谢物的空间分布映射中的应用，Anal.Chem.2017,89,6,3421–3429和Y.Cui等人，飞行质谱仪的超短脉冲激光消融时间的深度剖析和成像能力，Rev.Sci.仪表.83,093702(2012)中发现激光消融的各种方法，但是这些方法存在一个或多个缺点。
发明内容
本文所述的实施例能够以不会过度降解生物材料并允许对获得的材料进行有效下游分析的方式从样品中收集目标生物材料。在某些实施例中，样品可以包括活细胞，并且可以在正常环境条件下(例如，没有压力控制、湿度控制等)获得目标生物材料。在某些实施例中，样品的目标感兴趣区域可以具有亚细胞尺寸。在某些实施例中，可以以甚至可以允许细胞存活以任选地用于进一步测试的方式从细胞中去除目标生物材料而对剩余细胞结构的影响最小。在某些实施例中，样品消融的特性在消融期间被实时监测并且包含空间和时间信息。相应地，这使得消融装置的参数能够实时地被动态地调整，以允许优化消融和/或保持用于样品分析的恒定条件，例如质谱分析成像，这可以提高MS成像质量。
在一个实施例中，提供了一种用于对样品进行成像和消融的装置，其允许分析样品的消融部分，该装置包括样品台，该样品台具有被配置为用于在其上放置样品的第一侧(例如，上侧)和与第一侧相对设置的第二侧(例如，下侧)。该装置包括光学组件，该光学组件包括物镜，该物镜设置在样品台的第二侧并且被配置为能够对放置在样品台上的样品进行显微成像，该光学组件还包括消融激光器。该消融激光器设置在样品台的第二侧，消融激光器被配置为引导激光穿过物镜、穿过样品台并进入样品以选择性地消融样品的至少一部分(例如，样品的目标感兴趣区域)。样品台通常具有允许激光和其他光通过的透明窗口。样品可以放置在透明窗口的上表面上。例如，透明窗口可以由玻璃或塑料制成。例如，透明窗口可以是载玻片或盖玻片。透明窗口通常定义例如物镜的光学组件的视场(FOV)。接收器设置在样品台的第一侧，接收器被配置为接收从样品喷射的消融材料，以实现对消融材料的进一步分析。
在一个实施例中，光学组件还包括激光聚焦检测单元(FDU)，激光聚焦检测单元包括至少一个参考激光器，该至少一个参考激光器设置在样品台的第二侧并被配置为引导激光穿过物镜，穿过样品台进入样品。FDU可以用来检测或观察具有不同折射率的介质之间的界面。这样，一个或多个界面的轴向(z)位置，例如大气/样品台界面、样品台/样品界面或样品/大气界面。这使得例如物镜到样品的相对位置(距离)和样品厚度都能够被实时监测。激光聚焦检测单元还包括至少一个光电检测器，该至少一个光电检测器被配置为通过检测来自至少一个参考激光器的激光产生至少一个检测信号，该检测信号指示在样品的至少一部分被消融时样品的一种或多种特性，和/或指示从物镜到样品台的距离，和/或指示从物镜到样品的表面的距离。就样品而言，可以观察到以下一项或多项：样品中的空腔尺寸(及其相对于消融激光脉冲的延迟)；样品/大气界面的高度或位置，例如相对于样品台或物镜；和从样品到大气的轴向羽流形成。
激光聚焦检测单元还被配置为用于向控制器发送至少一个检测信号，该控制器被配置为基于至少一个检测信号动态地控制消融激光器的一个或多个参数和/或物镜的位置和/或接收器的位置。从而相对于样品的位置调整物镜的位置和/或接收器的位置。
在一个实施例中，激光聚焦检测单元被配置为使用至少一个光电检测器连续地或以高频率检测来自至少一个参考激光器的激光，并将至少一个检测信号发送到控制器。这样，至少一个检测信号可以允许在消融期间实时监测样品和/或物镜和/或接收器相对于样品的位置。该至少一个光电检测器优选地具有100微秒或小于100微秒的时间分辨率。在一个实施例中，该至少一个参考激光器可以被调制开和关以避免与其他光或激发源以及来自样品的图像的检测冲突。至少一个光电检测器优选地具有纳秒时间分辨率或亚纳秒时间分辨率(来自至少一个参考激光器的光被检测的时间分辨率)，例如1-10纳秒或更小，例如1纳秒或小于1纳秒。具有亚纳秒时间分辨率的光电检测器可用于以连续方式探测消融羽流膨胀的动态。对于这个功能，具有亚纳秒时间分辨率的光电检测器可以一直开启，即激活。然而，由具有亚纳秒时间分辨率的光电检测器检测到的所述至少一个参考激光器可以被调制开和关。
在一个实施例中，样品的一种或多种特性包括以下中的一种或多种：由来自消融激光器的激光引起的样品中的空腔的形成，由从样品喷射的消融材料引起的消融羽流的形成，以及样品的厚度的变化。在许多情况下，由于样品上或样品中存在的水的表面张力，样品的厚度变化在毫秒时间范围后消失。在某些非常薄的样品(单层细胞)的情况下，消融后可能会在表面留下“凹陷”。
在一个实施例中，控制器被配置为基于包括激光脉冲能量和/或激光脉冲频率的至少一个检测信号来控制消融激光器的一个或多个参数。在一个实施例中，至少一个检测信号可用于监测是否在样品表面(即样品-空气表面)处形成消融羽流。如果在样品表面没有形成消融羽流，则控制器可以调整激光脉冲能量和/或激光脉冲频率。优选地，可以增加激光脉冲能量和/或可以增加激光脉冲频率，直到在表面形成消融羽流。
在一个实施例中，控制器被配置为基于所述至少一个检测信号连续地(即以高数字频率实时地)调整物镜的位置和/或接收器的位置。一个或多个致动器可以驱动物镜。类似地，一个或多个致动器可以驱动接收器台。致动器可以由控制器实时控制。致动器可以具有亚毫秒范围内的响应时间，例如1毫秒或小于1毫秒的响应时间，从而允许对位置进行实时控制。调整的物镜位置和/或接收器位置可以是轴向位置(本文称为z位置)，其改变物镜和样品台之间或接收器台和样品台之间的距离。这样，例如可以通过调整物镜的位置来连续地调整样品中来自消融激光器的激光的焦深。这是有利的，因为样品的厚度随时间而变化。此外，接收器与样品表面的距离可以保持恒定和/或保持在最佳范围内。
在一个实施例中，至少一个光电检测器包括被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已从样品台和/或样品的至少一个表面或界面反射和/或透射穿过该至少一个表面或界面。在一个实施例中，至少一个光电检测器包括被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已经从样品台的表面或界面反射并被引导回穿过物镜。在一个实施例中，至少一个光电检测器包括被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已经从面向接收器的样品的表面或界面反射并被引导回穿过所述物镜。在这样的实施例中，光电检测器可以包括阵列检测器。该阵列检测器可以实现对至少一个参考激光器的峰值检测。这些峰是FDU中可观察到的对象，并且源自具有不同折射率的样品的(轴向)界面。阵列检测器可以包括多个单独的光电检测器或像素。阵列检测器可以与现场可编程门阵列(FPGA)和控制器相结合，实现快速信号分析(例如微秒时间范围内的峰值检测)。
在一个实施例中，至少一个光电检测器包括设置在样品的第一侧并且被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已经透射穿过样品。优选地，该光电检测器信号与样品的消融同时被监测。
在一个实施例中，所述至少一个光电检测器被配置为以亚纳秒时间分辨率解析至少一个检测信号。这使得能够通过由物镜聚焦到样品中的激光随时间监测样品中形成的空腔的位置。这种空腔通常以在样品介质中的声速行进。
在一个实施例中，该至少一个参考激光器是二极管激光器，优选地是光子集成电路的形式。在一个实施例中，该至少一个参考激光器包括多个参考激光器，即至少第一参考激光器和第二参考激光器。可以提供多个参考激光器作为光子集成电路(PIC)的激光输出孔。
在一个实施例中，所述至少一个参考激光器包括至少第一参考激光器，所述第一参考激光器被配置为将第一激光沿偏离所述物镜的光轴的轴引导到所述物镜，并且所述至少一个光电检测器被配置为检测沿偏离物镜光轴的轴反射回穿过物镜的第一激光。检测到的第一激光可以提供关于物镜到样品台的距离和/或物镜到样品-空气界面的距离的信息。可以使用三角测量方法来确定这些距离。这种方法进一步允许以高时间分辨率监测样品介质/空气的界面。例如，使用快速光电二极管，可以监测消融时间、空腔到样品表面的传播以及将空腔羽流排放到大气中。
在一个实施例中，所述至少一个参考激光器包括至少第二参考激光器，该第二参考激光器被配置为将第二激光沿物镜的光轴引导到该物镜，并且该至少一个光电检测器被配置为检测沿物镜光轴反射回穿过物镜的第二激光。被配置为检测沿物镜的光轴反射回的第二激光的至少一个光电检测器可以形成干涉仪的一部分，干涉仪本身可以是光学相干断层扫描(OCT)装置的一部分。Wang等人在Optics Letters,42卷，2017年第17期，第3466-3469页描述了一种合适的OCT技术。因此，沿物镜的光轴反射回的第二激光可以例如同时提供来自样品中由来自消融激光器的激光形成的空腔的干涉信号。干涉仪或OCT设置优选地允许干涉信号由从样品中的激光诱导空腔和/或从消融羽流/样品界面反射的第一激光产生。干涉信号可以提供关于介质中的空腔和/或大气中的羽流形成的精确的时间分辨位置信息。可以以亚纳秒分辨率(1ns或更小)实时提供有关空腔和/或羽流形成的信息。使用干涉仪，观察体积可以从样品介质仅扩展到将样品留在大气中的消融材料的羽流体积。作为OCT设置的一部分，干涉信号可以提供空腔和/或羽流形成的层析成象测量。
在一个实施例中，该装置还可以包括设置在样品的第一侧的光源，该光源被配置用于样品的透照。为此目的可以使用闪光灯或灯。闪光灯或灯优选地可以发射纳秒(例如1-10ns)或亚纳秒(小于1ns)宽度的光脉冲。因此，可以使用闪光灯/灯获得快照成像，即在用消融激光器脉冲化样品之后在时间延迟t处的空腔的快照图像。诸如照相机的检测器可以设置在样品的第二侧以检测透照光并形成样品的图像。透照光可用于样品中的空腔尺寸确定，例如在使用中的物镜焦深的任何轴向位置处。
在一个实施例中，该装置可以进一步包括被配置为用于样品的落射荧光成像和/或分析的荧光激发源。该荧光激发源优选地设置在样品的第二侧。可以在消融激光器之后延迟施加荧光激发。荧光激发源可以包括脉冲光源，优选具有大约ns的脉冲长度，以匹配的荧光激发波长探测样品中感兴趣的荧光(标记)分子的数量。
可以提供检测器，例如照相机，或具有(快速)光电检测器的光谱仪，其被配置为响应于在应用消融激光器后(关闭荧光激发源)的自体荧光或在应用消融激光器后的时间延迟t'处由荧光激发源的照射而光谱分辨和/或时间分辨(即实时检测)来自样品的荧光发射，并提供荧光图像或信号。荧光发射检测可以在亚毫秒曝光时间内发生。用于荧光发射的检测器优选地设置在样品的第二侧。用于检测荧光发射的检测器，例如照相机，可以与用于检测透照的检测器或照相机相同。使用该系统，样品介质中的空腔形成可以在消融激光脉冲之后的时间t使用闪光灯通过透照成像，并在稍后的时间t'在荧光激发之后荧光成像。因此，也可以从透照和荧光的不同光源中获得延时快照成像信息。通过具有足够动态强度范围的相机，图像可以显示两种对比度。通常，透照和荧光图像的对比度区域不相同。从透照图像中可以看到高对比度，且可以将弱(较弱)的信号识别为荧光。
检测到的落射荧光信号或图像优选地是时间分辨的并且可以用于提供空腔特性和关于样品中的分子分裂的信息，即在物镜的焦点位置处。光谱图像分离器可用于将荧光引导到与光谱仪结合的快速(更快)光电检测器(例如阵列)上，以光谱分离透照图像和荧光图像。
在一个实施例中，测量的荧光的消耗表明样品中的分子由消融引起的分裂，通常是因为激光脉冲能量太高。在这种情况下，下一个激光脉冲需要以较低的能量施加。因此，荧光信号可用于调整激光脉冲能量。定量荧光强度分析使能估计材料到接收器并由此到分析器(例如质谱仪)的传递效率。
在一个实施例中，来自消融激光器的焦点的拉曼信号可以附加地或选择性地被检测。拉曼信号为荧光信号提供补充信息。虽然拉曼信号的灵敏度通常低于荧光的灵敏度，但它的优点是样品不需要用荧光团标记进行修饰。来自消融材料的拉曼信号可以例如通过与用于检测荧光的检测器或光谱仪相同的检测器或光谱仪来检测。拉曼信号提供消融分子的振动和旋转带。例如，拉曼信号的出现揭示了关于发送到分析器(例如质谱仪)的分子的预期质量的信息，而振动/旋转带的强度分布表明了分子的热状态(内能)。拉曼光谱可以与在分析器(质谱仪)中检测到的分子的峰值强度相关。因此，优化拉曼信号可用于对分析器(质谱仪)中检测到的分子进行更定量的校准。
现在描述消融装置和系统的各种进一步的特征。
在一个实施例中，消融激光器和物镜被配置成使得激光被引导穿过物镜并且被定向为使得激光基本上在由样品消融产生的消融羽流的预期运动方向上传播。这有利地允许膨胀的消融羽流沿基本上平行于传播激光的方向而不是逆着传播激光的方向有效地朝向接收器行进。
光学组件可以配置成能够实现明场成像、切片(例如，通过共焦显微镜检查)、落射荧光成像、双光子成像或其组合。物镜可具有约0.5或更大、或约0.65或更大、或约0.75或更大、或约0.8或更大的数值孔径(NA)。
消融激光器优选地是脉冲激光器。消融激光器优选地是飞秒红外激光器。激光器和其他光学组件部件可以被配置为每μm3样品输送约1nJ至约10μJ的脉冲能量。待消融的目标感兴趣区域可具有约50μm或更小、或约30μm或更小、或约10μm或更小、或约5μm或更小、或约3μm或更小，或约1.5μm或更小，或约1μm或更小的“光斑尺寸”直径。在体积方面，待消融的目标感兴趣区域可以具有约500μm3或更小、约250μm3或更小、约100μm3或更小、约50μm3或更小、约25μm3或更小、约10μm3或更小、约5μm3或更小、或约2μm3或更小的体积。因此，光学组件可用于消融多个全细胞、单个全细胞或亚细胞体积，例如靶向细胞器或其他细胞内结构，或细胞外的细胞外体积。
在一个实施例中，接收器包括一种介质，该介质被配置成用于对消融材料的各个子样品，例如微孔板或芯片，进行非重叠的空间区分。在一个实施例中，接收器包括纳米液滴阵列。在一个实施例中，接收器包括电喷雾探针，该电喷雾探针被配置为收集消融的子样品并将它们以电离的液滴的形式传输到质谱仪的入口。电喷雾探针可以与提供用于润湿电喷雾探针外表面的溶剂的毛细管相关联。
在一个实施例中，一种用于对样品的目标区域进行消融和分析的系统包括成像和消融装置以及被配置为接收和分析由接收器接收的消融材料的至少一部分的分析器。该分析器可以包括例如一种或多种PCR机器、测序机器、光谱仪、核磁共振(NMR)光谱仪、质谱仪、色谱装置、离心机、电泳装置、放射性标记和放射性标记检测装置、其他分析生化装置、或其组合。该系统还可以包括上游处理器，例如电动液滴分类机、分类离心机等，其被配置为用于在将样品定位在样品台上之前对样品进行分类或以其他处理。
在一个实施例中，一种对样品进行成像和消融以能够分析样品的消融部分的方法包括以下步骤：提供成像和消融装置、获取样品的图像、在样品内选择感兴趣区域、传送激光到感兴趣区域以消融感兴趣区域的至少一部分。并在接收器上捕获消融材料的至少一部分。
在一个实施例中，该方法包括基于来自激光聚焦检测单元的至少一个检测信号动态地(例如以毫秒或更高的时间分辨率实时地)调整消融激光器的一个或多个参数和/或物镜的位置和/或接收器的位置。
在一个实施例中，消融在环境气氛中进行。在一个实施例中，样品包括活细胞。在一个实施例中，从靶细胞中去除消融子样品而不杀死靶细胞。
在一个实施例中，对样品施加多个激光脉冲。可以应用多个激光脉冲来消融一个子样品。多个消融子样品可以由多个消融事件形成，并且可以在接收器处在非重叠的空间区分位置内收集。激光脉冲频率、激光脉冲能量水平或激光脉冲深度中的一种或多种可以跨越多个激光脉冲动态地变化。例如，在一种操作模式中，将激光脉冲强度设置为初始高水平以去除覆盖在感兴趣区域上的样品中的材料，然后将激光脉冲强度设置为较低水平以消融感兴趣区域的至少一部分.
本发明内容的提供是为了以简化形式引入下文在具体实施方式中进一步描述的概念的选择。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征或本质特征，也不旨在用作对所要求保护的主题的范围的指示。
本公开的附加的特征和优势将在下面的描述中阐述，且描述中的一部分会很明显，或可以通过本公开的实践被了解。本公开的特征和优势可以借助于所附权利要求书中特别指出的仪器和组合实现和获得。本公开的这些特征和其它特征将根据以下描述和所附权利要求书更为充分且明显，或者可以通过如下文阐述的本公开的实践被了解。
附图说明
为了描述可以获得本公开的上述以及其它优点和特征的方式，将通过参考附图中所示的其特定实施例呈现对以上简要描述的本公开的更具体描述。应当理解，这些附图仅描绘了本公开的典型实施例，并且因此不应被视为限制本公开的范围。将通过使用附图以附加的特征和细节来描述和说明本公开，在附图中：
图1示出了传统的激光辅助电喷雾电离(LAESI)系统；
图2示出了用于对样品进行成像和消融的系统的示意图，该系统有优于传统的成像和消融系统的一个或多个优点，该系统包括具有光学组件、样品台和接收器的成像/消融装置；
图3示出了上游电动液滴分类机形式的示例性上游处理器；
图4示出了可用于如本文所述的成像/消融装置中的光学组件的示例；
图5示出了接收器的示例，该接收器包括一个诸如微孔板的空间区分的介质；
图6A示出了包括纳米滴阵列的接收器的示例；
图6B示出了用于形成纳米滴阵列的示例过程；
图7示出了接收器的实施例，该接收器包括电喷雾探针并且被配置为用于产生包含消融子样品的电离的液滴以传输到质谱仪的入口；
图8示出了下游过程的一个示例，其中一种或多种试剂可以添加到接收器的空间分离的隔室和/或一种或多种子样品可以传到液相色谱柱，该液相色谱柱耦合到电喷雾探针以把电离的样品传到质谱仪；
图9示出了用于将接收器上的消融子样品的位置与消融事件和样品载玻片上的目标感兴趣区域相关联的示例性方法；
图10以图形方式示出了示例成像/消融装置操作模式，其中样品的矩形xy区域被扫描和消融；和
图11以图形方式示出了成像/消融装置操作模式的示例，该模式可用于通过动态地调整所施加的激光脉冲的位置和脉冲能量水平来去除覆盖在目标感兴趣区域上的一层组织、介质或其他阻碍材料。
图12示出了包括激光聚焦检测单元的示例性成像/消融装置。
图13示意性地示出了包含成像/消融装置和激光聚焦检测单元的示例性光学系统。
图14示出了包含激光聚焦检测单元的示例性光学系统的进一步细节，该激光聚焦检测单元包括干涉仪。
图15在A中示出了在激光聚焦检测单元的阵列检测器处接收到的参考激光束的位置，并且在B中示出了通过的光束之一被分束器反射并被快速光电检测器检测。
图16示出了包含激光聚焦检测单元的另一示例性光学系统。
图17示出了阵列检测器上来自从样品台下表面(ΔZ1)和上表面(ΔZ1')反射的激光束的像素强度的示例性数据。
图18示出了针对已知物镜位置的阵列检测器的检测像素的校准。
图19示出了对于不同水位或样品高度a，b，c，d，由于从样品台(ΔZ1)和从样品表面(ΔZ2)反射的光束而在阵列检测器上的像素强度的示例性数据。
图20示出了图19的数据以及当样品在样品台上变干时阵列检测器上的像素强度的附加示例性数据。
图21示出了来自激光聚焦检测单元的光电检测器处的参考激光器的干涉信号(I)的时间(t)依赖性，该干涉信号(I)源自激光从空腔形成和羽流-样品界面的反射。
图22示意性地示出了用于消融监测的光学器件的操作。
图23示出了实时(t)校准或控制消融参数的效果：(i)每个脉冲的脉冲能量E0，(ii)空腔的膨胀，(iii)从样品介质到大气的过渡位置,(iv)落射荧光信号。
图24示出了实时优化成像/消融装置的控制参数的过程的流程图。
具体实施方式
引言
在详细描述本公开的各种实施例之前，应理解，本公开不限于特别示例的系统、方法、设备、产物、工艺和/或套件的参数，所述参数理所当然地可以变化。因此，虽然将参考特定配置、参数、组件、元件等来详细描述本公开的某些实施例，但是所述描述为示例性的，且不应被理解为限制所要求保护的发明的范围。另外，本文中所用的术语是出于描述实施例的目的，且不必用于限制所要求保护的发明的范围。
此外，应理解，对于本文中描述的任何给定组件或实施例，除非隐含地或明确地另有理解或陈述，否则针对所述组件列出的任何可能候选或替代方案通常可以单独使用或彼此结合使用。另外，应理解，除非另外隐含地或明确地理解或陈述，否则此类候选或替代方案的任何列表仅是示例性的，而不是限制性的。
另外，除非另有指示，否则在说明书和权利要求书中所使用的表达数量、构成、距离或其它度量的数字应被理解为由术语“约”修饰，正如术语在本文中定义。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可根据寻求通过本文提出的主题获得的期望特性而改变的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。尽管阐述本文呈现的主题的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告特定示例中阐述的数值。然而，任何数值固有地含有某些必然因其相应测试测量中存在的标准偏差所致的误差。
本文所使用的标题和小标题只是出于组织目的，而不用于限制本说明书或权利要求书的范围。
图1示出了传统的LAESI系统60。如图所示，激光40被引导到设置在样品载玻片30上的样品10。激光40被调谐以使样品10的一部分消融，引起在与激光传播方向相反的方向上向上传播的消融羽流20。电喷雾针50设置在样品载玻片30上方，高度介于样品载玻片30和激光40穿过的光学器件。电喷雾针50发射电喷雾液滴52贯穿消融羽流20的路径。这些液滴52中的一些将与消融羽流20的液滴相互作用以形成电离的样品液滴54。质谱仪入口56通常与电喷雾针50对齐并且被定位以接收一些电离的样品液滴54用于分析。
尽管诸如系统60之类的常规LAESI系统能够收集和分析样品10的消融部分，但仍存在一些限制。特别地，固有的空间限制严重限制了激光40可以应用于样品10的分辨率，这意味着光斑尺寸相对较大，通常比整个细胞大得多。为了使电喷雾液滴52流贯穿消融羽流20，电喷雾针50和质谱仪入口56必须定位在样品载玻片30和激光40传播通过的光学组件之间。这限制了系统的聚焦潜力，并致使光学器件的NA不够理想。除了空间限制之外，还可能需要光学器件通过电喷雾液滴52流聚焦以聚焦在样品10上。
这种传统LAESI系统60的另一个缺点是为了到达电喷射液滴52的交叉路径，激光40的传播方向(即，激光的k矢量)与消融羽流20而必须行进的方向相反。.这降低了将消融材料传输到质谱仪入口56的效率。此外，部件的空间定位意味着来自消融羽流20的碎屑会弄脏光学器件和其他上覆部件，进一步降低系统的性能并增加清洁和/或部件更换的操作成本。
成像和消融系统概述
图2示出了用于对样品进行成像和消融的系统100的示意图。所示系统100可以改进如上所述的传统LAESI系统60的一个或多个限制。系统100包括成像/消融装置110。成像/消融装置110包括光学组件112、样品台114和接收器116。如图所示，光学组件112倒置地设置在样品台114下方，使得光向上传播通过光学组件112并进入样品台114。样品台114的第一侧为上侧，样品台114的第二侧为下侧，使得光学组件112的物镜倒置地设置在样品台下方。
在操作中，用于成像和/或消融的光穿过光学组件112，然后穿过样品台114并进入位于样品台114上的样品10(例如，在本身位于样品台114上的样品载玻片上)。相同的光学组件112可用于样品10的成像和样品10内的目标感兴趣区域的消融。在消融期间，以样品10内的感兴趣区域为目标，并且将激光引导穿过光学组件112并进入感兴趣区域。可以调谐引导的激光以使感兴趣区域消融并形成从样品台114向接收器116延伸的消融羽流20。接收器116位于样品台114上方，使得可以在接收器116处捕获延伸的消融羽流20的至少一部分。样品台114、接收器116或所述两者可以包括允许它们在至少两个轴向方向上、优选在所有三个轴向方向上选择性地移动的定位系统。
与传统的LAESI系统60相比，所示的成像/消融装置110提供了倒置的光学组件112。有益地，可以更自由地相对于样品台114定位光学组件112，允许使用更高NA的光学器件。反过来，较高NA的光学器件能够专注于较小的感兴趣区域和较小的消融光斑尺寸。如下文更详细说明的，一些实施例可以实现亚细胞水平的消融光斑尺寸。
所示的成像/消融装置110还被配置为将激光引导到消融羽流20延伸的方向。在所示的成像/消融装置110中，消融羽流20旨在与传播的激光在相同的方向上延伸，而不是像在常规LAESI系统60中那样与传播的激光在相反的方向上延伸。所示的成像/消融装置110因此能够使消融样品材料有效转移到接收器116，而不需要消融羽流20逆着传播激光的方向行进。
此外，所示的成像/消融装置110的配置将光学组件112从延伸的消融羽流20的路径中移除。有益地，这限制了由消融碎屑接触或聚集在光学组件112上导致的光学退化和/或部件损坏。
接收器116可以配置为在空间和/或时间上区分接收到的消融材料的各个子样品(即，分别对应于每个消融事件的材料)。在一些实施例中，接收器116包括被配置为用于各个子样品的空间区分的介质，例如微孔板或纳米液滴阵列。这样的介质允许对收集的和空间区分的子样品进行后续分析，例如消融材料内的核酸的PCR或消融材料内核酸的测序。
接收器116可以附加地或选择性地包括电喷雾探针。电喷雾探针可用于产生电离的样品液滴以传输到质谱仪入口。接收器116也可以配置为溶剂润湿的表面。溶剂可以具有这样的流速，使得接收的消融子样品基于它们被消融和接收的时间在空间上被区分。
在一些实施例中，电喷雾探针和润湿表面结合。例如，如下文更详细说明的，电喷雾探针可以部分地设置在毛细管内，具有从毛细管伸出并终止于尖端的暴露的远端部分。暴露的远端部分被定位为接收来自样品台的消融子样品(即，定位于样品台上方)。毛细管被配置为将溶剂施加到电喷雾探针的外表面，使得溶剂沿暴露的远端部分的外表面流向电喷雾探针的尖端。以这种方式，当消融的子样品被暴露的远端部分捕获时，它们然后流向探针的尖端，在那里它们被电离并传输到质谱入口。
接收器116，特别是接收器的最初接触和接收消融羽流20的部分，可以与样品台的上表面间隔开约1mm或更小、或约500μm或更小，或约350μm或更小，或约250μm或更小，或约200μm或更小，或约150μm或更小的距离。已发现在上述范围内的尺寸，可通过接收器有效收集消融材料。
样品和接收器116最初接收消融羽流20的部分之间的距离也可以被调整以使消融材料有效传输到接收器116。消融材料将以动能(与速度成二次方)从样品中转移出来，但会经受使材料减速并消除动能的阻力(与速度成二次方)。所有动能将在大约L的距离内被移除：
Figure BDA0003656787950000131
其中h是样品消融部分的厚度/高度，ρs是样品密度，ρg是气体密度，C是阻力系数(通常约为1)。通常，计算出L约为700小时。因此，样品的上表面和接收器之间的距离优选地小于L，或者换句话说，优选地比样品的消融部分高度的大约700分之一还小。
在一些实施例中，成像/消融装置110包括孵育容器(未示出)，其在尺寸和形状方面被配置为设置在样品台114和接收器116之间，并被配置为向放置在样品台114上的样品10提供孵育环境。
所示系统100还可以包括上游处理器120，其被配置为在将样品定位在样品台114上之前对样品进行分类、空间定向和/或以其他方式处理样品。例如，上游处理器120可以包括用于将细胞或其他样品成分分类到样品载玻片上的分类装置，例如电动液滴分类器，该样品载玻片被配置为用于随后放置在样品台114上。上游处理器120可以附加地或选择性地包括离心机，例如CytospinTM离心机。离心机可以被配置为例如将细胞悬浮液旋转到载玻片上，载玻片被配置成用于随后放置在样品台114上。如本领域已知的用于分类和定位样品和/或细胞的其他上游处理组件可以附加地或选择性地包括在上游处理器120中。
上游处理器的一个示例是如图3所示的电动液滴分类器220。一系列液滴11可以在偏转器222(例如，一个或多个电极)附近通过，该偏转器用于选择性地偏转感兴趣的液滴，例如包含细胞12的液滴。细胞12可被引导到位于响应台213上的成像载玻片215。随着附加的液滴在载玻片215上分类，响应台213可以顺序移动以在载玻片215上提供空间。载玻片215可以具有参考标记，允许参考各个分类液滴的空间位置。摄像机224允许记录各个分类液滴的位置，该位置也可以与液滴流数据(例如，指示何时从液滴流中分类每个单独分类液滴的定时数据)相关联。
在已将所需数量的液滴分类到载玻片215上之后，载玻片215可被转移到例如图2所示的样品台114。由照相机224记录的载玻片215上的各个分类液滴的位置可以与使用成像/消融装置110获得的图像相关联。因此，消融子样品可以追溯到使用成像/消融装置110获得的图像，然后追溯到载玻片215上的空间位置，并最终追溯到液滴流数据。
附加的或选择性的上游处理操作可以包括将细胞固定到载玻片上。然而，如上所述，本文所述的系统、装置和方法能够在环境条件下执行活细胞的成像和消融，因此固定细胞不是必要的预处理步骤。其他附加的或选择性的上游处理操作可以包括对样品进行染色和/或将标签添加到样品。
再次参考图2，所示系统100还可以包括下游分析器130，其被配置为从接收器116接收消融样品以进行进一步分析。下游分析器130可以包括例如PCR机器、测序机器、光谱仪、质谱仪或它们的组合。可以附加地或选择性地包括本领域已知的其他生物分子分析装置。在包括质谱仪的情况下，分析器130可以包括例如飞行时间(TOF)质谱仪、OrbitrapTM质谱仪、线性离子阱质谱仪、四极质谱仪、四极离子阱质谱仪、扇形磁质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪中的一种或多种。
所示系统100还可以包括控制器140，该控制器通信地耦合到系统的一个或多个其他组件以提供系统100的控制和/或反馈。控制器140包括一个或多个处理器142、存储器144(例如，在一个或多个硬件存储设备上)和通信模块146，用于控制控制器与系统100的各种组件之间的数据发送和接收，控制器140耦合至该系统。控制器140还可以包括本领域已知的用于接收来自用户的输入和/或用于向用户显示信息的输入/输出硬件148。
下面描述与系统100有关的附加细节和实施例。应当理解，下文描述的实施例可以以任何组合提供并且与如上所述的整个系统100结合使用。在以下描述的实施例中，相似的数字可以用来指代相似的组件。
光学组件
图4示意性地示出了可以在诸如上述系统100的成像和消融系统中使用的光学组件312的一个示例。在一些实施例中，光学组件312被配置为提供落射荧光成像。光学组件312可以包括物镜318，其优选地具有约0.5或更大、或约0.65或更大、或约0.75或更大、或约0.8或更大的NA。光学组件312还包括成像光源356、消融光源354(即，消融激光源354)和照相机352(例如，电荷耦合器件(CCD)或CMOS照相机)。
光学组件312还可包括一个或多个二向色分束器/反射镜，例如二向色镜355和357。例如，二向色镜357被配置为将来自成像光源356的激发光或其一部分反射向物镜318，并允许样品发射回物镜318的发射光通过。然后发射的光可以被二向色镜355向相机352反射。一个或多个滤光器也可以沿光路定位，以便根据特定应用需要过滤/阻挡源光和/或反射的激发光。例如，根据需求，一个或多个激发滤光器可用于抑制来自激发光源的不想要的背景，一个或多个发射滤光器可用于抑制从样品和/或其他已知的滤光元件发出的不想要的荧光背景。二向色镜355还可用于允许来自消融光源354的消融光通向物镜318。也可以包括一个或多个反射镜/滤光器353，用于沿源354和物镜318之间的光路操纵激光。
例如，成像光源356可以包括氙弧灯、水银灯或LED。消融光源354优选地包括红外激光器(例如，近红外或“近红外线(NIR)”)。消融激光器也优选地是飞秒激光器。激光器还可以被配置为使用物镜318实现两个光子成像。消融光源354可与光源356补充或替代使用，用于成像以及消融目的。例如，如下所述，NIR源可以在低脉冲能量下用于获得成像信息并且在高脉冲能量下用于消融。
使用来自消融光源354的NIR对于预期的消融操作可能是特别有利的，特别是与使用紫外(UV)光相比。例如，消融光与目标生物样品的意义非凡的交互受限于光在生物材料结构处的散射(例如，膜、细胞核、囊泡等处的折射率的变化)。这会导致信息丢失，并且难以以有意义的方式将目标信息集中在检测器上。所施加的消融光还将受到生物结构上的相移和损失以及生物结构对光的吸收的影响。因为这些限制主要是所施加光的波长的函数，所以当使用NIR光时限制会更加宽松。因此，与UV应用(例如UV基质辅助激光解吸电离(MALDI)应用)相比，将消融光源354配置为NIR源具有更高的分辨率和样品穿透深度。
此外，为了通过定位实现优于约20nm的超分辨率，一个被限制为典型固定生物样品厚度的约1μm的穿透深度。对于标准可见(视觉识别系统(VIS))范围分辨率或约250nm，穿透深度最大约为10至20μm。在NIR的情况下，两个光子激发的穿透深度要高得多，例如高达约100μm。因此，NIR的使用有利地允许更深入地穿透到目标样品组织中，并且甚至能够对相对复杂的组织(例如，脑)进行消融。增强的深度穿透和分辨率还增加了剩余材料在激光操作后存活和/或保留结构信息的机会。此外，虽然较厚样品的成像在VIS范围内是不可行的，但使用低NIR脉冲能量的两个光子成像有利地允许在更大深度进行成像，因此能够获得更好的体积信息。
尽管在此示出了示例性光学系统312，但应当理解，用于成像和/或消融的其他光学部件，包括其他二向色镜、滤光器、反射镜、光源、照相机和/或本领域已知的其他光学部件，可以附加地或选择性地包括以提供其他成像模态。光学组件312也可以被配置为，例如，以实现明场成像和/或切片(例如，使用共焦成像组件)。本文所述的光学组件可以被配置为向成像和消融中的每一个提供独立的焦点控制。即，可以包括一个或多个自适应光学组件以提供例如对给定成像视场内的消融光斑尺寸的动态控制。
当用于消融感兴趣区域时，激光器可以配置为对于给定的1μm乘1μm乘2μm体素传送大约1nJ到大约20μJ的脉冲能量。更大的感兴趣区域能够吸收更多的能量，因此能够承受更大的绝对脉冲能量。换言之，激光器可以被配置为每μm3传送大约0.5nJ到大约10μJ的脉冲能量。
每μm3 10μJ的上限表示在预期过度发生分裂和电离之前的上限，因此表示希望保留消融感兴趣区域的上限。然而，如下文更详细说明的，在一些实施例中，可能期望通过递送一个或多个高于每μm3 10μJ上限的脉冲来使目标区域分裂/电离。简而言之，例如，可能需要将激光聚焦在细胞内感兴趣区域上方的大量介质上，并在随后消融细胞内感兴趣区域之前吹掉上覆的介质。这个过程可以为消融的感兴趣区域从样品台行进到接收器提供更大的间隙(参见对应于图11的相关讨论)。
如上所述，本文所述的成像/消融装置有利地能够靶向相对较小的感兴趣区域。光学组件可以被配置为提供例如约50μm或更小、或约30μm或更小、或约10μm或更小、或约5μm或更小、或约3μm或更小、或约1.5μm或更小、或约1μm或更小的目标区域的光斑尺寸直径。就体积而言，光学组件可以配置为消融约500μm3或更小、约250μm3或更小、约100μm3或更小、约50μm3或更小、约25μm3或更小、约10μm3或更小、约5μm3或更小、或约2μm3或更小的目标区域。
在一些实施例中，光学组件可以被配置为消融整个细胞或多个细胞的集合。在其他实施例中，光学组件可以被配置为用于消融亚细胞大小的目标区域，例如特定细胞器或其他细胞内区域，或特定细胞外区域。
消融样品接收器
图5示出了接收器416的示例，该接收器包括空间区分介质，例如微孔板、微孔芯片、纳米液滴阵列或能够接收单个的消融子样品并将不同的子样品保持在不同的、空间分离的隔室中的其他结构。接收器416可以附接到接收器台417，该接收器台能够选择性地在至少两个轴向上移动，更优选地在所有三个轴向上移动。
如上文关于其他实施例所述，光学组件412被配置以提供放置在样品台414上的样品10的成像和/或消融。在消融期间，产生的消融羽流20向上朝向接收器416延伸，在该接收器处它被收集并在空间上与其他消融子样品区分开来。当已收集到所需数量的子样品时，或当接收器416已满时，可将其从接收器台417移除并传到分析器以对收集的子样品进行进一步处理和/或分析。
图6A示出了接收器516被配置为纳米液滴阵列的特定实施例。与其他实施例一样，光学组件512被配置以提供放置在样品台514上的样品10的成像和/或消融。在消融期间，产生的消融羽流20向上朝向接收器516延伸，在该接收器处它可以被收集到相应的纳米液滴519或一系列这样的纳米液滴519中。不同的纳米液滴519因此形成不同的隔室，其用于在空间上将不同的消融子样品与不同的消融事件区分。如上所述，当已收集到所需数量的子样品时，或当接收器516已满时，可将其从接收器台移除并传至分析器以对所收集的子样品进行进一步处理和/或分析。
图6B示出了用于形成例如包括在接收器516中的纳米液滴阵列的示例性过程。声换能器562可用于施加声能以分离条形码阵列560中的条形码溶液。所得纳米液滴从条形码阵列560传输到上覆载玻片515。纳米液滴519可以包括不同的条形码并且因此准备好用于随后分析由纳米液滴捕获的消融子样品，例如随后的PCR或捕获的核酸的测序。条形码可以与载玻片515上纳米液滴519的空间位置相关联。
图7示出了包括电喷雾探针670的接收器616的实施例。这种类型的接收器对于生成包含消融子样品的电离的液滴可能特别有用，以便通过质谱法进行分析。电喷雾探针670穿过毛细管674。探针670的暴露的远端部分676延伸超出毛细管674的远端。溶剂672设置在毛细管674内并流出以润湿暴露的远端部分676的表面。毛细管674被配置为施加溶剂672，使得溶剂672沿暴露的远端部分676的外表面流向电喷雾探针670的尖端。电喷雾探针670的尖端形成电喷雾液滴并将它们引向质谱仪入口678。溶剂可以包括例如水和/或一种或多种挥发性有机化合物，例如甲醇、乙腈、乙酸等。
如图所示，暴露的远端部分676的润湿表面可以位于消融羽流20上方，使得在使用光学组件612对样品10进行消融期间将被消融的子样品收集在润湿表面上。样品台614和接收器台617的定位系统可以协调以将消融羽流20与暴露的远端部分676对齐。可根据消融频率控制溶剂672的流速以确保由流动溶剂672在暴露的远端部分676的润湿表面上捕获的连续子样品的有效空间分离。
与电离相对小部分消融材料的传统LAESI系统相比，已发现所示配置能够以约20％或更高、约35％或更高、约50％或更高、约65％或更高、约80％或更高、约90％或更高、约95％或更高、或约99％或更高的效率电离消融材料。
消融样品分析器
如上所述，下游分析器可用于进一步处理和/或分析接收器收集的消融子样品。取决于所需的处理和/或分析的类型，下游分析器可以包括一种或多种，例如PCR机器、测序机器、光谱仪、核磁共振(NMR)光谱仪、质谱仪、色谱装置、离心机、电泳装置、放射性标记和放射性标记检测装置、其他分析生化装置或其组合。
在包括质谱仪的情况下，分析器可以包括例如飞行时间(TOF)质谱仪、Orbitrap质谱仪、线性离子阱质谱仪、四极质谱仪、四极离子阱质谱仪、扇形磁质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪中的一种或多种。
在应用测序的情况下，测序机器可以配置为执行下一代测序(NGS)，有时也称为高通量测序。合适的测序方式包括454焦磷酸测序、离子激流测序、纳米孔测序、合成测序(即Illumina测序)和/或本领域已知或将开发的其他测序方法。也可以使用更传统的链终止方法(例如，Sanger测序)。
图8示出了下游过程的一个示例，其中一种或多种试剂可以添加到接收器716的空间分离的隔室(本示例中的纳米液滴719)中。可以添加一种或多种试剂以进行例如细胞裂解、蛋白质提取、还原、烷基化、分解和/或其他所需的反应以制备收集的子样品。
图8还示出了子样品可以附加地或选择性地转移到液相色谱质谱(LC MS)系统。例如，子样品可以传到液相色谱柱780，该色谱柱与电喷雾探针770耦合，用于将电离的样品传送到质谱仪730。
操作模式：
本文所述的装置和系统可以被配置为执行各种成像和/或消融过程。图9示出了用于将接收器上的消融子样品的位置与消融事件和样品载玻片上的目标感兴趣区域相关联的示例性方法800。如上所述，样品载玻片上的感兴趣区域可以进一步与上游分类/流数据相关联(参见例如图3和相关描述)。方法800可以使用通信地耦合到系统的某些组件的控制器来执行，例如上面关于系统100描述的控制器140。
在所示方法中，控制器可以首先使用样品的收集的图像数据记录感兴趣区域的空间位置(步骤810)。例如，可以使用明场成像、切片、落射荧光成像和/或双光子成像中的一种或多种来完成成像。此外，可以使用相同的物镜来完成成像，消融激光脉冲随后穿过该物镜用于消融目标感兴趣区域。
控制器然后可以将感兴趣区域的空间位置与导致感兴趣区域的至少一部分消融的消融事件相关联，消融事件形成携带自感兴趣区域到接收器的消融材料的消融子样品的消融羽流(步骤820)。因此，该步骤可以将消融事件的时间信息与样品载玻片上感兴趣区域的空间位置相关联。
然后控制器可以记录接收器上的消融子样品的位置(步骤830)，然后将消融事件与接收器上的消融子样品的位置相关联，接收器上的消融子样品的位置从而与消融事件和感兴趣区域的空间位置相关联(步骤840)。因此，这些步骤可以使接收器上的消融子样品的空间位置与消融事件的相应时间信息和样品载玻片上感兴趣区域的空间位置相关联。因此，该组相关性允许随后将子样品数据追踪回导致子样品数据的相应时间事件和空间位置。
在消融期间，激光脉冲频率、激光脉冲能量水平和激光脉冲深度可以独立变化以提供所需的操作能力。例如，在标准实施方式中，单个脉冲可以指向固定的焦点位置。可选择脉冲能量以优化消融、优化羽流形成和/或使转移子样品的降解最小化。
在其他实施方式中，所施加的激光脉冲的深度和/或脉冲能量水平可以动态地变化以提供期望的效果。图10以图形方式示出了一个示例操作模式，其中矩形xy区域被扫描和消融。可以调谐激光脉冲频率以平衡停留时间和脉冲到脉冲的重叠。这种类型的实施方式可以用于以空间协调的方式消融整个结构(例如，细胞内的各种细胞器)或其所需部分。请注意，沿图表轴的单位仅用于说明目的，不一定是明确的比例。
图11以图形方式示出了可以在有一层组织、介质或其他阻碍材料覆盖目标感兴趣区域的情况下使用的操作模式的另一个示例。“z驱动”线表示施加的激光脉冲沿轴向/垂直通道(即沿z轴，垂直于由x轴和y轴定义的样品台平面)的移动。“焦点位置”线表示目标感兴趣区域所在的深度。如图所示，上层最初会经历更高能量的激光脉冲，这些激光脉冲可以更好地按需定制用于去除覆盖材料并打开轴向通道。一旦动态移动的激光脉冲到达感兴趣区域的深度，激光脉冲能量水平可以降低到更适合于感兴趣区域的消融的水平。然后，在形成的通道塌陷回感兴趣区域之前，消融材料可以离开样品并朝向接收器行进。请注意，沿图表轴的单位仅用于说明目的，不一定是明确的比例。
如图11所示的操作模式可以有利地消融从上表面测量的样品内较深的目标区域。例如，在不首先去除一些覆盖材料的情况下，在某些情况下，消融可能仅限于样品的上部2-10μm，因为需要通过任何剩余的覆盖材料将产生的羽流向上传输到接收器。动态地配置如图11中的操作模式可以去除或减少覆盖组织的数量，因此允许来自更深感兴趣区域的消融羽流有效地传输到接收器。
如本文所述的成像和消融装置也可以操作以将消融激光器聚焦在距样品上表面与空间分辨率值相关联的深度处(即，样本上两点之间的最短距离仍可区分)。也就是说，当所需的空间分辨率值较小时，消融激光器聚焦的最大深度也较小，当所需和/或利用的空间分辨率值较大时，消融激光器的最大聚焦深度也更大。这种方法允许在有效瞄准感兴趣区域所需的空间分辨率值足够大的情况下获得更大的聚焦深度，但在所需空间分辨率值较小的情况下限制聚焦深度，从而增加产生的消融羽流能够成功地从样品传输到接收器的可能性。
例如，消融激光器可以聚焦在从样品上表面测量的不超过空间分辨率的R倍的深度，其中R是约5至约30的值，例如大约10、15、20或25的值。然而，应当理解，在大于由R值规定的深度，可以在至少一些应用中消融，例如在使用动态激光操作的情况下，如图11所示的操作。
设置在样品的底表面和激光焦点之间的样品的至少一部分可以保持未消融。因此，可以以允许将所产生的消融羽流成功传输到接收器的方式将特定深度处的特定子样品体积作为消融的目标。
激光聚焦检测单元
图12示出了包括激光聚焦检测单元(FDU)1000的示例性成像/消融装置。FDU可以与上面参考图2至11提到的任何成像/消融装置一起使用。选择的物镜1020(该装置可以配备多个不同的物镜，例如多达五个物镜)将光聚焦通过样品台1001的透明窗口并进入样品1002。系统的光轴由箭头1008指示。样品台1001包括透明窗口，例如玻璃或塑料窗口，例如透明载玻片或盖玻片，或其上安装样品的其他透明玻璃或塑料支撑件。透明窗口可以保护样品免受显微镜或光学组件的大气影响。样品1002可以是一个或多个细胞的样品。样品1002具有顶层水1002b，即覆盖细胞。诸如空气的大气1007围绕样品。大气可以包括用于活细胞实验的湿度/CO2流量控制。
箭头C代表入射光束的路径或直径，可以是落射照明光束、用于消融的激光脉冲或用于荧光发射的激发光。光束C，例如用于消融的激光，由物镜聚焦在样品中的焦点1003处。具有直径1009的空腔最初通过消融激光的脉冲在焦点1003处在样品中产生。随后产生包含消融样品材料的消融羽流1004，其从样品在其表面处随大气膨胀，通常具有cos2分布。消融羽流1004向位于样品上方的接收器1005扩展，例如接收器板、电喷雾探针或质谱仪的入口。区域1006代表羽流1004在接收器1005上的投影。
允许(脉冲)透照快照成像的光源1011，例如闪光灯，定位于样品上方。提供透镜1014用于将来自光源的光准直进入样品1002。
指示了几个光路。来自消融激光器的激光由波前A和具有能量P的脉冲波形指示，其遵循路径C。路径C通常表示从下方朝向样品的光的落射照明光束路径，包括来自消融激光器的光和用于荧光发射的激发光。聚焦检测单元(FDU)的参考激光束由光束路径B表示。路径D表示背反射光和荧光发射的光路。图12中未显示的照相机(例如CCD)或光谱仪接收来自路径D的光以产生可以时间分辨和/或光谱分辨的信息。
来自运行中的FDU的参考激光器的激光从样品的表面1010反射回。显示了来自FDU的参考激光器的透射激光B//已经透射穿过样品1002。定位快速光电检测器1012以检测透射的激光B//。
包括图12中示意性示出的FDU的消融系统可以使用图13中所示的示例性光学系统来实施。图13中所示的光学系统包括许多与图4中示意性地示出的光学系统相同的组件，并且这些相同的组件使用相同的附图标记。图13所示的光学系统还包括一个FDU，该FDU包括至少一个参考激光器2002。两个参考激光器用于图12所示的系统。通常由箭头B所示的参考激光束被FDU二向色分束器/反射镜2004反射以进入物镜318。FDU的参考激光器优选是近红外或“NIR”激光器。在所示实施例中，参考激光束由905nm激光组成。参考激光聚焦在物镜的后焦平面(BFP)中，在样品空间中形成准直光。二向色镜2004仅反射905nm激光，其他波长光(例如UV、可见光、其他NIR等)通过二向色镜。因此，参考激光器波长与二向色镜2004一起，使落射光-显微镜设置独立于FDU。已经从样品台和/或样品背向反射的反射参考激光束，其可能包括来自产生的空腔或消融羽流的反射，由光电检测器2006检测。FDU参考激光器和检测的进一步的细节参考下面的图14和15进行描述。图13中的光学系统受控制器2050的控制，该控制器与针对上述系统100描述的控制器140一样，包括一个或多个处理器、存储器(例如，在一个或多个硬件存储设备上)和通信模块，用于控制控制器和与控制器耦合的系统的各个组件之间的数据的发送和接收。向/从控制器发送/接收数据由箭头指示。控制器还可以包括本领域已知的用于接收来自用户的输入和/或用于向用户显示信息的输入/输出(I/O)硬件。
参考图12，显示了系统中的几个距离，这些距离将在消融过程中进行监测：ΔZ1是从物镜1020到样品台1001(即其透明窗口)的距离，ΔZ2是在样品/大气界面处从物镜1020到样品反射面1010的距离，并且ΔZ3是从样品台1001到接收器1005的距离。
参考图12，F1，F2，F3表示FDU的参考激光束。来自FDU的第一参考激光器(激光器#1)的第一参考激光束F1被引导到偏离光轴的光学系统的物镜中。物镜1020将第一参考激光束F1以相对于物镜的角度α朝向样品台聚焦。角度α取决于所使用的物镜。第一参考激光束F1在物镜处聚焦以在物镜空间中以角度α形成平行光。角度α可用于三角测量以测量和/或控制物镜1020到样品台1001的相对距离ΔZ1以及物镜1020到样品表面1010的相对距离ΔZ2。
第一参考激光束F1的一部分从样品台(即从样品台的透明窗口)反射，产生第一反射参考激光束F'2。反射的参考激光束F'2在物镜内相对于进入的第一参考激光束F1以径向距离R1径向位移。参考图14和15，更详细地示出了光电检测器2006的阵列检测器检测第一参考激光束F1和反射的参考激光束F'2的光束位置以及因此之间的距离R1。参考光束之间的距离R1是距离的函数ΔZ1所以用于测量物镜1020到样品台1001的距离。
第一参考激光束F1的一部分也从具有大气的样品表面反射，这可能是细胞样品上方的水位，产生第二或进一步反射的参考激光束F3。反射的参考激光束F3在物镜内相对于进入的第一参考激光束F1以径向距离R2径向位移。参考图14和15，更详细地示出了光电检测器2006的阵列检测器检测第一参考激光束F1和反射的参考激光束F3的光束位置以及因此之间的距离R2。参考光束之间的距离R2是距离的函数ΔZ2所以用于测量物镜1020到关于大气的样品表面1010的距离。
来自FDU的第二参考激光器(激光器#2)的第二参考激光束F2沿光轴1008(即垂直于物镜)被引导进出物镜。第二参考激光束F2通过分束器被引导到物镜，分束器形成干涉仪的一部分(参考图14、15和16在下文描述)。FDU的第一和第二参考激光器可以同时(无时间延迟)或顺序(即有时间延迟)彼此施加。FDU的第一和第二参考激光器可以相对于消融激光脉冲的定时同时或顺序地施加，优选地与消融激光脉冲同时施加。换句话说，测量ΔZ1和/或ΔZ2和/或ΔZ3可以相对与消融激光脉冲的定时同时发生或顺序发生(优选同时发生)。测量ΔZ1和/或ΔZ2和/或ΔZ3优选地可以在消融激光脉冲之前开始并且优选地同时继续。测量ΔZ1和/或ΔZ2和/或ΔZ3可以在包括消融激光脉冲的时间段内基本上连续地执行。
图15在A中示出了在阵列检测器2006处接收到的参考激光束F2、F2'和F3的位置。为简单起见，参考激光束F1未示出。参考光束F2'和F3相对于光束F1在阵列检测器上的位置是样品台和样品表面分别相对于物镜的z轴位置的量度。如图14所示，参考光束通过分束器2010到达阵列检测器2006。分束器2010是50:50分束器。在其他实施例中，可以使用以不同的比率(例如10:90(透射：反射))分离光的分束器。在图14中，为简单起见仅示出了第二参考光束F2。
光电检测器2006的阵列检测器是具有实时峰值检测的光电检测器，即以至少kHz帧速率(>1kHz)操作。阵列检测器的时间分辨率优选为1ms或更高，或1μs或更高，例如在1ms至1ps，或1ms至1ns，或1ms至1μs，或1μs至1ns的范围内。在一个实施例中，FDU的光电检测器包括如所述的阵列检测器和一个或多个单元件光电检测器。单元素光电检测器用于实现尽可能高的时间分辨率，例如1ns或更高或1ps或更高。在一个实施例中，至少沿中心光轴进出物镜的光束F2由具有比阵列检测器更高的时间分辨率，例如至少10ns、或至少1ns、或至少1ps的时间分辨率，例如1ns至1ps的分辨率，的(单元件)检测器或阵列的像素检测。B中的图15示意性地示出了光束F2穿过然后被分束器2010反射以被单元件快速光电检测器Z检测。还示出了由反射的F2光束的这种检测产生的干涉图案2011。这可以实时检测样品表面，例如水位。
如图14示意性所示，检测器2006形成干涉仪2014的一部分，该干涉仪还包括分束器2010和反射镜2016，以及FDU的第一参考激光器(#1)3002和第二参考激光器(#2)3004形式的光源(为简单起见仅显示激光器#2)。FDU的另一个视图在图16中示意性地示出，该图再次示出了阵列检测器2006、分束器2010、二向色镜2004，以及第一参考激光器(#1)3002和第二参考激光器(#2)3004。
如上所述，参考激光器#1用于三角测量以在系统中确定距离ΔZ1和ΔZ2。在图17中，显示了由于从样品台(例如载玻片或盖玻片)表面ΔZ1(下表面)和ΔZ1'(上台面)反射的光束而在阵列检测器上的像素强度数据。通常，ΔZ1测量用于调整或控制相对于样品台定位物镜的z驱动机构，从而控制消融激光器的激光焦点深度。像素距离ΔZ1,1'是所用物镜的放大倍率和NA的函数。如图18所示，阵列检测器的检测像素可以针对已知的物镜位置(ΔZ1值，以及ΔZ2值)校准。校准提供了阵列检测器的像素和ΔZ1值的线性相关性。
如上所述，参考激光器#1也用于三角测量以在系统中确定距离ΔZ2，例如具有亚微米精度，这取决于所使用的物镜类型。在图19中，显示了对于不同水位(即样品高度)a,b,c,d,由于从样品台(ΔZ1)和从样品表面(ΔZ2)反射的光束而在阵列检测器上的像素强度数据。在图20中显示了相同的数据，但还显示了来自检测器的数据，因为样品在样品台上变干了。此ΔZ2值还用于调整或控制相对于样品表面定位物镜的z驱动机构，这提供了对消融激光器的激光焦点深度的控制。
FDU的参考激光器#2(光束F2)用于消融腔和羽流传播的干涉测量，即在z轴方向上。图21示出了来自激光器#2在光电检测器处的干涉信号(I)的时间(t)依赖性，该干涉信号(I)源自自空腔形成和羽流-样品界面的反射。干涉信号提供关于空腔和羽流形成的精确位置和时间分辨信息。信号中的建设性和破坏性极值定义了轨迹坐标，来自函数X(t,n.λ/2)。ΔX(t)/Δt)，它允许精确地监测空腔向接收器的速度。极值出现在n*λ/2处(n是整数)，并且由于羽流运动的方向是已知的，每个λ/2的数据点，在时间t检测极值X，ΔX(t)/Δt是速度。
从所描述的实施例可以看出，FDU可以包括至少第一参考激光器，该至少第一参考激光器被配置为将第一激光沿偏离物镜的光轴的轴引导到物镜，并且该至少一个光电检测器被配置为首先检测沿偏离物镜光轴的轴反射回穿过物镜的第一激光。从所描述的实施例中还可以看出，FDU可以包括至少第二参考激光器，该至少第二参考激光器被配置为将第二激光沿物镜的光轴引导到物镜，并且该至少一个光电检测器被配置为检测沿物镜的光轴反射回穿过物镜的第二激光。此外，在一个实施例中，被配置为检测沿物镜的光轴反射回的第二激光的至少一个光电检测器形成干涉仪的一部分。在一个实施例中，沿物镜的光轴反射回的第二激光同时提供来自样品中由来自消融激光器的激光形成的空腔的干涉信号。在一个实施例中，沿物镜的光轴反射回的第二激光同时提供来自样品中由来自消融激光器的激光形成的空腔的干涉信号。
再次参考图12，光B"是FDU的透射的参考激光束。位于样品上方的，角度α对应于物镜的NA的快速光电检测器1012监测通过样品表面的空腔。当空腔传播到表面时，空腔会干扰透射的参考激光束B"，因此光电检测器1012上的信号也会发生变化，从而提供关于空腔形成和空腔行进到样品表面的动态信息。这种对消融腔和羽流传播的监测可以与参考激光器#2补充或替代使用来监测ΔZ2.
通过快速光电检测器(亚纳秒(ns)分辨率)执行对消融空腔和羽流形成的动态检测，以监测样品的表面反射特性，即作为时间函数的样品高度H(t)。使用检测器1012对检测信号D(Ht)的监测指示空腔何时在时间t'通过样品/大气的表面。从时间t'到t"，羽流正在穿过表面。空腔/羽流的轴向长度通过Δt＝t"-t'和声速定义，此时其受样品介质和大气的影响且可以估算。图22示意性地示出了用于消融监测的光学器件的操作。显示出样品表面的高度H随着空腔传播随着时间的推移而发展，t1<t2<t3<t4，直到在t"处形成羽流。如上所述，显示了使用FDU的参考激光束F1、F2和F3监测空腔传播和羽流形成。
从上文可以看出，在一些实施例中，至少一个光电检测器包括快速光电检测器，该快速光电检测器被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光，该激光已经从样品台和/或样品的至少一个表面反射和/或透射穿过该至少一个表面。这里的快速光电检测器优选地具有亚纳秒时间分辨率，即至少1ns的分辨率，例如1ns-1ps。此外，在一些实施例中，至少一个快速光电检测器包括被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光源自具有不同折射率的样品的(轴向)界面，例如从样品台表面反射，并被引导回穿过物镜。至少一个光电检测器可以包括被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已经从面向接收器的样品与大气的表面反射，并被引导回穿过物镜。光电检测器可以包括用于峰值检测的阵列检测器。在一个实施例中，至少一个光电检测器包括设置在样品的第一(上)侧并且被配置为检测来自至少一个参考激光器的激光的光电检测器，该激光已经透射穿过样品。至少一个快速光电检测器优选地被配置为以亚纳秒时间分辨率解析至少一个检测信号。至少一个快速光电检测器优选地是至少一个光电二极管。
来自光源1011(特别是配置为闪光灯)的样品的脉冲透照，以及由相机(例如图4和13中的CCD检测器352)进行的透照检测，使得能够对空腔形成，空腔向表面介质的传播，以及羽流形成的动态进行快照成像。透照图像还可以确定空腔尺寸。
也可以使用成像/消融装置测量荧光发射，例如落射荧光和/或拉曼发射。来自荧光激发源(例如，图4或13中的光源356)的光可以被施加，例如，在消融激光器之后有或没有延迟。在延迟t＝0(即相对于消融激光器没有延迟)时，可以将消融激光器的非线性效应用于荧光，例如，如下所述：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6788598(Lee等人，同时无标记自发荧光和多谐波成像揭示小鼠皮肤的体内结构和代谢变化，BiomedOpt Express。2019,10(10),5431–5444；https://www.nature.com/articles/s41467-018-04470-8(You等人，通过同时无标记自发荧光多谐波显微镜检查进行活体成像，自然通讯9,货号：2125(2018)；和https://aip.scitation.org/doi/full/10.1063/1.5098349(SABoppart等人，同时无标记自发荧光-多谐波显微镜检查及其他.对于拉曼发射，可以使用单独的激发激光器(未显示)。发射可以光谱和/或时间分辨。这种发射可以作为来自消融激光器的焦点的信号并且例如从快照图像中获得。相同的检测器，例如用于检测透照的照相机，可用于检测荧光发射图像。然而，优选地，荧光发射或拉曼发射(至少拉曼)被引导到具有光谱仪的快速光电检测器(例如，阵列光电检测器)，以实现对样品的消融体积的荧光或拉曼发射的时间分辨和光谱分辨检测。使用这样的系统，样品中的空腔形成可以在消融激光脉冲之后的时间t使用闪光灯1011通过透照成像，并且可以在材料激发之后在稍后的时间t'荧光成像。因此，时间分辨率也可以通过使用不同的透照和荧光光源来获得。参考图22，来自激光焦点1009的落射信号(落射荧光和/或拉曼信号)由分光器引导到与光谱仪组合的快速光电检测器(例如阵列光电检测器)以实现荧光光谱或拉曼光谱，例如I(λ)，的时间分辨和光谱分辨检测。
检测到的落射荧光信号或图像优选地是时间分辨的并且可以用于提供空腔特性和关于样品中的分子分裂的信息，即在物镜的焦点位置处。检测到荧光耗尽可以表明正在发生分子分裂，例如，如果消融激光脉冲能量太高。在一个实施例中，随后以较低能量施加下一个消融激光脉冲。定量荧光强度分析能够估计消融材料到分析器(例如质谱仪)的传输效率。另一方面，对拉曼信号的振动/旋转带的分析揭示了有关发送到分析器(例如质谱仪)的分子的预期质量的信息，而振动/旋转带的强度分布表明了分子的热状态(内能)。拉曼峰强度可以与质谱仪检测到的分子的峰强度相关联。
图23显示了如何执行消融参数和消融激光脉冲能量E0的校准。脉冲能量E0和距物镜的样品高度ΔZ2确定空腔是否可以通过样品/大气界面并形成消融羽流。在阈值脉冲能量Emax消融分子变性，即分裂，其被检测为荧光耗尽。因此，如果有效脉冲能量E0>Emax，则需要降低脉冲能量EΔZ2。Δz2的值会因蒸发而降低。然而，这需要时间。可选地或另外地，Δ由于羽流浓度的cos2发散，可以降低Δz3。检测器1012上的信号D的变化是函数H(t)。在一个实施例中，如图(i)所示，每个脉冲和/或脉冲频率的脉冲能E0增加直到如图(ii)所示，检测信号D(H(t))表明空腔在时间t'处膨胀。时间t'是声速和ΔZ3的函数。从t'-t"，可以发现通过界面介质/空气的羽流的轴向高度。如图(iii)所示，参考光束F3(Ht)测量从介质到大气的过渡(界面)以及大气中的粒子向接收器传播的精确位置，接收器可以是例如质谱仪的电离模块。图(iv)中显示的(时间)分辨落射荧光信号提供了有关物镜焦点位置处的空腔特性和分子分裂的信息。
由上可知，在实施例中，所述光学组件包括激光聚焦检测单元，所述激光聚焦检测单元包括：至少一个参考激光器，所述至少一个参考激光器设置在样品台的第二侧且被配置为引导激光穿过物镜，穿过样品台并进入样品，激光聚焦检测单元进一步包括至少一个光电检测器，该至少一个光电检测器配置为通过检测来自至少一个参考激光器的激光产生至少一个检测信号，其指示在样品的至少一部分被消融时样品的一个或多个特性，和/或指示从物镜到样品台的距离，和/或指示从物镜到样品的表面的距离。
在实施例中，激光聚焦检测单元还被配置为将至少一个检测信号发送到控制器，控制器被配置为基于至少一个检测信号动态地控制消融激光器的一个或多个参数和/或物镜的位置和/或接收器的位置。控制器可以是控制器140或控制器2050，或类似的控制器。一般而言，控制器包括微控制器和FPGA或计算机系统并且通信地耦合到系统的一个或多个其他组件以提供系统的控制和/或反馈，如下文进一步描述。控制器通信地耦合到激光聚焦检测单元以接收一个或多个检测信号。在一个实施例中，控制器通信地耦合到物镜(例如，通过驱动器来控制物镜在z轴方向上的位置)。在一个实施例中，控制器还通信地耦合到接收器台(例如，通过驱动器来控制接收器在x、y和/或z轴方向上的位置)。在一个实施例中，控制器还通信地耦合到消融激光器(例如，以控制激光脉冲能量和/或脉冲频率)。
控制器可以包括一个或多个处理器、存储器(例如，在一个或多个硬件存储设备上)和通信模块，用于控制控制器与控制器耦合到的系统的各种组件之间的数据发送和接收.控制器还可以包括本领域已知的用于接收来自用户的输入和/或用于向用户显示信息的输入/输出硬件。
所描述的装置和系统可用于提供一种连续或实时调整或控制消融过程的手段，特别是样品中的激光脉冲能量、脉冲频率和/或激光焦点位置。在一个实施例中，控制器被配置为基于来自FDU的至少一个检测信号动态地控制消融激光器的一个或多个参数和/或物镜的位置和/或接收器的位置。在一个实施例中，控制器被配置为基于至少一个检测信号连续地调整物镜的位置和/或接收器的位置。因此，来自FDU的至少一个检测信号形成了用于对消融过程进行连续、实时控制的控制回路的基础。
在一个实施例中，基于由FDU测量的ΔZ1(和ΔZ2)，随着样品内激光焦点的移动，物镜和样品台之间的轴向(z)距离连续的以高频实时调整。响应于ΔZ1(和ΔZ2)的反馈，物镜的轴向位置的调整可以通过由控制器控制的可移动驱动器/致动器来实现。基于ΔZ1和ΔZ2，激光焦点与接收器之间或样品表面与接收器之间的距离被连续校正。响应于ΔZ1(和ΔZ2)的反馈，接收器的轴向位置的调整可以通过由控制器控制的可移动接收器台来实现。
在一个实施例中，优选使用来自快速光电检测器检测透射参考光束B"的检测信号，和/或来自快速光电检测器沿物镜光轴检测参考光束F2的检测信号来控制消融激光器的脉冲序列(脉冲频率)中的脉冲数量，以确保激光诱导的空腔馈通样品介质。脉冲数和脉冲强度都可以是控制回路参数。来自快速光电检测器检测参考光束F2的检测信号中的干涉用于监测空腔在轴向(z)方向上的相对行进。
在一个实施例中，来自快速光电检测器检测透射参考光束B"的检测信号(D)优选地用于控制消融激光器的脉冲能量。此外，荧光/拉曼信号还可以或可替代地允许通过相应地控制激光功率来监测和控制样品中分子的分裂。
在一个实施例中，快照落射荧光成像能解释羽流形成和热检测。以这种方式，消融的感兴趣区域(ROI)、激光功率和/或脉冲序列特性可以相应地进行调整。
在一个实施例中，控制器通信地耦合到分析样品的消融部分的质谱仪，使得由控制器控制的系统的一个或多个控制参数与质谱仪信号相关联。FDU的可观测量与MS信号的相关性能够对质谱仪响应进行定性校正。质谱仪信号的快照成像使质谱仪信号保持恒定以进行MS检测。
参考图24，显示了用于实时优化成像/消融装置的控制参数的过程的流程图。
如上所述使用成像能力，在步骤4010选择位于样品台上的样品中具有x、y、z坐标的感兴趣区域ROI。从样品台到接收器的最小距离在步骤4020由确保接收器和样品之间不接触的装置设置。在步骤4030，使用所描述的使用聚焦检测单元(FDU)三角测量ΔZ1,ΔZ2,ΔZ3的方法,可以测量样品台上方的样品介质的厚度，并且通过控制器在回路中的反馈，可以在质谱仪测量期间保持从样品介质到接收器的距离恒定，例如以补偿任何影响样品的冷凝或蒸发。在步骤4040，物镜焦点位置连同从样品介质到接收器的距离一起被连续校正。
在步骤4050以能量E0施加消融激光脉冲。然后在步骤4060，在快速光电检测器处发射的参考FDU激光束F1(B")的信号与反射的FDU激光束F2的干涉信号一起被监测。从这些信号可以确定消融羽流是否已经通过样品与大气的界面。如果“否”，则重复步骤4050，将消融激光脉冲能量调整为E0,i+1＝E0+ΔE。如果“是”，则在步骤4070，在测量消融脉冲和/或荧光发射和/或拉曼信号之后，在延迟时间t'处用透照光源捕获图像。同时，在步骤4080获取通过接收器引入质谱仪的消融材料的质谱仪测量值。在步骤4090将荧光发射强度与成像进行比较，以检查样品中的分子被激光脉冲分裂的程度是否是可接受的水平。如果“否”，那么ΔZ3和激光脉冲能量E0降低，或选择新的焦点位置和/或ROI。如果“是”，则在步骤4100为全ROI获取消融样品材料的质谱仪测量值。在步骤4200提供的来自步骤4060、4070、4080和4100的数据用于使用诸如空腔体积和荧光信号等的输入参数定量解释来自用质谱仪检测的样品的分子的传输。
计算机/控制器系统
应了解，计算机系统越来越多地采取各种各样的形式。在本说明书中和在权利要求书中，术语“控制器”、“计算机系统”或“计算系统”广泛地定义为包含任何装置或系统或其组合，其包含至少一个物理和有形处理器和能够在其上具有可由处理器执行的计算机可执行指令的物理和有形存储器。作为示例而非限制，如本文中所使用的术语“计算机系统”或“计算系统”意图包含个人计算机、台式计算机、膝上型计算机、平板电脑、手持型装置(例如，移动电话、掌上电脑、寻呼机)、基于微处理器的或可编程的消费电子产品、微型计算机、大型计算机、多处理器系统、网络个人电脑、分布式计算系统、数据中心、消息处理器、路由器、交换机和甚至传统上尚未认为是计算系统的装置，例如可穿戴物(例如，眼镜)。
存储器可采取任何形式，且可取决于计算系统的性质和形式。存储器可以是物理系统存储器，其包含易失性存储器、非易失性存储器或两者的某种组合。术语“存储器”在本文中还可用于指代非易失性大容量存储装置，例如物理存储介质。
计算系统在其上还具有通常称为“可执行组件”的多个结构。举例来说，计算系统的存储器可以包含可执行组件。术语“可执行组件”是计算领域的普通技术人员充分理解为可以是软件、硬件或其组合的结构的结构的名称。
举例来说，当在软件中实施时，本领域普通技术人员应理解，可执行组件的结构可以包含可由计算系统上的一个或多个处理器执行的软件对象、例程、方法等等，无论这种可执行组件是否存在于计算系统的堆中，或可执行组件是否存在于计算机可读存储介质上。可执行组件的结构以这种形式存在于计算机可读介质上，使得其在由计算系统的一个或多个处理器执行时可操作以使计算系统执行一个或多个功能，例如本文中所描述的功能和方法。这种结构可以直接由处理器成为计算机可读的——如同可执行组件是二进制的情况一样。替代地，结构可构造成可解译和/或编译的(无论是在单个级中还是在多个级中)，以便生成由处理器直接可解译的这种二进制。
术语“可执行组件”也由普通技术人员充分理解为包含专用或接近专用地在硬件逻辑组件中实施的结构，例如在可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、程序专用标准产品(ASSP)、片上系统(SoC)、复杂可编程逻辑装置(CPLD)或任何其它专用电路内。因此，术语“可执行组件”是用于计算领域的普通技术人员充分理解的结构的术语，无论是在软件、硬件还是其组合中实施。
术语“组件”、“服务”、“引擎”、“模块”、“控制”、“发生器”等也可用于本说明书中。如在本说明书中和在这种情况下所使用的，这些术语——无论是用修改子句还是不用修改子句来表达——也意图与术语“可执行组件”同义，且因此也具有由计算领域的普通技术人员充分理解的结构。
虽然不是所有的计算系统都需要用户接口，但在一些实施例中，计算系统包含用于传达来自用户的信息/向用户传达信息的用户接口。用户接口可以包含输出机构以及输入机构。本文中所描述的原理不限于精确的输出机构或输入机构，因为这将取决于装置的性质。然而，输出机构可以包含例如扬声器、显示器、触觉输出、投影、全息图等等。输入机构的示例可以包含例如麦克风、触摸屏、投影、全息图、相机、键盘、触控笔、鼠标或其它指示器输入、任何类型的传感器等等。
因此，本文中所描述的实施例可以包括或利用专用或通用计算系统。本文中所描述的实施例还包含物理和其它计算机可读介质，用于携带或存储计算机可执行指令和/或数据结构。这种计算机可读介质可以是可由通用或专用计算系统存取的任何可用介质。存储计算机可执行指令的计算机可读介质是物理存储介质。携带计算机可执行指令的计算机可读介质是传输介质。因此，作为示例而非限制，本文中所公开或设想的实施例可以包括至少两种明显不同种类的计算机可读介质：存储介质和传输介质。
计算机可读存储介质包含RAM、ROM、EEPROM、固态驱动器(“SSD”)、闪存、相变存储器(“PCM”)、CD-ROM或其它光盘存储器、磁盘存储器或其它磁性存储装置，或可用于存储呈计算机可执行指令或数据结构形式的所需程序代码且可由通用或专用计算系统存取和执行以实施本发明的所公开的功能的任何其它物理和有形存储介质。举例来说，计算机可执行指令可体现在一个或多个计算机可读存储介质上以形成计算机程序产品。
传输介质可以包含网络和/或数据链路，所述网络和/或数据链路可用于携带呈计算机可执行指令或数据结构形式的所需程序代码，且可由通用或专用计算系统存取和执行。上述的组合也应包含在计算机可读介质的范围内。
另外，在到达各种计算系统组件时，可将呈计算机可执行指令或数据结构形式的程序代码从传输介质自动传送到存储介质(或反之亦然)。举例来说，通过网络或数据链路接收到的计算机可执行指令或数据结构可在网络接口模块(例如，“NIC”)内的RAM中缓冲，且接着最终传送到计算系统RAM和/或计算系统处的较不易失性存储介质。因此，应理解，存储介质可以包含在也利用或甚至主要利用传输介质的计算系统组件中。
本领域的技术人员应进一步了解，计算系统还可含有允许计算系统通过例如网络与其它计算系统通信的通信信道。因此，本文中所描述的方法可在具有许多类型的计算系统和计算系统配置的网络计算环境中实践。所公开的方法还可在分布式系统环境中实践，其中通过网络(通过硬连线数据链路、无线数据链路或通过硬连线和无线数据链路的组合)链接的本地和/或远程计算系统都执行任务。在分布式系统环境中，处理、存储器和/或存储能力也可以是分布式的。
本领域的技术人员还应了解，所公开的方法可在云计算环境中实践。云计算环境可以是分布式的，但这不是必需的。当分布时，云计算环境可在组织内国际分布和/或具有跨多个组织拥有的组件。在本说明书和所附权利要求书中，“云计算”定义为用于实现对可配置计算资源(例如，网络、服务器、存储装置、应用和服务)的共享池的按需网络访问的模型。“云计算”的定义不限于当适当部署时可从这种模型获得的其它众多优点中的任一个。
云计算模型可由各种特性构成，例如按需自助服务、广泛网络访问、资源池化、快速弹性、测量的服务等等。云计算模型还可以各种服务模型的形式出现，例如软件即服务(“SaaS”)、平台即服务(“PaaS”)和基础设施即服务(“IaaS”)。云计算模型还可使用例如私有云、社区云、公共云、混合云等等的不同部署模型来部署。
所定义术语的缩写列表
为了辅助理解本书面说明书和所附权利要求书的范围和内容，下文直接定义了选择的几个术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通的技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文中所使用的术语“近似”、“约”和“大体上”表示接近仍进行所需功能或实现所需结果的具体陈述的量或条件的量或条件。举例来说，术语“近似”、“约”和“大体上”可指偏离具体陈述的量或条件小于10％，或小于5％，或小于1％，或小于0.1％，或小于0.01％的量或条件。
如本文所用，术语“消融”是指将能量选择性地施加到目标区域，以便将目标区域内的生物分子从周围结构中释放出来。消融材料通常会形成远离目标区域的初始位置而行进的材料“羽流”。
如本文所用，术语“感兴趣区域”旨在被理解为成像/消融装置的视野内的任何区域，其中存在一种或多种需要收集、处理和/或分析的生物分子.感兴趣区域可以包括整个视场，但更典型地是视场的一部分并且可以是例如细胞或细胞集合、例如细胞内的细胞器的细胞内/亚细胞区域，或一个细胞外区域。
如本文所用，术语“子样品”旨在指空间和/或时间上彼此分离的消融材料的各个部分，例如通过在接收器上彼此空间分离和/或通过被接收器在来自不同消融事件的不同时间接收。因此，术语子样品旨在将收集的消融材料的单独部分与较大的整体“样品”区分开来，该样品位于可以成像和选择性消融的载玻片/台上。
可参考本质上是示范性的一个或多个实施例或实施方式来说明本公开的各个方面，包含装置、系统和方法。如本文中所使用，术语“示范性”意味着“充当示例、例子或说明”，且未必应解释为相比本文中所公开的其它实施例为优选的或有利的。此外，对本公开或本发明的“实施”的引用包含对其一个或多个实施例的具体引用，且反之亦然，且所述引用意图提供说明性示例而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书而不是以下描述指示。
如说明书中所使用，以单数出现的词语涵盖其复数对应物，且以复数出现的词语涵盖其单数对应物，除非另外隐含地或明确地理解或陈述。因此，应注意，除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。举例来说，对单数指代物(例如，“小部件”)的引用包含一个、两个或更多个指代物，除非另外隐含地或明确地理解或陈述。类似地，除非内容和/或上下文清楚地规定，否则对多个指代物的引用应解释为包括单个指代物和/或多个指代物。举例来说，对复数形式的指代物(例如，“小部件”)的引用不一定需要多个这种指代物。相反，应了解，除非另有说明，否则独立于所推断的指代物的数目，在本文中设想了一个或多个指代物。
如本文中所使用，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“近端”、“远端”、“相邻”等的方向术语在本文中仅用于指示相对方向，且不意图以其它方式限制本公开和/或所要求保护的发明的范围。
结论
本文中已采用的术语和表达用作描述性术语而非限制，且在使用这种术语和表达时不意图排除所展示和描述的特征或其部分的任何等效物，而是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应理解，虽然本发明已通过优选实施例、示范性实施例和任选特征进行特别地公开，但本领域的技术人员可对本文中所公开的概念进行修改和改变，且这种修改和改变视为在由所附权利要求书限定的本发明范围内。本文中所提供的具体实施例是本发明的有用实施例的示例，且可在不脱离由权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下对所说明实施例作出本文中所说明的发明特征的各种更改和/或修改和相关领域的技术人员将想到的且拥有本公开的本文中所说明的原理的额外应用，且这些视为在本公开的范围内。
还应了解，根据本公开的某些实施例的系统、装置、产品、套件、方法和/或过程可以包含、并入或以其它方式包括本文中所公开和/或描述的其它实施例中所描述的性质或特征(例如，组件、构件、元件、零件和/或部分)。因此，某些实施例的各种特征可与本公开的其它实施例兼容、组合、包含在本公开的其它实施例中和/或并入本公开的其它实施例中。因此，相对于本公开的特定实施例的某些特征的公开不应解释为将所述特征的应用或包含限制于特定实施例。相反，应了解，在不一定脱离本公开的范围的情况下，其它实施例还可以包含所述特征、构件、元件、零件和/或部分。
此外，除非特征描述为需要与其组合的另一特征，否则本文中的任何特征可与本文中所公开的相同或不同实施例的任何其它特征组合。此外，为了避免混淆示例实施例的各方面，本文中未特别详细地描述说明性系统、方法、设备和其类似物的各种众所周知的方面。然而，这种方面在本文中也是设想的。
本申请中列举的所有参考文献在不与本申请中的公开不一致的程度上特此通过引用以其全文并入。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，除了本文中具体描述的那些之外的方法、装置、装置元件、材料、程序和技术可应用于如本文中广泛公开的本发明的实践，而无需借助过度实验。本文中具体描述的方法、装置、装置元件、材料、程序和技术的所有本领域已知的功能等效物意图由本发明涵盖。
当本文中公开材料、组合物、组分或化合物的群组时，应理解，那些群组的所有单独成员和其所有子群组是分开公开的。当在本文中使用马库什(Markush)群组或其它分组时，所述群组的所有单独成员和所述群组的所有可能组合和子组合意图单独地包含于本公开中。除非另有说明，否则本文中所描述或示范的每种制剂或组分的组合可用于实践本发明。每当在说明书中给出例如温度范围、时间范围或组成范围的范围时，所有中间范围和子范围以及包含在给出的范围中的所有单独值意图包含在本公开中。
落入权利要求书的同等含义和范围内的所有改变均应涵盖在权利要求书的范围内。

Claims (28)

1.一种用于对样品进行成像和消融的装置，其允许分析所述样品的消融部分，所述装置包括：
样品台，所述样品台具有被配置为用于在其上放置样品的第一侧和与所述第一侧相对设置的第二侧；
光学组件，所述光学组件包括物镜，所述物镜设置在所述样品台的所述第二侧并且被配置为能够对放置在所述样品台上的所述样品进行显微成像，所述光学组件还包括消融激光器，
其中所述消融激光器设置在所述样品台的所述第二侧，所述消融激光器被配置为引导激光穿过所述物镜、穿过所述样品台并进入所述样品以选择性地消融所述样品的至少一部分；和
接收器，所述接收器设置在所述样品台的所述第一侧，所述接收器被配置为接收从所述样品喷射的消融材料，以实现对所述消融材料的进一步分析；
其中所述光学组件还包括激光聚焦检测单元，所述激光聚焦检测单元包括：
至少一个参考激光器，所述至少一个参考激光器设置在所述样品台的所述第二侧并且被配置为引导激光穿过所述物镜、穿过所述样品台并进入所述样品，
所述激光聚焦检测单元还包括至少一个光电检测器，所述至少一个光电检测器被配置为通过检测来自所述至少一个参考激光器的激光来产生至少一个检测信号，所述至少一个检测信号指示在所述样品的至少一部分被消融时所述样品的一种或多种特性，和/或指示从所述物镜到所述样品台的距离，和/或指示从所述物镜到所述样品的表面的距离；
其中所述激光聚焦检测单元还被配置为将所述至少一个检测信号发送到控制器，所述控制器被配置为基于所述至少一个检测信号动态地控制所述消融激光器的一个或多个参数和/或所述物镜的位置和/或所述接收器的位置。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述激光聚焦检测单元被配置为以1-10纳秒或更小的时间分辨率检测来自所述至少一个参考激光器的激光，并将所述至少一个检测信号发送到所述控制器。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述样品的所述一种或多种特性包括以下至少一种：由来自所述消融激光器的所述激光引起的所述样品中的空腔的形成、由从所述样品喷射的消融材料导致的消融羽流的形成，以及所述样品的厚度的变化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其中所述控制器被配置为控制所述消融激光器的一个或多个参数，所述一个或多个参数包括激光脉冲能量和/或激光脉冲频率。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述控制器被配置为基于所述至少一个检测信号连续地调整所述物镜的位置和/或所述接收器的位置。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置，其中所述至少一个光电检测器包括快速光电检测器，所述快速光电检测器被配置为检测来自所述至少一个参考激光器的激光，所述激光已经从所述样品台和/或样品的至少一个表面反射和/或透射穿过所述至少一个表面。
7.根据权利要求6所述的装置，其中至少一个快速光电检测器包括被配置为检测来自所述至少一个参考激光器的激光的光电检测器，所述激光已经从所述样品台的表面反射并被引导回穿过所述物镜。
8.根据权利要求6或7所述的装置，其中所述至少一个光电检测器包括被配置为检测来自所述至少一个参考激光器的激光的光电检测器，所述激光已经从所述样品的面向所述接收器的表面反射并被引导回穿过所述物镜。
9.根据权利要求7或8所述的装置，其中所述光电检测器包括用于峰值检测的阵列检测器。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的装置，其中所述至少一个光电检测器包括设置在所述样品的所述第一侧并且被配置为检测来自所述至少一个参考激光器的激光的光电检测器，所述激光已经透射穿过所述样品。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的装置，其中至少一个光电检测器被配置为以亚纳秒时间分辨率解析所述至少一个检测信号。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的装置，其中所述至少一个参考激光器包括至少第一参考激光器，所述第一参考激光器被配置为将第一激光沿偏离所述物镜的光轴的轴引导到所述物镜，并且所述至少一个光电检测器被配置为检测沿偏离所述物镜的光轴的轴反射回穿过所述物镜的第一激光。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的装置，其中所述至少一个参考激光器包括至少第二参考激光器，所述第二参考激光器被配置为将第二激光沿所述物镜的光轴引导到所述物镜，并且所述至少一个光电检测器被配置为检测沿所述物镜的光轴反射回穿过所述物镜的第二激光。
14.根据权利要求13所述的装置，其中被配置为检测沿所述物镜的光轴反射回的第二激光的所述至少一个光电检测器形成干涉仪的一部分。
15.根据权利要求14所述的装置，其中沿所述物镜的光轴反射回的所述第二激光同时提供来自由来自所述消融激光器的所述激光在所述样品中形成的空腔的干涉信号。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的装置，其还包括设置在所述样品的所述第一侧的光源，所述光源被配置为用于对所述样品进行透照。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的装置，其还包括被配置为用于对所述样品进行落射荧光成像和/或分析的荧光激发源，所述荧光激发源优选地设置在所述样品的所述第二侧。
18.根据权利要求17所述的装置，其还包括光谱仪，所述光谱仪被配置为光谱解析和/或时间解析来自所述样品的荧光或拉曼发射，优选地，所述光谱仪设置在所述样品的所述第二侧。
19.根据权利要求1至19中任一项所述的装置，其中所述消融激光器是飞秒激光器，优选地是近红外激光器。
20.根据权利要求1至20中任一项所述的装置，其中所述至少一个参考激光器是二极管激光器，优选地为光子集成电路的形式。
21.根据权利要求1至21中任一项所述的装置，其中所述光学组件被配置为能够消融直径为约50μm或更小、或约30μm或更小、或约10μm或更小、或约5μm或更小、或约3μm或更小、或约1.5μm或更小、或约1μm或更小的目标区域。
22.一种用于消融和分析样品的目标区域的系统，所述系统包括：
根据权利要求1至21中任一项所述的成像和消融装置；和
分析器，所述分析器被配置为接收和分析由所述接收器接收的所述消融材料的至少一部分。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述分析器包括PCR机器、测序机器、光谱仪和质谱仪中的一个或多个。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述质谱仪被配置为飞行时间(TOF)质谱仪、Orbitrap质谱仪、线性离子阱质谱仪、四极质谱仪、四极离子阱质谱仪、扇形磁质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的系统，其还包括与所述分析器相关联的液相色谱柱，所述液相色谱柱被配置为在所述消融材料递送至所述分析器之前接收所述消融材料。
26.一种对样品进行成像和消融以能够分析所述样品的消融部分的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至21中任一项所述的成像和消融装置和/或根据权利要求22至25中任一项所述的系统；
获取所述样品的图像；
在所述样品内选择感兴趣区域；
将来自所述消融激光器的激光递送到所述感兴趣区域以消融所述感兴趣区域的至少一部分；和
在所述接收器上捕获所述消融材料的至少一部分；
任选地将所述消融材料的至少一部分从所述接收器传送到所述分析器；和
基于来自所述激光聚焦检测单元的至少一个检测信号动态地调整所述消融激光器的一个或多个参数和/或所述物镜的位置和/或所述接收器的位置。
27.根据权利要求26所述的方法，其中多个激光脉冲从所述消融激光器施加到所述样品，并且其中激光脉冲频率、激光脉冲能量水平或激光脉冲深度中的一项或多项跨越所述多个激光脉冲动态地变化。
28.根据权利要求26或27中任一项所述的方法，其中利用空间分辨率值来获取所述样品的所述图像，并且其中所述激光聚焦在从所述样品的上表面测量的不超过所述空间分辨率值的R倍的深度，其中R是约5至约30的值。
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