JP2000508771A5 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【著作権について】
【０００２】
本特許文書の開示内容の一部は、著作権保護の対象となる。しかし、著作権者は、米国特許商標庁の特許ファイル又は特許記録に存在しているままの形態であるならば、本特許文書または本特許開示内容のファクシミリによる複製を認める。
【０００３】
【発明の分野】
本発明は、一般にはクロマトグラムの分析に関する。さらに詳細には、本発明は、これに限定されるのではないが、クロマトグラフィ分析の精度を向上させるためにクロマトグラフ変動（chromatographic variability）を決定することに関する。
【０００４】
【発明の背景】
クロマトグラフィは、多成分物質の分析に広く使用されている手法である。クロマトグラフィでは、既知が組成又は未知である液体やガスがクロマトグラフに注入され、クロマトグラフからは、二次元グラフの形状を有するクロマトグラムが生じる。このクロマトグラムでは、注入した液体の吸光率、注入したガスの導電率又はそれ以外の物理的応答が時間に対してプロットされる。液体又はガスがクロマトグラフを通るときの時間経過に対する液体の吸光率又はガスの導電率の変化が、液体混合物又はガス混合物の組成を表している。
【０００５】
クロマトグラフィの通常の用途としては、製造された物質を分析して組成を確認するという品質管理、および未知物質からのクロマトグラムを生成させて該物質の組成を分析・決定するという定性分析と定量分析がある。品質管理での用途においては、既知物質と所望物質のクロマトグラムを生成させ、これらを製造物質のクロマトグラムと比較する。定性・定量分析での用途においては、未知物質の１つ以上のクロマトグラムを生成させ、成分の同定を行うか、あるいは物質中の各成分の量を定量する。
【０００６】
上記用途のいずれも、クロマトグラムを解析して、他のクロマトグラムとの類似性又は相違性を決定しなければならない。一般にこのような解析では、あるクロマトグラムと他のクロマトグラムとの間で、ピークの保持時間、高さ、及び面積を含めて、ピークを解析・比較する必要がある。このような比較を行うためには、比較しようとするピークを識別する方法を開発して最適化しなければならず、次いでクロマトグラムのピークおよび上記の他の識別状況を比較する方法を開発しなければならない。主成分分析（Principal Component Analysis; PCA）はこのような方法の１つであり、G. MalmquistとR. Danielssonによる「Alignment of Chromatographic Profiles for Principal Component Analysis: A Prerequisite for Fingerprinting Methods”,Journal of Chromatography A，687(1994)71-88」に記載されている。MalmquistとDanielssonが説明しているように、対応するクロマトグラムを整列させるのに、選定されたピークの保持時間が使用されている。クロマトグラムが整列したら、吸光度を比較する。他の方法が、J.P.Masonらによる「“A Novel Algorithm for Chromatogram Matching in Qualitative Analysis”,Journal of High Resolution Chromatography，v. 15，pp. 539-547（August 1992）」に記載されており、ピークの高さ、面積、及び保持時間だけを比較する自動化されたクロマトグラフィマッチング法（chromatographic matching technique）が説明されている。
【０００７】
更に、クロマトグラフィ分析では、クロマトグラフによって生じる変動（例えば、ベースラインのドリフト、保持時間の変動、濃度の変化など）を考慮しなければならない。クロマトグラフによって生じるこうした変動は、クロマトグラフによって生成されるクロマトグラムにおける変動として現れ、このような幾つかの変動を考慮した解析が必要となるために分析をより複雑にする。MalmquistとDanielssonによる上記報文においては、PCAによるクロマトグラフィ分析を強化するというやり方でクロマトグラフ変動を補償する方法が説明されている。
【０００８】
クロマトグラフィ分析の公知の方法（例えば、MalmquistとDanielssonによって説明されている方法）は一般に、比較しようとするピークを識別する方法を規定する工程、ピークの種々のアスペクトを比較する方法を規定する工程、そしてクロマトグラフ変動の影響を考慮しつつ実際に比較を行う工程を必要とする。コンピューター化された方法（例えば、Masonにより説明されている方法）はこのような作業を行うのに有効であるが、公知の多くの方法は、依然として時間がかかりすぎであり、場合によっては単調で退屈であり、高度に訓練した作業者の技能を必要とする。
【０００９】
従って、本発明の目的は、クロマトグラフ変動を補償する際に、従来の方法で必要とされたピークやそれ以外の外形の特徴付けを必要とせずにクロマトグラフィ分析を行うシステムを提供することである。
【００１０】
【発明の概要】
本発明の主要な目的によれば、クロマトグラフィ分析システムは、クロマトグラフ変動を特徴付けるクロマトグラム整合手順（chromatogram alignment procedure）を使用する。本発明の他の目的によれば、クロマトグラフィ分析システムは、特徴付けされたクロマトグラフ変動をクロマトグラムの比較において用いる。本発明のクロマトグラフィ分析システムは、複数のクロマトグラムをパターンとして比較するのであって、ピークの特徴付けや付随しているピークのリフトオフポイント（lift-off point）やピークのタッチダウンポイント（touch down points）の識別を必要としない。さらに、ピークの高さ、面積、又は保持時間を算出する必要がない。本明細書で言う「特徴付け」とは、問題としているピークのリフトポイントやタッチダウンポイントの識別によってベースラインを明確化すること、および実際にピークの積分を行うこと、を必要とするピーク積分のプロセスを表しているものとする。本発明のクロマトグラフィパターン分析システムは、アイソクラチッククロマトグラフィ分離又は勾配クロマトグラフィ分離によって得られるクロマトグラムに適用することができる。アイソクラチッククロマトグラフィでは、クロマトグラフィ分離の全体にわたって溶媒の組成を一定に保持する。勾配クロマトグラフィでは、化合物の保持時間に対する制御を高めるために、溶媒の組成を所定の仕方にしたがって変化させる。
【００１１】
本発明の原理にしたがって機能するクロマトグラフィ分析システムは、第１の態様においては、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの差を決定する。標準クロマトグラムは、選定された溶離時間範囲にわたる標準クロマトグラムを示している一組の標準データポイントによって表され、またサンプルクロマトグラムは、同じ溶離時間範囲又は一定量の分だけオフセットされた溶離時間範囲にわたるサンプルクロマトグラムを示している一組のサンプルデータポイントによって表される。標準データポイントとサンプルデータポイントとは、それぞれが、個々のクロマトグラムを一定の割合でサンプリングすることによって得られる。本発明のクロマトグラフィ分析システムは、次に、標準データポイントから複数組のクロマトグラフ変動データポイントを生成する。クロマトグラフ変動データポイントの各組は、標準クロマトグラムに及ぼす所定のクロマトグラフ変動源の影響を示す。更に、本発明のシステムは、修正された標準データポイントの組を生成するのであるが、この修正された標準データポイントは、クロマトグラフ変動データポイントの関数として修正された標準データポイントに対応し、前記クロマトグラムを生成するクロマトグラフのクロマトグラフ変動をモデル化するものである。
【００１２】
本発明によるシステムでは、同じ混合物から得られた標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとを使用して、クロマトグラフ変動を決定することができる。さらに、本発明のシステムを使用して、別の又は未知の混合物からの標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間の類似性又は相違性を決定することができる。このような比較をしやすくするために、本発明のシステムは、第２に態様において、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間の相違を示す残差値（residue values）を生成する。同じ混合物の標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの比較から得られる残差値を、異なった混合物の標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの比較から得られる残差値と比較して、サンプルクロマトグラムに対応する混合物と標準クロマトグラムに対応する混合物が同じ混合物であるか又は異なった混合物であるかを決定することができる。
【００１３】
標準クロマトグラムから得られるクロマトグラフ変動データポイントにより、クロマトグラフ変動の影響によってのみ標準クロマトグラムとは異なる可能なクロマトグラムの広い範囲を示すよう、標準クロマトグラムを修正することができる。
【００１４】
本発明のシステムは、サンプルクロマトグラムに最もよく整合するモデルクロマトグラムを見いだすのに、標準クロマトグラムから誘導されるクロマトグラフ変動データポイントを使用する。この意味において、本発明のシステムは、標準クロマトグラムを修正することによってサンプルに現れるクロマトグラフィ一変動性を測定する。
【００１５】
クロマトグラフ変動データポイントの関数として生成されるスケールファクター（この「最良適合（best-fit）」モデルクロマトグラムを表している）は、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間のクロマトグラフ変動の１つの尺度である。モデルクロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間の差違がもう一つの尺度である。これらはいずれも、サンプルクロマトグラムと整合する標準クロマトグラムに基づいてモデルクロマトグラムを得るのに、標準クロマトグラムにどの程度の変動性を加えるべきか（クロマトグラフ変動データポイントを使用することにより）を本発明のシステムが決定する、という意味においてクロマトグラフ変動の好ましい尺度である。
【００１６】
標準クロマトグラムから誘導されるクロマトグラフ変動データポイントは、各標準クロマトグラムに対して１回だけ生成させればよく、標準クロマトグラムと複数のサンプルクロマトグラムとの間の変動性を決定する際に、繰り返し使用することができる。
【００１７】
上記にて要約されている原理にしたがって機能する実施態様は、該クロマトグラムの特定のピーク又は他の特徴を識別あるいは特性表示する必要なく、クロマトグラフ変動の正確な決定を有利な形でもたらす。クロマトグラムが同一又は類似の混合物からのものである場合は、ベースラインのドリフトによるクロマトグラフ変動、保持時間の変動、および濃度変化を測定し、該クロマトグラムの特定の特徴に関係なく、またクロマトグラフのさらなるキャリブレーションや、該混合物への基準化合物の付加を行わずに除外する。好ましい実施態様においては、本発明のクロマトグラフィ分析システムは、濃度の変化、保持時間の片寄り、保持時間の伸び、ベースラインの片寄り、およびベースラインの勾配によるクロマトグラフ変動を除去する。他の実施態様においては、本発明のシステムは、上記変動源の異なったサブセットのクロマトグラフ変動において、上記変動源のうちの１つのみによるクロマトグラフ変動を除去する。
【００１８】
本発明のこれらの特徴と利点および他の特徴と利点は、本発明の特定の好ましい実施態様についての下記の詳細な説明を考察することによって、より理解を深めることができる。下記の説明においては、添付の図面を参照しつつ説明する。
【００１９】
【詳細な説明】
図１は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）システム１０２からのデータを受け取るように結合された好適なクロマトグラフィパターン分析システム（ＣＰＡＳ）１００の概略図を示している。このようなシステムは、米国マサチューセッツ州ミルフォード０１７５７のウォーターズ・コーポレーション（Waters Corporation）から市販されており、ウォーターズ６２６（Waters^TM 626）という商品名のポンプを含み、このポンプは、インジェクタとカラムと検出器とを通して溶媒を廃棄ボトルに継続的にポンプ送りする。このようなシステムは、高分解能のタンパク質精製、ヘプチドのマッピング、核酸の単離、オリゴ糖類の精製と分析、マイコバクテリアからのミコール酸の分析などの種々の応用に対して適用可能である。インジェクタにより、カラムによって分離しようとするサンプル混合物を、ポンプによって生成される溶媒流れの中に注入する。インジェクタは、サンプルを自動的に加え、ミキシングし、そして注入するための自動化ルーチンを含めた種々の機能を果たすために、下記のクロマトグラフィマネジャを介してプログラム化できるオートサンプラ（Autosampler）とウォーターズ７１７（Waters^TM717）との組合せという形態をとるのが好ましい。注入された混合物の成分を分離するクロマトグラフィカラムの１つが、ウォーターズ・コーポレーションからウォーターズ（登録表象）デルタ・パック（Delta-Pak）（登録商標）Ｃ１８スチールカラムの商品名で入手可能である。このようなカラムは、３.９ｍｍの内径と１５０ｍｍの長さを有し、３００オングストロームの孔サイズを有する５ミクロンサイズのビーズが充填されている。検出器が、カラムを出る流出液流れの吸光率（absorptivity）を測定し、測定された吸光度（absorbance）を数字表示する。このような検出器も、ウォーターズ・コーポレーションからウォーターズ（登録商標）４８６チューナブルＵＶ吸光度検出器という商品名で市販されており、１９０〜６００ナノメートル（ｎｍ）の検出範囲、±２ｎｍの精度での８ｎｍのバンド幅、および±０.２５ｎｍの再現性をもたらす。ＣＰＡＳ１００は、ＨＰＬＣ１０２の操作を制御し、検出器のデジタル化出力を受け取るデータ・ステーションにより機能を果たすのが好ましい。このようなデータ・ステーションは、ワシントン州レッドモンドのマイクロソフト社から市販のウインドウズ３.１オペレーティングシステム、およびウインドウズ３.１に適合したアプリケーションプログラム（機器によってなされた分析から誘導される結果をプログラム化し、詳細に記録し、そしてリンクさせる能力も含めて、HPLC機器の作動の制御を可能にするようにクロマトグラフィデータマネージメントシステムを実行するミレニアム２０１０クロマトグラフィマネジャ(Millennium ２０１０Chromatography Manager）を含む）を実行するよう設計されたＰＣベースのコンピューターの形態をとるのが好ましい。このようなクロマトグラフィ・マネジャは、データの取得や他のシステム作動機能を制御するためのグラフィカル・ユーザ・インターフェースとＨＰＬＣ１０２によって結果の系統化、記憶、および検索を容易にするリレーショナルデータベースを提供する。
【００２０】
他のタイプの液体クロマトグラフやガスクロマトグラフも含めて、他のタイプのクロマトグラフィ機器をＣＰＡＳ１００と組み合わせて使用することができる。ＣＰＡＳ１００は、クロマトグラムをアナログ電圧信号の形で表したデータ（このとき一般には、１ボルトが１吸光度単位（ＡＵ）に等しい）、あるいはデジタル信号の形で表したデータを必要とする。信号は通常、１秒間に１つの割合でサンプリングされ、デジタル化される。クロマトグラフィのピークは一般に、隔離されたピークのリフトオフポイントからタッチダウンポイントまで測定したときに３０〜６０秒の幅である。
【００２１】
図１に図解されているように、ＣＰＡＳ１００は、それぞれのサンプルクロマトグラムについて、標準クロマトグラムと比較することにより、クロマトグラフ変動測定モジュール１０４を介して、残差値Ｓ^２を生成する。図１に示されるように、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラム１とは、それぞれ、同一の混合物から得られたクロマトグラムである。そして、別の混合物２,３,...,Ｎからは、複数のクロマトグラム（図１では、サンプルクロマトグラム２,３,..,Ｎとして示されている）が追加的に得られ、ＣＰＡＳ１００のクロマトグラフィ識別モジュール１０６に送られて、これら複数のサンプルクロマトグラムと標準クロマトグラムとの間の類似または差異が判断される。ＣＰＡＳ１００は、様々な目的に用いることができる。その一例として、混合物２,３,...,Ｎに対応するサンプルクロマトグラム２,３,...,Ｎを標準クロマトグラムと比較することにより、製造された混合物２,３,...,Ｎと所望の組成を有する混合物を表す混合物１との差を決定する品質管理がある。更に、ＣＰＡＳ１００は、ミコール酸分析やトリプシンマッピング（tryptic mapping）を含む他の多くの応用にも使用することができる。
【００２２】
図２は、図１の標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラム１とを示しており、好適実施例の動作を図解するのに用いる。図２では、標準クロマトグラムは実線２０２で、サンプルクロマトグラム１は点線２０２で、示されている。以下の説明では、標準クロマトグラム２０２の上の種々のポイントは偶数の参照番号２０４−２１０で、サンプルクロマトグラム２０２の上のポイントは奇数の参照番号２０５−２１１で示される。図２から明らかなように、標準クロマトグラム２０２とサンプルクロマトグラム２０２とは、それぞれ、複数のピーク２０４−２１１を含んでいる。さらに図２からわかるように、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとは、同一の混合物から得られているにもかかわらず、多くの点で異なっている。例えば、クロマトグラム２０３のピークは、時間経過と共に、クロマトグラム２０２の対応するピークからシフトし、拡大（ストレッチ）している。さらに、クロマトグラム２０３のベースラインも、クロマトグラム２０２から上方向へシフトされ傾斜が付けられている。また、クロマトグラム２０３のピークの高さは、対応するクロマトグラム２０２のピークの高さと異なっている。周知のように、このような差異は、クロマトグラフ自体の特性が、同じ混合物が注入される場合であってもわずかに異なるために生じる。例えば、クロマトグラフにおける溶媒流量が日によってあるいは機器ごとに変わり、ベースラインがドリフトすることがある。下記の表１には、クロマトグラムに影響を及ぼす一般的な機器変動を５つ挙げている。表１においては、最も左の欄に変動が、次いで右に向かって順に、変動の大きさを測定するモデル値、モデル値の単位、そして個々の欄に記載されている変動の物理的原因が表記されている。
【００２３】
【表１】

【００２４】
ＣＰＡＳ１００は、上記モデル値のそれぞれを、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラム１との比較により評価する。最初に、クロマトグラフ変動に起因するこれら２つのクロマトグラム間の差異を説明するために、５つのモデル値を決定する（「モデル変動」（model variability）と称する）。モデル変動がない場合、モデル値はｓ=１、ｒ=０、ｔ_ｏ=０、ｂ_ｌ=０、ｂ_ｏ=０である。いったんモデル変動が決定されると、残りの差異（「残差変動」（residual variability）と称する）が決定される。この明細書では、「残差変動」という用語は、表１で定義されているモデルによって記述されるクロマトグラフ変動からは生じない２つのクロマトグラム間の差異を表す。従って、モデル変動と残差変動とを用いて、異なった混合物からのクロマトグラムの分析精度を高める。
【００２５】
クロマトグラム２０２または２０２を表すデータをＣＰＡＳ１００に提供して分析する前に、標準クロマトグラムの溶離時間範囲を選択しなければならない。溶離時間範囲は、比較範囲とも称され、図２のグラフの横軸によって表される。溶離時間範囲は、比較しようとする標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの関心対象となるピークを含むように選択される。溶離時間範囲が少なくとも２つのピークを含む限りは、溶離時間範囲の長さに対して制約を設けないのが好ましい。さらに、溶離時間範囲内のピークが既知化合物のものであるか、未知化合物のものであるかどうかについても制約はない。例えば、ＣＰＡＳ１００が機能するためには、基準化合物からのピークが溶離時間範囲に含まれる必要はない。２つ以上のピークがあれば、相対的な保持時間のシフトと広がり、そしてベースラインのモデル値と濃度変化を決定することができる。ただ１つのピークだけの場合には、保持時間の拡大（ストレッチ）を決定することができない。従って、システムを適切に動作させるためには、比較範囲に少なくとも２つのピークを含む必要がある。
【００２６】
図２の例では、選択された比較範囲は、ポイント２１から始まってポイント４２０で終わる４００ポイントを含む。以下の説明では、比較範囲はインデクスｉ_Ｎによって示され、このときｉ_startは比較範囲における最初のポイント（ポイント２１）を、そしてｉ_stopは比較範囲における最後のポイント（ポイント４２０）を示す。この例では、比較範囲はＮ＝４００個のポイントを含む。なお、以下の説明においては、ベクトルや行列はボールドで示す（この日本語明細書では、その都度指摘することにする）。
【００２７】
比較範囲の他に、オフセット範囲（パラメータＫによってサンプリングインデクスの単位で表示）を選択しなければならない。オフセット範囲は、可能性のある最大の保持時間オフセットを示し、標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間の比較が変動する−Ｋから＋Ｋまでの範囲を特定する。従って、標準クロマトグラムは、サンプルクロマトグラムの（２Ｋ＋１）個の、重複する、Ｎ個のポイントを有する区域と比較する。オフセット範囲内のある特定のオフセットは、オフセット・インデクスと称される値ｋによって特定される。現実には、値（２Ｋ＋１）は、クロマトグラムのピークの幅と同等であることが多い。下記の例においては、Ｋ＝１０であり、したがって、オフセットはｋ＝＋１０からｋ＝−１０インデクスの範囲にある。
【００２８】
図３は、好適実施例によって実行され標準クロマトグラム２０２とサンプルクロマトグラム２０２とからクロマトグラフ変動を決定するステップを示すフローチャートである。図３では、標準クロマトグラム２０２からのデータを用いて、５つのクロマトグラフ変動曲線を生じさせる。これらの曲線は、それぞれ、対応するデータの組（本明細書では「クロマトグラフ変動データポイント」と呼ぶ）によって具体化され、３０２においてグラフの形で示され、より詳細には、図４（ａ）から４（ｅ）に示されている。前記の表１に記載の対応するモデル値が、各曲線と関連している。これらのクロマトグラフ変動曲線が、一組のクロマトグラフ変動データポイントの概念を具体的に表現している。
【００２９】
図４（ａ）に示されているデータポイントは、選択された溶離時間範囲の中で測定された最小吸光度を標準クロマトグラムから減算することによって得られる。選択された溶離時間範囲の中で測定された最小吸光度は、その時間範囲の中から全ての吸光度値を集めてソートし、そしてこのソートされた組から最も低い値を取り出すことによって見いだすことができる。こうして得られた図４（ａ）の曲線は、初期モデルクロマトグラム（ＩＭＣ）と称され、これに関連したスケーリングパラメータは、ｓと称され、ｓは、標準クロマトグラムの濃度変化をモデル化するように作用する。ＩＭＣのＮ個の成分は、ｐ_ｉ（ただし、ｉ＝１,...,Ｎ）と示すことにする。
【００３０】
図４（ｂ）に示されているデータポイントは、ＩＭＣの一次導関数を求めることによって得られる。この演算は、Abraham Savitzky and Marcel J．E．GolayによるSmoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures”, Analytical Chemistry，v.36，pp. 1627-1639（July 1964）に記載されたサビツキ・ゴーレイ（Savitzky-Golay）フィルタを使用して行うのが好ましい。
【００３１】
図４（ｂ）の曲線のＮ個の成分は、ｐ’_ｉで示すことにする。この曲線に関連したスケーリングパラメータはδである。図４（ｂ）の曲線のスケールリングされた成分をＩＭＣに加算することにより、ＩＭＣのピーク保持におけるｔ_ｏ＝δ／ｓに等しい時間分のシフトがモデル化される。
【００３２】
図４（ｃ）のデータポイントは、図４（ｂ）の曲線と、勾配が１（単位勾配）で平均がゼロの直線とを成分ごとに乗算することによって得られる。具体例で説明しよう。溶離時間範囲内にＮ個のポイントがある場合を考え、ｈをｈ＝（Ｎ−１）／２であるとすると、ｔ_ｉ=-ｈ,...,-１,０,１,...,ｈが、勾配が１で平均がゼロの曲線を定義する。この曲線に関連するスケーリングパラメータはｒである。図４（ｃ）の曲線のスケーリングされた成分をＩＭＣに加算することにより、ＩＭＣの中点の周りのＩＭＣピークの保持時間の拡大をモデル化することができる。ピークの保持時間は、保持時間と比較範囲の中点との差のｒ倍に比例する。
【００３３】
図４（ｄ）のグラフは、勾配がゼロで値が１の直線である。このグラフに関連するスケーリングパラメータはｂ_ｏである。図４（ｄ）のグラフのスケーリングされた成分をＩＭＣに加算すると、ＩＭＣのベースラインをｂ_ｏだけ変化させたものがモデル化される。図４（ｅ）のグラフは、勾配が１で平均がゼロの直線である。このグラフの成分は、上述したポイントｔ_ｉである。このグラフに関連するスケーリングパラメータはｂ_ｌである。図４（ｅ）の曲線のスケーリングされた成分をＩＭＣに加算すると、ＩＭＣのベースライン勾配をｂｌだけ変化させた状態のモデル化が得られる。
【００３４】
いったんクロマトグラフ変動曲線が得られると、ＣＰＡＳは、ステップ３０４で、Ｎ行５列のデザイン行列を生成する。したがって、この例では、デザイン行列の成分は、４００行５列で構成されている。ｉを１≦ｉ≦４００、ｊを１≦ｊ≦５とすると、デザイン行列の成分は、Ｄ_ｉｊによって表すことができる（国際公開では、Ｄはゴシック）。また、デザイン行列の各列は、１つのスケーリングパラメータに対応する。デザイン行列の各成分は、クロマトグラフ変動曲線の中の１つの曲線に沿った１つの点である。この同じデザイン行列を標準クロマトグラムと関連づけ、上述したインデクス・オフセットを特定するｋの全ての値に対して用いることが好ましい。
【００３５】
デザイン行列Ｄからは、下記の数式１の関係を用いて、フィルタ行列Ｆが得られる。
【００３６】
【数１】

【００３７】
フィルタ行列Ｆは、５行Ｎ列の行列である。フィルタ行列Ｆの各行は、個々のクロマトグラフ変動曲線に関連した射影ベクトルとして作用する、Ｎ個の成分を有する行ベクトルである。なお、上記の数式（１）では、プライム（「ダッシュ」とも称する）は行列の転置（transposition、行と列とを入れ替えた行列）を意味し、−１は逆行列（乗算して単位行列になる行列）を意味する。この技術分野の当業者であるならば理解するはずであるが、上記の数式（１）は、サンプルデータをデザイン行列のスケーリングされた列（scaled column）にあてはめる線形最小二乗問題への解を与える。換言すれば、上記の数式（１）で表される関係を、下記の数式（２）、（３）および（５）に示される関係と組み合わせると、Ｓ_ｋ ^２の最小値を与える５つのスケーリングパラメータ（ｓ，δ，ｒ，ｂ_ｏ，ｂ_ｌ）に対する一組の値が得られる。あるいは、これらの値を、５次元空間でサーチを行うことにより、または、やはり５次元空間で何らかの逐次的手段を用いることにより、求めることができる。
【００３８】
フィルタ行列Ｆが得られた後で、オフセット範囲Ｋに対する値が選択され、それぞれのインデクスオフセットの値ｋに対し、ブロック３０７の中に示されている機能が実行される。それぞれのインデクスオフセットｋに対し、ブロック３０７の中の機能により、当該インデクスオフセットｋに対する標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの差を示す量が得られる。
【００３９】
ステップ３０８では、最適（ベスト・フィット）なスケーリングパラメータが、フィルタ行列、サンプルクロマトグラム、およびオフセット・インデクスｋの関数として生成される。オフセット・インデクスｋに対する最適なパラメータは、オフセット・インデクスｋだけずれた（オフセットした）比較範囲に対応するサンプルクロマトグラムからの吸光度を選択することによって生成させるのが好ましい。従って、比較範囲がｉ_startからｉ_stopまでの範囲でにあるインデクスからのものである場合には、サンプルクロマトグラムは（ｉ_start＋ｋ）から（ｉ_stop+ｋ）までの成分を含むことになり、これを成分ｑで表すことにする。ブロック３０８において、我々は、次の数式（２）の量を最小化するベクトルｃ^ｋを見つける最小二乗問題を解くことになる。
【００４０】
【数２】

【００４１】
積Ｄｃ^ｋは、ベクトルｃ^ｋの５つの成分を用いて行列Ｄの列に重み付け（weighting）するという作用を有する。この例では、ｃ^ｋは５つの成分から構成される列ベクトルであり、これら５つの値はスケーリング・ファクタである。積Ｄｃ^ｋは、クロマトグラフ変動曲線に基づくクロマトグラフ・データｑｋに対するモデルである。ベクトルｑ^ｋはサンプル吸光度ｑ^ｋ _ｊを含む。数式（２）で与えられる量を最小化するベクトルｃ^ｋを求めることが、この数式への最小２乗解を得ることであり、ｋだけずれたサンプルクロマトグラフ・データに最もよく当てはまるモデルが得られる。上記の量を最小化するベクトルｃ^ｋを与えるよく知られた解が、次の数式（３）で表される関係を用いて、フィルタ行列Ｆから得られる。
【００４２】
【数３】

【００４３】
このよく知られている式と最小二乗問題に対する解とは、Gilbert Strangによる「Introduction to Applied Mathematics published by Wellesley-Cambridge Press，Wellesley，MA 02182 USA（1986），p. 37」に説明がある。列ベクトルｃ^ｋの５つの成分は、スケーリングパラメータ（ｓ，δ，ｒ，ｂ_ｌ，ｂ_ｏ）のそれぞれの最小二乗評価であり、次の数式（４）により関係付けられる。
【００４４】
【数４】

【００４５】
次に、ステップ３１０で、選択されたインデクスｋに対する最適モデルが、数式（５）を用いて、比較範囲の中にあるポイントの数（この例では、４００個）と長さが等しい列ベクトルｍ_ｉを生成させることによって得られる。
【００４６】
【数５】

【００４７】
数式（５）の右辺にある行列Ｄとベクトルｃ^ｋとの乗算は、パラメータ値ｃ^ｋを用いて行列Ｄ_ｉｊの列に重み付けを行い、その結果を加算するという効果を有する。こうして結果的に得られる和は、ｋだけずれたサンプルクロマトグラムに最もよく当てはまるモデルクロマトグラムを具体化する４００個のポイントの組を構成するモデルｍ^ｋである。
【００４８】
ステップ３１２では、２つの曲線の間の差を取ることにより、モデルクロマトグラム（ｍ_ｉ）とサンプルクロマトグラム（ｑ_ｉ ^ｋ）とを比較し、残差曲線（ｒ_ｉ＝ｍ_ｉ−ｑ_ｉ）を得る。量ｒ_ｉは、モデルクロマトグラムとサンプルクロマトグラムとのポイントごとの差である。ステップ３１４では、残差曲線から、残差の２乗の和（Ｓ^２）が数式（６）に従って、計算される。この残差の２乗の和は、残差値とも称され、モデルクロマトグラムに対するサンプルクロマトグラムのあてはめの精度の尺度となる。
【００４９】
【数６】

【００５０】
数式（６）の右辺は、数式（２）と数式（５）との組合せに等しい。
Ｓ^２ _ｋの値は、下記の数式（７）に示される関係を用いて正規化できる。正規化されたＲ_ｋは、モデル・クロマトグラムとサンプルクロマトグラムとの間の百分率偏差（percentage deviation）として、Ｓ^２ _ｋを表している。
【００５１】
【数７】

【００５２】
ステップ３１４でいったん残差値が得られると、ステップ３１６でオフセット・インデクスをインクリメントさせ、その範囲にある各オフセット・インデクスに対してステップ３０８からステップ３１４までを繰り返す。最初にオフセット・インデクスを−ｋに選択し、次いで、各オフセット・インデクス値に対するＳ^２値が生成されるまで、ステップ３０８、３１０、３１２および３１４を通過するそれ以後のパスのために、オフセット・インデクスを順にインクリメントさせる。図３ではインクリメントによってオフセット・インデクス値を変化させているが、値を変化させるのは、（ｋからデクリメントさせるなど）他の方法でもかまわない。ステップ３１８では、各オフセット・インデクスについて得られたＳ_ｋ ^２の値の最小値（この明細書ではＳ^２またはｍｉｎＳ^２と称する）が選択される。こうして得られた最小値が、最適のｋ^＊の値と、ｋ^＊に関連するパラメータとを与えることになる。
【００５３】
クロマトグラムが同一の混合物からのものであるときのＳ^２の挙動のため、このようなＳ^２の測定方法には意味がある。Ｓ^２は、濃度変化とクロマトグラフ変動との影響を除去した後で差を測定しているので、Ｓ^２およびシステムの残差誤差に特徴的なものに対して低い値が得られる。
【００５４】
図６（ａ）から６（ｄ）には、オフセット・インデクスｋ＝０の場合の最適モデルの例が示されている。図６（ａ）には、ｋ＝０だけずれたＩＭＣ（実線）とサンプルクロマトグラム（点線）との点が示されている。図６（ｂ）には、ｋ＝０だけずれたＩＭＣ（実線）とサンプルに最適に当てはまる最適モデル（点線）との点が示されている。図６（ｃ）は、最適モデル（点線）とサンプルクロマトグラム（実線）を示している。これら２つの曲線から、Ｒｄ＝１５．８％という相対偏差（Ｒ_ｄ）が得られる。図６（ｄ）は、図６（ｃ）のサンプルクロマトグラムとモデルクロマトグラムとの間のポイントごとの差であるある残差のプロットを示している。図６（ｄ）における値の２乗の総和により、Ｓ^２に対する値が得られる。
【００５５】
図７（ａ）から（ｄ）は図６（ａ）から（ｄ）に類似しているが、オフセット・インデクスｋ＝０の最適モデルの例を示している。ＩＭＣ（実線）とサンプルクロマトグラム（点線）とが図７（ａ）に示されており、ＩＭＣ（実線）と最適モデルのクロマトグラム（点線）とが図７（ｂ）に示されている。図７（ｃ）は、最良適合モデルのクロマトグラム（実線）とサンプルクロマトグラム（点線）とを示している。これら２つの曲線から、Ｒ４＝４％という相対偏差が得られる。言うまでもなく、ｋ＝４の方が、ｋ＝０よりも良好な当てはめを生じさせる。図７（ｄ）は残差値のプロットを示している。図６（ｄ）の場合もそうであるが、このプロットにおける値の２乗の総和がＳ^２の値を与える。
【００５６】
また、値ｍｉｎＳ^２は、２つのクロマトグラムの間の差の目安を与える。その際、これら２つのクロマトグラムが同一の混合物から得られたか異なる混合物から得られたかは問わない。同一のまたは類似する混合物から得られた複数のクロマトグラムを相互に比較することを通じてクロマトグラフ変動がいったん決定されると、異なる混合物からのクロマトグラムを標準クロマトグラムと比較することにより、ある異なる混合物が、標準クロマトグラムを生じさせた混合物と同一か異なるかを判断することができる。標準クロマトグラムを生じさせた標準混合物は基準標準または黄金標準と称されるが、多くの場合、この標準混合物を慎重に保管しておき、ごく少量ずつ、比較の際の基準物の一部として、週１回ベースで用いられる。分析担当者は、この基準となる混合物から１又は複数のクロマトグラムを得ておいて、新たに製造される混合物との比較に用いる。最も単純なケースでは、既に図１〜３を参照しながら論じたように、基準となる混合物から２つのクロマトグラム（標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラム）を得ることになる。しかし、多くの場合は、図５に示されているように、基準となる混合物から複数（Ｎ種類）のクロマトグラムを得ておく。図５の場合には、基準となる混合物である混合物１から複数の標準クロマトグラム（標準クロマトグラム１，２,...,Ｍ）を得ている。１つの混合物からＭ個のクロマトグラムを得ることで、Ｓ^２の値の統計的に有意な分布が得られ、偏差が大きなをクロマトグラムを分布値から除去することができる。データをこれ以外の方法を用いて収集することも可能である。例えば、臨床試験の場合、混合物が生物学的な供給源からのものであるときは、基準となる混合物を多く用いることがあり得る。一般に、ある値が分布の一部であるかどうかを決定する問題は、統計学でよく知られた問題である。この問題に対する可能な解法は、J. C. Miller and J. M. Millerによる「Statistics for Analytical Chemistry, published by Halsted Press：a division of John Wiley & Sons，New York（1988）」に記載されている。
【００５７】
図１およびそれに付随する説明でわかるように、未知のすなわちサンプルとなる混合物は、任意の数を用いることが可能である。最も単純なシナリオでは、図１に示されているように、基準となる混合物をただ１つだけ（混合物１）使用し、混合物１から２つのクロマトグラム（標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラム１）を得て、そして複数の未知の混合物（混合物２，３,...Ｎ）からそれぞれ１つのクロマトグラムを得る（サンプロクロマトグラム２，３,...Ｎ）。このようなシナリオにおいては、図２および図３に記載のように、標準クロマトグラムと複数のサンプルクロマトグラムとの比較から、５つの変動曲線、５つのスケーリング・パラメータ、整数であるオフセット、および残差値が得られる。残差値ｍｉｎＳ^２が記憶され、以下の説明においては基準残差（reference residual）と呼ぶ。応用例に適した手法を用いて、この基準残差から、標準からの最大許容偏差を示す閾値を生成する。この閾値は、例えば、基準残差の整数倍であったり、固定された値であったりする。閾値は、また、同一の混合物から得られた複数のサンプルクロマトグラムと標準クロマトグラムとの比較から得られる基準残差の分布を分析して求めることもできる。
【００５８】
次いで、標準クロマトグラムと複数の未知のサンプルクロマトグラムの中の１つとを比較する。標準クロマトグラムから得られた５つの変動曲線から、新たな５つのスケーリングパラメータ、新たな整数オフセット、新たな残差曲線、および新たな残差値ｍｉｎＳ^２が各サンプルに対して得られる。最後に、各サンプルに対して得られる残差値（未知の残差）を閾値と比較する。未知残差が閾値より大きければ、その残差に対応する混合物は標準混合物とは異なる、と決定される。未知残差が閾値より小さければ、その未知混合物は標準混合物と同一である（あるいは、厳密に言えば、標準混合物とは、認識できるほどには異なっていない）と判断される。
【００５９】
以上の議論では、１つの混合物から得られた１つのクロマトグラム比較領域を考察する場合の説明に重点をおいたが、既に示唆しておいた別の場合も存在する。例えば、上記の手法は、各クロマトグラムからのデータの比較範囲または比較部分が、重畳的でも非重畳的でもかまわないが、複数個ある場合にも適用可能である。トリプシンマップ（tryptic maps）を比較する際に有用であることが判明している比較方式として、ピーク幅が約５個または６個分の幅を有する１つの比較範囲を選択し、１つのピーク幅に相当する部分ごとの複数個の比較範囲を用いて比較を実行する方法がある。例えば、１５０個のポイントを含む１つの比較範囲を選択し、この比較範囲を約１〜５個のポイント分だけ移動させると、データの各ポイントは、約３０個〜１５０個の連続的な比較範囲に含まれることになる。本明細書で「移動ウインドウ比較（moving window comparison）」と称するこのような比較方法では、残差値を各比較範囲の中心位置の関数としてプロットできる。また、複数の残差値を組み合わせて１つの複合値を構成することもできる。さらに、それぞれが個別の比較から導かれた１又は複数のスケール値（scale value）を、各比較範囲の中心点の関数としてプロットすることもできる。
【００６０】
以上で説明した場合とは異なり、５つの変動曲線に反映された５つ未満の変動パラメータと５つのスケーリングパラメータとを用いる場合がある。一般に、５つの変動パラメータの一部としてその部分集合だけを用いる利点は、Ｒ及びＳ^２に対する残差曲線（residual difference curve）と残差値（residual difference value）との、サンプルクロマトグラムに反映されるサンプル混合物の変化に対する感度が向上することである。また、それぞれの比較に要する計算時間が短縮される利点もある。計算時間の短縮は、計算集約的である上述した移動ウインドウ比較法の場合に有用である。もちろん、存在するクロマトグラフ変動の複数の成分を適切にモデル化するには、十分な数のパラメータを用いなければならない。例えば、比較領域が狭く、わずかに数ピーク分の幅にすぎないときには、対応する３つの変動曲線及び３つのスケーリングパラメータと共に、変動パラメータを３つだけ含むモデルを使用することが可能であろう。好ましい選択は、ｓによってパラメータ化されるスケールファクタ、δによってパラメータ化される保持時間オフセット、およびｂ_ｏによってパラメータ化されるベースラインオフセットである。狭い比較領域であれば、残りの２つの変動である保持時間の伸び（ｒによってパラメータ化される）と、ベースラインの勾配（ｂ_ｌによってパラメータ化される）とは、有意的でない程度に小さいことがありうる。保持時間の伸びとベースラインの勾配とのいずれか一方を、第４の変数として考慮することもできるが、それは、第４の変数の追加が、クロマトグラフによって生じるこれらの効果に起因する変動によって正当化される場合である。
【００６１】
追加的な部分集合は、ただ１つの変動パラメータであるスケールｓで構成される。この部分集合が適切であるためには、ベースラインオフセットと勾配とは、それぞれの比較領域についてほぼ同じでなければならず、また、保持時間の伸びはほとんどゼロかまたはゼロでなければならない。この方法は、上述した３パラメータモデルや４パラメータモデルや、５パラメータモデルほどには効果的でない場合がある。特に、この方法は、サンプルピリオド（sample period）またはインデクスオフセットの整数に等しい保持時間オフセットの値をもたらす。しかし、この方法は、ピークの識別または特性付けを必要とすることなく、保持時間オフセットを測定できるという利点を有する。この方法は、さらに、濃度の比に対する値（スケール変化ｓ、残差曲線、および残差値Ｓ^２によって表される）を与えるという利点を有する。前記の１パラメータ法の欠点は、保持時間のシフトが、一般にはサンプルピリオドまたはインデクスオフセットの整数に対応しないという点である。我々は、パラメータδと保持時間シフトに関連した対応する曲線とを加えることによって、１つの変動パラメータｓを使用する上記方法を改良することができる。この２パラメータ法では、サンプリングユニットの整数以外だけオフセットされる複数の曲線を比較するときには、インテグラルインデクスオフセット間で内挿され、これによって保持時間のシフトが正確に測定される。さらに、この２パラメータ法は、残差曲線とＳ^２に対する値を生成するという利点を依然として有している。要するに、５個のパラメータを要素とする集合｛ｓ，δ，ｂ_ｏ，ｒ，ｂ_ｌ｝の有用な部分集合は、｛ｓ｝、｛ｓ，δ｝、｛ｓ，δ，ｂ_ｏ｝、｛ｓ，δ，ｂ_ｏ，ｒ｝、｛ｓ，δ，ｂ_ｏ，ｒ，ｂ_ｌ｝である。
【００６２】
図１、２および３を参照して説明した実施例は、汎用コンピュータ上で動作するプログラムとして実施するのが好ましい。マトラブ（MATLAB）プログラミング言語を用いた好ましい実装例のコードリストを以下に記載する。下記のリストは、米国マサチューセッツ州ネーティック０１７６０のマス・ワークス社（The Math Works, Inc.）から市販されているマトラブ（MATLAB）プログラミング言語用の適当なインタープリタを用いた解釈によって実行可能な形に変換できる。
【００６３】
【表２−Ａ】

【００６４】
【表２−Ｂ】

【００６５】
【表２−Ｃ】

【００６６】
言うまでもないことであるが、説明してきた特定のメカニズムと方法は、本発明の原理の１つの応用例を単に例示したにすぎない。本発明の真の精神と範囲を逸脱することなく、本発明の方法と装置に対する種々の改良形が可能である。

【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＰＬＣ機器に連結した好ましいクロマトグラフィ分析システムのブロック図である。
【図２】
好ましい実施態様の操作を示すためのインプットとして使用される標準クロマトグラムとサンプルクロマトグラムを示しているグラフである。
【図３】
好ましい実施態様の操作を示しているフローチャートである。
【図４】
図４（ａ）ないし４（ｅ）は、好ましい実施態様によって生成されるクロマトグラフ変動データポイントを図２の標準クロマトグラムの関数として示しているグラフである。
【図５】
図１のシステムの別の使用状態を示しているブロック図である。
【図６】
図６（ａ）ないし６（ｄ）は、異なったオフセット値に対する好ましい実施態様の操作を示しているグラフである。
【図７】
図７（ａ）ないし７（ｄ）は、異なったオフセット値に対する好ましい実施態様の操作を示しているグラフである。