CN104697967A - 高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，属于共焦显微成像技术、光谱成像技术和质谱成像技术领域。本发明将双轴共焦成像技术、质谱成像技术和光谱探测技术相结合，利用经超分辨技术处理的双轴共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨形态成像，利用质谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱信息进行光谱成像，然后再通过探测数据信息的融合与比对实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。本发明可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。

Description

高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置

技术领域

本发明属于共焦显微成像技术、光谱成像技术和质谱成像技术领域，将双轴共焦显微成像技术、质谱成像技术和光谱探测技术相结合，涉及一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱的高分辨成像。

技术背景

质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。

自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域-生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研究的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研究提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。

但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题：

1)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；

2)无法对中性原子、分子、中离子及基团等进行探测，其结果制约了样品质谱成分的准确完整获取；

3)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移问题。

而生物样品“微区”完整组分信息的准确获取对于生命科学研究具有极其重要的意义。事实上，如何高灵敏地探测微区质谱信息是目前生物质谱领域亟待研究的重要技术问题。

实事上，强脉冲激光聚焦到样品表面会使样品离子化，可激发出带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子等。如何能够完整地获取带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子的信息，对于高精度分析样品的组分具有重要意义。

利用激光诱导击穿光谱(LIBS)技术可测量等离子体发射光谱信息，获得样品中元素成分。将激光诱导击穿光谱(LIBS)技术与质谱探测技术相结合，可用来弥补激光质谱成像技术中无法获得中性原子、分子和中离子信息的不足。

激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。

基于此，本发明提出一种高空间分辨力的激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，其创新在于：首次将具有高空间分辨能力双轴共焦显微技术与激光诱导击穿光谱(LIBS)技术和质谱探测技术相融合，可实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。

本发明一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。

发明内容

本发明的目的是提高质谱成像的空间分辨力，提出一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测样品成份空间信息和功能信息。本发明将激光双轴共焦显微镜聚焦光斑的探测功能与激光聚焦解吸电离功能相融合，利用经超分辨技术处理的双轴共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨形态成像，利用质谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱信息进行光谱成像，然后再通过探测数据信息的融合与比对获得完整的样品成分信息，继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法，其利用高空间分辨双轴共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用质谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱进行探测，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的同时成像与探测，其包括以下步骤：

步骤一、使平行光束通过环形光发生系统后整形为环形光束，该环形光束再经测量物镜聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；

步骤二、使计算机控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向在测量物镜焦点附近上下移动，利用采集物镜、聚焦透镜和强度点探测器对经被测样品反射和分色镜透射的测量光束进行聚焦点探测，得到双轴共焦轴向强度曲线；

步骤三、将双轴共焦轴向强度曲线沿z向平移s后得到移位双轴共焦轴向强度曲线，然后将移位双轴共焦轴向强度曲线与双轴共焦轴向强度曲线相减处理得到错位双轴共焦轴向强度曲线；

步骤四、将错位双轴共焦轴向强度曲线的零点位置z_A减去平移值s/2得(z_A-s/2)，计算机依据(z_A-s/2)值控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向运动，使测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上；

步骤五、利用电离样品吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由采集物镜、聚焦透镜、强度点探测器共焦强度点探测器和三维工作台构成的激光双轴共焦探测系统对测量物镜聚焦到被测样品的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

步骤七、利用光谱探测系统对经分色器反射和光谱收集透镜收集的激光诱导击穿光谱进行探测，测得对应聚焦光斑区域的组分信息；

步骤八、计算机将激光双轴共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息、光谱探测系统同时探测激光聚焦微区的激光诱导击穿光谱、质谱探测系统同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态、光谱和质谱信息；

步骤九、计算机控制三维工作台使测量物镜对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态、光谱和质谱信息；

步骤十、重复步骤九直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机进行处理即可得到被测样品形态、光谱和质谱信息。

本发明高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法中，包括步骤一可为使平行光束通过矢量光束发生系统、和光瞳滤波器后整形为环形光束，该环形光束再经测量物镜聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。

本发明高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法中，包括步骤四可以为计算机依据双轴共焦轴向强度曲线最大值M对应的位置z_B值来控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向运动，使测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上。

本发明的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置，包括点光源、沿光轴方向放置的准直透镜、产生环形光束的环形光束光发生系统和聚焦光斑到被测样品的测量物镜，包括沿采集光轴放置的用于探测测量物镜聚焦光斑反射光强度信号的采集透镜、聚焦透镜和位于聚焦透镜焦点的光强点探测器，还包括探测激光诱导击穿光谱的分色镜、-光谱收集透镜和光谱探测系统，以及用于探测测量物镜聚焦光斑解吸电离的离子体羽组分的电离样品吸管和质谱探测系统，入射光轴和采集光轴之间的夹角为2θ，并关于测量面法线对称。

本发明的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置中，包括环形光束光发生系统可以用沿光轴方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统和光瞳滤波器替代。

有益效果

本发明对比已有技术，具有以下优点：

1)将具有高空间分辨能力的双轴共焦显微技术与质谱探测技术相融合，使双轴共焦显微成像系统的光斑实现聚焦探测和样品解吸电离双重功能，可实现样品微区质谱的高空间质谱显微成像；

2)激光诱导击穿光谱的同时探测，克服了现有激光质谱仪无法对中性原子、分子、中离子及基团等进行探测的不足，可以获得更为全面的微区组分信息；

3)利用错位相减双轴共焦轴向强度曲线的过零点进行样品预先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到样品表面，可实现样品微区高空间分辨质谱探测和微区显微成像，有效地发挥双轴共焦系统高空间分辨的潜能；

4)利用错位相减双轴共焦轴向强度曲线过零点进行样品预先定焦处理，可抑制现有质谱仪因长时间质谱成像中聚焦光斑相对被测样品的漂移问题；

5)利用环形光束成像既压缩了聚焦光斑的尺寸大小，又为质谱探测提供了结构方面的最佳融合，可提高激光质谱仪的空间分辨能力；

6)利用双轴结构光束斜入射探测，克服了现有共焦显微成像技术无法抑制焦面杂散光干扰的缺陷，抗杂散光能力强。

附图说明

图1为高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法示意图；

图2为高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法变换示意图；

图3为实施例1的高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法与装置示意图。

其中：1-点光源，2-准直透镜、3-平行光束、4-环形光发生系统、5-环形光、6-测量物镜、7-入射光轴、8-被测样品、9-等离子体羽、10-采集光轴、11-采集透镜、12-分色镜、13-聚焦透镜，14-强度点探测器、15-双轴共焦轴向强度曲线、16-移位双轴共焦轴向强度曲线、17-错位相减双轴共焦轴向强度曲线、18-计算机、19-激光诱导击穿光谱、20-电离样品吸管、21-质谱探测系统、22-三维工作台、23-测量面法线、24-针孔、25-光强探测器、26-光谱收集透镜、27-光谱探测系统、28-矢量光束发生系统、29-光瞳滤波器、30-脉冲激光器、31-聚光透镜、32-传光光纤、33-出射光束衰减器、34-探测光束衰减器。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的核心方法如图1所示，以下实施例均是在图1基础上实现的。

实施例1

本发明实施例基于图3所示的高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置，该装置采用脉冲激光器30、聚光透镜31和聚光透镜31焦点处的传光光纤32替代图1中的点光源1。在图3的激光聚焦系统中引入出射光束衰减器33，在激光双轴共焦探测系统中引入探测光束衰减器34。

如图3所示，高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置包括点光源1，沿入射光轴7方向放置的准直透镜2、出射光束衰减器33、环形光发生系统4、聚焦光斑到被测样品8的测量物镜6，还包括沿采集光轴10方向放置的用于探测测量物镜6聚焦光斑反射光强度信号的采集透镜11、探测光束衰减器34、聚焦透镜13和位于聚焦透镜13焦点的强度点探测器14，还包括用于探测激光诱导击穿光谱19的分色镜12、光谱收集透镜26和光谱收集透镜26焦点处的光谱探测系统27，以及用于探测测量物镜6聚焦光斑解吸电离的离子体羽9组分的电离样品吸管20和质谱探测系统21，入射光轴7和采集光轴10之间的夹角为2θ，并关于测量面法线23对称。其中，强度点探测器14可以由针孔24和光强探测器25构成。

主要构成的功能如下：

由点光源1、沿入射光轴7方向放置的准直透镜2、环形光发生系统4、聚焦光斑到被测样品8的测量物镜6构成的激光聚焦系统用于产生超过衍射极限的微小聚焦光斑，该超衍射微小尺寸光斑具有测量样品表面和产生表面等离子体的双重功能。

由沿采集光轴10方向的采集物镜11、聚焦透镜13、聚焦透镜13焦点处的强度点探测器14构成的激光双轴共焦探测系统对被测样品8进行精密定焦，并对测量物镜6聚焦到被测样品8的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

由电离样品吸管20和质谱探测系统21构成的质谱探测系统基于飞行时间法(TOF)探测等离子体羽9中的带电原子、分子等，来进行飞行时间质谱探测。

由采集物镜11、分色镜12、位于分色镜12反射光方向的光谱收集透镜26和位于光谱收集透镜26焦点处的光谱探测系统27构成的光谱探测系统，用于对被测样品8的激光诱导击穿光谱19进行探测，测得对应聚焦光斑区域的组分信息；

由环形光发生系统4和测量物镜6构成的环形光横向超分辨系统，用于压缩聚焦光斑横向尺寸。

由计算机18、三维工作台22构成的三维运动系统可对被测样品8进行轴向定焦定位和三维扫描。

由出射光束衰减器33和探测光束衰减器34构成光强调节系统，用于衰减聚焦光斑和强度点探测器14探测的光斑强度，以适应样品表面定位时的光强强度需求。

脉冲激光器30的波长、脉宽和重复频率可根据需要选择。

对被测样品进行高分辨质谱成像的过程主要包括以下步骤：

步骤一、脉冲激光器30出射的光束经聚光透镜31、传光光纤32和准直透镜2后准直为平行光束3，该平行光束3经出射光束衰减器33、环形光发生系统4生成环形光束5，环形光束5再经测量物镜6聚焦为超过衍射极限的微小光斑照射在被测样品8上；

步骤二、利用计算机18控制三维工作台22使由沿采集光轴10方向的采集物镜11、聚焦透镜13、聚焦透镜13焦点处的强度点探测器14构成的激光双轴共焦探测系统对被测样品8进行轴向扫描，测得双轴共焦轴向强度曲线15；

步骤三、将双轴共焦轴向强度曲线15沿z向平移s后得到移位双轴共焦轴向强度曲线16，然后将移位双轴共焦轴向强度曲线16与双轴共焦轴向强度曲线15相减处理得到错位相减双轴共焦轴向强度曲线17；

步骤四、计算机18依据错位相减双轴共焦轴向强度曲线17的零点位置z_A减去平移s/2的(z_A-s/2)值来控制三维工作台22，使测量物镜6的聚焦光斑聚焦到被测样品8上，实现对被测样品8的初始定焦；

步骤五、调节出射光束衰减器30来增强测量物镜6的聚焦光斑强度使被测样品8表面产生等离子体，利用电离样品吸管20将聚焦光斑解吸电离被测样品8产生的等离子体羽9中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统21中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由沿采集光轴10方向的采集物镜11、聚焦透镜13、聚焦透镜13焦点处的强度点探测器14构成的激光双轴共焦探测系统同时对被测样品8表面等离子体羽9对应的微区形态进行成像，测得区域形态信息，探测光束衰减器31用于衰减光强以避免强度点探测器14过饱和探测；

步骤七、同时，利用光谱探测系统27对经分色镜12反射和光谱收集透镜26收集的激光诱导击穿光谱19进行光谱成像探测，测得对应聚焦光斑区域的组分信息；

步骤八、计算机18将激光双轴共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息、光谱探测系统27同时探测的激光聚焦微区的激光诱导击穿光谱19、质谱探测系统21同时探测的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态、光谱和质谱信息；

步骤九、计算机18控制三维工作台22使测量物镜6对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息；

步骤十、重复步骤八直到被测样品8上的所有待测点均被测到，然后利用计算机18进行数据融合和图像重构处理，即可得到被测样品形态信息和质谱信息。

实施例2

如图2所示的高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置中，环形光发生系统4可以由矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29替代。

由矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29和测量物镜6构成的径向偏振光纵向场紧聚焦系统用于压缩聚焦光斑横向尺寸。

其余成像测量方法与实施例1相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围。

本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法，其特征在于：利用高空间分辨双轴共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用质谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱进行探测，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的同时成像与探测，包括以下步骤：

步骤一、使平行光束(3)通过环形光发生系统(4)后整形为环形光束(5)，该环形光束(5)再经测量物镜(6)聚焦到被测样品(8)上解吸电离产生等离子体羽(9)；

步骤二、使计算机(18)控制三维工作台(22)带动被测样品(8)沿测量面法线(23)方向在测量物镜(6)焦点附近上下移动，利用采集物镜(11)、聚焦透镜(13)和强度点探测器(14)对经被测样品(8)反射和分色镜(12)透射的测量光束进行聚焦点探测，得到双轴共焦轴向强度曲线(15)；

步骤三、将双轴共焦轴向强度曲线(15)沿z向平移s后得到移位双轴共焦轴向强度曲线(16)，然后将移位双轴共焦轴向强度曲线(16)与双轴共焦轴向强度曲线(15)相减处理得到错位双轴共焦轴向强度曲线(17)；

步骤四、将错位双轴共焦轴向强度曲线(17)的零点位置z_A减去平移值s/2得(z_A-s/2)，计算机(18)依据(z_A-s/2)值控制三维工作台(22)带动被测样品(8)沿测量面法线(23)方向运动，使测量物镜(6)的聚焦光斑聚焦到被测样品(8)上；

步骤五、利用电离样品吸管(20)将聚焦光斑解吸电离被测样品(8)产生的等离子体羽(9)中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统(21)中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由采集物镜(11)、聚焦透镜(13)、强度点探测器(14)构成的激光双轴共焦探测系统对测量物镜(6)聚焦到被测样品(8)的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

步骤七、利用光谱探测系统(27)对经分色器(12)反射和光谱收集透镜(26)收集的激光诱导击穿光谱(19)进行探测，测得对应聚焦光斑区域的组分信息；

步骤八、计算机(18)将激光双轴共焦探测系统测得的激光聚焦微区 形态信息、光谱探测系统(27)同时探测的激光聚焦微区的激光诱导击穿光谱(19)、质谱探测系统(21)同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态、光谱和质谱信息；

步骤九、计算机(18)控制三维工作台(22)使测量物镜(6)对准被测对象(8)的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态、光谱和质谱信息；

步骤十、重复步骤九直到被测样品(8)上的所有待测点均被测到，然后利用计算机(18)进行处理即可得到被测样品形态、光谱和质谱信息。

2.根据权利要求1所述的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法，其特征在于：包括步骤一可为使平行光束(3)通过矢量光束发生系统(28)、光瞳滤波器(29)后整形为环形光束(5)，该环形光束(5)再经测量物镜(6)聚焦到被测样品(8)上解吸电离产生等离子体羽(9)。

3.根据权利要求1所述的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像方法，其特征在于：包括步骤四可为计算机(18)依据双轴共焦轴向强度曲线(15)最大值M对应的位置z_B值来控制三维工作台(22)带动被测样品(8)沿测量面法线(23)方向运动，使测量物镜(6)的聚焦光斑聚焦到被测样品(8)上。

4.一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置，其特征在于：包括点光源(1)、沿入射光轴(7)方向放置的准直透镜(2)、产生环形光束的环形光发生系统(4)和聚焦光斑到被测样品(8)的测量物镜(6)，包括沿采集光轴(10)方向放置的用于探测测量物镜(6)聚焦光斑反射光强度信号的采集透镜(13)、聚焦透镜(13)和位于聚焦透镜(13)焦点的光强点探测器(14)，还包括探测激光诱导击穿光谱(19)的分色镜(12)、光谱收集透镜(26)和光谱收集透镜(26)焦点处的光谱探测系统(27)，以及用于探测测量物镜(6)聚焦光斑解吸电离的离子体羽(9)组分的电离样品吸管(20)和质谱探测系统(21)，入射光轴(7)和采集光轴(10)之间的夹角为2θ，并关于测量面法线(23)对称。

5.根据权利要求4所述的一种高空间分辨激光双轴共焦光谱-质谱显微成像装置，其特征在于：包括环形光发生系统(4)可以用沿入射光轴(7)方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统(28)和光瞳滤波器(29)替代。