EP1636624A1 - Verefahren zur fluoreszenzmikroskopie - Google Patents

Verefahren zur fluoreszenzmikroskopie

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Publication number
EP1636624A1
EP1636624A1 EP04739720A EP04739720A EP1636624A1 EP 1636624 A1 EP1636624 A1 EP 1636624A1 EP 04739720 A EP04739720 A EP 04739720A EP 04739720 A EP04739720 A EP 04739720A EP 1636624 A1 EP1636624 A1 EP 1636624A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dyes
reference spectra
detection
spectra
inclusion
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04739720A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Wolleschensky
Bernhard Zimmermann
Richard Ankerhold
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of EP1636624A1 publication Critical patent/EP1636624A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices

Definitions

  • the invention relates to a method in fluorescence microscopy, in particular laser scanning microscopy.
  • the irradiated photons of a certain energy excite the dye molecules through the absorption of a photon from the ground state into an excited state.
  • This excitation is usually referred to as single-photon absorption (Fig. 1a).
  • the dye molecules excited in this way can return to the ground state in various ways.
  • fluorescence microscopy the transition with the emission of a fluorescence photon is most important.
  • the wavelength of the emitted photon is generally red-shifted due to the Stokes shift compared to the excitation radiation, so it has a longer wavelength. The Stokes shift enables the fluorescence radiation to be separated from the excitation radiation.
  • Fig. 1 b shows a multi-photon excitation
  • the fluorescent light is split off from the excitation radiation with suitable dichroic beam splitters in combination with block filters and observed separately. This makes it possible to display individual cell parts stained with different dyes. In principle, however, several parts of a preparation can also be colored simultaneously with different specific dyes (multiple fluorescence). Special dichroic beam splitters are used to differentiate the fluorescence signals emitted by the individual dyes.
  • LSM confocal laser scanning microscope
  • An LSM is essentially divided into 4 modules: light source, scan module, detection unit and microscope. These modules are described in more detail below. Reference is also made to DE19702753A1.
  • lasers with different wavelengths are used in an LSM. The choice of the excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be examined.
  • the excitation radiation is generated in the light source module.
  • Various lasers are used here (argon, argon krypton, TiSa laser).
  • the wavelengths are also selected in the light source module and the intensity of the required excitation wavelength is set, for example by using an acousto-optical crystal.
  • the laser radiation then arrives in the scan module via a fiber or a suitable mirror arrangement.
  • the laser radiation generated in the light source is focused into the specimen with the aid of the objective (2) and diffraction-limited via the scanner, the scanning optics and the tube lens.
  • the focus raster scans the sample in the x-y direction.
  • the pixel dwell times when scanning over the sample are usually in the range of less than a microsecond to a few seconds.
  • confocal detection descanned detection
  • MDB dichroic beam splitter
  • the fluorescent light is then focused on a diaphragm (confocal diaphragm / pinhole) which is located exactly in a plane conjugate to the focal plane. This suppresses fluorescent light components outside of the focus.
  • the optical resolution of the microscope can be adjusted by varying the aperture size.
  • Another dirchroic block filter (EF) is located behind the diaphragm, which again suppresses the excitation radiation.
  • the fluorescent light is measured using a point detector (PMT).
  • PMT point detector
  • the dye fluorescence is excited in a small volume at which the excitation intensity is particularly high. This area is only slightly larger than the detected area when using a confocal arrangement. The use of a confocal Aperture can thus be omitted and detection can take place directly after the lens (non-descanned detection).
  • a descanned detection still takes place, but this time the pupil of the objective is imaged in the detection unit (non-confocal descanned detection).
  • the plane (optical section) that is in the focal plane of the objective is reproduced by both detection arrangements in conjunction with the corresponding single-photon or multi-photon absorption.
  • a three-dimensional image of the sample can then be generated with the aid of a computer.
  • the LSM is therefore suitable for examining thick specimens.
  • the excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters matched to the emission properties of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
  • the spectral detection range must be restricted. The area in which the two dyes overlap is simply cut out and not detected. The efficiency of the detection unit thus deteriorates.
  • the same signal-to-noise ratio can only be achieved by increasing the excitation power, which can damage the specimen. For this reason, up to 6 different dye probes are used simultaneously at the same time, since otherwise the dyes cannot be separated due to the strongly overlapping emission bands.
  • fluorescent dyes are used for the specific labeling of the preparations
  • the fluorescence is spectrally split in the ZEISS META Laser Scanning Microscope.
  • the emission light is split off from the excitation light in the scan module or in the microscope (in the case of multi-photon absorption) using the main color splitter (MDB).
  • MDB main color splitter
  • a block diagram of the following detector unit is shown in Fig. 5.
  • the light of the sample is now focused by means of an imaging optics PO with confocal detection through an aperture (pinhole) PH, whereby fluorescence that has arisen out of focus is suppressed.
  • the aperture is omitted for undescanned detection.
  • the light is now broken down into its spectral components using an angle-dispersive element DI.
  • Prisms, gratings and acousto-optical elements come into question as angle-dispersive elements.
  • the light split by the dispersive element into its spectral components is subsequently imaged on a line detector DE.
  • This line detector DE therefore measures the emission signal as a function of the wavelength and converts it into electrical signals.
  • a line filter for suppressing the excitation wavelengths can be connected upstream of the detection unit.
  • the structure shown essentially describes a Cerny Turner structure.
  • the light L of the sample is focused with the pinhole optics PO through the confocal aperture PH.
  • this aperture can be omitted.
  • the first imaging mirror S1 collimates the fluorescent light.
  • the light hits a line grating G, for example a grating with a number of lines of 651 lines per mm.
  • the grating bends the light in different directions according to its wavelength.
  • the second imaging mirror S2 focuses the individual spectrally split wavelength components on the corresponding channels of the line detector DE.
  • the use of a line secondary electron multiplier from Hamamatsu H7260 is particularly advantageous.
  • the detector has 32 channels and a high sensitivity.
  • the free spectral range of the embodiment described above is approximately 350 nm. In this arrangement, the free spectral range is evenly distributed over the 32 channels of the line detector, resulting in an optical resolution of approximately 10 nm. This arrangement is therefore only conditionally suitable for spectroscopy. However, their use in an imaging system is advantageous since the signal per detection channel is still relatively large due to the relatively broad spectral band detected. A shift the free spectral range can also be achieved by rotating the grating, for example.
  • Another possible embodiment could involve the use of a matrix detector (e.g. a CCD).
  • the dispersive element splits into different wavelength components in a coordinate.
  • a complete line (or column) of the scanned image is imaged in the remaining direction on the matrix detector.
  • This embodiment is particularly advantageous when building a line scanner (Lit .: Code, Kino; "Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems”; Academic Press 1996).
  • the basic structure corresponds essentially to that of an LSM according to Fig. 2. However, instead A line is mapped into the focus of a point focus and the sample to be examined is only scanned in one direction.
  • a slit diaphragm is used as the confocal diaphragm instead of a pin diaphragm. Detection using a multiphoton absorption can also be carried out with this arrangement. Again, the confocal aperture can be omitted.
  • the spectral splitting of the fluorescent light enables the spectral components to be recorded separately after the fluorescence spectra of fluorescence markers have been recorded in pure form and the spectra with fluorescence components of several markers have been recorded by a “unmixing” method (DE 19915137 A1).
  • the number of fluorescent markers used for fluorescent labeling can be reduced or combinatorics can be used if not only pure fluorescence spectra are used as reference spectra but also reference spectra of mixed forms are recorded.
  • These mixed forms can, for example, be characterized by the time-dependent color state of a biological material when a fluorescent marker slowly leads to staining.
  • Such mixed states can furthermore be characterized by a mixed color when a fluorescent marker changes its color or its excitation properties.
  • Mixing ratios of this type can be generated in various ways: they can be present in the sample, they can be generated by irradiating the sample or they can be the result of a biological process that is stimulated by irradiation.
  • Mixed spectra can characterize a biological process, for example a change in concentration, a first spectrum corresponding to a lower concentration state and at least one further spectrum corresponding to a higher concentration state.
  • Image channels are defined and evaluated accordingly using the different reference spectra.
  • Such references can be generated over the entire image or advantageously via marked "regions of interest” (ROI).
  • ROI can also be used for targeted manipulation by defined irradiation.
  • a reference can be determined in a first region and in at least one In a further region, targeted irradiation and measurement can be carried out by extracting mixed spectra. The spectra can be separated and displayed after the image has been taken or during the image red colored (Lit: Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2002), An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.
  • PNAS 99/20, 12651-12656 in the detection of organic processes, for example inter- and intracellular processes and to the marrow ation of individual cells or cell populations, can be used and spectrally detected.
  • Photoconvertible dyes that dynamically change their spectra due to intracellular processes or dyes that are used for FRET but also other indicator dyes can be used advantageously by the method according to the invention.
  • different cells or cell groups can have different lengths with UV or violet
  • Color mixing ratios which are recorded as reference spectra. Different cell populations can then be recorded individually over time.
  • An area can be selected using the ROI.
  • An analysis of transport processes at cellular and subcellular level can be carried out.
  • only one dye can be used, for example
  • Irradiation or other effects are placed in different states that are clearly identifiable via reference formation.
  • ROls can be defined interactively directly in the image.
  • the selected laser is switched on and off pixel-precisely at the border of these regions.
  • the radiation parameters for changing the radiation can also be automatically integrated here
  • Dye properties through photoactivation or photoconversion lead for example, repetition rate, wavelength, intensity, position.
  • the evaluation can be done after the experiment or online during the simulation
  • the META detector makes it possible to record the entire spectrum of the emission, for example from Kaede, to spectrally separate the respective mixed forms during the measurement and to display the segregated channels.
  • 4 shows schematically how different image channels CH1-CH3 are formed, wherein, as shown, different spectral mixed distributions CH1-3 are used as references and are used for image evaluation.

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Abstract

Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere mit einem Laser-Scanning-Mikroskop, wobei eine zumindest teilweise spektral aufgelöste Detektion des Fluoreszenzspektrums erfolgt und Referenzspektren zur spektralen Entmischung herangezogen werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme der Referenzspektren von zeitlich und/oder spektral veränderlichen Farbstoffen und/oder Farbstoffkombinationen erfolgt und zur Bildauswertung dient.

Description

Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere der Laser Scanning Mikroskopie.
Stand der Technik
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: Pawley, „Handbook of biological confocal Microscopy"; Plenum Press 1995). Hierbei werden bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Geweben, Zellen oder von Zellteilen oder auch von Materialien verwendet.
Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die Farbstoffmoleküle durch die Absoption eines Photons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Diese Anregung wird meist als Einphotonen-Absorption bezeichnet (Abb. 1a). Die so angeregten Farbstoffmoleküle können auf verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des emittierten Photons ist aufgrund der Stokesverschiebung im Vergleich zur Anregungsstrahlung generell rotverschoben, besitzt also eine größere Wellenlänge. Die Stokesverschiebung ermöglicht die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.
In Abb.1 b ist eine Mehrphotonenanregung dargestellt.
Das Fluoreszenzlicht wird mit geeigneten dichroitischen Strahlteilern in Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen Farbstoffen eingefärbten Zellteilen, möglich. Grundsätzlich können jedoch auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz). Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitische Strahlteiler verwendet.
Der Stand der Technik soll im folgenden beispielhaft anhand eines konfokalen Laser- Scanning- Mikroskopes (LSM) erläutert werden (Abb. 2). Ein LSM gliedert sich im wesentlichen in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen. Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto optischen Kristalls Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs (2) beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen Sekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variiren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen. Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, daß nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellen oder Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilem (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x). Eine flexible Anpassung der Detektion und der Anregung an entsprechende neue Farbstoffeigenschaften durch den Anwender ist mit der oben beschriebenen Anordnung nicht möglich. Statt dessen müssen für jeden (neuen) Farbstoff neue dichroitische Strahlteiler und Blockfilter kreiert werden. Überlagern sich die Emissionsspektren zweier Farbstoffe, so stoßen die bisherigen Detektionseinrichtungen an ihre Grenzen. Um ein Übersprechen zwischen beiden Farbstoffen zu vermeiden, muß der spektrale Detektionsbereich eingeschränkt werden. Der Bereich in dem sich die beiden Farbstoffe überlagern wird hierzu einfach herausgeschnitten und nicht detektiert. Somit verschlechtert sich die Effizienz der Detektionseinheit. Ein gleiches Signal- zu Rauschverhältnisses kann nur durch die Erhöhung der Anregungsleistung erzielt werden, wodurch es zu einer Präparatschädigung kommen kann. Deshalb werden heutzutage maximal bis zu 6 verschiedene Farbstoffsonden simultan eingesetzt, da die Farbstoffe sonst aufgrund der sich stark überlagernden Emissionsbänder nicht getrennt werden können.
Bisher wurden Farbstoffe so modifiziert, daß sie sich entweder in ihren Absorptionseigenschaften oder in ihren Emissionseigenschaften voneinander unterscheiden. Fig 3 zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Zu erkennen ist das sich die mit 1 bis 4 bezeichneten Farbstoffe in der Lage und der Form ihrer Emissionsspektren unterscheiden. Diese Farbstoffe sind jedoch in den meisten Fällen toxisch für Lebendpräparate. Somit sind Untersuchungen zur Evolution von Zellverbänden in Lebendpräparaten unmöglich. Ende der 90 er Jahre wurden in der Natur vorkommende Farbstoffe, die sogenannten fluoreszierenden Proteine (GFP, YFP, CFP, TOPAS, GFT, RFP) entdeckt (Firma: Clonetech, USA).
In all den o.g. Systemen werden Fluoreszenzfarbstoffe zur spezifischen Markierung der Präparate eingesetzt
Im ZEISS Laser Scanning Mikroskop META wird die Fluoreszenz spektral aufgespalten. Dazu wird das Emissionslicht im Scanmodul oder im Mikroskop (bei Mehrphotonen-Absorption) mit Hilfe des Hauptfarbteilers (MDB) vom Anregungslicht abgespalten. Ein Blockschaltbild der nun folgenden Detektoreinheit ist in Abb. 5 dargestellt. Das Licht der Probe wird nun mit Hilfe von einer abbildenden Optik PO bei konfokaler Detektion durch eine Blende (Pinhole) PH fokusiert, wodurch Fluoreszenz, die außerhalb des Fokus entstand, unterdrückt wird. Bei einer nichtdescannten Detektion entfällt die Blende. Das Licht wird nun mit Hilfe eines winkeldispersiven Elements DI in seine Spektralanteile zerlegt. Als winkeldispersive Elemente kommen Prismen, Gitter und akusto optische Elemente in Frage. Das vom dispersiven Element in seine spektralen Komponenten aufgespaltete Licht wird im Anschluß auf einen Zeilendetektor DE abgebildet. Dieser Zeilendetektor DE mißt also das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge und wandelt dies in elektrische Signale um. Zusätzlich kann der Detektionseinheit noch ein Linienfilter zur Unterdrückung der Anregungswellenlängen vorgeschaltet werden.
Der dargestellte Aufbau beschreibt im wesentlichen einen Cerny Turner Aufbau. Bei einer konfokalen Detektion wird das Licht L der Probe mit der Pinholeoptik PO durch die konfokale Blende PH fokusiert. Bei einer nichtdescannten Detektion im Falle einer Mehrphotonen-Absorption kann diese Blende entfallen. Der erste abbildende Spiegel S1 kollimiert das Fluoreszenzlicht. Anschließend trifft das Licht auf ein Liniengitter G, beispielsweise ein Gitter mit einer Linienzahl von 651 Linien pro mm Das Gitter beugt das Licht entsprechend seiner Wellenlänge in verschiedene Richtungen. Der zweite abbildende Spiegel S2 fokusiert die einzelnen spektral aufgespaltenen Wellenlängenanteile auf die entsprechenden Kanäle des Zeilendetektors DE. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Zeilen- Sekundärelektronenverfielfachers der Firma Hamamatsu H7260. Der Detektor besitzt 32 Kanäle und eine hohe Empfindlichkeit. Der freie Spektralbereich der oben beschriebenen Ausführungsform beträgt etwa 350 nm. Der freie Spektralbereich wird in dieser Anordnung gleichmäßig auf die 32 Kanäle des Zeilendetektors verteilt, wodurch sich eine optische Auflösung von etwa 10 nm ergibt. Somit ist diese Anordnung nur bedingt zur Spektroskopie geeignet. Jedoch ist ihr Einsatz in einem bildgebenden System vorteilhaft, da das Signal pro Detektionskanal aufgrund des relativ breiten detektierten Spektralbandes noch relativ groß ist. Eine Verschiebung des freien Spektralbereiches kann zusätzlich durch eine Verdrehung beispielsweise des Gitters erfolgen.
Eine weitere mögliche Ausführungsform könnte die Verwendung eines Matrixdetektors (z.B. eine CCD) beinhalten. Hierbei wird in einer Koordinate durch das dispersive Element eine Aufspaltung in verschiedene Wellenlängenanteile vorgenommen. In der verbleibenden Richtung auf dem Matrixdetektor wird eine komplette Zeile (oder Spalte) des gescannten Bildes abgebildet. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft beim Aufbau eines Linienscanners (Lit.: Code, Kino; „Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996). Der prinzipielle Aufbau entspricht im wesentlichen dem eines LSM nach Abb. 2. Jedoch wird statt eines Punktfokus eine Linie in den Fokus abgebildet und die zu untersuchende Probe nur noch in einer Richtung gescannt. Als konfokale Blende dient in einem solchen Aufbau statt einer Lochblende eine Schlitzblende. Eine nichtdescannte Detektion bei Verwendung einer Mehrphotonen- Absorption kann auch mit dieser Anordnung erfolgen. Hierzu kann wiederum die konfokale Blende entfallen.
Durch die spektrale Aufspaltung des Fluoreszenzlichtes kann nach Erfassung der Fluoreszenzspektren von Fluoreszenzmarkem in Reinform und der Erfassung von Spektren mit Fluoreszenzanteilen mehrerer Marker durch ein „unmixing"- Verfahren eine getrennte Erfassung der Spektralanteile erfolgen ( DE 19915137 A1).
Erfindung:
Erfindungsgemäß ist nun erkannt worden, daß sich die Zahl der für die Fluoreszenzmarkierung verwendeten Fluoreszenzmarker verringern kann oder eine Kombinatorik ausgenutzt werden kann, wenn nicht nur Fluoreszenzspektren in Reinform als Referenzspektren verwendet werden sondern auch Referenzspektren von Mischformen aufgezeichnet werden. Diese Mischformen können beispielsweise durch den zeitabhängigen Färbezustand eines biologischen Materials charakterisiert sein, wenn ein Fluoreszenzmarker langsam zu einer Ver ärbung führt. Weiterhin können derartige Mischzustände durch eine Mischfarbe gekennzeichnet sein, wenn ein Fluoreszenzmarker seine Farbe bzw. seine Anregungseigenschaften wechselt.
Derartige Mischungsverhältnisse können auf verschiedene Weise erzeugt werden: Sie können in der Probe vorhanden sein, durch Bestrahlung der Probe erzeugt werden oder Ergebnis eines biologischen Prozesses sein, der durch eine Bestrahlung angeregt wird.
Mischspektren können einen biologischen Prozeß charakterisieren, beispielsweise eine Konzentrationsänderung, wobei ein erstes Spektrum einem geringeren Konzentrationszustand und mindestens ein weiteres Spektrum einem höheren Konzentrationszustand entspricht.
Mittels der unterschiedlichen Referenzspektren werden Bildkanäle definiert und entsprechend ausgewertet. Die Erzeugung derartiger Referenzen kann über das gesamte Bild oder vorteilhaft über markierte „ regions of interest" (ROI) erfolgen. Über derartige ROI kann auch eine gezielte Manipulation durch definierte Bestrahlung erfolgen. Es kann weiterhin in einer ersten Region eine Referenz bestimmt werden und in mindestens einer weiteren Region eine gezielte Bestrahlung und Messung durch Extrahierung von Mischspektren erfolgen. Eine Entmischung und Darstellung der Spektren kann nach der Bildaufnahme oder während der Bildaufnahme erfolgen. Überraschend ergibt sich, daß neuartige Marker wie das fluoreszierende Protein Kaede, das sich bei Bestrahlung von grün nach rot verfärbt (Lit: Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2002), An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. PNAS 99/20, 12651-12656) bei der Erfassung von organischen Vorgängen, beispielsweise inter- und intrazellulärer Vorgängeund zur Markierung einzelner Zellen bzw. Zellpopulationen, eingesetzt und spektral detektiert werden kann. Photokonvertierbare Farbstoffe, die dynamisch ihre Spektren aufgrund von intrazellulären Vorgängen verändern bzw. Farbstoffe, die für FRET verwendet werden aber auch andere Indikatorfarbstoffe, können durch das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft eingesetzt werden. Beispielsweise können in einer Zellpopulation, die mit dem Farbstoff Kaede markiert worden ist, unterschiedliche Zellen oder Zellgruppen unterschiedlich lang mit UV oder violettem
Licht beleuchtet bzw. konvertiert werden. Dadurch stellen sich unterschiedliche
Farbmischverhältnisse ein, die als Referenzspektren erfaßt werden. Anschließend können unterschiedliche Zellpopulationen einzeln über die Zeit erfaßt werden.
Das trifft nicht nur für Zellkulturen zu sondern kann sowohl subzelluläre Strukturen als auch ganze Organismen betreffen, wobei eine bestimmte Zellpopulation bestrahlt und in ihrer Entwicklung beobachtet werden kann, indem die resultierenden Referenz bestimmten Bildkanälen zugewiesen und so verfolgt werden kann.
Über die ROI kann jeweils ein Bereich ausgewählt werden. Es kann eine Analyse von Transportprozessen auf zellulärem und subzellulärem Niveau erfolgen.
Vorteilhaft kann nur noch ein Farbstoff verwendet werden, der beispielhaft durch
Bestrahlung oder andere Einwirkungen in verschiedene Zustände versetzt wird, die über Referenzbildung eindeutig identifizierbar sind.
Auch ein unterschiedlicher Anstieg der Fluoreszenzintensität wie bei PA-GFP
(photoaktivierbares GFP, Lit. Patterson, G.H., and Lippincott-Schwartz, J. (2002), A photoactivatable GFP for selective photobleaching of proteins and cells. Science
297, 1873-1877) nach Anregung mit violettem Licht kann als Referenz dienen.
Beim Zeiss LSM META können ROls direkt im Bild interaktiv definiert werde. Der ausgewählte Laser wird pixelgenau an der Grenze diese Regionen ein- und ausgeschaltet.
Im Timeseries Dialog werden Start und Ende einer Zeitserie sowie Intervalle und
Delays zwischen den Aufnahmen festgelegt. Automatisch eingebunden werden können hier auch die Bestrahlungsparameter, die zur Veränderung der
Farbstoffeigenschaften durch Photoaktivierung bzw. Photokonversion führen wie beispielsweise Wiederholungsrate, Wellenlänge, Intensität, Position.
Die Auswertung kann nach dem Experiment oder online schon während der
Aufnahme erfolgen, um direkt in den Ablauf des Experimentes eingreifen zu können.
Die mittleren Intensitäten der ROI im Zeitverlauf sowie die Zeiten von
Photoaktivierungen und Konversionen werden angezeigt.
Der META Detektor erlaubt es, das gesamte Spektrum der Emission, beispielsweise von Kaede zu erfassen und die jeweiligen Mischformen während der Messung spektral zu trennen und die entmischten Kanäle anzuzeigen. In Fig. 4 wird schematisch dargestellt, wie unterschiedliche Bildkanäle CH1-CH3 gebildet werden, wobei wie dargestellt , unterschiedliche spektrale Mischverteilungen CH1-3 als Referenz verwendet und zur Bildauswertung herangezogen werden.

Claims

Patentansprüche
1.
Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere mit einem Laser-Scanning-
Mikroskop, wobei eine zumindest teilweise spektral aufgelöste Detektion des
Fluoreszenzspektrums erfolgt und Referenzspektren zur spektralen Entmischung herangezogen werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahme der Referenzspektren von zeitlich und / oder spektral veränderlichen
Farbstoffen und/ oder Farbstoffkombinationen erfolgt und zur Bildauswertung dient.
2.
Verfahren nach Anspruch 1 , zur Erfassung von organischen Vorgängen.
3.
Verfahren nach Anspruch 2, zur Erfassung intrazellulärer Vorgänge.
4.
Verfahren nach Anspruch 2, zur Erfassung interzellulärer Vorgänge.
5.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, zur Erfassung von
Zellen und/oder Zellpopulationen.
6.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei eine Aufnahme von
Referenzspektren photokonvertierbarer Farbstoffe erfolgt.
7.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei eine Aufnahme von
Referenzspektren photoaktivierbarer Farbstoffe erfolgt.
8.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei eine Aufnahme von
Referenzspektren von Indikatorfarbstoffen erfolgt.
9.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei eine Aufnahme von Referenzspektren von Farbstoffen erfolgt, die dynamisch ihre Spektren aufgrund von intrazellulären Vorgängen verändern .
10.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei eine Aufnahme von Referenzspektren von Farbstoffen bei unterschiedlichem Anstieg der Fluoreszenzintensität erfolgt.
11.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, wobei eine Aufnahme von
Referenzspektren vom fluoreszierenden Protein Kaede erfolgt.
12.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11 , wobei eine Aufnahme von
Referenzspektren von PA-GFP erfolgt.
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