JPH0245150B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は多素子検出器を用いて試料に対する
多波長同時検出を行ない、吸光度あるいは螢光強
度などの多波長での検出値の時間変化である三次
元情報を検出処理する分析法に関するものであ
り、特に高速液体クロマトグラフイーによる分析
やに適した分析方法に関するものである。

従来技術 例えば高速液体クロマトグラフイーによる分離
分析は、食品や薬品、石油化学、農業、生化学、
臨床分析など、多方面の分野で利用されている。
この高速液体クロマトグラフイーにおける試料成
分を検出する検知器としては、可視紫外分光光度
計や螢光分光光度計、屈折率計、熱伝導セル等が
用いられており、これらの検知器から得られた吸
光度、螢光強度、屈折率などの検生値の時間変
化、すなわち二次元情報からなるクロマト波形を
積分器などにより求めたピーク面積、ピークの出
る時間（リテンシヨンタイム）によつて定性・定
量分析することが行なわれている。

これらの分析は、試料液中に含まれる各成分に
よる各ピークの分離が充分良く、それぞれの成分
に対して独立ピークとみなすことができる場合は
正確な分離結果が得られるが、ピークが近い場合
や複数のピークが重なつた場合、あるいはピーク
のベースが平坦でなく大きくドリフトする場合な
どにおいては、ピーク分割処理、テイリング処
理、ドリフト処理等、種々の波形分離処理を行な
わなければならない。このような従来の波形分離
処理は、例えば講談社版『機器分析のためのコン
ピユータ入門』第189頁以降に紹介されていると
ころであり、また特公昭47−45556号、特公昭51
−40832号、特開昭56−22955号、特開昭57−
86047号等にも種々の処理方法が開示されている。

第１図には従来のこのような高速液体クロマト
グラフイーの一般的な概念図を示し、また第２図
には従来の波形処理方法の例を示す。

第１図において、リザーバータンク１からポン
プ２によつて汲上げられた溶媒は試料注入口とし
てのサンプルインジエクタ３に送られ、このサン
プルインジエクタ３において試料が溶媒に混合さ
れ、その試料を含んだ液はサンプルインジエクタ
３からカラム４に送液されて、そのカラム４にお
いて試料中の各成分が時間的に分離され、さらに
試料液は可視紫外分光検知器あるいは螢光検知器
などの検知器５内のフローセルを通過してドレイ
ン６に排出される。検知器５の出力はレコーダー
８およびインテグレータ７に導入され、レコーダ
ー８においてクロマト波形が記録されるとともに
インテグレータ７においてクロマト波形のピーク
面積が求められる。そしてクロマト波形のピーク
の分離が不完全な場合には、第２図に示すような
種々の波形分離処理を施す。例えば(a)ドリフト処
理、(b)垂直分割処理、(c)テーリング処理、(d)テー
リング垂直分割処理などの処理を前記インテグレ
ータ７において行ない、ピークの面積を求める。

しかしながら上述のような種々の波形分離処理
を行なつた場合、定量精度は極端に低下し、実用
上間題が生じる。そのため従来の高速液体クロマ
トグラフイーにおいては種々の試料に対して化学
的分離条件、溶離条件を探し出して独立のピーク
に分離するために多くの努力が払われていた。し
かしながらこのように探し出された分離条件でピ
ークをそれぞれ分離して分析する場合、当然のこ
とながら試料によつて分析時間が定まり、一般に
は分析に要する時間が長くなるなどの操作上の基
本的問題を内在していた。

したがつてルーチン分析等に用いる場合、分析
試料によつては作業能率が低下する問題があり、
また反復して用いる回数が少ないことが望ましい
貴重なサンプル、例えば微少生体サンプル等がピ
ークが完全に分離されずに分析された場合にその
後に化学的分離条件を探し出して再分析すること
が困難となり、またドリフトに依り微少、低濃度
サンプルの検出限界が低下するなど、種々の問題
があつた。

発明の目的 この発明は以上の事情に鑑みてなされたもの
で、高速液体クロマトグラフイーによる分析にお
いて、多素子検知器を用いて多波長同時検出を行
ない、吸光度あるいは螢光強度等の多波長での時
間変化である三次元情報を検出処理することによ
り、分離不完全な複数成分の合成クロマト波形の
検出結果であつてもデータの演算処理により精度
の高い分離定量を可能にした分析方法を提供する
ことを目的とするものである。

さらにこの発明の他の目的は、分離不完全な複
数成分のクロマト波形であつてしかも未知成分を
含む場合においても、データを演算処理すること
によつて既知試料成分と未知試料成分に対応する
完全に分離されたクロマト波形を求めることを可
能にするにある。

さらにこの発明の他の目的は、溶媒の２成分、
３成分混合等のグラジエント時のベースのドリフ
トを平坦に補正して記録し、あるいは検出器の温
度変化によるベースのドリフトを平坦に補正し、
微少低濃度サンプルの検出限界を向上させて高感
度測定を可能にした分析方法を提供することにあ
る。

そして以上のような分離分析が可能となること
により、従来の分析装置の欠点であつたルーチン
分析の作業能率の向上、貴重なサンプルの分析操
作上のミスをなくして精度の高い分析が可能とな
るのである。

発明の構成 この発明は以上のような目的を達成するため、
次のような構成を有する分析方法を提供する。

すなわち第１発明の分析方法は、フオトダイオ
ードアレイ等の多素子検出器を用いて、吸光度あ
るいは螢光強度等を多波長で同時検出し、多波長
での検出値の時間変化の三次元情報（すなわち時
間軸、波長軸、検出値軸の三次元情報）を検出処
理する、高速液体クロマトグラフイーにおける分
析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含
有する試料についてのものであつて、しかもその
三次元情報における時間軸でのクロマトが各成分
に分離不完全なものである場合に： 前記複数成分のうちの既知成分についての予め
記憶させてある各標準スペクトル情報を観測され
た試料の合成スペクトルに最小二乗誤差評価で適
合させる演算を行ない、かつその最小二乗誤差評
価における不一致分を各観測時刻で求め、その求
めた値を未知成分のクロマト波形とする第１の演
算過程； 試料成分のうち既知成分についての予め記憶さ
れている各標準クロマト波形と第１の演算過程に
よつて得られた未知成分のクロマト波形を、観測
された試料についての合成クロマト波形に最小二
乗誤差評価で適合させて、未知成分を含む各成分
の成分量を求める第２の演算過程； とによつて未知成分に対応する分離したクロマト
波形を求めて定量分析を行なうことを特徴とする
ものである。

ここで、第２の演算過程によつて求められた各
成分の成分量を用い、予め記憶されている既知成
分についての標準スペクトルに、それぞれ対応す
る既知成分の成分量を乗算して、その乗算した値
を観測記憶されている試料の合成スペクトルから
差し引いて未知成分のスペクトルを求めることが
できる。

さらに第２発明の分析方法は、前記同様に吸光
度あるいは螢光強度等を多素子検出器により多波
長で同時検出し、吸光度あるいは螢光強度等の検
出値の多波長での時間変化からなる三次元情報を
検出処理する、高速液体クロマトグラフイーにお
ける分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含
有する試料についてのものであつて、しかもその
三次元情報における時間軸でのクロマトが各成分
に分離不完全なものである場合に： 前記複数成分のうちの既知成分についての予め
記憶されている各標準クロマト情報を、観測され
た試料の合成クロマト波形に最小二乗誤差評価で
適合させる演算を行ない、かつその最小二乗誤差
評価における不一致分を各観測波長で求め、その
求めた値を未知成分のスペクトルとする第１の演
算過程； 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶
されている各標準スペクトル情報と前記第１の演
算過程によつて求められた未知成分のスペクトル
情報を、観測された試料についての合成スペクト
ル情報に最小二乗誤差評価で適合させて、未知成
分を含む各成分の成分量を求める第２の演算過
程； とによつて未知成分に対応する分離したスペクト
ル波形を求めることを特徴とするものである。

ここで、第２の演算過程で求められた各成分の
成分量を用い、予め記憶されている既知成分につ
いての標準クロマトに、それぞれ対応する既知成
分の成分量を演算して、その乗算した値を観測記
憶されている試料の合成クロマトから差し引いて
未知成分のクロマト波形を求めることができる。

実施例 第３図には、この発明の方法を実施するための
高速液体クロマトグラフイーの全体構成の一例を
既略的に示す。なお第３図において、第１図に示
される従来の装置の要素と同一の要素については
同一の符号を付し、その説明は省略する。

第３図の装置においては、試料に対する検知器
５として、フオトダイオードアレイ等の多素子検
出器５Ａ（第４図参照）を内蔵した多波長同時検
出型の分光光度計が用いられている。また従来の
装置におけるインテグレータ７、レコーダ８の代
りにコンピユータ等からなるデータ処理部９とＸ
−Ｙプロツター１０を用いた構成とされている。

第４図には、第３図の装置に用いられる多波長
同時検出型のダブルビーム方式の分光光度計５の
一例を示す。光源１１からの光はビームスプリツ
タ１２によりダブルビームに分割され、各ビーム
がそれぞれ参照室１３、試料室１４を通過する。
試料室１４内には図示しないフローセルが設けら
れており、試料を含んだ液がこのフローセルを通
過する。一方参照室１３内には空のセルもしくは
標準物質を収容したセルが設けられている。前記
参照室１３および試料室１４をそれぞれ通過した
各ビームすなわち参照光および試料光は、チヨツ
パー１５により交互にチヨツピングされた後、回
折格子１６で分光され、さらにビーム混合器１７
で混合されて、例えば32チヤンネルのフオトダイ
オードアレイからなる多素子検出器５Ａで検出さ
れる。この多素子検出器５Ａを構成する例えば32
個の単位検出素子５１には、それぞれ多波長に分
光された各波長（各チヤンネル）の光が、参照
光、試料光と交互に入射され、参照光の出力で規
格化された試料光強度に相当する信号が出力され
る。すなわち、多素子検出器５Ａからは、観測波
長領域を32チヤンネルに分割した各チヤンネル
（各波長）それぞれにおける試料光強度に対応す
る32チヤンネルの信号が同時に出力される。

第５図Ａ，Ｂ，Ｃは、前記多素子検出器５Ａか
らの検出出力を三次元情報、すなわち波長軸（チ
ヤンネル軸）、時間軸、検出値軸（吸光度軸ある
いは光強度軸等）の三次元における情報として記
憶し、また試料に含まれていることが予想される
成分について予め実験により求めておいた標準ス
ペクトル情報もしくは標準クロマト情報を前もつ
て記憶させておき、観測された試料についての前
記三次元情報と、その試料に含まれる既知成分に
対応する予め記憶してある標準スペクトル情報お
よび標準クロマト波形とを演算処理してクロマト
波形分離を行なうためのコンピユータ等からなる
デーク処理部９を示す。そして特に第５図Ａは、
多素子検出器５Ａとしての32チヤンネルフオトダ
イオードアレイにより検出した32チヤンネルの信
号を読出すための回路部分９Ａを示し、また第５
図Ｂは第５図Ａにより読出された値をデジタル化
して、時間軸および波長チヤンネル軸に対応する
三次元情報として処理しかつ各種の制御を行なう
ための処理制御部分９Ｂを示し、さらに第５図Ｃ
は、予め用意された各種成分の標準スペクトル波
形情報および標準クロマト情報を記憶させてある
情報記憶部（フロツピーデイスク部）から記憶さ
れている情報を読出し、観測して記憶された試料
についての三次元情報と演算するデータステーシ
ヨン部９Ｃを示す。

第５図Ａ〜Ｃに示されるデータ処理部９におい
て、同時に観測される波長領域を32チヤンネルに
分割した各チヤンネルにおける検出値（この場合
には試料光強度）が多素子検出器５Ａから出力さ
れて、それぞれのチヤンネルに対応する前置増幅
器１９を経て主増幅器２０に送られ、その主増幅
器２０内の対数増幅器２０Ａによつて対数増幅さ
れるとともに同期スイツチ２０Ｂにより同期検出
される。なお同期スイツチ２０Ｂは同期信号発生
回路２０Ｃからの同期信号によつて制御される。
このようにして同期検出された各チヤンネルの主
増幅器２０の出力は、マルチプレクサからなるア
ナログスイツチ２３によつて順次読出され、レン
ジ切換回路２４を経て第５図ＢのＡ／Ｄコンバー
タ２５によりデジタル化され、インターフエース
２６を経て主コンピユータ２７に読込まれる。な
お前記アナログスイツチ２３は主コンピユータ２
７からの制御信号によつて切替制御される。そし
て主コンピユータ２７によつて検出値信号（対数
増幅値）は時間軸、波長軸（チヤンネル）に対応
した信号、すなわち三次元情報とされ、その三次
元情報はデータ・コマンド双方向転送インターフ
エース２８，２８′を介して第５図Ｃに示される
外部コンピユータ部、すなわちデータステーシヨ
ン部９Ｃへ送られる。

なお検出値は、前述のように通常の試料の光強
度として検出されて対数増幅されるが、通常の分
析ではその逆数、すなわち対数吸光度として用い
られることが多く、その場合には適宜逆数に変換
すれば良く、以下の説明では検出値を吸光度とし
て表現するものとする。

なおまた、第５図Ｂにおいて２１は多チヤンネ
ルDAC出力インターフエースで、外部コンピユ
ータ部（データステーシヨン部）を接続しない場
合等において演算を行なわない生データをＸ−Ｙ
プロツター１０その他の記録器に読出すためのも
のであり、また２２は各指令表示や指示スイツチ
等が設けられているフロントパネル、３０は多素
子検出器５Ａからの出力信号の少なくとも一部を
一時的に記憶して必要に応じて読出すためのメモ
リーである。

一方第５図Ｃのデータステーシヨン部（外部コ
ンピユータ部）９Ｃは、インターフエース２８′、
コンピユータ３２、フロツピーデイスク部３３、
CRT３４、プリンター３５、出力インターフエ
ース３６によつて構成されており、出力インター
フエース３６はＸ−Ｙプロツター１０に接続され
ている。フロツピーデイスク部３３は、試料に含
まれていることが予想される各種成分の標準クロ
マト情報もしくは標準スペクトル波形情報を記憶
しておくための情報記憶部を構成するものであ
り、またこのフロツピーデイスク部３３は前述の
観測された三次元情報や分離された各成分の波形
等も記憶する。そしてコンピユータ３２は、フロ
ツピーデイスク部３３から読出された標準クロマ
ト情報および標準スペクトル波形情報と観測され
た試料についての三次元情報を最小二乗誤差評価
法で演算処理して、分離されたクロマト波形を導
出し、その分離されたクロマト波形をＸ−Ｙプロ
ツター１０に表示させる。

次に上述のような装置を用いて定量分析を行な
うこの発明の方法について説明する。

第６図は多素子検出器によつて検出された、複
数成分を含有する試料についての三次元情報の一
例を示す。ここで水平面内のＸ軸は時間ｔを表わ
し、Ｙ軸は波長λを表わし、また高さ方向のＺ軸
は吸光度を表わす。この例では、クロマト波形
（すなわち時間軸−吸光度軸のなす面における波
形）のピークが分離されておらず、複数成分の含
成クロマト波形となつている。もちろんスペクト
ル波形（波長軸−吸光度軸のなす面における波
形）も複数成分の合成スペクトル波形となつてい
る。

第７図は、スペクトル波形およびクロマト波形
と前記三次元情報との関係を判り易く模式的に示
す図である。なおこの図では試料が３成分を含有
し、そのうち２成分が既知成分で残る１成分が未
知成分である場合について例示する。以下この図
を参照して説明を進める。なおここでは多成分ス
ペクトルのそれぞれの成分間に干渉はなく、各成
分量（組成比）とスペクトル強度情報（対数変換
値の吸光度も含む）との間に線形性が成り立つも
のとして扱かう。

先ず、観測した試料に含まれる複数の成分が、
それ自体は既知であるが、それらの既知成分から
なる観測した試料のクロマト波形（したがつて複
数の既知成分の合成クロマト波形）のピークが完
全に分離されていない場合において、分離された
各成分ごとのクロマト波形を求めるためのこの発
明による演算処理方法を説明する。

この場合には、観測した試料に含まれる各成分
の標準スペクトル波形（予め記憶してあるもの）
を読出し、その各成分の標準スペクトルに各々の
成分濃度（未知量）を掛けてその合成値を観測し
た試料の合成スペクトル（三次元情報のうちの波
長軸−吸光度軸の情報）に最小二乗法で適合させ
ることにより、ある観測時刻での各成分の成分比
を求め、同様の演算を観測時間の全域（もしくは
主要領域）にわたつて各時刻ごとに行なうことに
より、各試料成分の分離されたクロマト波形を求
める。

すなわち、観測した試料にｍ個の既知成分が含
まれており、観測波長領域がｎチヤンネル（前述
の例では32チヤンネル）に等間隔に分割されてい
る場合、ある時刻ｔにおけるスペクトルの横軸
（波長軸）のｎ個の等間隔分点のうちのｉ番目分
点におけるｍ個の標準スペクトル（前もつて記憶
させてあるｍ個の成分に対応する標準スペクト
ル）のうちｊ番目標準による縦軸値（吸光度）を
Rijとする。そのｊ番目の成分の成分量Xjを未知
量とし、その値Xjをそれぞれ対応する標準スペ
クトルの縦軸値Rijに掛けて、観測された試料の
合成スペクトルの波長軸上のチヤンネルｉ番目分
点の縦軸値（吸光度）Siに適合させる操作を行な
えば良い。

最小二乗誤差評価でこれを実行するためには、
次の(1)式におけるＱの値を最小とすれば良い。

Ｑ＝_o 〓ⁱ⁼¹ 〔Si−_n 〓^j=1 Xj・Rij〕² ……(1) 但しここで標準スペクトルは生データSiと比べ
て充分に正確に求められているものとする。

∂Q／∂Xnを求めて０と置いて得られる正規式
は次の(2)式となる。

この(2)式の解は、行列表示を用いれば、 Ｘ＝（R^TＲ）^-1R^TＳ ……(3) の形で得られる。この解を得る手法としてはいく
つかの方法があるが、通常は第８図に示す手順で
行なう。すなわち、ｍ個の標準スペクトルからＲ
の要素Rij（ｉ＝１〜ｎ、ｊ＝１〜ｍ）、すなわち
各縦軸値を読む。次いでR^TＲの計算を行ない、
また試料の観測スペクトル値Si（ｉ＝１〜ｎ）を
読み、R^TＳの計算を行なう。そしてＸ＝（R^TＲ）
^-1R^TＳをコレスキ（Choleski）の方法で計算し
てＸを求める。

このようにして、ある時刻でのｍ個の成分の各
成分量Xj（ｊ＝１〜ｍ）が求められる。そしてこ
のような演算を観測時間軸の全領域にわたつて
次々に行なうことにより、各時刻における各成分
の成分量が観測時間軸の全領域にわたつて求めら
れる。したがつてある波長での各試料成分の成分
量の時間変化、すなわちクロマト波形が分離され
て求められる。なお場合によつては、吸光度が零
もしくは零に近い平坦な部分の時刻については上
述のような演算を省略して、観測時間軸の主要領
域のみについて上述のような演算を行なうことに
より分離されたクロマト波形を求めることもでき
る。

次に、試料中に含まれる複数成分のうちに未知
成分がある場合において、その未知成分のクロマ
ト波形を分離して求めるためのこの発明による演
算処理方法について説明する。

この場合には、試料中に含まれる複数成分のう
ちの未知成分を除いた複数個の既知成分の標準ス
ペクトル波形（予め記憶してあるもの）を読出
し、前記と同様に各既知成分の標準スペクトルに
それぞれの既知成分の成分量（未知量）を掛けて
その値を観測した試料の合成スペクトルに最小二
乗法で適合させる演算を行なう。ここで既知成分
の成分量は(1)式におけるＱの値が最小値をとると
きのXjの値である。一方、観測された試料の合
成スペクトルが、既知成分のスペクトルのみの合
成となつている場合（すなわち全成分の標準スペ
クトルで最小二乗誤差評価を行なう場合）には、
このＱの値の最小値は零に近くなるが、未知成分
を含む場合にはその未知成分の存在により最小二
乗法による一致度が悪くなり、Ｑは正の値とな
る。このようにＱの値が最小値となるときのＱの
値の平方根、すなわち不一致分はスペクトル座標
面における未知成分の成分量に対応することにな
る。そこでこのような演算を観測時間軸の全領域
にわたつて行つて、各時刻におけるＱの最小値の
平方根（不一致分）を次々に求めることにより、
未知成分のクロマト波形を求めることができる。
但しここで得られた未知成分のクロマトグラム
は、前記(1)式から明らかなように未知成分のピー
ク波形は知ることができるが、吸光度スケールを
決定することができない。すなわち(1)式において
Ｑの値は二乗の値の積分値となつているから、Ｑ
の平方根の値の大小は未知成分の大小と対応する
が、Ｑの平方根自体は未知成分の成分量自体と等
しくならない。そこでこの発明の方法において
は、さらに次のような演算処理を行なつて未知成
分を含む各成分の成分量（混合比）を求め、吸光
度スケールを決定する。

すなわち前述のようにして求められた未知成分
のクロマトグラムと予め記憶されている既知成分
の標準クロマト波形とを、観測された多成分試料
の合成クロマトに最小二乗誤差評価で適合させ
る。この演算は、前の段階でスペクトル座標面
（吸光度軸−波長軸）において行つた最小二乗誤
差評価を、座標面を変えてクロマト座標面（吸光
度−時間軸）で行なうことを意味する。すなわち
前記(1)式における波長軸での等間分点ｉ（ｉ＝１
〜ｎ）を時間軸での等間隔分点に置き換え、その
時間軸での等間隔分点における標準クロマト波形
および未知成分クロマト波形の縦軸値をＲとして
演算を行なう。このような演算によつて未知成分
を含めて各試料成分の混合比が求められ、したが
つて未知成分のクロマト波形の吸光度スケールが
他の既知成分のクロマト波形の吸光度スケールと
同一とされ、定量分析を行なうことができる。

さらに未知成分のスペクトル波形を求める場合
には、上述の演算によつて求められた各既知成分
の成分量と予め記憶されている各既知成分に対応
する標準スペクトルを掛け合せ、その合成値を、
観測された未知成分を含む試料の合成スペクトル
から差引けば、その差し引いた残りが未知試料成
分のスペクトルとして求められる。

以上のようにして、未知成分を含む試料の場合
に、その未知成分のクロマト波形およびスペクト
ル波形を求めることができる。

なお試料に含まれる未知成分の数は１種に限ら
ず、２種以上の未知成分が含まれている場合にも
適用可能である。但し２種以上の未知成分が含ま
れている場合には、それらの複数の未知成分の合
成クロマトあるいは合成スペクトルが求められる
ことになる。

また未知成分を含む場合、上述の説明では、最
初に既知成分の標準スペクトル波形を用い、観測
した合成スペクトルを最小二乗誤差評価で適合さ
せる演算を各時刻で行つて未知成分のクロマト
（但し吸光度スケールが決定されていないもの）
を求め、次の段階で既知成分の標準クロマト波形
および前の段階で求められた未知成分のクロマト
を用いて観測された試料の合成クロマト波形に最
小二乗誤差評価で適合させる演算処理を行なうも
のとしたが、場合によつては逆に最初の段階で既
知成分の標準クロマト情報を用いて観測された試
料の合成クロマトに最小二乗誤差評価で適合させ
る演算を行なうことにより未知成分のスペクトル
（但し吸光度スケールが決定されていないもの）
を求め、次の段階で既知成分の標準スペクトル波
形および前の段階で求められた未知成分のスペク
トルを用いて、観測された合成スペクトル波形に
最小二乗誤差評価で適合させる演算を行なつても
良い。

すなわち、最初の段階では、試料中に含まれる
複数成分のうち既知成分の標準クロマト波形（予
め記憶してあるもの）を読出し、各既知成分の標
準クロマトにそれぞれの既知成分の成分量（未知
量）を掛けてその合成値を観測した試料の合成ク
ロマトに最小二乗誤差評価で適合させる演算を観
測波長軸の全領域もしくは主要領域にわたつて行
ない、その不一致分（Ｑの平方根の値）を未知成
分のスペクトルとする。このスペクトルは前述の
場合と同様に吸光度スケールが決定されていない
ものである。そこで吸光度スケールを決定するた
めに、前述のようにして求められた未知成分のス
ペクトルと予め記憶されている既知成分のスペク
トルとを。観測された試料の合成スペクトルに最
小二乗誤差評価で適合させ、これによつて未知成
分を含めて各試料成分の成分量を求め、吸光度ス
ケールを決定する。これによつて未知成分のスペ
クトルも既知成分のスペクトルと同一スケールと
される。さらに、上述の演算によつて求められた
既知成分の成分量と予め記憶されている各既知成
分の標準クロマトを掛け合わせ、その値を観測さ
れた合成クロマトから差し引けば、その差し引い
た残りが未知試料成分のクロマトとして求められ
る。

次にこの発明の方法を複数成分試料の分析に実
際に適用した例を記す。

第９図は、ナフタレンとアントラセンを含有す
る試料の場合の例であり、第９図Ａはその複数成
分の合成クロマト波形、すなわち各成分に分離す
る前のクロマト波形を示し、ここではクロマト波
形のピークが分離されていない。一方第９図Ｂは
この発明の方法にしたがつて分離したナフタレン
およびアントラセンのクロマト波形を示す。

第１０図Ａ〜Ｄ、第１１図Ａ，Ｂは試料成分が
ナフタレン、アントラセン、ピレンからなる３成
分試料の場合についての例であり、第１０図Ａ，
Ｂ，Ｃはそれぞれナフタレン、ピレン、アントラ
センを可視紫外スペクトルを示す。一方第１１図
Ａは、この３成分試料におけるアントラセンを未
知成分、ナフタレンおよびピレンを既知成分とし
て第２発明の第１の演算過程にしたがつて前記演
算式(1)のＱの値が最小となるようにしてナフタレ
ン（Na）およびピレン（Pr）のクロマト波形を
求め、かつＱの値の最小値の平方根（不一致分）
をアントラセン（An）のクロマトとしてプロツ
トしたもの（したがつて吸光度スケールが決定さ
れていないもの）を示す。そして第１１図Ｂは、
第２の演算過程により最終的に未知成分を含めた
混合比を決定した各成分のクロマトグラムを示
す。第１１図Ｂでは第１１図Ａの場合と比較して
アントラセン（An）の成分量が低くなつている
ことが判る。さらに、第１１図Ｂで求められた成
分量に基いて、アントラセンのスペクトルを算出
した例を第１０図Ｄに示す。この第１０図Ｄに示
されるアントラセンの算出スペクトルは、第１０
図Ｃに示されるアントラセン実測スペクトルと良
く一致していることが判る。

上述のように、この発明の各方法は、実際の分
析にも充分な精度で適用できることが判明した。

発明の効果 以上の説明で明らかなようにこの発明の方法に
よれば、分離不完全な複組成のクロマト波形であ
つても、データを演算処理することによつて精度
の高い分離定量が可能となり、また未知試料成分
を含む場合にも、データを演算処理することによ
つて未知試料成分の分離したクロマト、スペクト
ルを求めて未知試料成分の分離定量を行なうこと
が可能となつた。したがつてこの発明の方法を適
用することによつて分析作業能率の向上を図り、
かつ貴重なサンプルの分析操作上のミスで分析不
可能とすることなく、精度の高い測定が行なえる
など、産業上多大な貢献をすることができる。

なおこの発明は検出値としても吸光度もしくは
光強度（透過率）のみならず、螢光強度等であつ
ても良く、要は多波長で同時検出して時間変化に
よる三次元情報としてデータが得られる分析には
全て適用可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の高速液体クロマトグラフイーの
一般的な構成を示す略解図、第２図は従来の高速
液体クロマトグラフイーにおける波形分離処理の
代表例を示す模式図で、ａはドリフト処理、ｂは
垂直分割処理、ｃはテーリング処理、ｄはテーリ
ング垂直分割処理の例をそれぞれ示す。第３図は
この発明を実施するための高速液体クロマトグラ
フイーの全体構成の一例を示す略解図、第４図は
第３図の装置における検出部として用いられる多
波長同時検出型ダブルビーム方式の分光光度計の
一例を示す略解図、第５図Ａ，Ｂ，Ｃはこの発明
の方法に用いられるデータ処理部の一例を示すブ
ロツク図、第６図はこの発明における多素子検出
器から得られた三次元情報の一例を示す波形図、
第７図は三次元情報とクロマト波形、スペクトル
波形との関係を原理的に示す模式図、第８図はこ
の発明における波形分離のために用いられる最小
二乗誤差評価の実際の演算処理手順を示すフロー
チヤート、第９図Ａ，Ｂは試料にナフタレンおよ
びアントラセンが含まれる場合のこの発明の方法
によるクロマト分離例を示す波形図、第１０図Ａ
〜Ｄはナフタレン、ピレンおよびアントラセンの
スペクトルと、演算により求めたアントラセンの
スペクトルを示す波形図、第１１図Ａ，Ｂは未知
成分としてのアントラセンと既知成分としてのナ
フタレンおよびアントラセンを含む試料について
第２発明の方法で分離定量した例を示すクロマト
波形図である。 １……リザーバータンク、２……ポンプ、３…
…サンプルインジエクタ、４……カラム、５……
検知器、５Ａ……多素子検出器、９……データ処
理部、９Ａ……検出回路部分、９Ｂ……処理制御
部分、９Ｃ……データステーシヨン部、１０……
Ｘ−Ｙプロツター、１１……光源、１３……参照
室、１４……試料室、１５……チヨツパー、１６
……回折格子、２７……主コンピユータ、３３…
…フロツピーデイスク部（情報記憶部）、３５…
…プリンター。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 多素子検出器を用いて、吸光度あるいは蛍光
   強度等を多波長で同時検出し、吸光度あるいは蛍
   光強度等の検出値の多波長での時間変化の三次元
   情報を検出処理する、高速液体クロマトグラフイ
   ーによる分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含
   有する試料についてのものであつて、しかもその
   三次元情報における時間軸でのクロマトが各成分
   ごとに分離不完全なものである場合に： 前記複数の試料成分のうちの既知成分について
   の予め記憶させてある各標準スペクトル情報を、
   観測された試料の合成スペクトルに最小二乗誤差
   評価で適合させる演算を行ない、かつその最小二
   乗誤差評価における不一致分を各観測時刻で求
   め、その求めた値を未知成分のクロマト波形とす
   る第１の演算過程と； 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶
   させてある各標準クロマト波形と第１の演算過程
   によつて得られた未知成分のクロマト波形を、観
   測された試料についての合成クロマト波形に最小
   二乗誤差評価で適合させて、未知成分を含む各成
   分の成分量を求める第２の演算過程； とによつて未知成分に対応する分離したクロマト
   波形を求めて定量分析を行なうことを特徴とする
   多波長同時検出による定量分析方法。 ２ 前記第２の演算過程によつて求められた各成
   分の成分量を用い、予め記憶されている既知成分
   についての標準スペクトルに、それぞれ対応する
   既知成分の成分量を乗算して、その乗算した値を
   観測記憶されている試料の合成スペクトルから差
   し引いて未知成分のスペクトルを求める第３の演
   算過程を有する特許請求の範囲第１項記載の多波
   長同時検出による定量分析方法。 ３ 多素子検出器を用いて、吸光度あるいは蛍光
   強度等を多波長で同時検出し、吸光度あるいは蛍
   光強度等の検出値の多波長での時間変化の三次元
   情報を検出処理する、高速液体クロマトグラフイ
   ーによる分析方法において、 その三次元情報が未知成分を含む複数成分を含
   有する試料についてのものであつて、しかもその
   三次元情報における時間軸でのクロマトが各成分
   ごとに分離不完全なものである場合に： 前記複数の試料成分のうちの既知成分について
   の予め記憶させてある各標準クロマト情報を、観
   測された試料の合成クロマト波形に最小二乗誤差
   評価で適合させる演算を行ない、かつその最小二
   乗誤差評価における不一致分を各観測時刻で求
   め、その求めた値を未知成分のスペクトルとする
   第１の演算過程と； 試料成分のうちの既知成分についての予め記憶
   させてある各標準スペクトル情報と前記第１の演
   算過程によつて求められた未知成分のスペクトル
   情報を、観測された試料についての合成スペクト
   ル情報に最小二乗誤差評価で適合させて、未知成
   分を含む各成分の成分量を求める第２の演算過
   程； とによつて未知成分に対応する分離したスペクト
   ルを求めることを特徴とする多波長同時検出によ
   る定量分析方法。 ４ 前記第２の演算過程によつて求められた各成
   分の成分量を用い、予め記憶されている既知成分
   についての標準クロマトに、それぞれ対応する既
   知成分の成分量を乗算して、その乗算した値を観
   測記憶されている試料の合成クロマトから差し引
   いて未知成分のクロマトを求める第３の演算過程
   を有する特許請求の範囲第３項記載の多波長同時
   検出による定量分析方法。