JP5918981B2 - 標的ポリヌクレオチドの検出用剤及びその利用 - Google Patents
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Description
固相担体と、
前記標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、前記固相担体上に固定されるオリゴヌクレオチドプローブと、
を備える、検出用剤。
(2)前記固相担体上には、1又は2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための1又は2以上のフィーチャーエリアが画定されており、
前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアのそれぞれにおいて、1又は2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの固定領域又はそれらの非固定領域によって特徴付けられる、(1)に記載の検出用剤。
(3)前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアの輪郭に沿う前記固定領域によって実質的に囲繞される前記非固定領域によって特徴付けられる、(2)に記載の検出用剤。
(4)前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の形状に関する情報を含む、(2)又は(3)に記載の検出用剤。
(5)前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の大きさに関する情報を含む、(2)〜(4)のいずれかに記載の検出用剤。
(6)前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の模様に関する情報を含む、(2)〜(5)のいずれかに記載の検出用剤。
(7)前記パターン情報は、文字、数字、記号及び図形並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるシンボルを含む、(2)〜(6)のいずれかに記載の検出用剤。
(8)前記シンボルはバーコードを含む、(7)に記載の検出用剤。
(9)前記パターン情報は、目視によって識別可能な大きさを備える、(1)〜(8)のいずれかに記載の検出用剤。
(10)前記固相担体上には、1又は2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための1又は2以上のフィーチャーエリアが画定されており、
1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が配置されている、(1)〜(9)のいずれかに記載の検出用剤。
(11)1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が少なくとも部分的に重複する、(10)に記載の検出用剤。
(12)1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドの前記パターン情報が相補的である、(10)に記載の検出用剤。
(13) 前記固相担体上の前記パターン情報の方向性を示す方向性情報を前記固相担体上に備える、(1)〜(12)のいずれかに記載の検出用剤。
(14) 複数個の前記オリゴヌクレオチドプローブを、これらの前記オリゴヌクレオチドプローブ毎の前記プローブ識別情報を伴って前記固相担体上に備える、(1)〜(13)のいずれかに記載の検出用剤。
(15)(1)〜(14)のいずれかに記載の検出用剤と、
前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、
を備える、キット。
(16)(1)〜(14)のいずれかに記載の検出用剤の製造方法であって、
前記固相担体上に、前記オリゴヌクレオチドプローブを、前記プローブ識別情報を伴って供給する工程、
を備える、製造方法。
(17)前記オリゴヌクレオチドの供給工程は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含有する液体を、ピエゾ素子を用いて吐出して前記固相担体上に供給する工程である、(16)に記載の製造方法。
(18)標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
(1)〜(14)のいずれかに記載の検出用剤上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示する前記プローブ識別情報に基づいて前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備える、検出方法。
(19)前記ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程を、備える、(18)に記載の検出方法。
(20)前記標的ポリヌクレオチドは一塩基多型を含む、(18)は(19)に記載の検出方法。
本発明の標的ポリヌクレオチドの検出用剤(以下、本検出用剤という。)10は、固相担体2と、
標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、固相担体2上に固定されるオリゴヌクレオチドプローブ4と、を備えている。
固相担体2は、その材料を特に限定しないで、セラミックス、ガラス、金属、合成樹脂等を用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブ4を固定化するための層を別途備えることもできる。固相担体2は、ダウンサイジング性、小スケールでの取り扱い性、反応性、プローブ識別情報の視認性等を考慮すると、液体の浸透性又は透過性を有することが好ましい。こうした材料としては、例えば、合成樹脂が挙げられ、典型的には、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔性のメンブランフィルターのほか、セルロースなどのろ紙を好ましく用いることができる。
オリゴヌクレオチドプローブ(以下、単にプローブという。)4は、特に限定しないで、従来公知の手法で固相担体2上に固定されている。すなわち、共有結合他、非共有結合で固定されていてもよい。また、プローブ4は、固相担体2上に少なくとも1つ備えられる。好ましくは複数個備えられ、より好ましくは十数個以上備えられ、さらに好ましくは数十個以上備えられる。
プローブ4は、それぞれそのプローブ4を識別するためのプローブ識別情報を伴って固相担体2上に固定されている。プローブ識別情報は、固相担体2上のプローブ4ごとに特徴的であって、固相担体2上の他のプローブ4のプローブ識別情報と区別可能であることが好ましい。
プローブ識別情報は、パターン情報を含んでいる。プローブ識別情報がパターン情報を含むことで、他種多様な組み合わせを設定することができ、同一の固相担体2上に多数のプローブを配置してもそれぞれを識別することができる。例えば、プローブ識別情報が色情報のみの場合、色の多様性は低く、また多様な色を提供することも困難であり、さらに色の識別も困難である。このため、同一の固相担体2上において多数個のプローブを配置することができない。さらに、異なる発色操作や化合物を用いて異なる色を付与しなければならず、操作も煩雑でコストがかかってしまうことになる。さらに、安定した発色を確保することも困難である。なお、プローブ識別情報がパターン情報を含んでいれば、さらに色情報を含むことを排除するものではない。
(1)複数のプローブ4の複数のフィーチャーエリア6の各固定領域を、フィーチャーエリア6の輪郭に一致させることができる。プローブ4間で、その固定領域の輪郭が一致しているため、プローブ4を識別するパターン情報の識別力のバラツキを低減することができる。
(2)フィーチャーエリア6内の固定領域におけるハイブリダイゼーション反応性にバラツキが生じた場合であっても、非固定領域による特徴付けが維持されやすく、パターン情報の識別力が高い(特に、パターン情報が数字の場合などが該当する。)
(3)隣り合うフィーチャーエリア6間で非固定領域で特徴付けられるパターン情報が同種であったとしても(例えば、いずれも数字であり、一方が一桁の数字で他方が二桁の数字である場合などが該当する。)、各フィーチャーエリア6における非固定領域は、それぞれの固定領域で区画化されているので、各フィーチャーエリア6のパターンをそれぞれ確実に識別できる。
固相担体2上には、固相担体2上のパターン情報の方向性を示す方向性情報8を備えることができる。こうした方向性情報を固相担体2上に備えることで、プローブ識別情報の識別力を高めることができる。方向性情報は、例えば、顔料インク又は染料インク等で固相担体2上に付与して形成することができる。方向性情報8の形態は特に限定しないで、バー状、ドット状等とすることができ、固相担体2における位置は、固相担体2を視認する場合の方向を特定できる形態であれば特に限定されない。方向性情報8は、例えば、固相担体2の一部(例えば、方形状のとき、上辺及び/又は下辺、角部等)に設けることができる。
本検出用剤の製造方法は、固相担体2上に、プローブ4を、プローブ識別情報を伴って供給する工程を備えることができる。こうすることで、プローブ4の固定位置の照合操作を省略できる検出用剤を製造できる。
本発明のキットは、本検出用剤と、本検出用剤において得られる被験試料中のDNA等とのハイブリダイズ産物にプローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、を備えることができる。肉眼で視認可能な検出シグナルをハイブリダイズ産物に付与できれば、蛍光を検知する装置なくして簡易にプローブ識別情報を確認できる。
本発明の標的ポリヌクレオチドの検出方法は、本検出用剤10上のプローブ4と、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示するプローブ識別情報に基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、を備えることができる。この検出方法によれば、プローブ識別情報を用いて標的ポリヌクレオチドを検出できるため、従来のプローブ位置の照合操作を省略することができる。
ハイブリダイゼーション工程に供する被験試料は、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションの対象となる可能性のある標的ポリヌクレオチドを含んでいればよい。被験試料としては、プローブハイブリダイゼーションが適用される公知の遺伝子情報、DNAを用いた検出、検査、診断方法における被験試料を本方法に用いることができる。
ハイブリダイゼーション工程では、本検出用剤10のプローブ4と被験試料とにつきハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは、プローブ4と被験試料中の可能性ある標的ポリヌクレオチドが特異的に結合するような条件で行う。こうした温度、塩濃度及び時間等は、用いるプローブ4等の種類にもよるが、当業者であれば適宜設定することができる。
ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を検出可能な検出シグナルを付与する工程を、備えることができる。ハイブリダイズ産物が、被験試料において付与された標識物質によって既に標識されている場合においては、ハイブリダイゼーション工程後に検出工程を実施してプローブ識別情報を確認できるが、そうでない場合には、ハイブリダイズ産物からプローブ識別情報をなんらかの手段で確認できる検出シグナルを付与することが好ましい。
検出工程は、ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示するプローブ識別情報に基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程である。この検出工程によれば、予めプローブ毎に付与されているプローブ識別情報を識別することで直ちに標的ポリヌクレオチドを特定できるため、従来のようなプローブの位置照合操作を省略することができる。上記のとおり、ハイブリダイズ産物は、被験試料調製時からあるいはハイブリダイゼーション工程後の修飾により検出シグナルが付与されているので、プローブ識別情報を呈示することができる。プローブ識別情報は、標識物質の種類に応じて、特定波長域の光を照射して検出したり、発色反応を行って検出したりすることができる。標識物質等の種類により、プローブ識別情報を肉眼にて視認できる場合には、特別な、標的ポリヌクレオチドの有無を検出する。
ポリエーテルスルホン製であって、サイズが285mm×50mm、孔径が0.5μm、厚さが0.15mのシートに、以下の表に示す塩基配列からなるDNAプローブ溶液を、特開2003−75305号公報に記載されている吐出ユニット(ピエゾ素子を用いた吐出ユニット)を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT(登録商標)スポッターを用いて、スポットし、以下の手順で固定化した。
DNAプローブ15種類を以下の表に示す塩基配列に従って合成し、Tris-EDTA bufferで溶解した水溶液を、SSC緩衝液、ブロモフェノールブルーと混合してDNAプローブ濃度が2μM〜60μMのDNAプローブ溶液を調製した。
吐出ユニット内に配置した液体注入部に、DNAプローブ溶液を注入し、シートにスポットする前に、シート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査スポットに対し、スポットが形成されないことはないか、スポットがいびつな形状ではないか、スポット径が設計値から10% 以上ずれていないか、サテライトと呼ばれる本スポット以外の不要なスポットが発生していないか、スポット位置がスポット径の3分の1以上ずれていないかという項目を実施した。シートの色は白色で、DNAプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されているため、目視で検査を実施した。ブロモフェノールブルーは、ハイブリダイゼーション〜酵素付抗体免疫反応〜酵素発色色素沈着において、溶出し、除去される。
検査スポットで不良が検出されたときは、吐出ユニット内に配置された圧電/電歪素子の駆動信号を調整して検査スポットを再度行う。駆動信号の調整は電圧値、所定電圧までの上昇時間、所定電圧値のキープ時間、電圧立ち下げ時間の変更で行った。それでも不良が検出されるときは、真空吸引することで吐出ユニットからDNAプローブ溶液を抜き取り、液体注入部にDNAプローブ溶液を再度注入して、検査スポットを行う。不良スポットが検出されなくなるまで、この操作を繰り返した。
不良スポットが検出されなくなったことを確認したのち、以下の方法でDNAプローブ溶液をシートにスポットした。すなわち、1種類のDNAプローブ溶液につき、スポットのピッチを横方向(X方向)、縦方向(Y方向)ともに0.05mmで、横方向、縦方向ともにスポットを行い、横方向0.9mm、縦方向1.3mmのスクエア形状の一つのフィーチャーを形成した。固定領域のコーナーはR=0.05mmとなった。シート上を吐出ユニットが、シート長手方向(X方向)に移動しながら、シートがシート短手方向(Y方向)に移動して、非接触でスポットを行う。フィーチャーのピッチを縦方向1.5mm、横方向1mmで3列×5行の格子エリア内に15種類のDNAプローブの固定化領域を形成・配置して、複数のフィーチャーからなる1つの区画(7.3mm×2.9mm)を形成した。さらにこの区画を、縦方向13.5mmピッチ、横方向6.8mmピッチで、1シートに84個形成した。
1区画の上部に、1区画の上下を判別できるように顔料系マゼンダインクのマーカー(方向性情報)のスポットを行った。
DNAプローブ溶液、マーカーのスポットが完了したのち、風乾することで、DNAプローブの固定、マーカーの固着を行った。
(手順6)
(手順1)で行う検査と同様の項目で検査を行った。
(手順7)
不良が検出されなかったシートについて、1アレイを4mm×9mmサイズに、ローラーカッターで切断することで、1シートから84個のアレイを得た。2種類のアレイを図7に示す。
DNAプローブに対して相補的な配列を有するように人工的に合成したDNAを、DIGラベルにより標識することで、サンプルDNAを得た。
各チューブに、ハイブリダイゼーション液として、0.5%Tween20、1%BSAのPBS溶液200μlを加えて、良く混合し、95℃に加熱したヒートブロックに5分配置後、氷水中に移して急冷した。
各チューブに、実施例1で作製したアレイを一個ずつ、投入して、60℃に制御したヒートブロックに挿入して15分ハイブリダイゼーションを実施した。
ハイブリダイゼーション工程に用いた溶液を一旦除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液200μlを添加し、60℃のヒートブロックで1分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ10分及び1分の洗浄を繰り返した。
抗DIG抗体酵素(ペルオキシダーゼ)含有試薬(DIG−POD、ロッシュ製)の1000倍希釈液200μlを各チューブ内のアレイに供給して、抗原抗体反応により酵素を結合させた。
シグナル付与工程に用いた溶液を除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液250μlを添加し、60℃のヒートブロックで1分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ10分及び1分の洗浄を繰り返した。
洗浄後のチューブに対してペルオキシダーゼの基質溶液(Vec.Lab製、TMBキット)200μlを供給して、室温で酵素反応を行い、青色の反応生成物を生成させた。
DNAプローブ名”1”は発色パターンの数字の”1”と対応している。他にもDNAプローブ名”2”、”A”、”B”は、それぞれ発色パターンの数字の”2”並びにアルファベットの”A”及び”B”に対応している。各チューブ内で反応後、固定化領域の発色パターンを確認したところ、図8のように、それぞれの発色パターン、“1”、“2”、“A”、“B”が発色するのを確認することができた。白抜けのデザインについても、図9のように、プローブ名を白抜けの英数字で確認することができた。こうして、発色したDNAプローブの位置情報とプローブ配置図を照合することなく、DNAプローブを認識することができた。図8のように文字の部分が発色したことで、迅速かつ容易にDNAプローブを認識することができた。図9のように、文字部を白抜けとすることで、さらに認識が容易となった。
Claims (19)
- 標的ポリヌクレオチドを検出するための検出用剤であって、
固相担体と、
複数の前記標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、前記固相担体上に固定される複数のオリゴヌクレオチドプローブと、
を備え、
前記固相担体上には、前記パターン情報の方向性を示す方向性情報を備えるとともに、複数の前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ固定するための12個以上のフィーチャーエリアが画定されており、
前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアのそれぞれにおいて、複数の前記オリゴヌクレオチドプローブの固定領域又はそれらの非固定領域によって目視による識別可能な大きさを備えている、検出用剤。 - 前記フィーチャーエリアは、前記固相担体の表面をグリッド状に区画した方形状である、請求項1に記載の検出用剤。
- 前記固相担体は、アスペクト比が1.5以上である、請求項1又は2に記載の検出用剤。
- 前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアの輪郭に沿う前記固定領域によって実質的に囲繞される前記非固定領域によって特徴付けられる、請求項1〜3のいずれかに記載の検出用剤。
- 前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の形状に関する情報を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の検出用剤。
- 前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の大きさに関する情報を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の検出用剤。
- 前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の模様に関する情報を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の検出用剤。
- 前記パターン情報は、文字、数字、記号及び図形並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるシンボルを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の検出用剤。
- 前記シンボルはバーコードを含む、請求項8に記載の検出用剤。
- 前記固相担体上には、1又は2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための1又は2以上のフィーチャーエリアが画定されており、
1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が配置されている、請求項1〜9のいずれかに記載の検出用剤。 - 1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が少なくとも部分的に重複する、請求項10に記載の検出用剤。
- 1つの前記フィーチャーエリア内において、2以上の前記オリゴヌクレオチドの前記パターン情報が相補的である、請求項11に記載の検出用剤。
- 複数個の前記オリゴヌクレオチドプローブを、これらの前記オリゴヌクレオチドプローブ毎の前記プローブ識別情報を伴って前記固相担体上に備える、請求項1〜12のいずれかに記載の検出用剤。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の検出用剤と、
前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、
を備える、キット。 - 請求項1〜13のいずれかに記載の検出用剤の製造方法であって、
前記固相担体上に、前記オリゴヌクレオチドプローブを、前記プローブ識別情報を伴って供給する工程、
を備える、製造方法。 - 前記オリゴヌクレオチドの供給工程は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含有する液体を、ピエゾ素子を用いて吐出して前記固相担体上に供給する工程である、請求項15に記載の製造方法。
- 標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
請求項1〜13のいずれかに記載の検出用剤上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示する前記プローブ識別情報に基づいて前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備える、検出方法。 - 前記ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程を、備える、請求項17に記載の検出方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドは一塩基多型を含む、請求項17又は18に記載の検出方法。
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