JPS60104238A - 多波長同時検出による定量分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は多素子検出器を用いて試料に対する多波長同
時検出を行ない、吸光度あるいは螢光強度などの多波長
での検出値の時間変化である三次元情報を検出処理する
分析法に関するものであシ、特に高速液体クロマトグラ
フィーによる分析やフローインジェクシ目ンアナライザ
による分析に適した分析方法および装置に関するもので
ある。

従来技術 例えば高速液体クロマトグラフィーによる分離分析は、
食品や薬品、石油化学、農業、生化学、臨床分析など、
多方面の分野で利用されている。

この高速液体クロマトグラフィーにおける試料成分を検
出する検知器としては、可視紫外分光光度計や螢光分光
光度計、屈折率計、熱伝導セル等が用いられておシ、こ
れらの検知器から得られた吸光度、螢光強度、屈折率な
どの検出値の時間変化、すなわち二次元情報からなるク
ロマト波形を積分器などによ請求めたピーク面積、ピー
クの出る時間（リテンションタイム）によって定性・定
瞼分析することが行なわれている。

これらの分析は、試料液中に含まれる各成分による各ピ
ークの分離が充分良く、それぞれの成分に対して独立ピ
ークとみなすことができる場合は正確な分離結果が得ら
れるが、ピークが近い場合や複数のピークが重なった場
合、あるいはピークのベースが平坦でなく大きくドリフ
トする場合などにおい□ては、ピーク分割処理、ティリ
ング処理、ドリフト処理等、種々の波形分離処理を行な
わなければならない。このような従来の波形分離処理は
、例えば講談社版ｒ機器分析のだめのコンピ−タ入門」
第１８９頁以降に紹介されているところであり、また特
公昭４７−４５５５６号、特公昭５１−４０８３２号、
特開昭５６−２２９５５号、特開昭５７−８６０４７号
等にも種々の処理方法が開示されている。

第１図には従来のこのような高速液体クロマトグラフィ
ーの一般的な概念図を示し、また第２図には従来の波形
処理方法の例を示す。

第１図において、リザーバータンク１からポンプ２によ
って汲上げられた溶媒は試料注入口としてのサンプルイ
ンジェクタ３に送られ、このサンプルインジェクタ３に
おいて試料が溶媒に混合され、その試料を含んだ液はサ
ンプルインジェクタ３から力２ム４に送液されて、その
カラム４において試料中の各成分が時間的に分離され、
さらに試料液は可視紫外分光検知器あるいは螢光検知器
などの検知器５内のフローセルを通過してドレイン６に
排出される。検知器５の出力はレコーダー８およびイン
チグレータフに導入され、レコーダー８においてクロマ
ト波形が記録されるとともにインチグレータフにおいて
クロマト波形のピーク面積がめられる。そしてクロマト
波形のピークの分離が不完全な場合には、第２図に示す
ような神々の波形分離処理を施す。例えば（ａ）ドリフ
ト処理、（ｂ）垂）α分割処理、（ｃ）テーリング処理
、（ｄ）テーリング垂直分割処理などの処理を前記イン
チグレータフにおいて行ない、ピークの面積をめる。

しかしながら上述のような種々の波形分離処理を行なっ
た場合、定を精度は極端に低下し、実用上問題が生じる
。そのため従来の高速液体クロマトグラフィーにおいて
は種々の試料に対して化学的分離条件、溶離条件を探し
出して独立のピークに分離するために多くの努力が払わ
れていた。しかしながらこのように探し出された分離条
件でピークをそれぞれ分離して分析する場合、当然のこ
とながら試料によって分析時間が定まり、一般には分析
に媛する時間が長くなるなどの操作上の基本的問題を内
在していた。

したがってルーチン分析等に用いる場合、分析試料によ
っては作業能率が低ドする問題があり、捷た反復して用
いる回数が少ないことが望ましい貴重なサンプル、例え
ば微少生体サンプル等がビ一りが完全に分離されずに分
析された場合にその後に化学的分離条件を探し出して再
分析することが困難となり、またドリフトに依り微少、
低濃度サンプルの検出限界が低−Ｆするなど、種々の問
題があった。

以上のような問題は、高速液体クロマトグラフィーのみ
なラス、フローインジヱクションによる分析の場合も全
く同様であった。すなわち、上述のような問題は、吸光
度あるいは螢光強度などの一つの情報の時間的変化、す
なわち二次元情報のクロマト波形から分析定着する場合
に本質的に不可避のものである。

発明の目的 この発明は以上の事情に鑑みてなされたもので、高速液
体クロマドグシフイーあるいは７０−インジェクション
による分析において、多素子検出器を用いて多波長同時
検出を行ない、吸光度あるいは螢光強度等の多波長での
時間変化である三次元情報を検出処理することにより、
分離不完全な複数成分の合成りロマト波形の検出結果で
あってもデータの演算処理により精度の高い分離定量を
可能にした分析方法および装置を提供することを目的と
するものである。

さらにこの発明の他の目的は、分離不完全な複数成分の
クロマト波形であってしかも未知成分を含む場合におい
ても、データを演算処理することによって既知試料成分
と未知試料成分に対応する完全に分離されたクロマト波
形をめることを可能にするにある。

さらにこの発明の他の目的は、溶媒の２成分、；３成分
混合等のグラジェント時のペースのドリフトを平坦に補
正して記録し、あるいは検出器の温度変化によるベース
のドリフトを平坦に補正し、微少低濃度サンプルの検出
限界を向上させて高感度測定を可能にした分析方法およ
び装装置を提供することにある。

そして以上のような分離分析が可能となることにより、
従来の分析装置の欠点であったルーチン分析の作業能率
の向上、貴重なサンプルの分析操作上のミスをなくして
精度の高い分析が可能となるのである。

発明の構成 この発明は以上のような目的を達成するため、次のよう
な構成を有する分析方法および装置を提供する。

すなわち第１発明の分析方法は、フォトダイオードアレ
イ等の多素子検出器を用いて、吸光度あるいは螢光強度
等を多波長で同時検出し、多波長での検出値の時間変化
の三次元情報（すなわち時間軸、波長軸、検出値軸の三
次元情報）を検出処理する、高速液体クロマトグラフィ
ーもしくはフローインジェクション分析における分析方
法において、 その三次元情報が複数成分を含有する試料についてのも
のであってしかもその三次元情報の時間軸でのクロマト
が各成分に分離不完全なものである場合に、予め前記複
数成分のそれぞれの標準スペクトル情報を、観測された
試料の合成スペクトル（すなわち前記三次元情報におけ
る波長軸での情報）に最小二乗誤差評価で適合させる演
算を時間軸上の観測時間全領域もしくは主要領域にわた
って行なうことによシ、各試料成分に対応する各、成分
ごとに分離したクロマト波形をめて定量分析を行なうこ
とを特徴とするものである。

また第２発明の分析方法は、前記同様に吸光度あるいは
螢光強度等を多素子検出器によシ多波長で同時検出し、
吸光度あるいは螢光強度等の検出値の多波長での時間変
化からなる三次元情報を検出処理する、高速液体クロマ
トグラフィーもしくはフローインジェクションにおける
分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含有する試
料についてのものであって、しかもその三次元情報にお
ける時間軸でのクロマトが各成分に分離不完全なもので
ある場合に： 前記複数成分のうちの既知成分についての予め記憶させ
である各標準スペクトル情報を観測された試料の合成ス
ペクトルに最小二乗誤差評価で適合させる演算を行ない
、かつその最小二乗誤差評価における不一致分を各観測
時刻でめ、そのめた値を未知成分のクロマト波形とする
第１の演算過程： 試料成分のうち既知成分についての予め記憶されている
各標準クロマト波形と第１の演算過程によって得られた
未知成分のクロマト波形を、観測された試料についての
合成りロマト波形に最小二乗誤差評価で適合させて、未
知成分を含む各成分の成分量をめる第２の演算過程： とによって未知成分に対応する分離したクロマト波形を
めて定量分析を行なうことを特徴とするものである。

ここで、第２の演算過程によってめられた各成分の成分
量を用い、予め記憶されている既知成分についての標準
スペクトルに、それぞれ対応する既知成分の成分量を乗
算して、その乗算した値を観測記憶されている試料の合
成スペクトルから差し引いて未知成分のスペクトルをめ
ることができる。

さらに第３発明の分析方法は、前記同様に吸光度あるい
は螢光強度等を多素子検出器により多波長で同時検出し
、吸光度あるいは螢光強度等の検出値の多波長での時間
変化からなる三次元情報を検出処理する、高速液体クロ
マトグラフィーもしくはフローインジェクションにおけ
る分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含有する試
料についてのものであって、しかもその三次元情報にお
ける時間軸でのクロマトが各成分に分離不完なものであ
る場合に： 前記複数成分のうちの既知成分についての予め記憶され
ている各標準クロマト情報を、観測された試料の合成り
ロマト波形に最小二乗誤差評価で適合させる演算を行な
い、かつその最小二乗誤差評価における不一致分を各観
測波長でめ、そのめた値を未知成分のスペクトルとする
第ｔの演算過程： 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶されてい
る各標準スペクトル情報と前記第１の演算過程によって
められた未知成分のスペクトル情報を、観測された試料
についての合成スペクトル情報に最小二乗誤差評価で適
合させて、未知成分を含む各成分の成分量をめる第２の
演算過程；とによって未知成分に対応する分離したスペ
クトル波形をめることを特徴とするものである。

ここで、第２の演算過程でめられた各成分の成分量を用
い、予め記憶されている既知成分についての標準クロマ
トに、それぞれに対応する既知成分の成分量を乗算して
、その乗算した値を観測記憶されている試料の合成りロ
マトを差し引いて未知成分のクロマト波形をめることが
できる。

また第４発明は、分析装置についてのものであって、分
光器内のフ四−セルを通過する試料液を多波長で同時検
出する多素子検出器と、その多素子検出器によシ検出さ
れた多波長での検出値の時間変化からなる三次元情報を
演算処理するデータ処理部とを有する高速液体クロマト
グラフィーもしくはフローインジェクシコンアナライザ
ーにおいて、 前記データ処理部が、前記三次元情報を記憶する記録部
と、前記試料液中に含まれる複数個の試料成分それぞれ
に対応する標準スペクトル情報および標準クロマト波形
を予め記憶しておくための情報記憶部と、検出記録され
た前記三次元情報と前記情報記憶部から読出された情報
に対して最小二乗誤差評価による演算処理部とを具備し
、前記観測された三次元情報での時間軸のクロマトが分
離不完全な複数成分の試料のクロマト波形の合成からな
る場合に、前記情報記憶部に予め記憶されている前記各
成分に対応する標準スペクトルを読出して、その標準ス
ペクトルを観測された三次元情報の合成スペクトルに最
小二乗誤差評価で適合させる演算を前記演算処理部にお
いて観測時間領域にわたって行なうようにし、これによ
って各試料成分に対応する成分ごとに分離したクロマト
波形をめて定量分析を行なうようにしたことを特徴とす
るものである。

さらに第５発明も分析装置についてのものであって、分
光器内のフローセルを通過する試料液を多波長で同時検
出する多素子検出器と、その多素子検出器により検出さ
れた多波長での検出値の時間変化からなる三次元情報を
演算処理するデータ処理部とを有する高速液体クロマト
グラフィーもシく、はフローインジェクションアナライ
ザーにおいて、 前記データ処理部が、前記三次元情報を記録する記録部
と、前記試料液中に含まれる複数個の成分のうちの既知
成分に対応する標準スペクトル情報および標準クロマト
波形を予め記憶しておくための情報記憶部と、検出記録
された前記三次元清報と前記情報記憶部から読出された
情報に対し最小二乗誤差評価による演算処理を行なう演
算処理部とを具備し、 前記観測された三次元ｔｎ報でのクロマトが分離不完全
な複数成分の試料の合成りロマト波形であってしかもそ
の試料成分のうちに未知成分が含まれる場合に、前記情
報記憶部に予め記憶されている既知成分に対応する標準
スペクトル情報を読出して、演算処理部においてその読
出された標準スペクトルを観測された試料の合成スペク
トルに最小二乗誤差評価で適合させる演算を行ない、そ
の最小二乗誤差評価における不一致分を各観測時刻でめ
て請求めた値を未知試料成分のクロマト波形とする演算
を行ない、さらに情報記憶部に記憶されている既知成分
の標準クロマト波形と演算によってめられた未知成分の
クロマトを、観測された合成りロマト波形に最小二乗誤
４差評価で適合さ、する演痒を行なって未知成分を含む
各成分の成分清をめ、これによって未知試料成分に対応
する分離したクロマト波形をめるようにしたことを特徴
とするものである。

実施例 第３図には、この発明の方法を実施するための高速液体
クロマトグラフィーの全体構成の一例を既略的に示す。

なお第３図において、第１図に示される従来の装置の要
素と同一の要素については同一の符号を付し、その説明
は省略する。

第３図の装置においては、試料に対する検知器５として
、フォトダイオードアレイ等の多素子検出器５Ａ（第４
図参照）を内蔵した多波長同時検出型の分光光度Ｈ１が
用いられている。また従来の装置におけるインチグレー
タフ、レコーダ８の代シにコンピュータ等からなるデー
タ処理部９とＸ−Ｙプロッター１０を用いた構成とされ
ている。

第４図には、第３図の装置に用いられる多波長同時検出
型のダブルビーム方式の分光光度計５の一例を示す。光
源１１からの光はビームスプリッタエ２によりダブルビ
ームに分割され、各ビームがそれぞれ参照室１３、試料
室１４を通過する。

試料室１４内には図示しないフローセルが設けられてお
り、試料を含んだ液がこのフローセルを通過する。一方
参照室１３内には空のセルもしくは標準物質を収容した
セルが設けられている。前記参照室１３および試料室１
４をそれぞれ通過した各ビームすなわち参照光および試
料光は、チョッパー１５により交互にチョッピングされ
た後、回折格子１６で分光され、さらにビーム混合器１
７で混合されて、例えば３２チヤンネルの７オトダイオ
ードアレイからなる多素子検出器５Ａで検出される。こ
の多素子検出器５Ａを構成する例えば３２個の単位検出
素子５１には、それぞれ多波長に分光された各波長（各
チャンネル）の光が、参照光、試料光と交互に入射され
、参照光の出力で規格化された試料光強度に相当する信
号が出力される。すなわち、多素子検出器５Ａからは、
観測波長領域を３２チヤンネルに分割した゛各ｊヤンネ
ル（各波長）それぞれにおける試料光強度に対応する３
２チヤンネルの信号が同時に出力される。

第５図（〜、　（Ｂ）　、　（Ｃ）は、前記多素子検出
器５Ａからの検出出力を三次元情報、すなわち波長軸（
チャンネル軸）、時間軸、検出値軸（吸光度軸あるいは
光強度軸等）の三次元における情報として記憶し、また
試料に含まれていることが予想される成分について予め
実験によ請求めておいた標準スペクトル情報および標準
クロマト情報を前もって記憶させておき、観測された試
料についての前記三次元情報と、その試料に含まれる既
知成分に対応する予め記憶しである標準スペクトル情報
および標準クロマト波形とを演算処理してクロマト波形
分離を行なうためのコンピータ等からなるデータ処理部
９を示す。そして特に第５図囚は、多素子検出器５Ａと
しての３２チヤンネルフオトダイオードアレイにょシ検
出した３２チヤンネルの信号を読出すための回路部分９
Ａを示し、また第５図（Ｂ）は第５図（４）にょシ続出
された値をデジタル化して、時間軸および波長チャンネ
ル軸に対応する三次元情報として処理しかつ各種の制御
を行なうだめの処理制御部分９Ｂを示し、さらに第５図
（Ｃ’Ｊは、予め用意された各種成分の標準スペクトル
波形情報および標準クロマト情報を記憶させである情報
記憶部（フロッピーディスク部）から記憶されている情
報を読出し、観測して記憶された試料についての三次元
情報と演算するデータステーション部９ｃを示す。

第５図（４）〜（Ｃ）に示されるデータ処理部９におい
て、同時に観測される波長領域を３２チヤンネルに分割
した各チャンネルにおける検出値（この場合には試料光
強度）が多素子検出器５Ａから出方されて、それぞれの
チャンネルに対応する前置増幅器１９を経て主増幅器２
ｏに送られ、その主増幅器２０内の対数増幅器２０Ａに
よって対数増幅されるとともに同期スイッチ２０Ｂによ
って同期スイッチ２０１３により同期検出される。なお
同期スイッチ２０Ｂは同期信号発生回路２０Ｃからの同
期信号によって制御される。このようにして同期検出さ
れた各チャンネルの主増幅器２ｏの出力は、マルチプレ
クサからなるアナログスイッチ２：うによって順次読出
され、レンジ切換回路２４を経て第５図（Ｂ）のＡ／Ｄ
コンバータ２５によりデジタル化され、インターフェー
ス２６を経て主コンピータ２７に読込まれる。なお前記
アナログスイッチ２３は主コンピユータ２７がらの制御
信号によって切替制御される。そして主コンピユータ２
７によって検出値信号（対数増幅値）は時間軸、波長軸
（チャンネル）に対応した信号、すなわち三次元情報と
され、その三次元情報はデータ・コマンド双方向転送イ
ンターフェース２８　、２８’を介して第５図（Ｃ）に
示される外部コンピータ部、すなわちデータステーショ
ン部９ｃへ送られる。

なお検出値は、前述のように通常は試料の光強度として
検出されて対数増幅されるが、通常の分析ではその逆数
、すなわち対数吸光度として用いられることが多く、そ
の場合には適宜逆数に変換すれば良く、以丁の説明では
検出値を吸光塵として表現するものとする。

なおまた、第５図（Ｂ）において２１は多チャンネルＤ
ＡＣ出力インターフェースで、外部コンピュータ部（デ
ータステーション部）を接続しない場合等において演算
を行なわない生データをＸ−Ｙグロック−１Ｏその他の
記録器に読出すだめのものであり、また２２は各指令表
示や指示スイッチ等が設けられているフロントパネル、
３ｏは多素子検出器５Ａからの出力信号の少なくとも一
部を一時的に記憶して必要に応じて読出すだめのメモリ
ーである。

一方第５図（Ｃ）のデータステーション部（外部コンピ
ュータ部）９Ｃは、インターフェース２８′、コンピュ
ータ３２、フロッピーディスク部３３、ＣＲＴ　３４、
プリンター３５、出力インターフェース３６によって構
成されておシ、出力インターフェース３６はＸ−Ｙプロ
ッター１０に接続されている。フロッピーディスク部３
３は、試料に含まれていることが予想される各種成分の
標準クロマト清報および標準スペクトル波形情報を記憶
しておくだめの情報記憶部を構成するものであり、また
このフロッピーディスク部３３は前述の観測された三次
元情報や分離された各成分の波形等も記憶する。そして
コンピュータ３２は、フロッピーディスク部３３から読
出された標準クロマト情報および標準スペクトル波形情
報と観測された試料についての三次元情報を最小二乗誤
差評価法で７υγ算処理して、分離されたクロマト波形
を導出し、その分離されたクロマト波形をＸ−Ｙプロッ
ター１０に表示させる。

次に上述のような装置を用いて定■・分析を行なうこの
発明の方法について説明する。

第６図は多素子検出器によって検出された、複数成分を
富有する試料についての三次元情報の一例を示す。ここ
で水平面内のＸ軸は時間ｔを表わし、Ｙ軸は波長λを表
わし、また高さ方向の２＠は吸光度を表わす。この例で
は、クロマト波形′（すなわち時間軸−吸光度軸のなす
面における波形）のピークが分離されておらず、複数成
分の合成りロマト波形となっている。もちろんスペクト
ル波形（波長軸−吸光度軸のなす面における波形）も複
数成分の合成スペクトル波形となっている。

第７図は、スペクトル波形およびクロマト波形と前記三
次元情報との関係を判り易く模式的に示す図である。な
おこの図では試料が：う成分ケ含イｆ踵そのうち２成分
が既知成分で残る１成分が未知成分である場合について
例示する。以丁この図を参照して説明を進める。なおこ
こでは多成分スペクトルのそれぞれの成分間に干渉はな
く、各成分＋Ｊ４：（組成比）とスペクトル強度情報（
対数変換値の吸光度も含む）との間に線形性が成り＼ｒ
つものとして扱かう。

先ず、（Ｐｌ測した試料に含まれる複数の成分が、それ
自体は既知であるが、それらの既知成分からなる観測し
た試料のクロマト波形（したがって複数の既知成分の合
成りロマト波形）のピークが完全に分離されていない場
合において、分離された各成分ごとのクロマト波形をめ
るためのこの発明による演算処理方法を説明する。

この場合には、観測した試料に含まれる各成分の標準ス
ペクトル波形（予め記憶しであるもの）を読出し、その
各成分の標準スペクトルに各々の成分濃度（未知＋Ｊ　
）を掛けてその合成値を観測した試料の合成スペクトル
（三次元情報のうちの波長軸−吸光度軸の情報）に最小
二乗法で適合させることにより、ある観測時刻での各成
分の成分比をめ、同様の演算を観測時間の全域（もしく
は主安領域）にわたって各時刻ごとに行なうことにより
、各試料成分の分離されたクロマト波形をめる。

すなわち、観測した試料にｍ個の既知成分が含まれてお
り、観測波長領域がｎチャンネル（前述の例では３２チ
ヤンネル）に等間隔に分割されている場合、ある時刻ｔ
におけるスペクトルの横軸（波長軸）のｎ個の等間隔分
点のうちのｉ酢目分点におけるｍ個の標準スペクトル（
前もって記憶させであるｍ個の成分に対応する標準スペ
クトル）のうちｊ番目標準による縦軸値（吸光ｊｆ　）
を旧１とする。そのｊ番目の成分の成分清Ｘｊを未矧曖
とし、その値Ｘｊをそれぞれ対応する標準スペクトルの
縦軸値Ｒｉｊに掛けて、観測された試料の合成スペクト
ルの波長軸上のチャンネル１番目分点の縦軸値（吸光度
）Ｓｉに適合させる操作を行なえば良い。

最小二乗誤差評価でこれを実行するためには、次の（１
）式におけるＱの値を最小とすれば良い。

但しここで標準スペクトルは生データＳｉと比べて充分
に正確にめられているものとする。

ａＱ／ａｘｎをめて０と置いて得られる１Ｅ規式は次の
（２）式となる。

Ｘ　＝　（Ｒ”Ｒ）−”　ＲＴＳ　・・・・・・　（３
）の形で得られる。この解を得る手法としてはいくつか
の方法があるが、通常は第８図に示す手順で行なう。す
なわち、ｍ個の標準スペクトルからＲの要素Ｒｉｊ　（
ｉ　＝　ｌ”ｎ　、　ｊ＝１〜ｍ　）　、すなわち各縦
軸値を読む。次いでＲＴＲの計算を行ない、また試料の
観測スペクトル値Ｓｉ　（ｉ　＝１−ｎ　）を読み、Ｒ
ＴＳの計算を行なう。そしてＸ　＝　（ＲＴＲ）−１Ｒ
ＴＳをコレスキ（Ｃｈｏｌｅｓｋｉ　）の方法で計算し
てＸをめる。

このようにして、ある時刻でのｍ個の成分の各成分量Ｘ
ｊ（ｊ＝１〜ｍ）がめられる。そしてこのような演算を
観測時間軸の全領域にわたって次々に行なうことによシ
、各時刻における各成分の成分量が観測時間軸の全領域
にわたってめられる。

したがっである波長での各試料成分の成量分の時間変化
、すなわちクロマト波形が分離されてめられる。なお場
合によっては、吸光度が零もしくは零に近い平坦な部分
の時刻については上述のような演算を省略して、観測時
間軸の主要領域のみについて上述のような演算を行なう
ことにより分離されたクロマト波形をめてることもでき
る。

次に、試料中に含まれる複数成分のうちに未知成分があ
る場合において、その未知成分のクロマト波形を分離し
てめるためのこの発明による演算処理方法について説明
する。

この場合には、試料中に含まれる複数成分のうちの未知
成分を除いた複数個の既知成分の標準スペクトル波形（
予め記憶しであるもの）を読出し、前記と同様に各既知
成分の標弗スペクトルにそれぞれの既知成分の成分量（
未知上）を掛けてその値を観測した試料の合成スペクト
ルに最小二乗法で適合させる演算を行なう。ここで既知
成分の成分量は（０式におけるＱの値が最小値をとると
きのＸｊＯ値である。一方、観測された試料の合成スペ
クトルが、既知成分のスペクトルのみの合成となってい
る場合（すなわち全成分の標準スペクトルで最小二乗誤
差評価を行なう場合）には、このＱの値の最小「直は零
となるが、未知成分を含む場合にはその未知成分の存在
によシ最小二乗法による一致度が悪くなり、Ｑは正の値
となる。このようにＱの値が最小値となるときのＱの値
の平方根、すなわち不一致分はスペクトル座標面におけ
る未知成分の成分量に対応することになる。そこでこの
ような演算を観測時間軸の全領域にわたって行って、各
時刻におけるＱの最小値の平方根（不一致分）を次々に
めることによシ、未知成分のクロマト波形をめることが
できる。但しここで得られた未知成分のクロマトグラム
は、前記（１）式から明らかなように未知成分のピーク
波形は知ることができるが、吸光度スケールを決定する
ことができない。すなわち（１）式においてＱの値は二
乗の値の積分値となっているから、Ｑの平方根の値の大
小は未知成分の大小と対応するが、Ｑの平方根自体は未
知成分の成分量自体と等しくならない。

そこでこの発明の方法においては、さらに次のような演
算処理を行なって未知成分を含む各成分の成分量（混合
比）をめ、吸光度スケールを決定する。

すなわち前述のようにしてめられた未知成分のクロマト
グラムと予め記憶されている既知成分の標準クロマト波
形とを、観測された多成分試料の合成りロマトに最小二
乗誤差評価で適合させる。

この演算は、前の段階でスペクトル座標面（吸光度軸−
波長軸）において行った最小二乗誤差評価を、座標面を
変えてクロマト座標面（吸光度一時間軸）で行なうこと
を意味する。すなわち前記（１）式における波長軸での
等間分点１（ｉ＝１〜ｎ）を時間軸での等間隔分点に置
き換え、その時間軸での等間隔分点における標準クロマ
ト波形および未知成分クロマト波形の縦軸値をＲとして
演算を行なう。このような演算によって未知成分を含め
て各試料成分の混合比がめられ、したがって未知成分の
クロマト波形の吸光度スケールが他の既知成分のクロマ
ト波形の吸光度スケールと同一とされ、定量分析を行な
うことができる。

さらに未知成分のスペクトル波形をめる場合には、上述
の演算によってめられた各既知成分の成分量と予め記憶
されている各既知成分に対応する標準スペクトルを掛は
合せ、その合成値を、観測された未知成分を含む試料の
合成スペクトルから差引けば、その差し引いた残りが未
知試料成分のスペクトルとしてめられる。

以上のようにして、未知成分を含む試料の場合に、その
未知成分のクロマト波形およびスペクトル波形をめるこ
とができる。

なお試料にバまれる未知成分の数は１種に限らず、２種
以上の未知成分が含凍れている場合にも適用可能である
。但し２種以上の未知成分が含まれている場合には、そ
れらの複数の未知成分の合成りロマトあるいは合成スペ
クトルがめられることになる。

また未知成分を含む場合、上述の説明では、最初に既知
成分の標準スペクトル波形を用い、観測した合成スペク
トルを最小二乗誤差評価で適合させる演算を各時刻で行
って未知成分のクロマト（但し吸光度スケールが決定さ
れていないもの）をめ、次の段階で既知成分の標準クロ
マト波形および前の段階でめられた未知成分のクロマト
を用いて観測された試料の合成りロマト波形に最小二乗
誤差評価で適合させる演算処理を行なうものとしたが、
場合によっては逆に最初の段階で既知成分の標準クロマ
ト情報を用いて観測された試料の合成りロマトに最小二
乗誤差評価で適合させる演算を行なうことにより未知成
分のスペクトル（但し吸光度スケールが決定されていな
いもの）をめ、次の段階で既知成分の標準スペクトル波
形および前の段階でめられた未知成分のスペクトルを用
いて、観測された合成スペクトル波形に最小二乗誤差評
価で適合させる演算を行なっても良い。

すなわち、最初の段階では、試料中に含まれる複数成分
のうち既知成分の標準クロマト波形（予め記憶しである
もの）を読出し、各既知成分の標準クロマトにそれぞれ
の既知成分の成分量（未知量）を掛けてその合成値を観
測した試料の合成りロマトに最小二乗誤差評価で適合さ
せる演算を観測波長軸の全領域もしくけ主要領域にわた
って行ない、その不一致分（Ｑの平方根の値）を未知成
分のスペクトルとする。このスペクトルは前述の場合と
同様に吸光度スケールが決定されていないものである。

そこで吸光度スケールを決定するために、前述のように
してめられた未知成分のスペクトルと予め記憶されて゛
いる既知成分のスペクトルとを、観測された試料の合成
スペクトルに最小二乗誤差評価で適合させ、これによっ
て未知成分を含めて各試料成分の成分量をめ、吸光度ス
ケールを決定する。これによって未知成分のスペクトル
も既知成分のスペクトルと同一スケールとされる。さら
に、上述の演算によってめられた既知成分の成分量と予
め記憶されている各既知成分の標準クロマトを掛は合わ
せ、その値を観測された合成りロマトから差し引けば、
その差し引いた残シが未知試料成分のクロマトとしてめ
られる。

次にこの発明の方法を複数成分試料の分析に実際に適用
した例を記す。

第９図は、ナフタレンとアントラセンを含有する試料の
場合の例であり、第９図囚はその複数成分の合成りロマ
ト波形、すなわち各成分に分離する前のクロマト波形を
示し、ここではクロマト波形のピークが分離されていな
い。一方第９図（Ｂ）はこの発明の方法にしたがって分
離したナフタレンおよびアントラセンのクロマト波形を
示す。

第１０図（Ｎ〜（ハ）、第１１図（Ａ）　、　（Ｂ）は
試料成分がナフタレン、アントラセン、ピレンからなる
３成分試料の場合についての例であり、第１０図（Ａ）
。

（Ｂ）　、　（Ｃ）はそれぞれす７タレン、ピレン、ア
ントラセンの可視紫外スペクトルを示す。−力筒１１図
（４）は、この３成分試料におけるアントラセンを未知
成分、ナフタレンおよびピレンを既知成分として第２発
明の第１の演算過程にしたがって前記演ｎ　式（１）の
Ｑの値が最小となるようにしてナフタレン（Ｎａ　）お
よびピレン（Ｐｒ　）のクロマト波形をめ、かつＱの値
の最小値の平方根（不一致分）をアントラセン（Ａｎ　
）のクロマトとしてプロットしたもの（したがって吸光
度スケールが決定されていないもの）を示す。そして第
１１図（Ｂ）は、第２の演算過程により最終的に未知成
分を含めた混合比を決定した各成分のクロマトグラムを
示す。

第１１図（Ｂ）では第１１図（Ａ）の場合と比較してア
ントラセン（Ａｎ）の成分量が低くなっていることが判
る。さらに、第１１図（Ｂ）でめられた成分量に基いて
、アントラセンのスペクトルを算出した例を第１０図（
Ｄ）に示す。この第１０図ＣＤ）に示されるアントラセ
ンの算出スペクトルは、第１０図（Ｃ）に示されるアン
トラセン実測スペクトル波形く一致していることが判る
。

上述のように、この発明の各方法は、実際の分析にも充
分な精度で適用できることが判明した。

発明の効果 以上の説明で明らかなようにこの発明の方法および装置
によれば、分離不完全な複組成のクロマト波形であって
も、データを演算処理することによって精度の高い分離
定量かり能となり、また未知試料成分を含む場合にも、
データを演算処理することによって未知試料成分の分離
したクロマト、スペクトルをめて未知試料成分の分離定
量を行なうことが可能となった。したがってこの発明の
方法および装置を適用することによって分析作業能率の
向上を図り、かつ貴重なサンプルの分析操作上のミスで
分析不可能とすることなく、精１Ｗの高い測定が行なえ
るなど、産業上名犬な貢献をすることができる。

なおこの発明は高速液体クロマトグラフィーに好適に用
いられるが、フローインジェクション分析にも適用でき
ることはもちろんであり、また検出値としても吸光度も
しくは光強度（透過率）のみならず、螢光強度等であっ
ても良く、要は多波長で同時検出して時間変化による三
次元情報としてデータが得られる分析には全て適用可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の高速液体クロマトグラフィーの一般的な
構成を示す略解図、第２図は従来の高速液体クロマトグ
ラフィーにおける波形分離処理の代表例を示す模式図で
、（ａ）はドリフト処理、（６）は垂直分割処理、（Ｃ
）はテーリング処理、（ｄ）はテーリング垂直分割処理
の例をそれぞれ示す。第３図はこの発明を実施するだめ
の高速液体クロマトグラフィーの全体構成の一例を示す
略解図、第４図は第３図の装置における検出部として用
いられる多波長同時検出型ダブルビーム方式の分光光度
泪の一例を示す略解図、第５図（Ａ）　、　（Ｂ）　、
　（Ｃ）はこの発明の装置に用いられるデータ処理部の
一例を示すブロック図、第６図はこの発明における多素
子検出器から得られた三次元情報の一例を示す波形図、
第７図は三次元情報とクロマト波形、スペクトル波形と
の関係を原理的に示す模式図、第８図はこの発明におけ
る波形分離のために用いられる最小二乗誤差評価の実際
の演算処理手順を示すフローチャート、第９図（４）、
（Ｂ）は試料にナフタレンおよびアントラセンが含まれ
る場合のこの発明の方法によるクロマト分離例を示す波
形図、第１０図（Ａ）〜θ））はナフタレン、ピレンお
よびアントラセンのスペクトルと、演、痒によりめたア
ントラセンのスペクトルを示す波形図、第１１図（Ａ）
　、　（＋３）は未知成分としてのアントラセンと既知
成分としてのナフタレンおよびアントラセンを含む試料
について第２発明の方法で分離定量した例を示すクロマ
ト波形図である。 １・・・リザーバータンク、２・・・ポンプ、：３・・
・サンプルインジェクタ、４・・・カラム、５・・・検
知器、５Ａ・・・多素子検出器、９・・・データ処理部
、９Ａ・・・検出回路部分、９Ｂ・・・処理判例１部分
、９Ｃ・・・データステーション部、１０・・・Ｘ　−
Ｙ　クロノター、１１・・・光源、１３・・・参照室、
１４・・・試料室、１５・・・チョッパー、１６・・・
回折格子、２７・・・主コンピユータ、３３・・・フロ
ッピーディスク部（情報記憶部）、３５・・・プリンタ
ー。 手　続　補　正　崗　（方式） 昭和５９年３月２８日 特許庁長官　若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２１１６１４号 ２、発明の名称 多波長同時検出にＪ：る定ｍ分析方法および装置３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都八王子市石川町２９６７番地の５名　称
　日木分光工業株式会社 ４、代理人 住　所　東京都港区三［１」３丁目４番１８号５、補正
命令の日付 昭和５９イ［２Ｊ］２８１ｇ＋（発送口）６、補正の対
象 明ｍ出および図面 ７、補正の内容 （１）　明ｉ出の浄書（内容に変更なし）を提出リ−る
。 （２）　図面の浄書（内容に変更なし）を提出する。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）　多素子検出器を用いて、吸光度あるいは螢光強
   度等を多波長で同時検出し、吸光度あるいは螢毘強度等
   の検出値の多波長での時間変化の三次元情報を検出処理
   する、高速液体クロマトグラフィーモジくハフローイン
   ジェクションによる分析方法において、 その三次元情報が複数成分を含有する試料についてのも
   のであってしかもその三次元情報の時間軸でのクロマト
   が各成分ごとに分離不完全なものである場合に、予め記
   憶させである前記複数成分のそれぞれの標準スペクトル
   情報を、観測された試料の合成スペクトルに最小二乗誤
   差評価で適合させる演算を時間軸における観測時間全領
   域もしくは主要領域にわたって行なうことにより、各試
   料成分に対応する各成分ごとに分離したクロマト波形を
   めて定量分析を行なうことを特徴とする多波長同時検出
   による定量分析方法。
2. （２）　多素子検出器を用いて、吸光度あるいは螢光強
   度等を多波長で同時検出し、吸光度あるいは螢光強度等
   の検出値の多波長での時間変化の三次元情報を検出処理
   する、高速液体クロマトグラフィーもしくはフローイン
   ジェクションによる分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含有する試
   料についてのものであって、しかもその三次元情報にお
   ける時間軸でのクロマトが各成分ごとに分離不完全なも
   のである場合に：前記複数の試料成分のうちの既知成分
   についての予め記憶させである各標準スペクトル情報を
   、観測された試料の合成スペクトルに最小二乗誤差評価
   で適合させる演算を行ない、かつその最小二乗誤差評価
   における不一致分を各観測時刻でめ、そのめた値を未知
   成分のクロマト波形とする第１の演算過程と： 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶させであ
   る各標準クロマト波形と第１の演算過程によって得られ
   た未知成分のクロマト波形を、観測された試料について
   の合成りロマト波形に最小二乗誤差評価で適合させて、
   未知成分を含む各成分の成分量をめる第２の演算過程； とによって未知成分に対応する分離したクロマト波形を
   めて定量分析を行なうことを特徴とする多波長同時検出
   による定量分析方法。
3. （３）　前記第２の演算過程によってめられた各成分の
   成分量番用い、予め記憶されている既知成分についての
   標準スペクトルに、それぞれ対応する既知成分の成分量
   を乗算して、その乗算した値を観１１１１１記憶されて
   いる試料の合成スペクトルから差し引いて未知成分のス
   ペクトルをめる第３の演算過程を有する特許請求の範囲
   第２項記載の多波長同時検出による定量分析方法。
4. （４）多素子検出器を用いて、吸光度あるいは螢光強度
   等を多波長で同時検出し、吸光度あるいは螢光強度等の
   検出値の多波長での時間変化の三次元情報を検出処理す
   る、高速液体クロマトグラフィーもしくはフローインジ
   ェクシ育ンによる分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含有する試
   料についてのものであって、しかもその三次元情報にお
   ける時間軸でのクロマトが各成分ごとに分離不完全なも
   のである場１合に：前記複数の試料成分のうちの既知成
   分についての予め記憶させである各標準クロマト情報を
   、観測された試料の合成りロマト波形に最小二乗誤差評
   価で適合させる演算を行ない、かつその最小二乗誤差評
   価における不一致分を各観測波長でめ、そのめた値を未
   知成分のスペクトルとする第１の濱Ｊ￥過程と； 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶させであ
   る各標準スペクトル情報と前記第１の演算過程によって
   められた未知成分のスペクトル情報を、観測された試料
   についての合成スペクトル情報に最小二乗誤差評価で適
   合させて、未知成分を含む各成分の成分量をめる第２の
   演算過程：とによって未知成分に対応する分離したスペ
   クトルをめることを特徴とする多波長同時検出による定
   量分析方法。
5. （５）前記第２の演算過程でめられた各成分の成分量を
   用い、予め記憶されている既知成分についての標準クロ
   マトに、それぞれ対応する既知成分の成分量を乗算して
   、その乗算した値を観測記憶されている試料の合成りロ
   マトから差し引いて未知成分のクロマトをめる第３の演
   算過程を有する特許請求の範囲第４項記載の多波長同時
   検出による定量分析方法。
6. （６）分光器内の７０−セルを通過する試料液を多波長
   で同時検出する多素子検出器と、その多素子検出器によ
   勺検出された多波長での時間変化を伴った検出値からな
   る三次元情報を演算処理するデータ処理部とを有する高
   速液体クロマトグラフィーもしくはフローインジェクシ
   ョンアナライザーにおいて、 前記データ処理部が、前記三次元情報を記録する記録部
   と、前記試料液中に含まれる複数個の試料成分それぞれ
   に対応する標準スペクトル情報および標準クロマト波形
   を予め記憶しておくだめの情報記憶部と、検出記録され
   た前記三次元情報と前記情報記憶部から読出された情報
   に対し最小二乗誤差評価による演算処理を行なう演痒処
   理部とを具備し、 前記観測された三次元情報での時間軸のクロマトが分離
   不完全な複数成分の試料のクロマト波形の合成からなる
   場合に、前記ｔＷ報記憶部に予め記憶されている前記各
   成分に対応する標準スペクトルを読出して、その標準ス
   ペクトルを観測された三次元情報の合成スペクトルに演
   算処理部において最小二乗誤差評価で適合させる演算を
   観測時間領域にわたって行なうようＫしたことを特徴と
   する多波長同時検出にょる定置分析装置。
7. （７）　分光器内のフローセルを通過する試料液を多波
   長で同時検出する多素子検出器と、その多素子検出器に
   よシ検出された多波長での時間変化を伴った検出値から
   なる三次元情報を演算処理するデータ処理部とを有する
   高速液体クロマトグラフィーもしくはフローインジェク
   ションアナライザ−において、 前記データ処理部が、前記三次元情報を記録する記録部
   と、前記試料液中に含まれる複数個の成分のうちの既知
   成分に対応する標準スペクトル情報および標準クロマト
   波形を予め記憶しておくだめの情報記憶部と、検出記録
   された前記三次元情報と前記情報記憶部から読出された
   情報に対し最小二乗誤差評価による演算処理を行なう演
   算処理部とを具備し、 前記観測された三次元情報でのクロマトが分離不完全な
   複数成分の試料の合成りロマト波形であってしかも未知
   試料成分を含む場合に、前記情報記憶部に予め記憶され
   ている既知成分の標準スペクトル情報を続出して、演算
   処理部においてその読出褌れた標準スペクトルを観測さ
   れた合成スペクトルに最小二乗誤差評価で適合させる演
   算を行ない、その不一致分をそれぞれの観測時刻でめて
   請求めた値を未知試料成分のクロマト波形とする演算を
   行ない、さらに情報記憶部に予め記憶されている既知成
   分の標準クロマト波形と演算によりめられた未知試料成
   分のクロマト波形を、観測された合成りロマト波形に最
   小二乗誤差評価で適合させる演算を行なって未知成分を
   含む各成分の成分敬をめ、未知試料成分に対応する分離
   したクロマト波形をめるようにした多波長同時検出によ
   る定量分析装置。