DE102022112823A1 - Systeme und verfahren zur abbildung und ablation einer probe - Google Patents

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Michael Ward
Rainer DAUM
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Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
FEI Deutschland GmbH
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Abstract

Hierin offenbart sind Systeme zur Abbildung und Ablation einer Probe. Eine Abbildungs-/Ablationsvorrichtung enthält eine optische Anordnung, einen Probentisch und einen Empfänger. Die optische Anordnung ermöglicht die Ablation einer Region von Interesse innerhalb der Probe. Das sich während der Ablation von der optischen Anordnung ausbreitende Laserlicht breitet sich im Wesentlichen in der gleichen Richtung aus wie die Richtung der Wanderung der Ablationsfahne in Richtung des Empfängers. Eine Laserfokusdetektionseinheit mit mindestens einem Referenzlaser und Photodetektor generiert mindestens ein Echtzeitdetektionssignal, das eine oder mehrere Eigenschaften der Probe während der Ablation und/oder einen Abstand vom Objektiv zum Probentisch oder einer Oberfläche der Probe angibt. Eine mit der Laserfokusdetektionseinheit gekoppelte Steuerung steuert dynamisch in Echtzeit einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers und/oder eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers relativ zu der Probe, um die Qualität der MS-Bildgebung zu verbessern.

Description

  • HINTERGRUND
  • Technisches Gebiet
  • Diese Offenbarung bezieht sich im Allgemeinen auf Systeme, Vorrichtungen und Verfahren zur Abbildung und Ablation einer Probe. Insbesondere bezieht sich diese Offenbarung auf Systeme, Vorrichtungen und Verfahren zur Abbildung und Ablation einer biologischen Probe, die den Zugriff auf subzelluläre Details ermöglichen und in der Lage sind, ein ablatiertes Ziel ohne übermäßigen Abbau des Ziels auf einen Empfänger zu übertragen, um eine zusätzliche nachgelagerte Analyse zu ermöglichen.
  • Verwandte Technologie
  • Die „-omik"-Gebiete sind bestrebt, Sätze biologischer Moleküle zu charakterisieren, zu quantifizieren oder anderweitig zu analysieren, die sich auf die Struktur, Funktion oder Dynamik eines Zielorganismus oder einer Gruppe von Organismen beziehen. Jedes „-omik"-Gebiet bezieht sich auf die Untersuchung eines zugehörigen „-oms". Die „-omik"-Gebiete enthalten die folgenden Gebiete: Genomik, d. h. die Untersuchung des Genoms; Epigenomik, d. h. die Untersuchung der Stützstruktur des Genoms, einschließlich DNA-Bindungen und chemische Modifikationen der DNA; Transkriptomik, d. h. die Untersuchung der von dem/den Zielorganismus(en) generierten RNA-Moleküle, einschließlich mRNA, miRNA, rRNA und tRNA; Proteomik, d. h. die Untersuchung des Komplements von Proteinen, die von dem Zielorganismus/den Zielorganismen generiert werden; und Metabolomik, d. h. die Untersuchung der Sammlung von Metaboliten, die durch zelluläre Prozesse des Zielorganismus/der Zielorganismen generiert werden. „Multiomik“ (manchmal auch als integrative -omik bezeichnet) beinhaltet die Analyse eines oder mehrerer derartiger -ome. Das Ziel der Multiomik-Analyse besteht darin, komplexe biologische Daten zu sammeln und/oder zu analysieren, um zum Beispiel Assoziationen zwischen den verschiedenen -omen auf eine Weise zu entdecken, die Krankheitsmarker besser lokalisieren kann und ein besseres Verständnis der Aufteilung zwischen Genotyp, Phänotyp, und Umweltauswirkungen für einen bestimmten Zustand ermöglicht und einen besseren Einblick in die Art und Weise bietet, wie die verschiedenen -ome sich gegenseitig regulieren und beeinflussen. Es bleiben jedoch mehrere Herausforderungen, um das Gebiet der Multiomik weiter voranzubringen. Insbesondere auf dem Weg vom Genotyp zum Phänotyp vom Genom zum Transkriptom und dann zum Proteom und Metabolom nimmt der Grad der chemischen Vielfalt und Komplexität exponentiell zu. Mit dieser Zunahme an Komplexität erhöht sich die Schwierigkeit, die relevanten Biomoleküle zu erhalten und zu analysieren.
  • Darüber hinaus befinden sich die relevanten Regionen von Interesse, in denen sich Zielbiomoleküle befinden, häufig auf der subzellulären Ebene. Es ist daher eine Herausforderung, die Zielbiomoleküle auf eine Weise zu erhalten, die eine effektive nachgelagerte Analyse der Biomoleküle ermöglicht. Herkömmliche Verfahren wie etwa Laser-Ablations-Elektrospray-Ionisation (LAESI), einschließlich Pikosekunden-Infrarot-LAESI (PIR-LAESI), ermöglichen jedoch keine Sammlung von Biomolekülen auf subzellulärer Ebene. Bei LAESI wird laserabladiertes Material durch nanometergroße Tröpfchen aus einer Elektrospray-Ionenquelle ionisiert, die dann an ein Massenspektrometer zur Analyse übertragen werden. Herkömmliche LAESI-Systeme haben jedoch inhärente räumliche Beschränkungen, die zu Optiken mit niedriger nummerischer Apertur (NA) führen. Die für die Ablation der Probe verwendete Optik mit niedriger NA führt zu großen Ablationspunktgrößen. Zum Beispiel sind minimale Punktgrößen typischerweise viel größer als ganze lebende Zellen und einfach nicht klein genug, um die gezielte Ablation von subzellulären Regionen von Interesse zu ermöglichen.
  • Der direkte Zugang zu intrazellulärem und/oder interzellulärem biologischem Material lebender Zellen ist auch der Schlüssel zur effektiven Analyse der biochemischen Aspekte derartiger Zellen unter Echtzeitbedingungen. Herkömmliche Verfahren zum Erhalten von zellulärem Zielmaterial für weitere nachgelagerte Analysen beruhen jedoch typischerweise auf dem Fixieren und häufig dem Trocknen einer Probe. Zum Beispiel verwendet die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisations-Flugzeit (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight, MALDI TOF) eine Matrix zur Ionisation von molekularen Komponenten. Aufgrund der Notwendigkeit, die Probe zu fixieren, ist MALDI TOF unvereinbar mit der Überwachung lebender Zellen.
  • Es besteht daher ein anhaltender Bedarf an Systemen, Vorrichtungen und Verfahren, die in der Lage sind, Zellmaterial aus lebenden Zellen auf der subzellulären Ebene in einer Weise zu gewinnen, die eine effektive nachgelagerte Analyse des erhaltenen Materials ermöglicht. Verschiedene Ansätze zur Laserablation finden sich in WO2021/104855A1 , US2021/0118661A1 , US2015/0018807A1 , US8199321B2 , WO2014/079802A2 , W. Muller et al, Initial performance metrics of a new custom-designed ArF excimer LA-ICPMS system coupled to a two-volume laserablation cell. J. Anal. At. Spectrom., 2009, 24. 209-214, K. Fowble et al, Development of „Laser Ablation Direct Analysis in Real Time Imaging“ Mass Spectrometry: Application to Spatial Distribution Mapping of Metabolites Along the Biosynthetic Cascade Leading to Synthesis of Atropine and Scopolamine in Plant Tissue, Anal. Chem. 2017, 89, 6, 3421-3429, and Y. Cui et al, Depth profiling and imaging capabilities of an ultrashort pulse laser ablation time of flight mass spectrometer, Rev. Sci. Instrum. 83, 093702 (2012),aber diese Ansätze weisen einen oder mehrere Nachteile auf.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Hierin beschriebene Ausführungsformen ermöglichen das Sammeln von biologischem Zielmaterial aus einer Probe auf eine Weise, die das biologische Material nicht übermäßig schädigt und eine effektive nachgelagerte Analyse des erhaltenen Materials ermöglicht. In bestimmten Ausführungsformen kann die Probe lebende Zellen enthalten und das biologische Zielmaterial kann unter normalen Umgebungsbedingungen (z. B. ohne Druckregelung, Feuchtigkeitsregelung usw.) erhalten werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine Zielregion von Interesse der Probe eine subzelluläre Größe aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen kann das biologische Zielmaterial aus einer Zelle mit minimaler Auswirkung auf die verbleibende Zellstruktur in einer Weise entfernt werden, die es der Zelle sogar ermöglicht, zu überleben, um optional für weitere Tests verwendet zu werden. In bestimmten Ausführungsformen werden Eigenschaften der Probenablation während der Ablation in Echtzeit überwacht und enthalten räumliche und zeitliche Informationen. Dies ermöglicht, dass Parameter der Ablationsvorrichtung entsprechend in Echtzeit dynamisch abgestimmt werden, um eine Optimierung der Ablation und/oder das Aufrechterhalten konstanter Bedingungen für die Analyse der Probe zu ermöglichen, wie etwa Massenspektrometriebildgebung, was die MS-Bildgebungsqualität verbessern kann.
  • In einer Ausführungsform wird eine Vorrichtung zur Abbildung und Ablation einer Probe bereitgestellt, die eine Analyse eines ablatierten Abschnitts der Probe ermöglicht, wobei die Vorrichtung einen Probentisch mit einer ersten Seite (z. B. einer Oberseite), die zum Platzieren einer Probe darauf konfiguriert ist, und einer zweiten Seite (z. B. eine Unterseite) umfasst, die gegenüber der ersten Seite angeordnet ist. Die Vorrichtung enthält eine optische Anordnung mit einem Objektiv, wobei das Objektiv auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet und dazu konfiguriert ist, eine mikroskopische Bildgebung der auf dem Probentisch platzierten Probe zu ermöglichen, wobei die optische Anordnung auch einen Ablationslaser enthält. Der Ablationslaser ist auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet, wobei der Ablationslaser dazu konfiguriert ist, Laserlicht durch das Objektiv, durch den Probentisch und in die Probe zu richten, um selektiv mindestens einen Abschnitt der Probe (z. B. eine Zielregion von Interesse der Probe) zu ablatieren. Der Probentisch weist typischerweise ein transparentes Fenster auf, um den Durchgang von Laser- und anderem Licht zu ermöglichen. Die Probe kann auf der Oberseite des transparenten Fensters platziert werden. Das transparente Fenster kann zum Beispiel aus Glas oder Kunststoff bestehen. Das transparente Fenster kann zum Beispiel ein Objektträger oder ein Deckglas sein. Das transparente Fenster definiert im Allgemeinen ein Sichtfeld (field of view, FOV) für die optische Anordnung, z. B. Objektiv. Ein Empfänger ist auf der ersten Seite des Probentisches angeordnet, wobei der Empfänger dazu konfiguriert ist, von der Probe ausgestoßenes ablatiertes Material aufzunehmen, um eine weitere Analyse des ablatierten Materials zu ermöglichen.
  • In einer Ausführungsform enthält die optische Anordnung auch eine Laserfokusdetektionseinheit (focus detection unit, FDU), die mindestens einen Referenzlaser enthält, wobei der mindestens eine Referenzlaser auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet und dazu konfiguriert ist, Laserlicht durch das Objektiv, durch den Probentisch und in die Probe zu richten. Die FDU kann Grenzflächen zwischen Medien mit unterschiedlichen Brechungsindizes detektieren oder beobachten. Auf diese Weise kann die axiale (z-) Position einer oder mehrerer Grenzflächen, z. B. die Grenzfläche Atmosphäre/Probentisch, die Grenzfläche Probentisch/Probe oder die Grenzfläche Probe/Atmosphäre, bestimmt werden. Dadurch können die relativen Positionen (Abstand) z. B. der Objektivlinse zur Probe und die Probendicke jeweils in Echtzeit überwacht werden. Die Laserfokusdetektionseinheit enthält ferner mindestens einen Photodetektor, wobei der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, mindestens ein Detektionssignal durch Detektieren von Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu generieren, das dabei eine oder mehrere Eigenschaften der Probe angibt, während zumindest ein Abschnitt davon ablatiert wird und/oder einen Abstand von dem Objektiv zu dem Probentisch angibt und/oder einen Abstand von dem Objektiv zu einer Oberfläche der Probe angibt. Im Fall der Probe können eine oder mehrere der folgenden Beobachtungen gemacht werden: eine Hohlraumgröße in der Probe (und deren Verzögerung in Bezug auf den Ablationslaserpuls); eine Höhe oder Position der Grenzfläche Probe/Atmosphäre, z. B. relativ zum Probentisch oder Objektiv; und axiale Fahnenbildung von der Probe in die Atmosphäre.
  • Die Laserfokusdetektionseinheit ist ferner dazu konfiguriert, das mindestens eine Detektionssignal an eine Steuerung zu senden, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers und/oder eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal dynamisch zu steuern. Dadurch wird die Position des Objektivs und/oder die Position des Empfängers relativ zur Position der Probe abgestimmt.
  • In einer Ausführungsform ist die Laserfokusdetektionseinheit dazu konfiguriert, kontinuierlich oder mit hoher Frequenz Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser unter Verwendung des mindestens einen Photodetektors zu detektieren und das mindestens eine Detektionssignal an die Steuerung zu senden. Auf diese Weise kann das mindestens eine Detektionssignal eine Echtzeitüberwachung der Probe während der Ablation und/oder der Position des Objektivs und/oder Empfängers relativ zur Probe ermöglichen. Der mindestens eine Photodetektor weist vorzugsweise eine Zeitauflösung von 100 Mikrosekunden oder weniger als 100 Mikrosekunden auf. In einer Ausführungsform kann der mindestens eine Referenzlaser ein- und ausgeschaltet werden, um einen Konflikt mit den anderen Licht- oder Anregungsquellen und der Detektion von Bildern von der Probe zu vermeiden. Mindestens ein Photodetektor hat vorzugsweise eine Zeitauflösung von Nanosekunden oder eine Zeitauflösung von weniger als einer Nanosekunde (Licht von dem mindestens einen Referenzlaser wird mit einer Zeitauflösung detektiert), z. B. von 1-10 Nanosekunden oder weniger, wie etwa 1 Nanosekunde oder weniger als 1 Nanosekunde. Der Photodetektor mit einer Zeitauflösung von unter einer Nanosekunde kann dazu verwendet werden, die Dynamik der Ausdehnung der Ablationsfahne kontinuierlich zu untersuchen. Für diese Funktion kann der Photodetektor mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Nanosekunde die ganze Zeit eingeschaltet, d. h. aktiv sein. Jedoch kann der mindestens eine Referenzlaser, der von dem Photodetektor mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Nanosekunde detektiert wird, ein- und ausgeschaltet werden.
  • In einer Ausführungsform enthalten die eine oder mehreren Eigenschaften der Probe eines oder mehrere der Folgenden: Bildung eines Hohlraums in der Probe, verursacht durch das Laserlicht von dem Ablationslaser, Bildung einer Ablationsfahne, die aus von der Probe ausgestoßenem ablatiertem Material entsteht, und eine Änderung in der Dicke der Probe. In vielen Fällen verschwindet eine Dickenänderung der Probe nach einem Zeitbereich von Millisekunden aufgrund der Oberflächenspannung von Wasser, das auf oder in der Probe vorhanden ist. In einigen Fällen sehr dünner Proben (einzelne Zellschichten) kann nach der Ablation eine „Senke“ in der Oberfläche zurückbleiben.
  • In einer Ausführungsform ist die Steuerung dazu konfiguriert, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal zu steuern, das eine Laserpulsenergie und/oder eine Laserpulsfrequenz enthält. In einer Ausführungsform kann das mindestens eine Detektionssignal dazu verwendet werden, zu überwachen, ob eine Ablationsfahne an der Probenoberfläche (d. h. Probenluftoberfläche) gebildet wird. Wenn die Ablationsfahne nicht an der Probenoberfläche gebildet wird, kann die Laserpulsenergie und/oder eine Laserpulsfrequenz durch die Steuerung abgestimmt werden. Vorzugsweise kann die Laserpulsenergie erhöht werden und/oder die Laserpulsfrequenz kann erhöht werden, bis die Ablationsfahne an der Oberfläche gebildet wird.
  • In einer Ausführungsform ist die Steuerung dazu ausgebildet, eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal kontinuierlich, d. h. in Echtzeit mit einer hohen digitalen Frequenz, abzustimmen. Ein oder mehrere Aktuatoren können das Objektiv antreiben. Auf ähnliche Weise können ein oder mehrere Aktuatoren den Empfängertisch antreiben. Der/die Aktuator(en) kann/können von der Steuerung in Echtzeit gesteuert werden. Der/die Aktuator(en) können eine Ansprechzeit im Sub-Millisekunden-Bereich aufweisen, z. B. 1 Millisekunde oder weniger als 1 Millisekunde Ansprechzeit, wodurch eine Echtzeitsteuerung der Positionen ermöglicht wird. Die Position des Objektivs und/oder die Position des Empfängers, die abgestimmt wird, kann eine axiale Position (hierin als z-Position bezeichnet) sein, die den Abstand zwischen dem Objektiv und dem Probentisch oder zwischen dem Empfängertisch und dem Probentisch verändert. Auf diese Weise kann zum Beispiel die Tiefenschärfe des Laserlichts des Ablationslasers in der Probe durch Abstimmen der Position des Objektivs stufenlos abgestimmt werden. Dies ist vorteilhaft, da sich die Dicke der Probe mit der Zeit verändert. Weiterhin kann der Abstand des Empfängers von der Probenoberfläche konstant und/oder in einem optimalen Bereich gehalten werden.
  • In einer Ausführungsform enthält der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das von mindestens einer Oberfläche oder Grenzfläche des Probentisches und/oder der Probe reflektiert und/oder durch diese übertragen wurde. In einer Ausführungsform enthält der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das von einer Oberfläche oder Grenzfläche des Probentisches reflektiert und durch das Objektiv zurück gerichtet wurde. In einer Ausführungsform enthält der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das von einer Oberfläche oder Grenzfläche der dem Empfänger zugewandten Probe reflektiert und durch das Objektiv zurück gerichtet wurde. In derartigen Ausführungsformen kann der Photodetektor einen Arraydetektor enthalten. Der Arraydetektor kann eine Peakdetektion des mindestens einen Referenzlasers ermöglichen. Die Peaks sind Beobachtungsgrößen der FDU und stammen von den (axialen) Grenzflächen der Probe mit unterschiedlichen Brechungsindizes. Der Arraydetektor kann mehrere einzelne Photodetektoren oder Pixel enthalten. Der Arraydetektor kann mit einem FPGA und einer Steuerung kombiniert werden, um eine schnelle Signalanalyse (z. B. Peakdetektion im Mikrosekunden-Zeitbereich) zu erreichen.
  • In einer Ausführungsform enthält der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor, der auf der ersten Seite der Probe angeordnet ist und dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das durch die Probe übertragen wurde. Vorzugsweise wird dieses Photodetektorsignal gleichzeitig mit der Ablation der Probe überwacht.
  • In einer Ausführungsform ist der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert, das mindestens eine Detektionssignal mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Nanosekunde aufzulösen. Dies ermöglicht eine zeitliche Überwachung der Position eines in der Probe gebildeten Hohlraums durch Laserlicht, das durch das Objektiv in die Probe fokussiert wird. Derartige Hohlräume wandern typischerweise mit Schallgeschwindigkeit im Probenmedium.
  • In einer Ausführungsform ist der mindestens eine Referenzlaser ein Diodenlaser, vorzugsweise in Form einer photonischen integrierten Schaltung. In einer Ausführungsform umfasst der mindestens eine Referenzlaser mehrere Referenzlaser, d. h. mindestens einen ersten Referenzlaser und einen zweiten Referenzlaser. Die mehreren Referenzlaser können als Laserausgangsaperturen einer photonischen integrierten Schaltung (photonic integrated circuit, PIC) bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform umfasst der mindestens eine Referenzlaser mindestens einen ersten Referenzlaser, der dazu konfiguriert ist, erstes Laserlicht entlang einer von der optischen Achse des Objektivs versetzten Achse auf das Objektiv zu richten, und ist der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert, erstes Laserlicht zu detektieren, das durch das Objektiv entlang einer Achse, die von der optischen Achse des Objektivs versetzt ist, zurück reflektiert wird. Das detektierte erste Laserlicht kann Informationen über einen Abstand des Objektivs zum Probentisch und/oder einen Abstand des Objektivs zur Grenzfläche Probe/Luft bereitstellen. Zum Bestimmen dieser Abstände kann ein Verfahren der Triangulation verwendet werden. Dieser Ansatz erlaubt es ferner, die Grenzfläche Probenmedium/Luft mit hoher Zeitauflösung zu überwachen. Zum Beispiel wird es mit einer schnellen Photodiode möglich, den Zeitpunkt der Ablation, die Ausbreitung des Hohlraums zur Probenoberfläche und die Emission der Fahne des Hohlraums in die Atmosphäre zu überwachen.
  • In einer Ausführungsform umfasst der mindestens eine Referenzlaser mindestens einen zweiten Referenzlaser, der dazu konfiguriert ist, zweites Laserlicht entlang der optischen Achse des Objektivs auf das Obj ektiv zu richten, und ist der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert, durch das Objektiv entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiertes zweites Laserlicht zu detektieren. Der mindestens eine Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiertes zweites Laserlicht zu detektieren, kann Teil eines Interferometers sein, das selbst Teil eines optischen Kohärenztomographie-(Optical Coherence Tomography, OCT)-Aufbaus sein kann. Eine geeignete OCT-Technik wird von Wang et al., Optics Letters, Bd. 42, Nr. 17, 2017, Seiten 3466-3469, beschrieben. Das entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektierte zweite Laserlicht kann dabei ein Interferenzsignal von einem Hohlraum bereitstellen, der durch das Laserlicht von dem Ablationslaser, z. B. gleichzeitig, in der Probe gebildet wird. Der Interferometer- oder OCT-Aufbau ermöglicht vorzugsweise die Generierung eines Interferenzsignals durch erstes Laserlicht, das von dem laserinduzierten Hohlraum in der Probe und/oder von der Grenzfläche Ablationsfahne/Probe reflektiert wird. Das Interferenzsignal kann genaue, zeitaufgelöste Positionsinformationen über den Hohlraum im Medium und/oder die Fahnenbildung in der Atmosphäre bereitstellen. Die Informationen über die Hohlraum- und/oder Fahnenbildung können in Echtzeit und mit einer Auflösung von weniger als einer Nanosekunde (1 ns oder weniger) bereitgestellt werden. Mit dem Interferometer kann das Beobachtungsvolumen vom Probenmedium nur in das Fahnenvolumen des ablatierten Materials erweitert werden, wodurch die Probe in die Atmosphäre gelangt. Als Teil eines OCT-Aufbaus kann das Interferenzsignal eine tomographische Messung der Hohlraum- und/oder Fahnenbildung bereitstellen.
  • In einer Ausführungsform kann die Vorrichtung ferner eine auf der ersten Seite der Probe angeordnete Lichtquelle umfassen, wobei die Lichtquelle zur Durchleuchtung der Probe konfiguriert ist. Zu diesem Zweck kann ein Blitzlicht oder eine -lampe verwendet werden. Das Blitzlicht oder die -lampe kann vorzugsweise Lichtpulse mit einer Breite von Nanosekunden (z. B. 1-10 ns) oder Sub-Nanosekunden (weniger als 1 ns) emittieren. Somit kann mit dem Blitzlicht/der Blitzlampe eine Momentaufnahmebildgebung erhalten werden, d. h. eine Momentaufnahme des Hohlraums mit einer Zeitverzögerung t nach dem Pulsen der Probe mit dem Ablationslaser. Ein Detektor, wie etwa eine Kamera, kann auf der zweiten Seite der Probe angeordnet sein, um das durchgestrahlte Licht zu detektieren und ein Bild der Probe zu bilden. Das Durchlicht kann zur Bestimmung der Hohlraumgröße in der Probe verwendet werden, z. B. in jeder axialen Position der Tiefenschärfe der verwendeten Objektivlinse.
  • In einer Ausführungsform kann die Vorrichtung ferner eine Fluoreszenzanregungsquelle umfassen, die für Epifluoreszenzbildgebung und/oder -analyse der Probe konfiguriert ist. Die Fluoreszenzanregungsquelle ist vorzugsweise auf der zweiten Seite der Probe angeordnet. Die Fluoreszenzanregung kann verzögert nach dem Ablationslaser angelegt werden. Die Fluoreszenzanregungsquelle kann umfassen: eine gepulste Lichtquelle, vorzugsweise mit einer Pulslänge von ~ns, bei entsprechender Fluoreszenzanregungswellenlänge, um eine Menge von interessierenden fluoreszierenden (Marker-)Molekülen in der Probe zu sondieren.
  • Es kann ein Detektor, wie etwa eine Kamera oder ein Spektrometer mit einem (schnellen) Photodetektor, bereitgestellt werden, der dazu konfiguriert ist, Fluoreszenzemission von der Probe als Reaktion auf Autofluoreszenz nach Anwendung des Ablationslasers (bei ausgeschalteter Fluoreszenzanregungsquelle) oder Bestrahlung durch die Fluoreszenzanregungsquelle mit einer Zeitverzögerung t' nach Anwendung des Ablationslasers spektral aufzulösen und/oder zeitlich aufzulösen (d. h. in Echtzeit zu detektieren), und ein Fluoreszenzbild oder -signal bereitzustellen. Die Fluoreszenzemissionsdetektion kann mit Belichtungszeiten von weniger als einer Millisekunde erfolgen. Der Detektor für Fluoreszenzemission ist vorzugsweise auf der zweiten Seite der Probe angeordnet. Der Detektor, wie etwa eine Kamera, die zum Detektieren von Fluoreszenzemission verwendet wird, kann derselbe Detektor oder dieselbe Kamera sein, die zum Detektieren von Durchleuchtung verwendet wird. Mit diesem System kann die Hohlraumbildung in dem Probenmedium mit Durchleuchtung unter Verwendung des Blitzlichts zu einem Zeitpunkt t nach dem/den Ablationslaserpuls(en) abgebildet werden und nach der Fluoreszenzanregung kann zu einem späteren Zeitpunkt t' ein Fluoreszenzabbild erstellt werden. Somit können auch zeitverzögerte Momentaufnahmebildgebungsinformationen von den unterschiedlichen Lichtquellen der Durchleuchtung und Fluoreszenz erhalten werden. Bei einer Kamera mit ausreichend dynamischem Intensitätsbereich kann das Bild zwei Arten von Kontrast aufweisen. Typischerweise sind der Kontrastbereich des Durchlicht- und des Fluoreszenzbildes nicht gleich. Aus dem Durchlichtbild ist ein hoher Kontrast sichtbar und ein schwaches/schwächeres Signal kann als Fluoreszenz identifiziert werden.
  • Das detektierte Epifluoreszenzsignal oder -bild ist vorzugsweise zeitlich aufgelöst und kann dazu verwendet werden, Hohlraumeigenschaften und Informationen über molekulare Fragmentierung in der Probe, d. h. in der Fokusposition der Objektivlinse, bereitzustellen. Ein spektraler Bildteiler kann dazu verwendet werden, das Fluoreszenzlicht auf einen schnellen/schnelleren Photodetektor (z. B. ein Array) zu führen, der mit einem Spektrometer kombiniert ist, um das Durchlichtbild spektral vom Fluoreszenzbild zu trennen.
  • In einer Ausführungsform weist ein Rückgang der gemessenen Fluoreszenz auf eine Fragmentierung von Molekülen in der Probe hin, die durch die Ablation verursacht wird, typischerweise weil die Laserpulsenergie zu hoch ist. In diesem Fall muss/müssen der/die nächste(n) Laserpuls(e) mit niedrigerer Energie angelegt werden. Dementsprechend kann das Fluoreszenzsignal dazu verwendet werden, die Laserpulsenergie abzustimmen. Die quantitative Fluoreszenzintensitätsanalyse kann eine Abschätzung der Übertragungseffizienz von Material zum Empfänger und dadurch zum Analysator, wie etwa einem Massenspektrometer, ermöglichen. In einer Ausführungsform kann zusätzlich oder alternativ ein Raman-Signal aus dem Fokus des Ablationslasers detektiert werden. Ein Raman-Signal stellt zu einem Fluoreszenzsignal komplementäre Informationen bereit. Während das Raman-Signal im Allgemeinen eine geringere Empfindlichkeit aufweist als Fluoreszenz, bietet es den Vorteil, dass die Probe nicht mit einer Fluorophor-Markierung modifiziert werden muss. Raman-Signale von ablatiertem Material können zum Beispiel durch den gleichen Detektor oder das gleiche Spektrometer detektiert werden, der/das zum Detektieren von Fluoreszenz verwendet wird. Raman-Signale stellen Vibrations- und Rotationsbanden der ablatierten Moleküle bereit. Das Auftreten des Raman-Signals gibt Aufschluss über die erwarteten Massen der Moleküle, die zum Beispiel zum Analysator (z. B. Massenspektrometer) gesendet werden, während die Intensitätsverteilung der Vibrations-/Rotationsbanden den thermischen Zustand (innere Energie) der Moleküle angibt. Die Raman-Spektren können mit der Peak-Intensität des im Analysator (Massenspektrometer) detektierten Moleküls korreliert werden. Somit kann die Optimierung des Raman-Signals für eine stärker quantitative Kalibrierung des im Analysator (Massenspektrometer) detektierten Moleküls verwendet werden.
  • Verschiedene weitere Merkmale der Ablationsvorrichtung und des Systems werden nun beschrieben.
  • In einer Ausführungsform sind der Ablationslaser und das Objektiv so konfiguriert, dass das Laserlicht durch das Objektiv gerichtet und so orientiert wird, dass sich das Laserlicht im Wesentlichen in der beabsichtigten Bewegungsrichtung einer Ablationsfahne ausbreitet, die durch Ablation der Probe entsteht. Dies hat den Vorteil, dass sich die sich ausbreitende Ablationsfahne effektiv in Richtung des Empfängers bewegt, und zwar entlang einer Linie, die im Wesentlichen parallel zur Richtung des sich ausbreitenden Laserlichts verläuft und nicht gegen diese.
  • Die optische Anordnung kann so konfiguriert werden, dass sie Hellfeldaufnahmen, Schnitte (z. B. über konfokale Mikroskopie), Epifluoreszenzaufnahmen, Zwei-Photonen-Aufnahmen oder Kombinationen davon ermöglicht. Das Objektiv kann eine nummerische Apertur (NA) von etwa 0,5 oder mehr oder etwa 0,65 oder mehr oder etwa 0,75 oder mehr oder etwa 0,8 oder mehr aufweisen.
  • Der Ablationslaser ist vorzugsweise ein gepulster Laser. Der Ablationslaser ist vorzugsweise ein Femtosekundeninfrarotlaser. Der Laser und andere Komponenten der optischen Anordnung können dazu konfiguriert sein, Pulsenergien von etwa 1 nJ bis etwa 10 µJ pro µm3 einer Probe zu liefern. Eine zu atladierende Zielregion von Interesse kann einen „Punktgrößen“-Durchmesser von etwa 50 µm oder weniger oder etwa 30 µm oder weniger oder etwa 10 µm oder weniger oder etwa 5 µm oder weniger oder etwa 3 µm oder weniger oder etwa 1,5 µm oder weniger oder etwa 1 µm oder weniger aufweisen. In volumetrischer Hinsicht kann die zu ablatierende Zielregion von Interesse ein Volumen von etwa 500 µm3 oder weniger, etwa 250 µm3 oder weniger, etwa 100 µm3 oder weniger, etwa 50 µm3 oder weniger, etwa 25 µm3 oder weniger, etwa 10 µm3 oder weniger, etwa 5 µm3 oder weniger oder etwa 2 µm3 oder weniger aufweisen. Die optische Anordnung kann daher dazu verwendet werden, mehrere ganze Zellen, einzelne ganze Zellen oder subzelluläre Volumina, wie etwa Zielorganellen oder andere intrazelluläre Strukturen oder extrazelluläre Volumina außerhalb von Zellen zu ablatieren.
  • In einer Ausführungsform enthält der Empfänger ein Medium, das für eine nicht überlappende, räumliche Differenzierung einzelner Teilproben von ablatiertem Material konfiguriert ist, wie etwa eine Mikrotiterplatte oder einen Chip. In einer Ausführungsform enthält der Empfänger ein Nanotröpfchenarray. In einer Ausführungsform enthält der Empfänger eine Elektrospraysonde, die dazu konfiguriert ist, ablatierte Teilproben zu sammeln und sie in Form von ionisierten Tröpfchen zu einem Einlass eines Massenspektrometers zu übertragen. Die Elektrospraysonde kann einer Kapillare zugeordnet sein, die ein Lösungsmittel zum Benetzen einer äußeren Oberfläche der Elektrospraysonde bereitstellt.
  • In einer Ausführungsform enthält ein System zum Ablatieren und Analysieren einer Zielregion einer Probe eine Abbildungs- und Ablationsvorrichtung und einen Analysator, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Abschnitt des von dem Empfänger empfangenen ablatierten Materials zu empfangen und zu analysieren. Der Analysator kann zum Beispiel eine oder mehrere PCR-Maschinen, Sequenziermaschinen, optische Spektrometer, Kernspinresonanz-(nuclear magnetic resonance, NMR)-Spektrometer, Massenspektrometer, Chromatographievorrichtungen, Zentrifugen, Elektrophoresevorrichtungen, Radiomarkierungs- und Radiomarkierungsdetektionsvorrichtungen, andere analytische Biochemievorrichtungen oder Kombinationen davon enthalten. Das System kann ferner einen vorgelagerten Prozessor, wie etwa einen elektrischen Tröpfchensortierer, eine Sortierzentrifuge oder dergleichen, aufweisen, die zum Sortieren oder anderweitigen Verarbeiten einer Probe vor dem Positionieren der Probe auf dem Probentisch konfiguriert sind.
  • In einer Ausführungsform enthält ein Verfahren zur Abbildung und Ablation einer Probe, um eine Analyse eines ablatierten Abschnitts der Probe zu ermöglichen, die Schritte des Bereitstellens einer Abbildungs- und Ablationsvorrichtung, des Erfassens eines Bildes der Probe, des Auswählens einer Region von Interesse innerhalb der Probe, des Zuführens eines Laserlichts in die Region von Interesse, um mindestens einen Abschnitt der Region von Interesse zu ablatieren. Und des Einfangens mindestens eines Abschnitts des ablatierten Materials auf dem Empfänger. In einer Ausführungsform enthält das Verfahren das dynamische (z. B. in Echtzeit mit einer Zeitauflösung von Millisekunden oder besser) Abstimmen eines oder mehrerer Parameter eines Ablationslasers und/oder einer Position eines Objektivs und/oder einer Position eines Empfängers basierend auf mindestens einem Detektionssignal von einer Laserfokusdetektionseinheit.
  • In einer Ausführungsform wird die Ablation in Umgebungsatmosphäre durchgeführt. In einer Ausführungsform enthält die Probe lebende Zellen. In einer Ausführungsform wird die ablatierte Teilprobe von einer Zielzelle entfernt, ohne die Zielzelle zu töten.
  • In einer Ausführungsform werden mehrere Laserpulse auf die Probe angelegt. Es können mehrere Laserpulse angelegt werden, um eine Teilprobe zu ablatieren. Mehrere ablatierte Teilproben können aus mehreren Ablationsereignissen gebildet werden, und können am Empfänger in nicht überlappenden, räumlich unterschiedlichen Positionen gesammelt werden. Laserpulsfrequenz und/oder Laserpulsenergieniveau und/oder Laserpulstiefe können dynamisch über die mehreren Laserpulse variiert werden. Zum Beispiel wird in einem Betriebsmodus die Laserpulsintensität auf ein hohes Anfangsniveau eingestellt, um Material in der Probe zu entfernen, die über der Region von Interesse liegt, und wird dann zum Ablatieren von mindestens einem Abschnitt der Region von Interesse auf ein niedrigeres Niveau eingestellt.
  • Diese Kurzdarstellung wird bereitgestellt, um eine Auswahl von Konzepten in vereinfachter Form vorzustellen, die nachstehend in der detaillierten Beschreibung weiter beschrieben werden. Diese Kurzdarstellung soll weder Schlüsselmerkmale oder wesentliche Merkmale des beanspruchten Gegenstands identifizieren, noch soll sie als Hinweis auf den Umfang des beanspruchten Gegenstands verwendet werden.
  • Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Offenbarung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und werden teilweise aus der Beschreibung offensichtlich oder sind durch die Praxis der Offenbarung erlernbar. Die Merkmale und Vorteile der Offenbarung können mittels der Instrumente und Kombinationen realisiert und erhalten werden, die speziell in den beiliegenden Ansprüchen herausgestellt sind. Diese und andere Merkmale der vorliegenden Offenbarung werden aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen deutlicher oder sind durch die Praxis der Offenbarung, wie sie nachstehend dargelegt wird, erlernbar.
  • Figurenliste
  • Um die Art und Weise zu beschreiben, wie die vorstehend angeführten sowie weitere Vorteile und Merkmale der Offenbarung realisiert werden können, folgt nun eine eingehendere Beschreibung der vorstehend kurz dargelegten Offenbarung anhand konkreter Ausführungsformen, die in den beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht sind. Es versteht sich, dass diese Zeichnungen nur typische Ausführungsformen der Offenbarung darstellen und daher nicht als Einschränkung von deren Umfang anzusehen sind. Die Offenbarung wird mit zusätzlicher Spezifität und Einzelheiten durch die Verwendung der beigefügten Zeichnungen beschrieben und erläutert, in denen:
    • 1 ein herkömmliches Laser-unterstütztes Elektrospray-Ionisationssystem (LAESI-System) veranschaulicht;
    • 2 einen schematischen Überblick über ein System zur Abbildung und Ablation einer Probe veranschaulicht, das einen oder mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Abbildungs- und Ablationssystemen bereitstellt, wobei das System eine Abbildungs-/Ablationsvorrichtung mit einer optischen Anordnung, einem Probentisch und einem Empfänger enthält;
    • 3 einen beispielhaften vorgelagerten Prozessor in Form eines vorgelagerten elektrischen Tröpfchensortierers darstellt;
    • 4 ein Beispiel einer optischen Anordnung veranschaulicht, die in einer Abbildungs-/Ablationsvorrichtung wie hierin beschrieben, verwendet werden kann;
    • 5 ein Beispiel eines Empfängers veranschaulicht, der ein räumlich differenziertes Medium wie etwa eine Mikrotiterplatte enthält;
    • 6A ein Beispiel eines Empfängers veranschaulicht, der ein Nanotropfenarray enthält;
    • 6B einen beispielhaften Prozess zum Bilden eines Nanotropfenarrays veranschaulicht;
    • 7 eine Ausführungsform eines Empfängers veranschaulicht, der eine Elektrospraysonde enthält und dazu konfiguriert ist, ionisierte Tröpfchen zu generieren, die ablatierte Teilproben zur Überführung zu einem Einlass eines Massenspektrometers enthalten;
    • 8 ein Beispiel eines nachgelagerten Prozesses veranschaulicht, bei dem ein oder mehrere Reagenzien zu räumlich getrennten Kammern eines Empfängers gegeben werden können und/oder dass eine oder mehrere Teilproben zu einer Flüssigchromatographiesäule durchgeleitet werden können, die mit einer Elektrospraysonde gekoppelt ist, um die ionisierten Proben zu einem Massenspektrometer durchzuleiten;
    • 9 ein beispielhaftes Verfahren zum Korrelieren der Position einer ablatierten Teilprobe auf einem Empfänger mit einem Ablationsereignis und mit einer Zielregion von Interesse auf dem Probenträger veranschaulicht;
    • 10 einen beispielhaften Betriebsmodus einer Abbildungs-/Ablationsvorrichtung, in dem ein rechteckiger xy-Bereich einer Probe abgetastet und ablatiert wird, grafisch veranschaulicht; und
    • 11 ein Beispiel eines Betriebsmodus einer Abbildungs-/Ablationsvorrichtung grafisch veranschaulicht, der dazu verwendet werden kann, eine Schicht aus Gewebe, Medien oder anderem blockierendem Material zu entfernen, die über der Zielregion von Interesse liegt, indem die Position der angelegten Laserpulse und des Pulsenergieniveaus dynamisch abgestimmt wird.
    • 12 eine beispielhafte Abbildungs-/Ablationsvorrichtung veranschaulicht, die eine Laserfokusdetektionseinheit enthält.
    • 13 schematisch ein beispielhaftes optisches System veranschaulicht, das eine Abbildungs-/Ablationsvorrichtung und eine Laserfokusdetektionseinheit enthält.
    • 14 weitere Einzelheiten eines beispielhaften optischen Systems veranschaulicht, in das eine Laserfokusdetektionseinheit integriert ist, die ein Interferometer enthält.
    • 15 in A die Positionen von Referenzlaserstrahlen veranschaulicht, die an einem Arraydetektor einer Laserfokusdetektionseinheit empfangen werden, und in B veranschaulicht, wie einer der passierenden Strahlen von einem Strahlteiler reflektiert und von einem schnellen Photodetektor detektiert wird.
    • 16 ein weiteres beispielhaftes optisches System veranschaulicht, in das eine Laserfokusdetektionseinheit integriert ist.
    • 17 beispielhafte Daten für Pixelintensitäten auf einem Arraydetektor von Laserstrahlen veranschaulicht, die von der Unterseite des Probentisches (ΔZ1) und der Oberseite (ΔZ1') reflektiert werden.
    • 18 eine Kalibrierung von Detektionspixeln eines Arraydetektors für bekannte Objektivpositionen veranschaulicht.
    • 19 beispielhafte Daten für Pixelintensitäten auf einem Arraydetektor aufgrund von reflektierten Strahlen von dem Probentisch (ΔZ1) und von der Probenoberfläche (ΔZ2) für unterschiedliche Wasserstände bzw. Probenhöhen a, b, c, d veranschaulicht.
    • 20 die Daten von 19 zusammen mit zusätzlichen beispielhaften Daten für Pixelintensitäten auf dem Arraydetektor veranschaulicht, wenn die Probe auf dem Probentisch austrocknet.
    • 21 die zeitliche (t) Abhängigkeit eines Interferenzsignals (I) von einem Referenzlaser an dem Photodetektor der Laserfokusdetektionseinheit, abgeleitet von der Reflexion des Laserlichts von einer Hohlraumbildung und einer Grenzfläche Fahne/Probe, veranschaulicht.
    • 22 schematisch einen Betrieb einer Optik zur Ablationsüberwachung veranschaulicht.
    • 23 Effekte der Kalibrierung oder Steuerung von Ablationsparametern in Echtzeit (t) veranschaulicht: (i) die Pulsenergie E0 pro Puls, (ii) Ausdehnung des Hohlraums, (iii) die Position des Übergangs vom Probenmedium zur Atmosphäre, (iv) das Epifluoreszenzsignal.
    • 24 ein Flussdiagramm für einen Prozess zur Echtzeitoptimierung von Steuerparametern der Abbildungs-/Ablationsvorrichtung veranschaulicht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Einleitung
  • Bevor verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung im Detail beschrieben werden, versteht es sich, dass diese Offenbarung nicht auf die Parameter der speziellen beispielhaft veranschaulichten Systeme, Verfahren, Einrichtungen, Produkte, Prozesse und/oder Bausätze beschränkt ist, die natürlich variieren können. Obwohl somit bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung unter Bezugnahme auf spezifische Konfigurationen, Parameter, Komponenten, Elemente usw. im Detail beschrieben werden, sind die Beschreibungen veranschaulichend und sollen nicht als Einschränkung des Umfangs der beanspruchten Erfindung ausgelegt werden. Darüber hinaus dient die hierin verwendete Terminologie dem Zweck der Beschreibung der Ausführungsformen und soll nicht notwendigerweise den Umfang der beanspruchten Erfindung einschränken.
  • Weiterhin sollte verständlich sein, dass für jede gegebene hierin beschriebene Komponente oder Ausführungsform im Allgemeinen jede der für diese Komponenten aufgelisteten möglichen Kandidaten oder Alternativen einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden kann, sofern das nicht anderweitig implizit oder explizit verständlich gemacht oder angegeben wird. Außerdem sollte verständlich sein, dass jede Liste solcher Kandidaten oder Alternativen lediglich der Veranschaulichung dient und keine Einschränkung darstellt, sofern das nicht anderweitig implizit oder explizit verständlich gemacht oder angegeben wird.
  • Darüber hinaus sind, sofern nicht anders angegeben, die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Zahlen, die Mengen, Bestandteile, Abstände oder andere Maße ausdrücken, so zu verstehen, dass sie durch den Begriff „etwa“ modifiziert werden, so wie dieser Begriff hierin definiert ist. Dementsprechend handelt es sich, sofern nicht gegenteilig angegeben, bei den in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen angegebenen numerischen Parametern um Näherungen, die abhängig von den gewünschten Eigenschaften, die durch den hier präsentierten Gegenstand der Erfindung erzielt werden sollen, abweichen können. Zumindest sollte, und das ist nicht als Versuch zu verstehen, die Anwendung der Äquivalenzdoktrin auf den Umfang der Ansprüche einzuschränken, jeder numerische Parameter mindestens vor dem Hintergrund der Anzahl der angegebenen signifikanten Ziffern und unter Anwendung gewöhnlicher Rundungstechniken ausgelegt werden. Ungeachtet der Tatsache, dass es sich bei den nummerischen Bereichen und Parametern, welche den allgemeinen Umfang des hier präsentierten Gegenstands der Erfindung festlegen, um Näherungen handelt, werden die in den konkreten Beispielen genannten nummerischen Werte so genau wie möglich angegeben. Jeder Zahlenwert enthält jedoch von Natur aus gewisse Fehler, die sich zwangsläufig aus der Standardabweichung ergeben, die bei den jeweiligen Versuchsmessungen ermittelt wurde.
  • Hierin verwendete Überschriften und Unterüberschriften dienen nur organisatorischen Zwecken und sollen nicht dazu verwendet werden, den Umfang der Beschreibung oder der Ansprüche einzuschränken.
  • 1 veranschaulicht ein herkömmliches LAESI-System 60. Wie gezeigt, wird Laserlicht 40 auf eine Probe 10 gerichtet, die auf einem Probenträger 30 angeordnet ist. Das Laserlicht 40 ist dazu abgeglichen, eine Ablation eines Abschnitts der Probe 10 zu bewirken, was zu einer Ablationsfahne 20 führt, die sich nach oben in einer Richtung ausbreitet, die der Ausbreitungsrichtung des Laserlichts entgegengesetzt ist. Über dem Probenträger 30 ist auf einer Höhe zwischen dem Probenträger 30 und der Optik, durch die das Laserlicht 40 gerichtet wird, eine Elektrospraynadel 50 angeordnet. Die Elektrospraynadel 50 emittiert Elektrospraytröpfchen 52 über den Weg der Ablationsfahne 20. Einige dieser Tröpfchen 52 interagieren mit Tröpfchen der Ablationsfahne 20, um ionisierte Probentröpfchen 54 zu bilden. Ein Massenspektrometereinlass 56 ist typischerweise an der Elektrospraynadel 50 ausgerichtet und dazu positioniert, einige der ionisierten Probentröpfchen 54 zur Analyse aufzunehmen.
  • Während herkömmliche LAESI-Systeme wie etwa das System 60 das Sammeln und Analysieren von ablatierten Abschnitten einer Probe 10 ermöglichen, bestehen mehrere Einschränkungen. Insbesondere begrenzen inhärente räumliche Einschränkungen erheblich die Auflösung, mit der das Laserlicht 40 auf die Probe 10 angelegt werden kann, was bedeutet, dass Punktgrößen relativ groß, typischerweise viel größer als ganze Zellen, sind. Damit der Strom von Elektrospraytröpfchen 52 die Ablationsfahne 20 kreuzt, müssen die Elektrospraynadel 50 und der Massenspektrometereinlass 56 zwischen dem Probenträger 30 und der optischen Anordnung, durch die sich das Laserlicht 40 ausbreitet, positioniert werden. Dies begrenzt das Fokussierpotenzial des Systems und führt dazu, dass die Optik eine weniger gute NA als gewünscht aufweist. Zusätzlich zu den räumlichen Einschränkungen kann auch das Fokussieren der Optik durch den Strom von Elektrospraytröpfchen 52 erforderlich sein, um auf die Probe 10 zu fokussieren.
  • Ein weiterer Nachteil eines derartigen herkömmlichen LAESI-Systems 60 besteht darin, dass die Ausbreitungsrichtung des Laserlichts 40 (d. h. der k-Vektor des Laserlichts) entgegen der Richtung verläuft, in der die Ablationsfahne 20 wandern muss, um den Kreuzungspfad der Elektrospraytröpfchen 52 zu erreichen. Dies verringert die Effizienz des Transports des ablatierten Materials zum Massenspektrometereinlass 56. Darüber hinaus bedeutet die räumliche Positionierung der Komponenten, dass Trümmer von der Ablationsfahne 20 die Optik und andere darüber liegende Komponenten verschmutzen können, was die Leistung des Systems weiter verschlechtert und die Betriebskosten für Reinigung und/oder Austausch von Teilen erhöht.
  • Überblick über das Abbildungs- und Ablationssystem
  • 2 veranschaulicht einen schematischen Überblick über ein System 100 zur Abbildung und Ablation einer Probe. Das veranschaulichte System 100 kann eine oder mehrere der Einschränkungen des herkömmlichen LAESI-Systems 60, wie vorstehend beschrieben, verbessern. Das System 100 beinhaltet eine Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110. Die Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 beinhaltet eine optische Baugruppe 112, einen Probentisch 114 und einen Empfänger 116. Wie gezeigt, befindet sich die optische Baugruppe 112 in einer umgekehrten Position unterhalb des Probentischs 114, so dass sich das Licht durch die optische Baugruppe 112 nach oben und in den Probentisch 114 ausbreitet. Die erste Seite des Probentisches 114 ist eine obere Seite und die zweite Seite des Probentisches 114 ist eine untere Seite, derart, dass das Objektiv der optischen Anordnung 112 unter dem Probentisch in einer umgekehrten Position angeordnet ist.
  • Im Betrieb tritt Licht zur Abbildung und/oder Ablation durch die optische Anordnung 112, dann durch den Probentisch 114 und in eine Probe 10 ein, die auf dem Probentisch 114 positioniert ist (z. B. auf einem Probenträger, der seinerseits auf dem Probentisch 114 positioniert ist). Dieselbe optische Anordnung 112 kann sowohl für die Abbildung der Probe 10 als auch für die Ablation einer Zielregion von Interesse innerhalb der Probe 10 verwendet werden. Während der Ablation wird auf eine Region von Interesse innerhalb der Probe 10 abgezielt, und Laserlicht wird durch die optische Anordnung 112 und in die Region von Interesse gerichtet. Das gerichtete Laserlicht kann abgeglichen werden, um das Ablatieren der Region von Interesse und das Bilden einer Ablationsfahne 20 zu bewirken, die sich von dem Probentisch 114 weg in Richtung des Empfängers 116 erstreckt. Der Empfänger 116 ist über dem Probentisch 114 positioniert, derart, dass zumindest ein Abschnitt der sich ausdehnenden Ablationsfahne 20 am Empfänger 116 eingefangen werden kann. Der Probentisch 114, der Empfänger 116 oder beide können Positionierungssysteme enthalten, die es ihnen ermöglichen, selektiv in mindestens zwei axialen Richtungen, vorzugsweise in alle drei axialen Richtungen, bewegt zu werden.
  • Im Gegensatz zum herkömmlichen LAESI-System 60 stellt die veranschaulichte Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 die optische Anordnung 112 in einer umgekehrten Position bereit. Dies bietet vorteilhafterweise größere Freiheit beim Positionieren der optischen Anordnung 112 relativ zum Probentisch 114, was die Verwendung von Optiken mit höherer NA ermöglicht. Die Optiken mit höherer NA wiederum ermöglichen das Fokussieren auf kleinere Regionen von Interesse und kleinere Ablationspunktgrößen. Wie im Folgenden näher erläutert, können einige Ausführungsformen Punktgrößen der Ablation auf subzellulärer Stufe ermöglichen.
  • Die dargestellte Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 ist auch dazu konfiguriert, Laserlicht in die Richtung der Erstreckung der Ablationsfahne 20 zu richten. Bei der dargestellten Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 soll sich die Ablationsfahne 20 in der gleichen Richtung wie das sich ausbreitende Laserlicht erstrecken, anstatt wie bei dem herkömmlichen LAESI-System 60 in Gegenrichtung. Die veranschaulichte Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 ist daher in der Lage, eine effektive Übertragung von ablatiertem Probenmaterial zum Empfänger 116 bereitzustellen, ohne dass es erforderlich ist, dass die Ablationsfahne 20 gegen die Ausbreitungsrichtung des Laserlichts wandert.
  • Darüber hinaus entfernt die Konfiguration der veranschaulichten Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 die optische Anordnung 112 aus dem Pfad der sich erstreckenden Ablationsfahne 20. Dadurch wird die optische Beeinträchtigung und/oder die Beschädigung von Komponenten durch Ablation von Trümmern, die mit der optischen Anordnung 112 in Berührung kommen oder sich auf ihr ansammeln, begrenzt.
  • Der Empfänger 116 kann so konfiguriert sein, dass er die empfangenen einzelnen Teilproben von ablatiertem Material (d. h. das Material, das jeweils jedem Ablationsereignis entspricht) in räumlicher und/oder zeitlicher Hinsicht differenziert. In einigen Ausführungsformen enthält der Empfänger 116 ein Medium, das zur räumlichen Differenzierung der einzelnen Teilproben konfiguriert ist, wie etwa eine Mikrotiterplatte oder ein Nanotröpfchenarray. Derartige Medien ermöglichen eine anschließende Analyse der gesammelten und räumlich differenzierten Teilproben, wie etwa eine PCR von Nukleinsäure in den ablatierten Materialien oder eine Sequenzierung von Nukleinsäure in den ablatierten Materialien.
  • Der Empfänger 116 kann zusätzlich oder alternativ eine Elektrospraysonde enthalten. Die Elektrospraysonde kann dazu verwendet werden, ionisierte Probentröpfchen zur Überführung zu einem Massenspektrometereinlass zu generieren. Der Empfänger 116 kann auch als eine mit Lösungsmittel benetzte Oberfläche konfiguriert sein. Das Lösungsmittel kann eine derartige Durchflussrate aufweisen, dass empfangene ablatierte Teilproben räumlich differenziert werden, basierend darauf, wann sie ablatiert und empfangen wurden.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Elektrospraysonde und die benetzte Oberfläche kombiniert. Zum Beispiel kann die Elektrospraysonde, wie weiter unten ausführlicher erläutert wird, teilweise innerhalb einer Kapillare angeordnet sein, mit einem freiliegenden distalen Abschnitt, der sich aus der Kapillare heraus erstreckt und an einer Spitze endet. Der freiliegende distale Abschnitt ist dazu positioniert, die ablatierten Teilproben von dem Probentisch aufzunehmen (d. h. ist über dem Probentisch positioniert). Die Kapillare ist dazu konfiguriert, das Lösungsmittel auf eine äußere Oberfläche der Elektrospraysonde aufzubringen, derart, dass das Lösungsmittel entlang einer äußeren Oberfläche des freiliegenden distalen Abschnitts in Richtung der Spitze der Elektrospraysonde fließt. Auf diese Weise fließen ablatierte Teilproben, wenn sie von dem freiliegenden distalen Abschnitt eingefangen werden, dann in Richtung der Spitze der Sonde, wo sie ionisiert und in Richtung eines Massenspektrometrieeinlasses übertragen werden. Der Empfänger 116 und insbesondere der Abschnitt des Empfängers, der anfänglich die Ablationsfahne 20 berührt und aufnimmt, kann von der Oberseite des Probentisches um einen Abstand von etwa 1 mm oder weniger oder etwa 500 µm oder weniger oder um etwa 350 µm oder weniger oder um etwa 250 µm oder weniger oder um etwa 200 µm oder weniger oder um etwa 150 µm oder weniger beabstandet sein. Es hat sich gezeigt, dass Abmessungen innerhalb der vorstehend genannten Entfernungsmessungen eine effektive Aufnahme des ablatierten Materials durch den Empfänger bereitstellen.
  • Der Abstand zwischen der Probe und dem Abschnitt des Empfängers 116, der die Ablationsfahne 20 empfängt, kann ebenfalls so gewählt werden, dass eine effektive Übertragung des ablatierten Materials auf den Empfänger 116 bereitgestellt wird. Ablatierte Materialien werden mit kinetischer Energie (quadratisch zur Geschwindigkeit) von der Probe verschoben, erfahren jedoch eine Widerstandskraft (quadratisch zur Geschwindigkeit), die die Materialien verlangsamt und die kinetische Energie entfernt. Die gesamte kinetische Energie wird entfernt über einen Abstand L von etwa: L = ( h C ) ( ρ s ρ g )
    Figure DE102022112823A1_0001
  • Dabei ist h die Dicke/Höhe des ablatierten Abschnitts der Probe, ps die Probendichte, pg die Gasdichte und C der Luftwiderstandsbeiwert (normalerweise etwa 1). Typischerweise beträgt L ungefähr 700 h. Der Abstand zwischen der Oberseite der Probe und dem Empfänger ist daher vorzugsweise kleiner als L oder, mit anderen Worten, vorzugsweise kleiner als etwa das 700-fache der Höhe des ablatierten Abschnitts der Probe.
  • In einigen Ausführungsformen enthält die Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 einen Inkubationsbehälter (nicht gezeigt), der in Größe und Form dazu konfiguriert ist, zwischen dem Probentisch 114 und dem Empfänger 116 angeordnet zu werden, und dazu konfiguriert ist, eine Inkubationsumgebung für die auf dem Probentisch 114 platzierte Probe 10 bereitzustellen.
  • Das veranschaulichte System 100 kann auch einen vorgelagerten Prozessor 120 beinhalten, der dazu konfiguriert ist, eine Probe vor dem Positionieren der Probe auf dem Probentisch 114 zu sortieren, räumlich zu orientieren und/oder anderweitig zu verarbeiten. Zum Beispiel kann der vorgelagerte Prozessor 120 eine Sortiervorrichtung wie etwa einen elektrischen Tröpfchensortierer zum Sortieren von Zellen oder anderen Probenkomponenten auf einen Probenträger enthalten, wobei der Probenträger für eine nachfolgende Platzierung auf dem Probentisch 114 konfiguriert ist. Der vorgelagerte Prozessor 120 kann zusätzlich oder alternativ eine Zentrifuge, wie etwa eine Cytospin™-Zentrifuge, enthalten. Die Zentrifuge kann zum Beispiel dazu konfiguriert sein, eine Zellsuspension auf einen Objektträger zu schleudern, wobei der Objektträger zur anschließenden Platzierung auf dem Probentisch 114 konfiguriert ist. Andere vorgelagerte Verarbeitungskomponenten, wie sie in der Technik zum Sortieren und Positionieren von Proben und/oder Zellen bekannt sind, können zusätzlich oder alternativ in dem vorgelagerten Prozessor 120 enthalten sein.
  • Ein Beispiel für einen vorgelagerten Prozessor ist ein elektrischer Tröpfchensortierer 220, wie in 3 veranschaulicht. Eine Reihe von Tröpfchen 11 kann in der Nähe eines Deflektors 222 (z. B. eine oder mehrere Elektroden) durchgeleitet werden, der dazu dient, Tröpfchen von Interesse, wie etwa diejenigen, die Zellen 12 enthalten, selektiv abzulenken. Die Zellen 12 können auf einen Bildgebungsobjektträger 215 gerichtet werden, der auf einem Reaktionstisch 213 positioniert ist. Der Reaktionstisch 213 kann sich sequenziell bewegen, um Platz auf dem Objektträger 215 bereitzustellen, wenn zusätzliche Tröpfchen auf den Objektträger 215 sortiert werden. Der Objektträger 215 kann Referenzmarkierungen aufweisen, die es ermöglichen, die räumliche Position der einzelnen sortierten Tröpfchen zu referenzieren. Eine Kamera 224 ermöglicht das Aufzeichnen der Positionen der einzelnen sortierten Tröpfchen, die auch mit Tröpfchenflussdaten korreliert werden können (z. B. Zeitdaten, die angeben, wann jedes einzelne sortierte Tröpfchen aus dem Tröpfchenfluss aussortiert wurde).
  • Nachdem eine gewünschte Anzahl von Tröpfchen auf den Objektträger 215 sortiert wurde, kann der Objektträger 215 auf den Probentisch 114 überführt werden, wie etwa in 2 veranschaulicht. Die Positionen der einzelnen sortierten Tröpfchen auf dem Objektträger 215, wie sie von der Kamera 224 aufgezeichnet werden, können mit Bildern korreliert werden, die unter Verwendung der Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 erhalten werden. Somit können ablatierte Teilproben zu Bildern zurückverfolgt werden, die unter Verwendung der Abbildungs-/Ablationsvorrichtung 110 erhalten wurden, dann zurück zu einer räumlichen Position auf dem Objektträger 215 und schließlich zurück zu den Tröpfchenflussdaten.
  • Zusätzliche oder alternative vorgelagerte Verarbeitungsvorgänge können das Fixieren von Zellen auf einem Objektträger enthalten. Wie vorstehend erläutert, sind jedoch die hierin beschriebenen Systeme, Vorrichtungen und Verfahren in der Lage, eine Abbildung und Ablation von lebenden Zellen unter Umgebungsbedingungen durchzuführen, und somit ist das Fixieren von Zellen kein notwendiger Vorverarbeitungsschritt. Andere zusätzliche oder alternative vorgelagerte Verarbeitungsvorgänge können das Färben der Probe und/oder das Hinzufügen einer Markierung zu der Probe enthalten.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 2 kann das veranschaulichte System 100 auch einen nachgelagerten Analysator 130 enthalten, der dazu konfiguriert ist, eine ablatierte Probe von dem Empfänger 116 zur weiteren Analyse zu empfangen. Der nachgelagerte Analysator 130 kann zum Beispiel eine PCR-Maschine, eine Sequenziermaschine, ein optisches Spektrometer, ein Massenspektrometer oder Kombinationen davon enthalten. Andere im Stand der Technik bekannte Biomolekül-Analysevorrichtungen können zusätzlich oder alternativ enthalten sein. Wenn ein Massenspektrometer enthalten ist, kann der Analysator 130 eines oder mehrere zum Beispiel von einem Flugzeit-(TOF)-Massenspektrometer, einem Orbitrap™-Massenspektrometer, einem linearen Ionenfallenmassenspektrometer, einem Quadrupol-Massenspektrometer, einem Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometer, einem Magnetsektormassenspektrometer oder einem Fourier-Transformationsionenzyklotronresonanz-(FTICR)-Massenspektrometer enthalten.
  • Das veranschaulichte System 100 kann auch eine Steuerung 140 enthalten, die mit einer oder mehreren der anderen Komponenten des Systems kommunikativ gekoppelt ist, um eine Steuerung und/oder Rückmeldung des Systems 100 bereitzustellen. Die Steuerung 140 enthält einen oder mehrere Prozessoren 142, Speicher 144 (z. B. auf einem oder mehreren HardwareSpeichervorrichtungen) und ein Kommunikationsmodul 146 zum Steuern des Sendens und Empfangens von Daten zwischen der Steuerung und den verschiedenen Komponenten des Systems 100, mit dem die Steuerung 140 gekoppelt ist. Die Steuerung 140 kann auch Eingabe-/Ausgabehardware 148 enthalten, wie sie in der Technik bekannt ist, um eine Eingabe von einem Benutzer zu empfangen und/oder um einem Benutzer Informationen anzuzeigen.
  • Zusätzliche Details und Ausführungsformen in Bezug auf das System 100 werden nachstehend beschrieben. Es versteht sich, dass die nachstehend beschriebenen Ausführungsformen in jeder Kombination bereitgestellt und in Verbindung mit dem Gesamtsystem 100 wie vorstehend beschrieben verwendet werden können. In den nachstehend beschriebenen Ausführungsformen können gleiche Zahlen dazu verwendet werden, sich auf gleiche Komponenten zu beziehen.
  • Optische Anordnung
  • 4 veranschaulicht schematisch ein Beispiel einer optischen Anordnung 312, die in einem Abbildungs- und Ablationssystem wie etwa dem vorstehend beschriebenen System 100 verwendet werden kann. In einigen Ausführungsformen ist die optische Anordnung 312 so konfiguriert, dass sie eine Epifluoreszenzbildgebung bereitstellt. Die optische Anordnung 312 kann ein Objektiv 318 enthalten, das vorzugsweise eine NA von etwa 0,5 oder mehr oder etwa 0,65 oder mehr oder etwa 0,75 oder mehr oder etwa 0,8 oder mehr aufweist. Die optische Anordnung 312 enthält auch eine Abbildungslichtquelle 356, eine Ablationslichtquelle 354 (d. h. Ablationslaserquelle 354) und eine Kamera 352 (z. B. eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (charge-coupled device, CCD) oder CMOS-Kamera).
  • Die optische Anordnung 312 kann auch einen oder mehrere dichroitische Strahlteiler/Spiegel enthalten, wie etwa die dichroitischen Elemente 355 und 357. Das dichroitische Element 357 ist zum Beispiel so konfiguriert, dass es Anregungslicht oder einen Abschnitt davon von der Abbildungslichtquelle 356 in Richtung des Objektivs 318 reflektiert und Emissionslicht, das von der Probe zum Objektiv 318 zurück emittiert wird, passieren lässt. Das emittierte Licht kann dann durch das dichroitische Element 355 in Richtung der Kamera 352 reflektiert werden. Entlang des Strahlengangs können auch ein oder mehrere Filter angeordnet sein, um Quellenlicht und/oder reflektiertes Anregungslicht nach Bedarf für bestimmte Anwendungsanforderungen zu filtern/blockieren. Zum Beispiel können ein oder mehrere Anregungsfilter dazu verwendet werden, unerwünschten Hintergrund von der Anregungslichtquelle zu unterdrücken, ein oder mehrere Emissionsfilter können dazu verwendet werden, unerwünschten Fluoreszenzhintergrund, der von der Probe ausgeht, zu unterdrücken, und/oder andere bekannte Filterelemente, wie gewünscht. Das dichroitische Element 355 kann auch dazu dienen, Ablationslicht von der Ablationslichtquelle 354 in Richtung des Objektivs 318 passieren zu lassen. Ein oder mehrere Spiegel/Filter 353 können auch enthalten sein, um das Laserlicht entlang des Strahlengangs zwischen der Quelle 354 und dem Objektiv 318 zu manipulieren.
  • Die Abbildungslichtquelle 356 kann zum Beispiel eine Xenon-Bogenlampe, eine Quecksilberdampflampe oder LEDs enthalten. Die Ablationslichtquelle 354 enthält vorzugsweise einen Infrarotlaser (z. B. nahes Infrarot oder „NIR“). Auch der Ablationslaser ist vorzugsweise ein Femtosekundenlaser. Der Laser kann auch dazu konfiguriert sein, eine Zweiphotonenbildgebung unter Verwendung des Objektivs 318 zu ermöglichen. Die Ablationslichtquelle 354 kann zusätzlich oder alternativ zu der Lichtquelle 356 zu Abbildungszwecken sowie für Ablation verwendet werden. Zum Beispiel kann, wie nachstehend beschrieben, eine NIR-Quelle bei niedrigen Pulsenergien dazu verwendet werden, Bildgebungsinformationen zu erhalten, und bei hohen Pulsenergien für Ablation.
  • Die Verwendung von NIR von der Ablationslichtquelle 354 kann für die beabsichtigten Ablationsvorgänge besonders vorteilhaft sein, insbesondere im Vergleich zur Verwendung von ultraviolettem (UV) Licht. Zum Beispiel wird eine sinnvolle Wechselwirkung von Ablationslicht mit einer biologischen Zielprobe durch die Streuung von Licht an den Strukturen des biologischen Materials (z. B. Änderungen des Brechungsindex an Membranen, Zellkernen, Vesikeln usw.) begrenzt. Dies führt zu einem Informationsverlust und kann das sinnvolle Fokussieren von Zielinformationen auf einen Detektor erschweren. Das angelegte Ablationslicht wird auch durch Phasenverschiebung und Verlust an den biologischen Strukturen und durch Lichtabsorption durch die biologischen Strukturen beeinflusst. Da diese Beschränkungen hauptsächlich von der Wellenlänge des angelegten Lichts abhängig sind, sind die Beschränkungen weniger streng, wenn NIR-Licht verwendet wird. Das Konfigurieren der Ablationslichtquelle 354 als eine NIR-Quelle weist daher im Vergleich zu UV-Anwendungen (wie etwa UV-MALDI-Anwendungen) eine bessere Auflösung und Probeneindringtiefe auf.
  • Darüber hinaus ist man, um eine Superauflösung von besser als etwa 20 nm durch Lokalisierung zu erreichen, auf eine Eindringtiefe von etwa 1 µm der Dicke einer typischen fixierten biologischen Probe beschränkt. Für eine standardmäßige Auflösung im sichtbaren (VIS) Bereich oder etwa 250 nm beträgt die Eindringtiefe maximal etwa 10 bis 20 µm. Im Fall von NIR ist die Eindringtiefe für Zweiphotonenanregung viel höher, beispielsweise bis zu etwa 100 µm. Die Verwendung von NIR ermöglicht somit vorteilhafterweise ein tieferes Eindringen in das Zielprobengewebe und macht die Ablation sogar von relativ komplizierten Geweben (z. B. Gehirn) möglich. Die verbesserte Tiefeneindringung und -auflösung erhöht auch die Wahrscheinlichkeit, dass verbleibendes Material nach der Lasermanipulation überlebt und/oder strukturelle Informationen behält. Während die Bildgebung dickerer Proben im VIS-Bereich nicht durchführbar ist, ermöglicht die Zweiphotonenbildgebung unter Verwendung niedriger NIR-Pulsenergien vorteilhafterweise die Bildgebung in größeren Tiefen und ermöglicht daher eine bessere Volumeninformation.
  • Obwohl das beispielhafte optische System 312 hierin veranschaulicht ist, versteht es sich, dass andere optische Komponenten zur Abbildung und/oder Ablation, einschließlich anderer dichroitischer Elemente, Filter, Spiegel, Lichtquellen, Kameras und/oder anderer optischer Komponenten, wie sie in der Technik bekannt sind, zusätzlich oder alternativ enthalten sein können, um andere Abbildungsmodalitäten bereitzustellen. Die optische Anordnung 312 kann zum Beispiel auch so konfiguriert sein, dass sie Hellfeldaufnahmen und/oder -schnitte (z. B. unter Verwendung von konfokalen Bildgebungskomponenten) ermöglicht. Hierin beschriebene optische Anordnungen können dazu konfiguriert sein, eine unabhängige Fokussteuerung sowohl für die Abbildung als auch für die Ablation bereitzustellen. Das heißt, es können eine oder mehrere adaptive optische Anordnungen enthalten sein, um zum Beispiel eine dynamische Steuerung der Größe des Ablationspunkts innerhalb eines gegebenen Bildgebungssichtfelds bereitzustellen. Wenn der Laser zur Ablation einer Region von Interesse verwendet wird, kann er so konfiguriert werden, dass er Pulsenergien von etwa 1 nJ bis zu etwa 20 µJ für ein gegebenes Voxel von 1 µm × 1 µm × 2 µm liefert. Größere Regionen von Interesse können mehr Energie absorbieren und sind daher in der Lage, größeren absoluten Pulsenergien standzuhalten. Mit anderen Worten kann der Laser dazu konfiguriert sein, Pulsenergien von etwa 0,5 nJ bis etwa 10 µJ pro µm3 zu liefern.
  • Die Obergrenze von 10 µJ pro µm3 stellt eine Obergrenze dar, bevor zu erwarten ist, dass übermäßig Fragmentierung und Ionisation auftreten, und stellt somit die Obergrenze dar, bei der die Erhaltung der ablatierten Region von Interesse erwünscht ist. Wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, kann es jedoch bei einigen Implementierungen erwünscht sein, eine Zielregion zu fragmentieren/ionisieren, indem ein oder mehrere Pulse oberhalb der Obergrenze von 10 µJ pro µm3 abgegeben werden. Kurz gesagt, kann es zum Beispiel wünschenswert sein, den Laser auf ein Medienvolumen oberhalb einer Region von Interesse innerhalb einer Zelle zu fokussieren und das darüber liegende Medium abzublasen, bevor dann die Region von Interesse innerhalb der Zelle ablatiert wird. Dieser Prozess könnte einen größeren Spielraum bereitstellen, in dem die ablatierte Region von Interesse vom Probentisch zum Empfänger wandern kann (siehe zugehörige Erörterung entsprechend 11).
  • Wie vorstehend erwähnt, sind die hierin beschriebenen Abbildungs-/Ablationsvorrichtungen vorteilhafterweise in der Lage, auf relativ kleine Regionen von Interesse abzuzielen. Die optische Anordnung kann dazu konfiguriert sein, einen Punktgrößendurchmesser einer Zielregion zum Beispiel von etwa 50 µm oder weniger oder etwa 30 µm oder weniger oder etwa 10 µm oder weniger oder etwa 5 µm oder weniger oder etwa 3 µm oder weniger oder etwa 1,5 µm oder weniger oder etwa 1 µm oder weniger bereitzustellen. Hinsichtlich des Volumens kann die optische Anordnung so konfiguriert sein, dass sie eine Zielregion von etwa 500 µm3 oder weniger, etwa 250 µm3 oder weniger, etwa 100 µm3 oder weniger, etwa 50 µm3 oder weniger, etwa 25 µm3 oder weniger, etwa 10 µm3 oder weniger, etwa 5 µm3 oder weniger oder etwa 2 µm3 oder weniger ablatiert.
  • In einigen Implementierungen kann die optische Anordnung dazu konfiguriert sein, eine ganze Zelle oder eine Ansammlung mehrerer Zellen zu ablatieren. In anderen Implementierungen kann die optische Anordnung zum Ablatieren von Zielregionen von subzellulärer Größe konfiguriert sein, wie etwa bestimmter Organellen oder anderer intrazellulärer Regionen oder bestimmter extrazelluläre Regionen.
  • Ablatierter Probenempfänger
  • 5 veranschaulicht ein Beispiel eines Empfängers 416, der ein räumlich differenziertes Medium wie etwa eine Mikrotiterplatte, einen Mikrotiterchip, ein Nanotröpfchenarray oder eine andere Struktur enthält, die in der Lage ist, einzelne ablatierte Teilproben aufzunehmen und die separaten Teilproben in unterschiedlichen, räumlich getrennten Kammern zu halten. Der Empfänger 416 kann an einem Empfängertisch 417 angebracht sein, der selektiv in mindestens zwei axialen Richtungen, stärker bevorzugt in alle drei axialen Richtungen bewegt werden kann. Wie vorstehend in Bezug auf andere Ausführungsformen beschrieben, ist die optische Anordnung 412 dazu konfiguriert, eine Abbildung und/oder Ablation einer auf dem Probentisch 414 platzierten Probe 10 bereitzustellen. Während der Ablation erstreckt sich die entstehende Ablationsfahne 20 nach oben in Richtung des Empfängers 416, wo sie gesammelt und räumlich von anderen ablatierten Teilproben unterschieden wird. Wenn eine gewünschte Anzahl von Teilproben gesammelt worden ist oder wenn der Empfänger 416 voll ist, kann er von dem Empfängertisch 417 entfernt und zur weiteren Verarbeitung und/oder Analyse der gesammelten Teilproben zu einem Analysator durchgeleitet werden.
  • 6A veranschaulicht eine bestimmte Ausführungsform, bei der der Empfänger 516 als Nanotröpfchenarray konfiguriert ist. Wie bei anderen Ausführungsformen ist die optische Anordnung 512 dazu konfiguriert, eine Abbildung und/oder Ablation einer auf dem Probentisch 514 platzierten Probe 10 bereitzustellen. Während der Ablation erstreckt sich die entstehende Ablationsfahne 20 nach oben in Richtung des Empfängers 516, wo sie in einem entsprechenden Nanotröpfchen 519 oder einer Reihe derartiger Nanotröpfchen 519 gesammelt werden kann. Die getrennten Nanotröpfchen 519 bilden somit getrennte Kompartimente, die dazu dienen, die verschiedenen Ablationsteilproben räumlich von getrennten Ablationsereignissen zu trennen. Wie vorstehend aufgeführt, wenn eine gewünschte Anzahl von Teilproben gesammelt worden ist oder wenn der Empfänger 516 voll ist, kann er von dem Empfängertisch entfernt und zur weiteren Verarbeitung und/oder Analyse der gesammelten Teilproben zu einem Analysator durchgeleitet werden.
  • 6B veranschaulicht einen beispielhaften Prozess zum Bilden eines Nanotröpfchenarrays, wie es etwa in dem Empfänger 516 enthalten ist. Ein akustischer Wandler 562 kann dazu verwendet werden, akustische Energie auf getrennte Barcode-Lösungen in einem Barcodearray 560 anzulegen. Die entstehenden Nanotröpfchen werden von der Strichcodeanordnung 560 auf einen darüber liegenden Objektträger 515 übertragen. Die Nanotröpfchen 519 können unterschiedliche Strichcodes enthalten und daher für eine nachfolgende Analyse der durch die Nanotröpfchen eingefangenen ablatierten Teilproben, wie etwa eine nachfolgende PCR oder Sequenzierung der eingefangenen Nukleinsäure, bereit sein. Die Barcodes können mit der räumlichen Position der Nanotröpfchen 519 auf dem Objektträger 515 korreliert werden.
  • 7 veranschaulicht eine Ausführungsform eines Empfängers 616, der eine Elektrospraysonde 670 beinhaltet. Diese Art von Empfänger kann besonders nützlich sein, um ionisierte Tröpfchen zu generieren, die ablatierte Teilproben zur Analyse mittels Massenspektrometrie enthalten. Die Elektrospray-Sonde 670 läuft durch eine Kapillare 674. Ein freiliegender distaler Abschnitt 676 der Sonde 670 erstreckt sich über das distale Ende der Kapillare 674 hinaus. Ein Lösungsmittel 672 ist in der Kapillare 674 angeordnet und fließt heraus, um die Oberfläche des freiliegenden distalen Abschnitts 676 zu benetzen. Die Kapillare 674 ist so konfiguriert, dass das Lösungsmittel 672 derart aufgebracht wird, dass das Lösungsmittel 672 entlang einer äußeren Oberfläche des exponierten distalen Abschnitts 676 in Richtung der Spitze der Elektrospraysonde 670 fließt. Die Spitze der Elektrospraysonde 670 bildet Elektrospray-Tröpfchen und richtet sie auf einen Massenspektrometereinlass 678. Das Lösungsmittel kann beispielsweise Wasser und/oder eine oder mehrere flüchtige organische Verbindungen wie Methanol, Acetonitril, Essigsäure und dergleichen beinhalten.
  • Wie gezeigt, kann die benetzte Oberfläche des freiliegenden distalen Abschnitts 676 über der Ablationsfahne 20 positioniert sein, so dass die ablatierte Teilprobe während der Ablation der Probe 10 unter Verwendung der optischen Anordnung 612 auf der benetzten Oberfläche gesammelt wird. Die Positionierungssysteme des Probentisches 614 und des Empfängertisches 617 können so koordiniert werden, dass die Ablationsfahne 20 an dem freiliegenden distalen Abschnitt 676 ausgerichtet ist. Die Flussrate des Lösungsmittels 672 kann in Abhängigkeit von der Ablationsfrequenz gesteuert werden, um eine effektive räumliche Trennung der aufeinanderfolgenden Teilproben zu gewährleisten, die durch das fließende Lösungsmittel 672 auf der benetzten Oberfläche des exponierten distalen Abschnitts 676 eingefangen werden.
  • Im Gegensatz zu herkömmlichen LAESI-Systemen, die nur einen relativ kleinen Bruchteil des ablatierten Materials ionisieren, ist die veranschaulichte Konfiguration in der Lage, das ablatierte Material mit einer Effizienz von etwa 20 % oder mehr, etwa 35 % oder mehr, etwa 50 % oder mehr, etwa 65 % oder mehr, etwa 80 % oder mehr, etwa 90 % oder mehr, etwa 95 % oder mehr oder etwa 99 % oder mehr zu ionisieren.
  • Analysator für ablatierte Proben
  • Wie vorstehend erörtert, kann ein nachgelagerter Analysator dazu verwendet werden, die durch den Empfänger gesammelten ablatierten Teilproben weiter zu verarbeiten und/oder zu analysieren. In Abhängigkeit von der gewünschten Verarbeitungs- und/oder Analyseart kann der nachgelagerte Analysator zum Beispiel eine oder mehrere PCR-Maschinen, Sequenziermaschinen, optische Spektrometer, Kernspinresonanz-(NMR)-Spektrometer, Massenspektrometer, Chromatographievorrichtungen, Zentrifugen, Elektrophoresevorrichtungen, Radiomarkierungs- und Radiomarkierungsdetektionsvorrichtungen, andere analytische Biochemievorrichtungen oder Kombinationen davon enthalten.
  • Wenn ein Massenspektrometer enthalten ist, kann der Analysator eines oder mehrere zum Beispiel von einem Flugzeit-(TOF)-Massenspektrometer, einem Orbitrap-Massenspektrometer, einem linearen Ionenfallenmassenspektrometer, einem Quadrupolmassenspektrometer, einem Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometer, einem Magnetsektormassenspektrometer oder einem Fourier-Transformationsionenzyklotronresonanz-(FTICR)-Massenspektrometer enthalten. Wenn eine Sequenzierung verwendet wird, kann die Sequenziermaschine dazu konfiguriert sein, eine Sequenzierung der nächsten Generation (next generation sequencing, NGS) durchzuführen, die manchmal auch als Hochdurchsatzsequenzierung bezeichnet wird. Geeignete Sequenzierungsmodalitäten enthalten 454-Pyrosequenzierung, Ionen-Torrent-Sequenzierung, Nanoporensequenzierung, Synthesesequenzierung (d. h. Illumina-Sequenzierung) und/oder andere Sequenzierungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind oder entwickelt werden.
  • Es können auch traditionellere Verfahren zum Kettenabbruch (z. B. Sanger-Sequenzierung) genutzt werden.
  • 8 veranschaulicht ein Beispiel eines nachgelagerten Prozesses, bei dem ein oder mehrere Reagenzien zu den räumlich getrennten Kammern (in diesem Beispiel Nanotröpfchen 719) des Empfängers 716 hinzugefügt werden können. Es können ein oder mehrere Reagenzien hinzugefügt werden, um zum Beispiel Zelllyse, Proteinextraktion, Reduktion, Alkylierung, Aufschluss und/oder andere gewünschte Reaktionen zur Herstellung der gesammelten Teilproben durchzuführen.
  • 8 veranschaulicht auch, dass Teilproben zusätzlich oder alternativ zu einem Flüssigchromatographiemassenspektrometrie-(LC-MS)-System überführt werden können. Zum Beispiel können Teilproben zu einer Flüssigchromatographiesäule 780 durchgeleitet werden, die mit einer Elektrospraysonde 770 gekoppelt ist, um ionisierte Proben zu einem Massenspektrometer 730 durchzuleiten.
  • Betriebsarten
  • Die hierin beschriebenen Vorrichtungen und Systeme können dazu konfiguriert sein, verschiedene Abbildungs- und/oder Ablationsprozesse durchzuführen. 9 veranschaulicht ein beispielhaftes Verfahren 800 zur Korrelation der Position einer ablatierten Teilprobe auf einem Empfänger mit einem Ablationsereignis und mit einer Zielregion von Interesse auf dem Probenträger. Wie vorstehend beschrieben, kann die Region von Interesse auf dem Probenträger weiter mit vorgelagerten Sortier-/Durchflussdaten korreliert werden (siehe z. B. 3 und zugehörige Beschreibung). Das Verfahren 800 kann unter Verwendung einer Steuerung durchgeführt werden, die mit bestimmten Komponenten des Systems kommunikativ gekoppelt ist, wie etwa der vorstehend in Bezug auf das System 100 beschriebenen Steuerung 140.
  • Bei dem veranschaulichten Verfahren kann die Steuerung zuerst eine räumliche Position einer Region von Interesse unter Verwendung gesammelter Bilddaten der Probe aufzeichnen (Schritt 810). Die Bildgebung kann zum Beispiel unter Verwendung von einem oder mehreren von Hellfeldaufnahmen, Schnitten, Epifluoreszenzbildgebung und/oder Zweiphotonenbildgebung durchgeführt werden. Ferner kann die Bildgebung unter Verwendung des gleichen Objektivs durchgeführt werden, durch das anschließend Ablationslaserpulse zum Ablatieren der Zielregion von Interesse durchgeleitet werden.
  • Die Steuerung kann dann die räumliche Position der Region von Interesse einem Ablationsereignis zuordnen, das zu einer Ablation von mindestens einem Abschnitt der Region von Interesse führt, wobei das Ablationsereignis eine Ablationsfahne bildet, die eine ablatierte Teilprobe von ablatiertem Material aus der Region von Interesse zu einem Empfänger transportiert (Schritt 820). Dieser Schritt kann daher die zeitlichen Informationen des Ablationsereignisses der räumlichen Position der Region von Interesse auf dem Probenträger zuordnen.
  • Die Steuerung kann dann eine Position der ablatierten Teilprobe auf dem Empfänger aufzeichnen (Schritt 830) und dann das Ablationsereignis der Position der ablatierten Teilprobe auf dem Empfänger zuordnen, wobei die Position der ablatierten Teilprobe auf dem Empfänger dadurch sowohl dem Ablationsereignis als auch der räumlichen Position der Region von Interesse zugeordnet wird (Schritt 840). Diese Schritte können daher ermöglichen, dass die räumliche Position der ablatierten Teilprobe auf dem Empfänger den entsprechenden zeitlichen Informationen des Ablationsereignisses und der räumlichen Position der Region von Interesse auf dem Probenträger zugeordnet wird. Der Satz von Korrelationen ermöglicht somit ein nachfolgendes Zurückverfolgen von Teilprobendaten zu den entsprechenden zeitlichen Ereignissen und räumlichen Positionen, die zu den Teilprobendaten geführt haben.
  • Während der Ablation können die Laserpulsfrequenz, das Laserpulsenergieniveau und die Laserpulstiefe unabhängig variiert werden, um gewünschte Betriebsfähigkeiten bereitzustellen. Bei einer Standardimplementierung kann zum Beispiel ein einzelner Puls auf eine feste Fokusposition gerichtet werden. Die Pulsenergie kann so gewählt werden, dass Ablation optimiert wird, Fahnenbildung optimiert wird und/oder die Verschlechterung der überführten Teilprobe minimiert wird.
  • In anderen Implementierungen können die Tiefe des angelegten Laserpulses und/oder das Pulsenergieniveau dynamisch variiert werden, um gewünschte Effekte bereitzustellen. 10 veranschaulicht grafisch einen beispielhaften Betriebsmodus, in dem ein rechteckiger xy-Bereich abgetastet und ablatiert wird. Die Laserpulsfrequenz kann abgeglichen werden, um die Verweilzeit und die Puls-zu-Puls-Überlappung auszugleichen. Diese Art der Implementierung kann dazu verwendet werden, ganze Strukturen (z. B. verschiedene Organellen innerhalb einer Zelle) oder gewünschte Abschnitte davon auf räumlich koordinierte Weise zu ablatieren. Es ist zu beachten, dass die Einheiten entlang der Achsen des Diagramms nur zu Veranschaulichungszwecken dienen und nicht unbedingt maßstabsgetreu sind.
  • 11 veranschaulicht grafisch ein weiteres Beispiel eines Betriebsmodus, der verwendet werden kann, wenn eine Schicht aus Gewebe, Medium oder einem anderen blockierenden Material über der Zielregion von Interesse liegt. Die „z-Antriebs“-Linie gibt die Bewegung der angelegten Laserpulse entlang eines axialen/vertikalen Kanals an (d. h. entlang der z-Achse, die senkrecht zu der durch die x- und y-Achse definierten Ebene des Probentisches liegt). Die Linie „Fokusposition“ gibt die Tiefe an, in der sich die Zielzone von Interesse befindet. Wie gezeigt, werden die oberen Schichten anfangs Laserpulsen mit höherer Energie ausgesetzt, die besser auf das Entfernen des darüber liegenden Materials und das Öffnen eines axialen Kanals zugeschnitten sein können. Sobald die sich dynamisch bewegenden Laserpulse die Tiefe der Region von Interesse erreichen, kann das Energieniveau des Laserpulses auf ein Niveau verringert werden, das für die Ablation der Region von Interesse besser geeignet ist. Das ablatierte Material kann dann von der Probe weg und in Richtung des Empfängers wandern, bevor der über der Region von Interesse gebildete Kanal wieder zusammenfällt. Es ist zu beachten, dass die Einheiten entlang der Achsen des Diagramms nur zu Veranschaulichungszwecken dienen und nicht unbedingt maßstabsgetreu sind.
  • Ein Betriebsmodus, wie er etwa in 11 gezeigt ist, kann vorteilhafterweise eine Ablation von Zielregionen ermöglichen, die gemessen von der Oberseite etwas tiefer in der Probe liegen. Zum Beispiel kann, ohne dass zuerst etwas vom darüber liegenden Material entfernt wird, die Ablation unter Umständen auf die oberen 2 bis 10 µm der Probe beschränkt sein, da die entstehende Fahne durch verbleibendes darüber liegendes Material nach oben zum Empfänger transportiert werden muss. Die dynamische Konfiguration des Betriebsmodus, wie etwa in 11, kann die Menge des darüber liegenden Gewebes entfernen oder verringern und somit das effektive Transportieren einer Ablationsfahne aus einer tieferen Region von Interesse zum Empfänger ermöglichen. Abbildungs- und Ablationsvorrichtungen, wie sie hierin beschrieben sind, können auch dazu betrieben werden, den Ablationslaser auf eine Tiefe von der Oberseite der Probe zu fokussieren, die dem räumlichen Auflösungswert zugeordnet ist (d. h. dem kürzesten Abstand zwischen zwei Punkten auf einer Probe, der noch erkannt werden kann). Das heißt, wenn der erforderliche räumliche Auflösungswert relativ klein ist, ist die maximale Tiefe, auf die der Ablationslaser fokussiert ist, ebenfalls kleiner, und wenn der erforderliche und/oder verwendete räumliche Auflösungswert größer ist, ist die maximale Tiefe, auf die der Ablationslaser fokussiert ist, ebenfalls größer. Dieser Ansatz ermöglicht größere Fokustiefen, wenn der erforderliche räumliche Auflösungswert zum effektiven Anvisieren der Region von Interesse ausreichend groß ist, begrenzt jedoch die Fokustiefen, wenn der erforderliche räumliche Auflösungswert klein ist, wodurch sich die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die entstehende Ablationsfahne dazu geeignet ist, erfolgreich von der Probe zum Empfänger transportiert zu werden.
  • Zum Beispiel kann der Ablationslaser auf eine Tiefe, gemessen von der Oberseite der Probe, fokussiert werden, die nicht mehr als das R-fache der räumlichen Auflösung beträgt, wobei R ein Wert von etwa 5 bis etwa 30, wie etwa ein Wert von etwa 10, 15, 20 oder 25 ist. Es versteht sich jedoch, dass Tiefen, die größer sind als diejenigen, die durch den Wert von R vorgegeben werden, in zumindest einigen Anwendungen ablatiert werden können, etwa wenn ein dynamischer Laserbetrieb wie bei dem in 11 veranschaulichten Betrieb verwendet wird.
  • Mindestens ein Abschnitt der Probe, der zwischen der unteren Oberfläche der Probe und dem Punkt des Laserfokus angeordnet ist, kann ohne Ablation verbleiben. Somit kann in bestimmten Tiefen für die Ablation auf bestimmte Teilprobenvolumina in einer Weise abgezielt werden, die einen erfolgreichen Transport der entstehenden Ablationsfahne zum Empfänger ermöglicht.
  • Laserfokusdetektionseinheit
  • 12 veranschaulicht eine beispielhafte Abbildungs-/Ablationsvorrichtung, die eine Laserfokusdetektionseinheit (FDU) 1000 enthält. Die FDU kann mit jedem der vorstehend unter Bezugnahme auf 2 bis 11 erwähnten Abbildungs-/Ablationsvorrichtungen verwendet werden. Eine Objektivlinse der Wahl 1020 (die Vorrichtung kann mit mehreren unterschiedlichen Objektiven ausgestattet sein, z. B. bis zu fünf Objektiven) fokussiert Licht durch ein transparentes Fenster eines Probentisches 1001 und in eine Probe 1002. Die optische Achse des Systems ist durch Pfeil 1008 angegeben. Der Probentisch 1001 umfasst ein transparentes Fenster, wie etwa ein Glas- oder Kunststofffenster, z. B. einen transparenten Objektträger oder ein Deckglas, oder einen anderen transparenten Glas- oder Kunststoffträger, auf dem die Probe befestigt ist. Das transparente Fenster kann die Probe vor der Atmosphäre des Mikroskops oder der optischen Anordnung schützen. Die Probe 1002 kann eine Probe aus einer oder mehreren Zellen sein. Die Probe 1002 weist eine obenliegende Wasserschicht 1002b auf, d. h. die die Zellen bedeckt. Eine Atmosphäre 1007, wie etwa Luft, umgibt die Probe. Die Atmosphäre kann eine Feuchtigkeits-/CO2-Durchflusssteuerung für Versuche mit lebenden Zellen umfassen.
  • Die Pfeile C stellen den Weg oder Durchmesser von einfallenden Lichtstrahlen dar, die ein Epi-Beleuchtungsstrahl, ein Laserpuls zur Ablation oder Anregungslicht zur Fluoreszenzemission sein können. Der Lichtstrahl C, wie etwa Laserlicht zur Ablation, wird durch das Objektiv auf einen Fokuspunkt 1003 in der Probe fokussiert. Ein Hohlraum mit einem Durchmesser 1009 wird anfänglich durch Pulse des Ablationslaserlichts in der Probe am Fokus 1003 generiert. Anschließend wird eine Ablationsfahne 1004 aus ablatiertem Probenmaterial erzeugt, die sich von der Probe an deren Oberfläche mit der Atmosphäre ausdehnt, typischerweise mit einer cos2-Verteilung. Die Ablationsfahne 1004 dehnt sich in Richtung eines Empfängers 1005 aus, der über der Probe positioniert ist, wie etwa eine Empfängerplatte, eine Elektrospraysonde oder ein Eingang zu einem Massenspektrometer. Der Bereich 1006 stellt die Projektion der Fahne 1004 auf dem Empfänger 1005 dar.
  • Eine Lichtquelle 1011, wie etwa eine Blitzlampe, die eine (gepulste) Durchlicht-Momentaufnahmebildgebung ermöglicht, ist über der Probe positioniert. Eine Linse 1014 ist zum Kollimieren von Licht von der Lichtquelle in die Probe 1002 bereitgestellt.
  • Es sind mehrere Lichtwege angegeben. Laserlicht vom Ablationslaser wird durch die Wellenfront A und die Pulswellenform mit der Energie P angegeben, die dem Weg C folgt. Der Weg C stellt im Allgemeinen den Epi-Beleuchtungsstrahlengang des Lichts dar, der von unten in Richtung der Probe verläuft, einschließlich des Lichts vom Ablationslaser und des Anregungslichts für die Fluoreszenzemission. Ein Referenzlaserstrahl der Fokusdetektionseinheit (FDU) ist durch den Strahlengang B angegeben. Der Weg D gibt den Lichtweg für zurück reflektiertes Licht und Fluoreszenzemission an. Eine Kamera (wie etwa eine CCD) oder ein Spektrometer, das in 12 nicht gezeigt ist, empfängt Licht von Pfad D, um Informationen zu erzeugen, die zeitlich aufgelöst und/oder spektral aufgelöst werden können.
  • Laserlicht von einem Referenzlaser der in Betrieb befindlichen FDU wird von der Oberfläche 1010 der Probe zurück reflektiert. Gezeigt ist übertragenes Laserlicht B// von einem Referenzlaser der FDU, das durch die Probe 1002 übertragen wurde. Ein schneller Photodetektor 1012 ist so positioniert, dass er das übertragene Laserlicht B// detektiert.
  • Das Ablationssystem, das die in 12 schematisch gezeigte FDU enthält, kann unter Verwendung des in 13 gezeigten beispielhaften optischen Systems implementiert werden. Das in 13 gezeigte optische System umfasst viele der gleichen Komponenten wie das in 4 schematisch gezeigte optische System, und diese gleichen Komponenten verwenden die gleichen Bezugszeichen. Das in 13 gezeigte optische System umfasst zusätzlich eine FDU mit mindestens einem Referenzlaser 2002. Für das in 12 gezeigte System werden zwei Referenzlaser genutzt. Die allgemein durch den Pfeil B gezeigten Referenzlaserstrahlen werden durch den dichroitischen Strahlteiler/Spiegel 2004 der FDU reflektiert, um in das Objektiv 318 einzutreten. Der/die Referenzlaser der FDU sind vorzugsweise Nahinfrarot- oder „NIR“-Laser. In der gezeigten Ausführungsform bestehen die Referenzlaserstrahlen aus 905-nm-Laserlicht. Das Referenzlaserlicht wird in der hinteren Brennebene (back focal plane, BFP) der Objektivlinse fokussiert, um kollimiertes Licht im Probenraum zu bilden. Das dichroitische Element 2004 reflektiert nur das 905-nm-Laserlicht, während andere Wellenlängen (z. B. UV, sichtbares Licht, anderes NIR usw.) das dichroitische Element passieren. Somit ermöglicht die Referenzlaserwellenlänge zusammen mit dem dichroitischen Element 2004, dass der Aufbau des Epi-Mikroskops unabhängig von der FDU ist. Reflektierte Referenzlaserstrahlen, die von dem Probentisch und/oder der Probe zurück reflektiert wurden, was eine Reflexion von dem generierten Hohlraum oder der Ablationsfahne beinhalten kann, werden von einem Photodetektor 2006 detektiert. Weitere Einzelheiten des FDU-Referenzlasers und der Detektion werden nachstehend unter Bezugnahme auf 14 und 15 beschrieben. Das optische System in 13 wird von einer Steuerung 2050 gesteuert, die wie die vorstehend für das System 100 beschriebene Steuerung 140 einen oder mehrere Prozessoren, Speicher (z. B. auf einem oder mehreren HardwareSpeichervorrichtungen) und ein Kommunikationsmodul zum Steuern des Sendens und Empfangens von Daten zwischen der Steuerung und den verschiedenen Komponenten des Systems, mit dem die Steuerung gekoppelt ist, umfasst. Das Senden/Empfangen von Daten an die/von der Steuerung wird durch die Pfeile angegeben. Die Steuerung kann auch Eingabe-/Ausgabe-(E/A)-Hardware enthalten, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, um eine Eingabe von einem Benutzer zu empfangen und/oder um einem Benutzer Informationen anzuzeigen. Unter Bezugnahme auf 12 sind mehrere Abstände im System gezeigt, die während des Ablationsprozesses überwacht werden müssen: ΔZ1 ist der Abstand vom Objektiv 1020 zum Probentisch 1001 (d. h. dessen transparentem Fenster), ΔZ2 ist der Abstand vom Objektiv 1020 zu der Reflexionsoberfläche 1010 der Probe an der Grenzfläche Probe/Atmosphäre, und ΔZ3 ist der Abstand vom Probentisch 1001 zum Empfänger 1005.
  • Unter Bezugnahme auf 12 geben F1, F2, F3 die Referenzlaserstrahlen der FDU an. Ein erster Referenzlaserstrahl F1 von einem ersten Referenzlaser der FDU (Laser Nr. 1) wird in das Objektiv des optischen Systems gerichtet, das von der optischen Achse versetzt ist. Das Objektiv 1020 fokussiert den ersten Referenzlaserstrahl F1 in einem Winkel α zum Objektiv in Richtung des Probentisches. Der Winkel α ist abhängig von der verwendeten Objektivlinse. Der erste Referenzlaserstrahl F1 wird auf die Objektivlinse fokussiert, um paralleles Licht im Objektraum unter dem Winkel α zu bilden. Der Winkel α kann zur Triangulation dazu verwendet werden, den relativen Abstand ΔZ1 von der Objektivlinse 1020 zum Probentisch 1001 und auch den relativen Abstand ΔZ2 von der Objektivlinse 1020 zur Probenoberfläche 1010 zu messen und/oder zu steuern.
  • Ein Teil des ersten Referenzlaserstrahls F1 wird von dem Probentisch (d. h. von dem transparenten Fenster des Probentisches) reflektiert, was zu einem ersten reflektierten Referenzlaserstrahl F'2 führt. Der reflektierte Referenzlaserstrahl F'2 ist innerhalb des Objektivs gegenüber dem einfallenden ersten Referenzlaserstrahl F1 um einen radialen Abstand R1 radial verschoben. Die Strahlpositionen des ersten Referenzlaserstrahls F1 und des reflektierten Referenzlaserstrahls F'2 und somit der Abstand R1 dazwischen werden durch einen Arraydetektor des Photodetektors 2006 detektiert, wie detaillierter unter Bezugnahme auf 14 und 15 gezeigt. Der Abstand R1 zwischen den Referenzstrahlen ist abhängig vom Abstand ΔZ1 und wird somit dazu verwendet, den Abstand von der Objektivlinse 1020 zum Probentisch 1001 zu messen.
  • Ein Teil des ersten Referenzlaserstrahls F1 wird auch von der Probenoberfläche mit der Atmosphäre reflektiert, die der Wasserspiegel über einer Zellprobe sein kann, was zu einem zweiten oder weiteren reflektierten Referenzlaserstrahl F3 führt. Der reflektierte Referenzlaserstrahl F3 ist innerhalb des Objektivs gegenüber dem einfallenden ersten Referenzlaserstrahl F1 um einen radialen Abstand R2 radial verschoben. Die Strahlpositionen des ersten Referenzlaserstrahls F1 und des reflektierten Referenzlaserstrahls F3 und somit der Abstand R2 dazwischen werden durch den Arraydetektor des Photodetektors 2006 detektiert, wie detaillierter unter Bezugnahme auf 14 und 15 gezeigt. Der Abstand R2 zwischen den Referenzstrahlen ist abhängig vom Abstand ΔZ2 und wird somit dazu verwendet, den Abstand von der Objektivlinse 1020 zur Probenoberfläche 1010 mit der Atmosphäre zu messen.
  • Ein zweiter Referenzlaserstrahl F2 von einem zweiten Referenzlaser der FDU (Laser Nr. 2) wird entlang der optischen Achse 1008, d. h. senkrecht zum Objektiv, in das Objektiv hinein und aus dem Objektiv heraus gerichtet. Der zweite Referenzlaserstrahl F2 wird über einen Strahlteiler, der Bestandteil eines Interferometers ist (nachstehend unter Bezugnahme auf 14, 15 und 16 beschrieben), auf das Objektiv gerichtet. Der erste und der zweite Referenzlaser der FDU können gleichzeitig (ohne Zeitverzögerung) oder sequenziell (d. h. mit einer Zeitverzögerung) auf einander angelegt werden. Der erste und der zweite Referenzlaser der FDU können gleichzeitig oder nacheinander auf den Zeitpunkt des/der Ablationslaserpulse(s), vorzugsweise gleichzeitig mit dem/den Ablationslaserpuls(en), angelegt werden. Mit anderen Worten kann die Messung von ΔZ1 und/oder ΔZ2 und/oder ΔZ3 gleichzeitig mit oder sequenziell zu dem Zeitpunkt des/der Ablationslaserpulse(s) (vorzugsweise gleichzeitig) stattfinden. Die Messung von ΔZ1 und/oder ΔZ2 und/oder ΔZ3 kann vorzugsweise vor dem/den Ablationslaserpuls(en) beginnen und vorzugsweise gleichzeitig andauern. Die Messung von ΔZ1 und/oder ΔZ2 und/oder ΔZ3 kann im Wesentlichen kontinuierlich über den Zeitraum durchgeführt werden, der den/die Ablationslaserpuls(e) enthält.
  • 15 zeigt in A die Positionen der Referenzlaserstrahlen F2, F2' und F3, wie sie am Arraydetektor 2006 empfangen werden. Der Referenzlaserstrahl F1 ist der Einfachheit halber nicht gezeigt. Die Position der Referenzstrahlen F2' und F3 relativ zu dem Strahl F1 auf dem Arraydetektor ist ein Maß für die z-Achsen-Position des Probentisches bzw. der Probenoberfläche relativ zum Objektiv. Die Referenzstrahlen erreichen den Arraydetektor 2006 über einen Strahlteiler 2010, wie in 14 gezeigt. Der Strahlteiler 2010 ist ein 50 : 50-Strahlteiler. In anderen Ausführungsformen kann ein Strahlteiler verwendet werden, der das Licht in einem anderen Verhältnis, z. B. 10 : 90 (übertragen : reflektiert), teilt. In 14 ist der Einfachheit halber nur der zweite Referenzstrahl F2 gezeigt.
  • Der Arraydetektor des Photodetektors 2006 ist ein Photodetektor mit Echtzeit-Peakdetektion, d. h. der mit mindestens einer kHz-Bildrate (>1 kHz) arbeitet. Die Zeitauflösung des Arraydetektors beträgt vorzugsweise 1 ms oder mehr oder 1 µs oder mehr, zum Beispiel im Bereich von 1 ms bis 1 ps oder 1 ms bis 1 ns oder 1 ms bis 1 µs oder 1 µs bis 1 ns. In einer Ausführungsform umfasst der Photodetektor der FDU einen Arraydetektor wie beschrieben und einen oder mehrere Einzelelementphotodetektoren. Einzelelementphotodetektoren werden dazu verwendet, die höchstmögliche Zeitauflösung zu erreichen, z. B. 1 ns oder höher oder 1 ps oder höher. In einer Ausführungsform wird zumindest der Strahl F2, der entlang der zentralen optischen Achse in das Objektiv hinein und aus diesem heraus wandert, durch einen (Einzelelement-) Detektor oder ein Pixel des Arrays detektiert, der/das eine höhere Zeitauflösung als der Arraydetektor aufweist, z. B. eine Zeitauflösung von mindestens 10 ns oder mindestens 1 ns oder mindestens 1 ps, zum Beispiel eine Auflösung von 1 ns bis 1 ps. 15 in B zeigt schematisch den Strahl F2, der durch den Strahlteiler 2010 hindurchgeht und dann von diesem reflektiert wird, um von einem schnellen Einzelelementphotodetektor Z detektiert zu werden. Das Interferenzmuster 2011, das sich aus dieser Detektion des reflektierten F2-Strahls ergibt, ist ebenfalls gezeigt. Dies ermöglicht eine Echtzeitdetektion der Probenoberfläche, zum Beispiel des Wasserstands.
  • Wie schematisch in 14 gezeigt, ist der Detektor 2006 Bestandteil eines Interferometers 2014, das auch den Strahlteiler 2010 und den Spiegel 2016 zusammen mit Lichtquellen in Form eines ersten Referenzlasers (Nr. 1) 3002 und eines zweiten Referenzlasers (Nr. 2) 3004 der FDU enthält (der Einfachheit halber ist nur der Laser Nr. 2 gezeigt). Eine weitere Ansicht der FDU ist schematisch in 16 dargestellt, die wiederum den Arraydetektor 2006, den Strahlteiler 2010, das dichroitische Element 2004 zusammen mit dem ersten Referenzlaser (Nr. 1) 3002 und dem zweiten Referenzlaser (Nr. 2) 3004 zeigt.
  • Wie beschrieben, wird der Referenzlaser Nr. 1 für Triangulationsmessungen zur Ermittlung der Abstände ΔZ1 und ΔZ2 im System verwendet. In 17 sind Daten für die Pixelintensitäten auf dem Arraydetektor aufgrund der Strahlen gezeigt, die von den Oberflächen des Probentisches (z. B. Objektträger oder Deckglas) ΔZ1 (Unterseite) und ΔZ1' (Tischoberseite) reflektiert werden. Typischerweise dient die Messung ΔZ1 zur Abstimmung oder Steuerung des z-Antriebsmechanismus, der das Objektiv relativ zum Probentisch positioniert, was eine Steuerung der Tiefe des Laserfokus für den Ablationslaser bereitstellt. Der Pixelabstand ΔZ1,1' ist abhängig von der Vergrößerung und der NA der verwendeten Objektivlinse. Die Detektionspixel des Arraydetektors können für bekannte Objektivpositionen kalibriert werden (ΔZ1-Werte, sowie ΔZ2-Werte), wie in 18 gezeigt. Die Kalibrierung stellt eine lineare Korrelation zwischen den Pixeln des Arraydetektors und der ΔZ1-Werte bereit.
  • Der Referenzlaser Nr. 1 wird, wie beschrieben, auch für Triangulationsmessungen zur Ermittlung des Abstands ΔZ2 im System verwendet, z. B. mit Präzision im Sub-Mikrometerbereich, je nach verwendetem Objektivtyp. In 19 sind Daten für die Pixelintensitäten auf dem Arraydetektor aufgrund der vom Probentisch (ΔZ1) sowie von der Probenoberfläche (ΔZ2) reflektierten Strahlen für verschiedene Wasserstände (d. h. Probenhöhen) a, b, c, d dargestellt. In 20 sind die gleichen Daten gezeigt, aber zusätzlich mit Daten vom Detektor, wenn die Probe auf dem Probentisch austrocknet. Der ΔZ2-Wert wird auch zur Abstimmung oder Steuerung des z-Antriebsmechanismus verwendet, der das Objektiv relativ zur Probenoberfläche positioniert, wodurch die Tiefe des Laserfokus für den Ablationslaser gesteuert wird.
  • Der Referenzlaser Nr. 2 (Strahl F2) der FDU wird zur interferometrischen Messung des Ablationshohlraums und der Fahnenausbreitung, d. h. in Richtung der z-Achse, verwendet. 21 zeigt am Photodetektor die Abhängigkeit des Interferenzsignals (I) vom Laser Nr. 2 von der Zeit (t), das von der Reflexion von der Hohlraumbildung und der Grenzfläche zwischen Fahne und Probe herrührt. Das Interferenzsignal stellt genaue nach Ort und Zeit aufgelöste Informationen über die Hohlraum- und Fahnenbildung bereit. Konstruktive und destruktive Extrema im Signal definieren Flugbahnkoordinaten aus der Funktion X(t, n.λ/2).ΔX(t)/Δt), wodurch die Geschwindigkeit des Hohlraums in Richtung des Empfängers genau überwacht werden kann. Die Extrema treten bei n* λ/2 auf (n ist eine ganze Zahl) und, da die Richtung der Fahnenbewegung mit Datenpunkten alle λ/2 bekannt ist, wobei die Extrema X zur Zeit t detektiert werden, ist ΔX(t)/Δt die Geschwindigkeit.
  • Aus den beschriebenen Ausführungsformen ist ersichtlich, dass die FDU mindestens einen ersten Referenzlaser umfassen kann, der dazu konfiguriert ist, erstes Laserlicht entlang einer von der optischen Achse des Objektivs versetzten Achse auf das Objektiv zu richten, und dass der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, zuerst Laserlicht zu detektieren, das durch das Objektiv entlang einer Achse, die von der optischen Achse des Objektivs versetzt ist, zurück reflektiert wird. Aus den beschriebenen Ausführungsformen ist ferner ersichtlich, dass die FDU mindestens einen zweiten Referenzlaser umfassen kann, der dazu konfiguriert ist, zweites Laserlicht entlang der optischen Achse des Objektivs auf das Objektiv zu richten, und der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, durch das Objektiv entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiertes zweites Laserlicht zu detektieren. Darüber hinaus ist in einer Ausführungsform der mindestens eine Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiertes zweites Laserlicht zu detektieren, Bestandteil eines Interferometers. In einer Ausführungsform stellt das entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektierte zweite Laserlicht gleichzeitig ein Interferenzsignal von einem Hohlraum bereit, der in der Probe durch das Laserlicht von dem Ablationslaser gebildet wird. In einer Ausführungsform stellt das entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektierte zweite Laserlicht gleichzeitig ein Interferenzsignal von einem Hohlraum bereit, der in der Probe durch das Laserlicht von dem Ablationslaser gebildet wird.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 12 ist das Licht B'' der übertragene Referenzlaserstrahl der FDU. Der schnelle Photodetektor 1012, der über der Probe in einem Winkel α positioniert ist, der der NA des Objektivs entspricht, überwacht den Hohlraum, der die Oberfläche der Probe passiert. Wenn sich der Hohlraum zur Oberfläche ausbreitet, stört der Hohlraum den übertragenen Referenzlaserstrahl B'', und daher ändert sich auch das Signal auf dem Photodetektor 1012, wodurch Informationen über die Dynamik der Hohlraumbildung und Hohlraumwanderung zur Probenoberfläche bereitgestellt werden. Diese Überwachung des Ablationshohlraums und der Fahnenausbreitung kann zusätzlich oder alternativ zur Verwendung des Referenzlasers Nr. 2 zur Überwachung von ΔZ2 erfolgen.
  • Die Detektion der Dynamik des Ablationshohlraums und der Fahnenbildung erfolgt über schnelle Photodetektoren (Auflösung im Sub-Nanosekundenbereich (ns)), um die Oberflächenreflexionseigenschaften der Probe zu überwachen, d. h. die Probenhöhe in Abhängigkeit von der Zeit, H(t). Die Überwachung des Detektionssignals D(Ht) unter Verwendung des Detektors 1012 gibt an, wann der Hohlraum zur Zeit t' die Oberfläche der Probe/Atmosphäre passiert. Von der Zeit t' bis t'' passiert die Fahne die Oberfläche. Die axiale Länge des Hohlraums/der Fahne wird über Δt= t'' -t' und die Schallgeschwindigkeit definiert, die an dieser Stelle sowohl vom Probenmedium als auch von der Atmosphäre beeinflusst wird und abgeschätzt werden kann. 22 veranschaulicht schematisch einen Betrieb der Optik zur Ablationsüberwachung. Die Höhe der Probenoberfläche H entwickelt sich mit der Hohlraumausbreitung über die Zeit, t1<t2<t3<t4, bis zur Fahnenbildung bei t". Die Überwachung der Hohlraumausbreitung und der Fahnenbildung unter Verwendung der Referenzlaserstrahlen F1, F2 und F3 der FDU ist gezeigt wie vorstehend beschrieben.
  • Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass in einigen Ausführungsformen mindestens ein Photodetektor einen schnellen Photodetektor enthält, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, der von mindestens einer Oberfläche des Probentisches und/oder der Probe reflektiert und/oder durch diese(n) übertragen wurde. Ein schneller Photodetektor hat hier vorzugsweise eine Zeitauflösung im Sub-ns-Bereich, z. B. eine Auflösung von mindestens 1 ns, z. B. 1 ns-1 ps. Darüber hinaus enthält der mindestens eine schnelle Photodetektor in einigen Ausführungsformen einen Photodetektor, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das von den (axialen) Grenzflächen der Probe mit unterschiedlichen Brechungsindizes stammt, z. B. von einer Oberfläche des Probentisches reflektiert und zurück durch das Objektiv gerichtet wurde. Der mindestens eine Photodetektor kann einen Photodetektor enthalten, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das von einer Oberfläche der Probe mit der Atmosphäre reflektiert wurde, die dem Empfänger zugewandt ist, und durch das Objektiv zurück gerichtet wurde. Der Photodetektor kann einen Arraydetektor zur Peakdetektion enthalten. In einer Ausführungsform enthält der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor, der auf der ersten (Ober-) Seite der Probe angeordnet ist und dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu detektieren, das durch die Probe übertragen wurde. Der mindestens eine schnelle Photodetektor ist vorzugsweise dazu konfiguriert, das mindestens eine Detektionssignal mit einer Zeitauflösung im Sub-Nanosekundenbereich aufzulösen. Der mindestens eine schnelle Photodetektor ist vorzugsweise mindestens eine Photodiode.
  • Die gepulste Durchleuchtung der Probe von der Lichtquelle 1011, die insbesondere als Blitzlampe konfiguriert ist, und die Detektion der Durchleuchtung durch die Kamera (z. B. CCD-Detektor 352 in 4 und 13) ermöglicht eine Momentaufnahmebildgebung der Dynamik der Hohlraumbildung, die Hohlraumwanderung zum Oberflächenmedium und die Fahnenbildung. Das Durchlichtbild ermöglicht auch die Bestimmung der Hohlraumgröße.
  • Die Fluoreszenzemission, wie etwa Epifluoreszenz, und/oder Raman-Emission können auch unter Verwendung der Abbildungs-/Ablationsvorrichtung gemessen werden. Licht von einer Fluoreszenzanregungsquelle (z. B. Lichtquelle 356, 4 oder 13) kann z. B. mit oder ohne Verzögerung nach dem Ablationslaser angelegt werden. Bei Verzögerung t = 0 (d. h. keine Verzögerung gegenüber dem Ablationslaser) ist es möglich, den nichtlinearen Effekt des Ablationslasers für Fluoreszenz zu verwenden, zum Beispiel wie beschrieben in: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6788598 (Lee et al, Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin, Biomed Opt Express. 2019, 10(10), 5431-5444; https://www.nature.com/articles/s41467-018-04470-8 (You et al, Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy, Nature Communications 9, Artikel Nummer: 2125 (2018); und https://aip.scitation.org/doi/full/10.1063/1.5098349 (S.A. Boppart et al, Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond). Für die Raman-Emission kann ein separater Anregungslaser verwendet werden (nicht gezeigt). Die Emission kann spektral und/oder zeitlich aufgelöst werden. Eine derartige Emission kann als Signal aus dem Fokus des Ablationslasers und zum Beispiel aus einer Momentaufnahme erhalten werden. Derselbe Detektor, wie etwa die Kamera, die zum Detektieren von Durchleuchtung verwendet wird, kann dazu verwendet werden, ein Fluoreszenzemissionsbild zu detektieren. Vorzugsweise wird jedoch die Fluoreszenz- oder Raman-Emission (mindestens Raman) auf einen schnellen Photodetektor (z. B. einen Arrayphotodetektor) mit einem Spektrometer geführt, um eine zeitlich aufgelöste und spektral aufgelöste Detektion der Fluoreszenz- oder Raman-Emission des Ablationsvolumens der Probe zu ermöglichen. Unter Verwendung eines derartigen Systems kann die Hohlraumbildung in der Probe mit Durchleuchtung unter Verwendung des Blitzlichts 1011 zu einem Zeitpunkt t nach dem/den Ablationslaserpuls(en) abgebildet werden, und nach der Anregung des Materials kann zu einem späteren Zeitpunkt t' die Fluoreszenz abgebildet werden. Zeitauflösung kann somit auch durch Verwendung der unterschiedlichen Lichtquellen für Durchleuchtung und Fluoreszenz erreicht werden. Unter Bezugnahme auf 22 wird das Epi-Signal (Epifluoreszenz- und/oder Raman-Signal) vom Laserfokus 1009 durch einen Teiler zu einem schnellen Photodetektor (z. B. einem Arrayphotodetektor) gerichtet, der mit einem Spektrometer kombiniert ist, um eine zeitlich aufgelöste und spektral aufgelöste Detektion des Fluoreszenzspektrums oder Raman-Spektrums, z. B. I(λ), zu ermöglichen.
  • Das detektierte Epifluoreszenzsignal oder -bild ist vorzugsweise zeitlich aufgelöst und kann dazu verwendet werden, Hohlraumeigenschaften und Informationen über molekulare Fragmentierung in der Probe bereitzustellen, d. h. in der Fokusposition der Objektivlinse. Die Detektion eines Fluoreszenzrückgangs kann auf das Auftreten einer Molekülfragmentierung hinweisen, z. B. wenn die Pulsenergie des Ablationslasers zu hoch ist. In einer Ausführungsform wird dann der nächste Ablationslaserpuls mit geringerer Energie angelegt. Die quantitative Fluoreszenzintensitätsanalyse ermöglicht das Abschätzen der Übertragungseffizienz von ablatiertem Material zum Analysator, z. B. Massenspektrometer. Die Analyse der Vibrations-/Rotationsbanden des Raman-Signals andererseits gibt Aufschluss über die erwarteten Massen der Moleküle, die zum Beispiel zum Analysator (z. B. Massenspektrometer) gesendet werden, während die Intensitätsverteilung der Vibrations-/Rotationsbanden den thermischen Zustand (innere Energie) der Moleküle angibt. Die Raman-Peak-Intensität kann mit der Peak-Intensität der durch das Massenspektrometer detektierten Moleküle korreliert werden.
  • 23 zeigt, wie die Kalibrierung des Ablationsparameters, der Ablationslaserpulsenergie E0, durchgeführt werden kann. Die Pulsenergie Eo und die Probenhöhe vom Objektiv ΔZ2 bestimmen, ob der Hohlraum die Probe/Atmosphäre-Grenzfläche passieren und eine Ablationsfahne bilden kann. Bei einer Schwellenpulsenergie Emax denaturieren, d. h. fragmentieren, ablatierte Moleküle, was als Fluoreszenzrückgang detektiert wird. Damit muss die Pulsenergie EΔZ2 abgesenkt werden, wenn die effektive Pulsenergie E0>Emax. Der Wert Δz2 kann durch Verdunstung abgesenkt werden. Dies kann jedoch einige Zeit in Anspruch nehmen. Optional oder zusätzlich kann die ΔAbsenkung z3 aufgrund der cos2-Divergenz der Fahnenkonzentration verwendet werden. Die Änderung des Signals D am Detektor 1012 ist eine Funktion H(t). In einer Ausführungsform, wie in Graph (i) gezeigt, wird die Pulsenergie Eo pro Puls und/oder die Pulsfrequenz erhöht, bis das Detektionssignal D (H(t)), wie in Graph (ii) gezeigt, eine Ausdehnung des Hohlraums zum Zeitpunkt t' angibt. Die Zeit t' ist abhängig von der Schallgeschwindigkeit und von ΔZ3. Aus t'-t'' kann die axiale Höhe der Fahne ermittelt werden, die die Grenzfläche Medium/Luft passiert. Wie in Graph (iii) gezeigt, misst der Referenzstrahl F3 (Ht) die genaue Position des Übergangs (Grenzfläche) vom Medium zur Atmosphäre und die Teilchen in der Atmosphäre, die sich in Richtung des Empfängers ausbreiten, der zum Beispiel ein Ionisationsmodul des Massenspektrometers sein kann. Das in Grafik (iv) dargestellte (zeitlich) aufgelöste Epifluoreszenzsignal stellt Informationen über die Hohlraumcharakteristik und die Molekülfragmentierung an der Fokusposition der Objektivlinse bereit.
  • Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass die optische Anordnung in Ausführungsformen eine Laserfokusdetektionseinheit enthält, wobei die Laserfokusdetektionseinheit Folgendes enthält: mindestens einen Referenzlaser, wobei der mindestens eine Referenzlaser auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet und dazu konfiguriert ist, Laserlicht durch das Objektiv, durch den Probentisch und in die Probe zu richten, wobei die Laserfokusdetektionseinheit ferner mindestens einen Photodetektor enthält, wobei der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, mindestens ein Detektionssignal zu generieren, indem Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser generiert wird, der eine oder mehrere Eigenschaften der Probe angibt, während mindestens ein Abschnitt davon ablatiert wird, und/oder einen Abstand vom Objektiv zum Probentisch angibt und/oder einen Abstand vom Objektiv zu einer Oberfläche der Probe angibt. In Ausführungsformen ist die Laserfokusdetektionseinheit ferner dazu konfiguriert, das mindestens eine Detektionssignal an eine Steuerung zu senden, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers und/oder eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal dynamisch zu steuern. Der Steuerung kann die Steuerung 140 oder die vorstehend beschriebene Steuerung 2050 oder eine ähnliche Steuerung sein. Im Allgemeinen umfasst der Steuerung einen Mikrocontroller und ein FPGA- oder Computersystem und ist mit einer oder mehreren der anderen Komponenten des Systems kommunikativ gekoppelt, um Steuerung und/oder Rückmeldung des Systems bereitzustellen, wie weiter unten beschrieben. Die Steuerung ist mit der Laserfokusdetektionseinheit kommunikativ gekoppelt, um das eine oder die mehreren Detektionssignale zu empfangen. In einer Ausführungsform ist die Steuerung mit dem Objektiv kommunikativ gekoppelt (z. B. über einen Antrieb, um die Objektivposition in den z-Achsenrichtungen zu steuern). In einer Ausführungsform ist die Steuerung auch mit dem Empfängertisch kommunikativ gekoppelt (z. B. über einen Antrieb, um die Empfängerposition in der x-, y- und/oder z-Achsenrichtung zu steuern). In einer Ausführungsform ist die Steuerung auch kommunikativ mit dem Ablationslaser gekoppelt (z. B. um die Laserpulsenergie und/oder Pulsfrequenz zu steuern).
  • Die Steuerung kann einen oder mehrere Prozessoren, Speicher (z. B. auf einem oder mehreren Hardwarespeichervorrichtungen) und ein Kommunikationsmodul zum Steuern des Sendens und Empfangens von Daten zwischen der Steuerung und den verschiedenen Komponenten des Systems, mit dem die Steuerung gekoppelt ist, enthalten. Die Steuerung kann auch Eingabe-/Ausgabehardware enthalten, wie sie in der Technik bekannt ist, um Eingaben von einem Benutzer zu empfangen und/oder um einem Benutzer Informationen anzuzeigen.
  • Die beschriebene Vorrichtung und das beschriebene System können dazu verwendet werden, ein Mittel zur kontinuierlichen oder Echtzeit-Abstimmung oder -Steuerung des Ablationsprozesses bereitzustellen, insbesondere der Laserpulsenergie, Pulsfrequenz und/oder Laserfokusposition in der Probe. In einer Ausführungsform ist die Steuerung dazu konfiguriert, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers und/oder eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal von der FDU dynamisch zu steuern. In einer Ausführungsform ist die Steuerung dazu konfiguriert, eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal kontinuierlich abzustimmen. Somit bildet das mindestens eine Detektionssignal von der FDU die Grundlage eines Regelkreises zur kontinuierlichen Echtzeitsteuerung des Ablationsprozesses.
  • In einer Ausführungsform wird, basierend auf ΔZ1 (und ZΔ2), der durch die FDU gemessene axiale (z) Abstand zwischen Objektiv und Probentisch kontinuierlich, d. h. mit hoher Frequenz und in Echtzeit, abgestimmt, während der Laserfokus innerhalb der Probe bewegt wird. Die Abstimmung der axialen Position des Objektivs kann über einen beweglichen Antrieb/Aktuator erreicht werden, der als Reaktion auf die Rückmeldung an ΔZ1 (und ΔZ2) durch die Steuerung gesteuert wird. Basierend auf ΔZ1 und ΔZ2 wird der Abstand zwischen dem Laserfokus und dem Empfänger bzw. zwischen der Probenoberfläche und dem Empfänger kontinuierlich korrigiert. Die Abstimmung der axialen Position des Empfängers kann über einen beweglichen Empfängertisch erreicht werden, der durch die Steuerung als Reaktion auf die Rückmeldung an ΔZ1 und ΔZ2 gesteuert wird.
  • In einer Ausführungsform wird vorzugsweise das Detektionssignal vom schnellen Photodetektor, der den übertragenen Referenzstrahl B'' detektiert, und/oder das Detektionssignal vom schnellen Photodetektor, der den Referenzstrahl F2 entlang der optischen Achse des Objektivs detektiert, dazu verwendet, die Anzahl von Pulsen in der Pulsfolge (Pulsfrequenz) des Ablationslasers zu steuern, um sicherzustellen, dass der laserinduzierte Hohlraum durch das Probenmedium geführt wird. Die Pulszahl und die Pulsintensität können jeweils Regelkreisparameter sein. Die Interferenz im Detektionssignal von dem schnellen Photodetektor, der den Referenzstrahl F2 detektiert, wird dazu verwendet, die relative Wanderung des Hohlraums in der axialen (z-) Richtung zu überwachen.
  • In einer Ausführungsform wird das Detektionssignal (D) von dem schnellen Photodetektor, der den übertragenen Referenzstrahl B'' detektiert, vorzugsweise dazu verwendet, die Pulsenergie des Ablationslasers zu steuern. Darüber hinaus kann das Fluoreszenz-/Raman-Signal auch oder alternativ eine Überwachung und Steuerung der Fragmentierung von Molekülen in der Probe durch entsprechende Steuerung der Laserleistung ermöglichen.
  • In einer Ausführungsform ermöglicht die Momentaufnahme-Epifluoreszenzbildgebung die Interpretation von Fahnenbildung und Wärmedetektion. Auf diese Weise können die ablatierte Region von Interesse (ROI), die Laserleistung und/oder die Eigenschaften der Pulsfolge entsprechend angepasst werden.
  • In einer Ausführungsform ist die Steuerung mit einem Massenspektrometer kommunikativ gekoppelt, das den ablatierten Abschnitt der Probe analysiert, derart, dass einer oder mehrere der Steuerparameter des von der Steuerung gesteuerten Systems mit dem Massenspektrometersignal verknüpft sind. Die Korrelation der Beobachtungsgrößen der FDU mit dem MS-Signal ermöglicht eine qualitative Korrektur der Reaktion des Massenspektrometers. Die Momentaufnahmebildgebung des Massenspektrometersignals ermöglicht es, das Massenspektrometersignal für die MS-Detektion konstant zu halten.
  • Unter Bezugnahme auf 24 ist dort ein Flussdiagramm eines Prozesses zur Echtzeitoptimierung von Steuerparametern der Abbildungs-/Ablationsvorrichtung gezeigt.
  • Unter Verwendung der beschriebenen Bildgebungsfähigkeit wird bei Schritt 4010 eine Region von Interesse ROI in der Probe ausgewählt, die auf dem Probentisch mit x-, y-, z-Koordinaten positioniert ist. Bei Schritt 4020 wird durch die Vorrichtung ein Mindestabstand vom Probentisch zum Empfänger eingestellt, der sicherstellt, dass zwischen dem Empfänger und der Probe kein Kontakt besteht. Bei Schritt 4030 kann unter Verwendung der beschriebenen Triangulationsverfahren unter Verwendung der Fokusdetektionseinheit (FDU) für ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3, die Dicke des Probenmediums über dem Probentisch gemessen werden und durch Rückmeldung in der Schleife mit der Steuerung kann der Abstand vom Probenmedium zum Empfänger während der Massenspektrometermessung konstant gehalten werden, um zum Beispiel Kondensations- oder Verdunstungseinflüsse auf die Probe zu kompensieren. Bei Schritt 4040 wird die Fokusposition der Objektivlinse zusammen mit dem Abstand von dem Probenmedium zu dem Empfänger kontinuierlich korrigiert.
  • Der Ablationslaserpuls wird bei Schritt 4050 mit der Energie Eo angelegt. Das Signal des übertragenen Referenz-FDU-Laserstrahls F1 (B'') am schnellen Photodetektor wird dann zusammen mit dem Interferenzsignal des reflektierten FDU-Laserstrahls F2 bei Schritt 4060 überwacht. Aus diesen Signalen wird bestimmt, ob die Ablationsfahne die Grenzfläche der Probe mit der Atmosphäre passiert hat oder nicht. Bei „Nein‟ wird der Schritt 4050 mit einer auf E0,i+1 = E0+ΔE abgestimmten Ablationslaserpulsenergie wiederholt. Bei „Ja‟ wird in Schritt 4070 ein Bild mit der Durchlichtquelle zur Verzögerungszeit t' aufgenommen, nachdem der Ablationspuls und/oder die Fluoreszenzemission und/oder ein Raman-Signal gemessen wurde. Unterdessen wird bei Schritt 4080 eine Massenspektrometermessung von ablatiertem Material erfasst, das über den Empfänger in das Massenspektrometer eingeführt wird. Die Intensität der Fluoreszenzemission wird in Schritt 4090 mit der Bildgebung verglichen, um zu prüfen, ob der Grad der Fragmentierung der Moleküle in der Probe durch den Laserpuls ein akzeptables Niveau hat. Bei „Nein‟ werden ΔZ3 und die Laserpulsenergie Eo abgesenkt, oder es wird eine neue Fokusposition und/oder ROI gewählt. Bei „Ja‟ werden bei Schritt 4100 Massenspektrometermessungen von ablatiertem Probenmaterial für die vollständige ROI erfasst. Die Daten aus den Schritten 4060, 4070, 4080 und 4100 sorgen bei Schritt 4200 für eine quantitative Interpretation der Überführung von Molekülen aus der Probe, die mit dem Massenspektrometer detektiert wurden, unter Verwendung von Eingabeparametern wie etwa Hohlraumvolumen und Fluoreszenzsignal.
  • Computer-/Steuerungssysteme
  • Es versteht sich, dass Computersysteme zunehmend eine große Vielzahl von Formen annehmen. In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen sind die Begriffe „Steuerung“, „Computersystem“ oder „Rechensystem“ weitgefasst definiert und enthalten jede Vorrichtung oder jedes System - oder Kombinationen davon - die/das mindestens einen physischen und materiellen Prozessor und einen physischen und materieller Speicher enthält, der dazu geeignet ist, dass sich computerausführbare Anweisungen darauf befinden, die von einem Prozessor ausgeführt werden können. Beispielhaft und nicht einschränkend soll der hierin verwendete Begriff „Computersystem“ oder „Rechensystem“ Personalcomputer, Desktop-Computer, Laptop-Computer, Tablets, Handgeräte (z. B. Mobiltelefone, PDAs, Pager), mikroprozessorbasierte oder programmierbare Unterhaltungselektronik, Minicomputer, Mainframe-Computer, Mehrprozessorsysteme, Netzwerk-PCs, dezentrale Rechensysteme, Rechenzentren, Nachrichtenprozessoren, Router, Switches und sogar Vorrichtungen, die herkömmlicherweise nicht als Rechensystem betrachtet wurden, wie etwa Wearables (z. B. eine Brille) enthalten.
  • Der Speicher kann jede Form annehmen und kann von der Art und Form des Rechensystems abhängig sein. Der Speicher kann ein physischer Systemspeicher sein, der einen flüchtigen Speicher, einen nichtflüchtigen Speicher oder eine Kombination der beiden enthält. Der Begriff „Speicher“ kann hierin auch dazu verwendet werden, sich auf einen nichtflüchtigen Massenspeicher, wie etwa physische Speichermedien, zu beziehen.
  • Auf dem Rechensystem befinden sich auch mehrere Strukturen, die oft als „ausführbare Komponente“ bezeichnet werden. Zum Beispiel kann der Speicher eines Rechensystems eine ausführbare Komponente enthalten. Der Begriff „ausführbare Komponente“ ist die Bezeichnung für eine Struktur, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Datenverarbeitung als eine Struktur bekannt ist, die Software, Hardware oder eine Kombination davon sein kann.
  • Bei einer Implementierung in Software würde beispielsweise ein Durchschnittsfachmann verstehen, dass die Struktur einer ausführbaren Komponente Softwareobjekte, Routinen, Verfahren usw. enthalten kann, die von einem oder mehreren Prozessoren auf dem Rechensystem ausgeführt werden können, gleich ob eine derartige ausführbare Komponente im Heap eines Rechensystems vorhanden ist, oder ob die ausführbare Komponente auf computerlesbaren Speichermedien vorhanden ist. Die Struktur der ausführbaren Komponente ist auf einem computerlesbaren Medium in einer solchen Form vorhanden, dass sie, wenn sie von einem oder mehreren Prozessoren des Rechensystems ausgeführt wird, das Rechensystem veranlassen kann, eine oder mehrere Funktionen, wie die hierin beschriebenen Funktionen und Verfahren, auszuführen. Eine derartige Struktur kann direkt durch einen Prozessor computerlesbar sein - wie es der Fall ist, wenn die ausführbare Komponente eine Binärdatei wäre. Alternativ kann die Struktur so strukturiert sein, dass sie interpretierbar und/oder kompiliert ist - ob in einer einzelnen Stufe oder in mehreren Stufen - um eine derartige Binärdatei zu generieren, die direkt von einem Prozessor interpretierbar ist.
  • Der Begriff „ausführbare Komponente“ wird von einem Durchschnittsfachmann auch so verstanden, dass er Strukturen enthält, die ausschließlich oder nahezu ausschließlich in Hardware-Logikkomponenten implementiert sind, wie etwa innerhalb eines feldprogrammierbaren Gate-Arrays (FPGA), einer anwendungsspezifischen integrierten Schaltung (ASIC), programmspezifischen Standardprodukten (ASSPs), System-on-a-Chip-Systemen (SOCs), komplexen programmierbaren Logikbausteinen (CPLDs) oder jeder anderen spezialisierten Schaltung. Dementsprechend ist der Begriff „ausführbare Komponente“ ein Begriff für eine Struktur, die von Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Datenverarbeitung gut verstanden wird, gleich ob sie in Software, Hardware oder einer Kombination davon implementiert ist.
  • In dieser Beschreibung können auch die Begriffe „Komponente“, „Dienst“, „Motor“, „Modul“, „Steuerung“, „Generator“ oder dergleichen verwendet werden. Wie in dieser Beschreibung und in diesem Fall verwendet, sind diese Begriffe - gleich ob mit oder ohne eine modifizierende Klausel ausgedrückt - auch als Synonyme des Begriffs „ausführbare Komponente“ zu verstehen und weisen somit auch eine Struktur auf, die von Durchschnittsfachleuten in der Datenverarbeitungstechnik gut verstanden wird.
  • Während nicht alle Rechensysteme eine Benutzerschnittstelle erfordern, enthält ein Rechensystem in einigen Ausführungsformen eine Benutzerschnittstelle zur Verwendung beim Kommunizieren von Informationen von/zu einem Benutzer. Die Benutzerschnittstelle kann sowohl Ausgabemechanismen als auch Eingabemechanismen enthalten. Die hierin beschriebenen Prinzipien sind nicht auf die genauen Ausgabe- oder Eingabemechanismen beschränkt, da diese von der Art der Vorrichtung abhängen. Die Ausgabemechanismen können jedoch beispielsweise Lautsprecher, Anzeigen, taktile Ausgabe, Vorsprünge, Hologramme und so weiter beinhalten. Beispiele für Eingabemechanismen können beispielsweise Mikrofone, berührungsempfindliche Bildschirme, Projektionen, Hologramme, Kameras, Tastaturen, Stifte, Mäuse oder andere Zeigereingaben, Sensoren aller Typen und so weiter beinhalten.
  • Dementsprechend können die hierin beschriebenen Ausführungsformen ein Spezial- oder Allzweck-Rechensystem umfassen oder nutzen. Die hierin beschriebenen Ausführungsformen enthalten auch physische und andere computerlesbare Medien zum Tragen oder Speichern von computerausführbaren Anweisungen und/oder Datenstrukturen ein. Solche computerlesbaren Medien können alle verfügbaren Medien sein, auf die ein allgemeines oder spezielles Rechensystem zugreifen kann. Derartige computerlesbare Medien können beliebige verfügbare Medien sein, auf die von einem Universal- oder Spezialrechensystem zugegriffen werden kann. Computerlesbare Medien, die computerausführbare Anweisungen tragen, sind Übertragungsmedien. So können die hierin offenbarten oder angedachten Ausführungsformen mindestens zwei deutlich unterschiedliche Arten von computerlesbaren Medien umfassen: Speichermedien und Übertragungsmedien.
  • Die computerlesbaren Speichermedien enthalten RAM, ROM, EEPROM, Festkörperlaufwerke („SSDs“), Flash-Speicher, Phase-Change-Speicher („PCM“), CD-ROM oder andere optische Plattenspeicher, Magnetplattenspeicher oder andere magnetische Speichervorrichtungen oder jedes andere physische und greifbare Speichermedium, das verwendet werden kann, um den gewünschten Programmcode in Form von computerausführbaren Anweisungen oder Datenstrukturen zu speichern, und auf das ein allgemeines oder spezielles Rechensystem zugreifen und es ausführen kann, um die offenbarte Funktionalität der Erfindung zu implementieren. Beispielsweise können computerausführbare Anweisungen auf einem oder mehreren computerlesbaren Speichermedien verkörpert werden, um ein Computerprogrammprodukt zu bilden.
  • Übertragungsmedien können ein Netzwerk und/oder Datenverbindungen enthalten, die dazu verwendet werden können, gewünschten Programmcode in Form von computerausführbaren Anweisungen oder Datenstrukturen zu transportieren, und auf die ein Universal- oder Spezialrechensystem zugreifen und sie ausführen kann. Kombinationen des Vorstehenden sollten ebenfalls im Umfang der computerlesbaren Medien enthalten sein.
  • Ferner kann der Programmcode in Form von computerausführbaren Anweisungen oder Datenstrukturen automatisch von den Übertragungsmedien auf die Speichermedien (oder umgekehrt) übertragen werden, wenn er verschiedene Komponenten des Rechensystems erreicht. Beispielsweise können computerausführbare Anweisungen oder Datenstrukturen, die über ein Netzwerk oder eine Datenverbindung empfangen werden, im RAM eines Netzwerkschnittstellenmoduls (z. B. einer „NIC“) gepuffert werden und dann schließlich in den RAM des Rechensystems und/oder auf weniger flüchtige Speichermedien in einem Rechensystem übertragen werden. Es ist also verständlich, dass Speichermedien in Komponenten von Rechensystemen beinhaltet werden können, die auch - oder sogar hauptsächlich - Übertragungsmedien verwenden.
  • Fachleute wissen ferner, dass ein Rechensystem auch Kommunikationskanäle enthalten kann, die es dem Rechensystem ermöglichen, mit anderen Rechensystemen zu kommunizieren, beispielsweise über ein Netzwerk. Dementsprechend können die hierin beschriebenen Verfahren in Netzwerk-Datenverarbeitungsumgebungen mit vielen Arten von Rechensystemen und Rechensystemkonfigurationen praktiziert werden. Die offenbarten Verfahren können auch in dezentralen Systemumgebungen praktiziert werden, in denen lokale und/oder entfernte Rechensysteme, die über ein Netzwerk (entweder durch festverdrahtete Datenverbindungen, drahtlose Datenverbindungen oder durch eine Kombination aus festverdrahteten und drahtlosen Datenverbindungen) verbunden sind, Aufgaben ausführen. In einer verteilten Systemumgebung können auch die Verarbeitungs-, Speicher- und/oder Ablagemöglichkeiten verteilt sein. Fachleute verstehen auch, dass die offenbarten Verfahren in einer Cloud-Computing-Umgebung durchgeführt werden können. Cloud-Computing-Umgebungen können verteilt sein, dies ist jedoch nicht erforderlich. Wenn sie verteilt sind, können Cloud-Computing-Umgebungen international innerhalb einer Organisation verteilt sein und/oder Komponenten enthalten, die in mehreren Organisationen vorhanden sind. In dieser Beschreibung und den folgenden Ansprüchen wird „Cloud-Computing“ als ein Modell für den bedarfsgerechten Netzzugang zu einem gemeinsamen Pool konfigurierbarer Rechenressourcen (z. B. Netzwerke, Server, Speicher, Anwendungen und Dienste) definiert. Die Definition von „Cloud-Computing“ beschränkt sich nicht auf die zahlreichen anderen Vorteile, die sich aus einem solchen Modell ergeben, wenn es richtig eingesetzt wird.
  • Ein Cloud-Computing-Modell kann sich aus verschiedenen Merkmalen zusammensetzen, wie z. B. On-Demand-Selbstbedienung, breiter Netzwerkzugriff, Ressourcen-Pooling, schnelle Elastizität, gemessener Dienst und so weiter. Ein Cloud-Computing-Modell kann auch in Form verschiedener Dienstmodelle angeboten werden, wie beispielsweise Software as a Service („SaaS“), Platform as a Service („PaaS“) und Infrastructure as a Service („IaaS“). Das Cloud-Computing-Modell kann auch über unterschiedliche Bereitstellungsmodelle wie Private Cloud, Community Cloud, Public Cloud, Hybrid Cloud usw. bereitgestellt werden.
  • Gekürzte Liste der definierten Begriffe
  • Zum besseren Verständnis des Umfangs und des Inhalts dieser schriftlichen Beschreibung und der beigefügten Ansprüche werden einige ausgewählte Begriffe direkt nachstehend definiert. Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Bereich, auf den sich die vorliegende Offenbarung bezieht, verstanden werden.
  • Die Begriffe „ungefähr“, „etwa“ und „im Wesentlichen“, wie hierin verwendet, stehen für eine Menge oder einen Zustand, der nahe an der angegebenen Menge oder dem angegebenen Zustand liegt und dennoch eine gewünschte Funktion erfüllt oder ein gewünschtes Ergebnis erzielt. Zum Beispiel können sich die Begriffe „ungefähr“, „etwa“ und „im Wesentlichen“ auf eine Menge oder eine Bedingung beziehen, die um weniger als 10 % oder um weniger als 5 % oder um weniger als 1 % oder um weniger als 0,1 % oder um weniger als 0,01 % von einer speziell angegebenen Menge oder Bedingung abweicht.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Ablation“ auf die selektive Anwendung von Energie auf eine Zielregion, um Biomoleküle innerhalb der Zielregion von umgebenden Strukturen zu befreien. Die ablatierten Materialien bilden typischerweise eine Material-„Fahne“, die von der Ausgangsposition der Zielregion weg wandert.
  • Der Begriff „Region von Interesse“, wie er hierin verwendet wird, soll als jede Region innerhalb eines Sichtfelds einer Abbildungs-/Ablationsvorrichtung verstanden werden, in der sich ein oder mehrere Biomoleküle befinden, die gesammelt, verarbeitet und/oder analysiert werden sollen. Die Region von Interesse kann das gesamte Sichtfeld enthalten, ist aber typischerweise ein Abschnitt des Sichtfelds und kann zum Beispiel eine Zelle oder eine Ansammlung von Zellen, eine intra/subzelluläre Region wie etwa eine Organelle innerhalb einer Zelle oder eine extrazelluläre Region darin sein.
  • Der Begriff „Teilprobe“, wie er hierin verwendet wird, soll sich auf die einzelnen Abschnitte von ablatiertem Material beziehen, die räumlich und/oder zeitlich voneinander getrennt sind, wie etwa indem sie auf dem Empfänger räumlich voneinander getrennt sind und/oder vom Empfänger zu unterschiedlichen Zeiten von unterschiedlichen Ablationsereignissen empfangen werden. Der Begriff „Teilprobe“ soll daher die getrennten Abschnitte des gesammelten ablatierten Materials von der größeren Gesamt-„Probe“ unterscheiden, die auf dem Objektträger/Tisch positioniert ist, die abgebildet und selektiv ablatiert werden kann.
  • Verschiedene Aspekte der vorliegenden Offenbarung, einschließlich Vorrichtungen, Systeme und Verfahren, können in Bezug auf eine oder mehrere Ausführungsformen oder Implementierungen, die ihrer Art nach beispielhaft sind, veranschaulicht werden. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „beispielhaft“ „als Beispiel, Fall oder Veranschaulichung dienend“ und sollte nicht notwendigerweise als bevorzugt oder vorteilhaft gegenüber anderen hierin offenbarten Ausführungsformen ausgelegt werden. Darüber hinaus enthält die Bezugnahme auf eine „Implementierung“ der vorliegenden Offenbarung oder Erfindung eine spezifische Bezugnahme auf eine oder mehrere Ausführungsformen davon, und umgekehrt, und soll veranschaulichende Beispiele bereitstellen, ohne den Umfang der Erfindung einzuschränken, der durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die nachfolgende Beschreibung angegeben ist.
  • Wie in der Patentschrift verwendet, schließt ein im Singular verwendetes Wort auch dessen Plural-Gegenstück ein und ein im Plural verwendetes Wort schließt auch dessen Singular-Gegenstück ein, sofern das nicht anderweitig implizit oder explizit verständlich gemacht oder angegeben wird. Es wird daher darauf hingewiesen, dass die in dieser Patentschrift und den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singularformen „ein“, „eine“, „ein“ und „der“, „die“, „das“ den Plural enthalten, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Zum Beispiel enthält die Bezugnahme auf einen Referenten im Singular (z. B. „ein Widget“) einen, zwei oder mehr Referenten, sofern nicht implizit oder explizit anders verstanden oder angegeben. Auf ähnliche Weise sollte die Bezugnahme auf mehrere Referenten so interpretiert werden, dass sie einen einzelnen Referenten und/oder mehrere Referenten umfasst, es sei denn, der Inhalt und/oder Kontext schreiben eindeutig etwas anderes vor. Zum Beispiel erfordert die Bezugnahme auf Referenten in der Pluralform (z. B. „Widgets“) nicht notwendigerweise mehrere derartiger Referenten. Stattdessen versteht es sich, dass unabhängig von der gefolgerten Anzahl von Referenten, sofern nicht anders angegeben, hierin ein oder mehrere Referenten in Betracht gezogen werden.
  • Wie hierin verwendet, werden Richtungsbegriffe wie „oben“, „unten“, „links“, „rechts“, „nach oben“, „nach unten“, „oberhalb“, „unterhalb“, „proximal“, „distal“, „angrenzend“ und dergleichen hierin nur zur Angabe relativer Richtungen verwendet, und sollen nicht den Umfang der Offenbarung und/oder der beanspruchten Erfindung anderweitig einschränken.
  • Schlussfolgerung
  • Die hierin verwendeten Begriffe und Ausdrücke dienen der Beschreibung und nicht der Einschränkung, und es ist nicht beabsichtigt, durch die Verwendung dieser Begriffe und Ausdrücke Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Abschnitte davon auszuschließen, aber es wird anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen im Rahmen der beanspruchten Erfindung möglich sind. Obwohl die vorliegende Erfindung teilweise durch bevorzugte Ausführungsformen, beispielhafte Ausführungsformen und optionale Merkmale offenbart wurde, können Fachleute auf Modifizierungen und Variationen der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen, und solche Modifizierungen und Variationen werden als innerhalb des durch die beigefügten Ansprüche definierten Umfangs dieser Erfindung betrachtet. Die hierin veranschaulichten Ausführungsformen sind Beispiele für nützliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, und verschiedene Abänderungen und/oder Modifizierungen der hierin veranschaulichten erfinderischen Merkmale sowie zusätzliche Anwendungen der hierin veranschaulichten Prinzipien, die einem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet und im Besitz dieser Offenbarung einfallen würden, können an den veranschaulichten Ausführungsformen vorgenommen werden, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, wie er durch die Ansprüche definiert ist, abzuweichen, und sind im Rahmen dieser Offenbarung zu betrachten.
  • Es versteht sich auch, dass Systeme, Vorrichtungen, Produkte, Bausätze, Verfahren und/oder Prozesse, die bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung entsprechen, Eigenschaften oder Merkmale (z. B. Komponenten, Bauteile, Elemente, Teile und/oder Abschnitte) enthalten, einbeziehen oder anderweitig enthalten können, die in anderen hierin offenbarten und/oder beschriebenen Ausführungsformen beschrieben sind. Dementsprechend können die verschiedenen Merkmale bestimmter Ausführungsformen mit anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung kompatibel, mit ihnen kombiniert, in ihnen enthalten und/oder in sie integriert sein. Daher sollte die Offenbarung bestimmter Merkmale in Bezug auf eine bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung nicht so ausgelegt werden, dass die Anwendung oder die Einbeziehung dieser Merkmale auf die bestimmte Ausführungsform beschränkt wird. Vielmehr versteht es sich, dass auch andere Ausführungsformen die genannten Merkmale, Bauteile, Elemente, Teile und/oder Abschnitte enthalten können, ohne notwendigerweise vom Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen.
  • Darüber hinaus kann jedes hierin enthaltene Merkmal mit jedem anderen Merkmal derselben oder einer anderen hierin offenbarten Ausführungsform kombiniert werden, es sei denn, ein Merkmal wird so beschrieben, dass es ein anderes Merkmal in Kombination mit diesem erfordert. Darüber hinaus werden verschiedene bekannte Aspekte von veranschaulichenden Systemen, Verfahren, Einrichtungen und dergleichen hierin nicht besonders ausführlich beschrieben, um ein Verschleiern von Aspekten der beispielhaften Ausführungsformen zu vermeiden. Derartige Aspekte werden hierin jedoch auch in Betracht gezogen.
  • Alle in dieser Anmeldung zitierten Verweise werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen, soweit sie nicht zu der Offenbarung in dieser Anmeldung im Widerspruch stehen. Für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ist offensichtlich, dass andere Verfahren, Vorrichtungen, Vorrichtungselemente, Materialien, Prozeduren und Techniken als die hierin speziell beschriebenen auf die Praxis der Erfindung, wie sie hierin weitgefasst offenbart ist, ohne übermäßigen Versuchsaufwand angewendet werden können. Alle im Stand der Technik bekannten funktionellen Äquivalente von Verfahren, Vorrichtungen, Vorrichtungselementen, Materialien, Prozeduren und Techniken, die hierin speziell beschrieben sind, sollen in dieser Erfindung eingeschlossen sein.
  • Wenn hierin eine Gruppe von Materialien, Zusammensetzungen, Komponenten oder Verbindungen offenbart wird, versteht es sich, dass alle einzelnen Mitglieder dieser Gruppen und alle Untergruppen davon separat offenbart werden. Wenn hierin eine Markush-Gruppe oder eine andere Gruppierung verwendet wird, sollen alle einzelnen Mitglieder der Gruppe und alle möglichen Kombinationen und Unterkombinationen der Gruppe einzeln in der Offenbarung enthalten sein. Jede hierin beschriebene oder beispielhaft dargestellte Formulierung oder Kombination von Komponenten kann dazu verwendet werden, die Erfindung in die Praxis umzusetzen, sofern nicht anders angegeben. Immer wenn in der Patentschrift ein Bereich angegeben ist, zum Beispiel ein Temperaturbereich, ein Zeitbereich oder ein Zusammensetzungsbereich, sollen alle Zwischenbereiche und Unterbereiche sowie alle in den angegebenen Bereichen enthaltenen Einzelwerte in der Offenbarung enthalten sein.
  • Alle Änderungen, die in die Bedeutung und in den Äquivalenzbereich der Ansprüche fallen, sind in ihren Umfang einzubeziehen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2021/104855 A1 [0005]
    • US 2021/0118661 A1 [0005]
    • US 2015/0018807 A1 [0005]
    • US 8199321 B2 [0005]
    • WO 2014/079802 A2 [0005]

Claims (28)

  1. Vorrichtung zur Abbildung und Ablation einer Probe, die eine Analyse eines ablatierten Abschnitts der Probe ermöglicht, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: einen Probentisch mit einer ersten Seite, die zum Platzieren einer Probe darauf konfiguriert ist, und einer zweiten Seite, die gegenüber der ersten Seite angeordnet ist; eine optische Anordnung mit einem Objektiv, wobei das Objektiv auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet und dazu konfiguriert ist, eine mikroskopische Bildgebung der auf dem Probentisch platzierten Probe zu ermöglichen, wobei die optische Anordnung auch einen Ablationslaser enthält, wobei der Ablationslaser auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet ist, wobei der Ablationslaser dazu konfiguriert ist, Laserlicht durch das Objektiv, durch den Probentisch und in die Probe zu richten, um selektiv mindestens einen Abschnitt der Probe zu ablatieren; und einen Empfänger, der auf der ersten Seite des Probentisches angeordnet ist, wobei der Empfänger dazu konfiguriert ist, von der Probe ausgestoßenes ablatiertes Material aufzunehmen, um eine weitere Analyse des ablatierten Materials zu ermöglichen; wobei die optische Anordnung auch eine Laserfokusdetektionseinheit enthält, wobei die Laserfokusdetektionseinheit Folgendes enthält: mindestens einen Referenzlaser, wobei der mindestens eine Referenzlaser auf der zweiten Seite des Probentisches angeordnet und dazu konfiguriert ist, Laserlicht durch das Objektiv, durch den Probentisch und in die Probe zu richten, wobei die Laserfokusdetektionseinheit ferner mindestens einen Photodetektor enthält, wobei der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, mindestens ein Detektionssignal durch Detektieren von Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser zu generieren, wobei das mindestens eine Detektionssignal eine oder mehrere Eigenschaften der Probe angibt, während mindestens ein Abschnitt davon ablatiert wird, und/oder einen Abstand von dem Objektiv zu dem Probentisch angibt und/oder einen Abstand von dem Objektiv zu einer Oberfläche der Probe angibt; wobei die Laserfokusdetektionseinheit ferner dazu konfiguriert ist, das mindestens eine Detektionssignal an eine Steuerung zu senden, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers und/oder eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers auf der Basis des mindestens einen Detektionssignals dynamisch zu steuern.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Laserfokusdetektionseinheit dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser mit einer Zeitauflösung von 1-10 Nanosekunden oder weniger zu detektieren und das mindestens eine Detektionssignal an die Steuerung zu senden.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die eine oder mehreren Eigenschaften der Probe mindestens eines der Folgenden enthalten: Bildung eines Hohlraums in der Probe, der durch das Laserlicht von dem Ablationslaser verursacht wird, Bildung einer Ablationsfahne, die durch von der Probe ausgestoßenes ablatiertes Material entsteht, und eine Änderung in der Dicke der Probe.
  4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 3, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, einen oder mehrere Parameter des Ablationslasers zu steuern, die eine Laserpulsenergie und/oder eine Laserpulsfrequenz enthalten.
  5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 4, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, eine Position des Objektivs und/oder eine Position des Empfängers basierend auf dem mindestens einen Detektionssignal kontinuierlich abzustimmen.
  6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 5, wobei der mindestens eine Photodetektor einen schnellen Photodetektor enthält, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser, das von mindestens einer Oberfläche des Probentisches oder der Probe reflektiert und/oder durch diese übertragen wurde, zu detektieren.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei der mindestens eine schnelle Photodetektor einen Photodetektor enthält, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser, das von einer Oberfläche des Probentisches reflektiert und durch das Objektiv zurück gerichtet wurde, zu detektieren.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor enthält, der dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser, das von einer dem Empfänger zugewandten Oberfläche der Probe reflektiert und durch das Objektiv zurück gerichtet wurde, zu detektieren.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Photodetektor einen Arraydetektor zur Peakdetektion enthält.
  10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis einschließlich 9, wobei der mindestens eine Photodetektor einen Photodetektor enthält, der auf der ersten Seite der Probe angeordnet ist und dazu konfiguriert ist, Laserlicht von dem mindestens einen Referenzlaser, das durch die Probe übertragen wurde, zu detektieren.
  11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 10, wobei mindestens ein Photodetektor dazu konfiguriert ist, das mindestens eine Detektionssignal mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Nanosekunde aufzulösen.
  12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 11, wobei der mindestens eine Referenzlaser mindestens einen ersten Referenzlaser umfasst, der dazu konfiguriert ist, erstes Laserlicht entlang einer von der optischen Achse des Objektivs versetzten Achse auf das Objektiv zu richten, und der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, erstes Laserlicht, das durch das Objektiv entlang einer Achse zurück reflektiert wird, die von der optischen Achse des Objektivs versetzt ist, zu detektieren.
  13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 12, wobei der mindestens eine Referenzlaser mindestens einen zweiten Referenzlaser umfasst, der dazu konfiguriert ist, zweites Laserlicht entlang der optischen Achse des Objektivs auf das Objektiv zu richten, und der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, durch das Objektiv entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiertes zweites Laserlicht zu detektieren.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der mindestens eine Photodetektor dazu konfiguriert ist, zweites Laserlicht, das entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektiert wird, das Bestandteil eines Interferometers ist, zu detektieren.
  15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das entlang der optischen Achse des Objektivs zurück reflektierte zweite Laserlicht ein Interferenzsignal von einem in der Probe durch das Laserlicht vom Ablationslaser gleichzeitig gebildeten Hohlraum bereitstellt.
  16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 15, ferner umfassend eine Lichtquelle, die auf der ersten Seite der Probe angeordnet ist, wobei die Lichtquelle zur Durchleuchtung der Probe konfiguriert ist.
  17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 16, ferner umfassend eine Fluoreszenzanregungsquelle, die für Epifluoreszenzbildgebung und/oder -analyse der Probe konfiguriert ist, wobei die Fluoreszenzanregungsquelle vorzugsweise auf der zweiten Seite der Probe angeordnet ist.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 17, ferner umfassend ein Spektrometer, das dazu konfiguriert ist, Fluoreszenz oder Raman-Emission von der Probe spektral aufzulösen und/oder zeitlich aufzulösen, wobei das Spektrometer vorzugsweise auf der zweiten Seite der Probe angeordnet ist.
  19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 18, wobei der Ablationslaser ein Femtosekundenlaser, vorzugsweise ein Laser im nahen Infrarotbereich, ist.
  20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 19, wobei der mindestens eine Referenzlaser ein Diodenlaser, vorzugsweise in Form einer photonischen integrierten Schaltung, ist.
  21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 20, wobei die optische Anordnung dazu konfiguriert ist, die Ablation einer Zielregion mit einem Durchmesser von etwa 50 µm oder weniger oder etwa 30 µm oder weniger oder etwa 10 µm oder weniger oder etwa 5 µm oder weniger oder etwa 3 µm oder weniger oder etwa 1,5 µm oder weniger oder etwa 1 µm oder weniger zu ermöglichen.
  22. System zum Ablatieren und Analysieren einer Zielregion einer Probe, wobei das System Folgendes umfasst: die Abbildungs- und Ablationsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 21; und einen Analysator, der dazu konfiguriert ist, mindestens einen Abschnitt des vom Empfänger empfangenen ablatierten Materials zu empfangen und zu analysieren.
  23. System nach Anspruch 22, wobei der Analysator eines oder mehrere von Folgendem umfasst: einer PCR-Maschine, einer Sequenziermaschine, einem optischen Spektrometer und einem Massenspektrometer.
  24. System nach Anspruch 23, wobei das Massenspektrometer als ein Flugzeit-(TOF)-Massenspektrometer, ein Orbitrap-Massenspektrometer, ein lineares Ionenfallenmassenspektrometer, ein Quadrupol-Massenspektrometer, ein Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometer, ein Magnetsektormassenspektrometer oder ein Fourier-Transformationsionenzyklotronresonanz-(FTICR)-Massenspektrometer konfiguriert ist.
  25. System nach einem der Ansprüche 22 bis einschließlich 24, ferner umfassend eine dem Analysator zugeordnete Flüssigchromatographiesäule, wobei die Flüssigchromatographiesäule dazu konfiguriert ist, das ablatierte Material vor der Lieferung an den Analysator aufzunehmen.
  26. Verfahren zur Abbildung und Ablation einer Probe, um eine Analyse eines ablatierten Abschnitts der Probe zu ermöglichen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen einer Abbildungs- und Ablationsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis einschließlich 21 und/oder eines Systems nach einem der Ansprüche 22 bis einschließlich 25; Erfassen eines Bildes der Probe; Auswählen einer Region von Interesse innerhalb der Probe; Zuführen von Laserlicht von dem Ablationslaser zu der Region von Interesse, um mindestens einen Abschnitt der Region von Interesse zu ablatieren; und Einfangen mindestens eines Abschnitts des ablatierten Materials auf dem Empfänger; optional Durchleiten mindestens eines Abschnitts des ablatierten Materials von dem Empfänger zu dem Analysator; und dynamisches Abstimmen eines oder mehrerer Parameter des Ablationslasers und/oder einer Position des Objektivs und/oder einer Position des Empfängers basierend auf mindestens einem Detektionssignal von der Laserfokusdetektionseinheit.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei mehrere Laserpulse von dem Ablationslaser auf die Probe angelegt werden und wobei Laserpulsfrequenz und/oder Laserpulsenergieniveau und/oder Laserpulstiefe über die mehreren Laserpulse dynamisch variiert werden.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 oder 27, wobei ein räumlicher Auflösungswert dazu verwendet wird, das Bild der Probe zu erfassen, und wobei das Laserlicht auf eine Tiefe fokussiert wird, gemessen von einer Oberseite der Probe, die nicht mehr als das R-fache des räumlichen Auflösungswerts beträgt, wobei R ein Wert von etwa 5 bis etwa 30 ist.
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