CN101654654A - 一种以混合筛分介质修饰dna微流控芯片微通道的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，属DNA微流控芯片电泳分析的技术领域。先配制聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合筛分介质作为修饰剂，再用修饰剂对DNA微流控芯片微通道进行修饰。有以下优点：操作步骤简便易行；微通道经本发明的方法修饰的DNA微流控芯片作DNA片段的分析时，对生化样品DNA的筛分效果好，分析时间短，修饰剂的使用寿命较长。特别适于用来对DNA微流控芯片的微通道进行修饰，使被修饰的芯片成为高效优质的DNA电泳分析器具。
Description
技术领域
本发明涉及一种以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，属DNA微流控芯片电泳分析的技术领域。
背景技术
随着微流控芯片分析技术的兴起，DNA微流控芯片在生命科学中的应用日益广泛，在DNA片段的分离和测序方面的应用也越来越频繁。DNA微流控芯片分析具有分析速度快、试剂消耗少、芯片可重复使用等特点，但芯片的微通道对生化样品的吸附，一定程度上限制了此项技术的普遍推广。因此，在保证芯片分析可靠性、重复性的基础上，对DNA微流控芯片的微通道进行修饰，成为推广DNA微流控芯片分析技术及产业化的关键之一。背景技术中有一种以单一筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，采用单一筛分介质作为修饰剂，微通道经该法修饰的DNA微流控芯片作DNA片段的分析时，微通道对生化样品的吸附大大减少，但其对生化样品DNA的分析时间较长，分析可靠性较差，并且修饰剂的使用寿命较短。
发明内容
针对背景技术存在的问题，本发明的目的是推出一种以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法。该方法有背景技术的全部优点，却没有背景技术的缺点。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案。先配制聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合筛分介质作为修饰剂，再用修饰剂对DNA微流控芯片微通道进行修饰。
现详细说明本发明的技术方案。一种以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步配制修饰剂
以聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合筛分介质作为修饰剂，将2.8mg～8.4mg的聚乙烯吡咯烷酮和2.8mg～8.4mg羟乙基纤维素溶解于2.8mL的pH 9.2的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA溶液中，聚乙烯吡咯烷酮∶羟乙基纤维素的质量比为1∶1，超声搅拌，驱除溶液中的气泡，得到质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂，经0.45μm微孔滤膜过滤，放入4℃的冰箱备用；
第二步DNA微流控芯片及其微通道的预处理
先将DNA微流控芯片及其微通道放入质量浓度为98％的H2SO4溶液浸泡20分钟，去离子水洗净，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液冲洗10分钟，去离子水冲洗10分钟，吹干备用；
第三步在修饰剂中添加荧光染料
将浓度为1mmol/L的荧光染料溶液1μL添加在第一步得到的修饰剂中，得到含荧光染料的修饰剂；
第四步DNA微流控芯片微通道的修饰
将第三步得到的含荧光染料的修饰剂吸入医用注射器，通过医用注射器的针头把所述的含荧光染料的修饰剂灌入经第二步处理的DNA微流控芯片的微通道中，使之充满，静置20分钟，使该修饰剂与微通道充分相互作用，至此修饰过程全部完成。
本发明的技术方案的进一步特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂的质量浓度为2.5％。
本发明的技术方案的进一步特征在于，所述的荧光染料是荧光花青单体染料。
本发明的技术方案的进一步特征在于，所述的医用注射器的容量为1mL。
聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基纤维素为高分子聚合物。高分子聚合物溶液的质量浓度对于DNA片段的分离有至关重要的作用：高浓度的混合筛分介质溶液，会得到高的样品分离度；低浓度的混合筛分介质溶液，整体粘度较低，有利于填充微通道和缩短分离时间。如下表所示，对于分离72bp～1353bp的DNA片段，当聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基纤维素混合溶液的质量浓度较小(1％)时，只需要70V/cm的场强即可确保样品片段完全进入微通道。当所述的混合溶液的质量浓度增大至3％，110V/cm的场强也不能使DNA样品完全进入微通道，虽然可以找出足够大的进样场强，但此时所述的混合溶液的粘度较大，将其注入或打出微通道及清洗微通道变得越来越困难。综合考虑到具有足够分离度和便于芯片预处理，最终确定聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基纤维素混合溶液的质量浓度的优选值为2.5％。
不同混合筛分介质的质量浓度和进样场强下DNA片段的分离(进样时间50S)
与背景技术相比，本发明具有以下优点：
1、操作步骤简便易行。
2、微通道经本发明的方法修饰的DNA微流控芯片作DNA片段的分析时，对生化样品DNA的筛分效果好，分析时间短，修饰剂的使用寿命较长。
本发明的方法以聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合筛分介质为修饰剂，修饰DNA微流控芯片的微通道，该芯片利用微芯片电泳技术成功分离DNA片段，与微通道经单一筛分介质修饰的DNA微流控芯片相比，前者的筛分效果好，分析时间短；后者的筛分效果差，分析时间长。以分离相同样品而言，后者分离DNA片段需600s，前者分离DNA片段只需180s。见图3。单一筛分介质的使用寿命较短，每天都需重新更换，而混合筛分介质的使用寿命长，连续使用一周未见其性能明显改变，数据见下表。
附图说明
图1：DNA微流控芯片的结构示意图，图中，1是样品液槽，2是缓冲废液槽，3是样品废液槽，4是缓冲液槽，5是微通道，9是芯片。
图2：DNA微流控芯片电泳分离DNA片段的的原理示意图，图中，6混合筛分介质，7是DNA样品，8是分离后的DNA样品。
图3：激光诱导荧光检测DNA微流控芯片电泳分离ΦX174-HaeIIIDNA makers电泳分离图。
具体实施方式
现结合附图和实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
本实施例完全按照上述的方法的具体操作步骤进行操作，为行文简练，以下仅罗列每一步骤的关键的技术数据。
第一步中，聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基纤维素的加入量均为6.8mg，得到修饰剂的百分浓度为2.5％；第三步中，所述的荧光染料是荧光花青单体染料；第四步中，所述的医用注射器的容量为1mL。
本实施例修饰的DNA微流控芯片对DNA样品分析的电泳过程：
在本实施例中，取0.5μg/μL的ΦX 174-HaeIII digest DNA marker，用超纯水稀释10倍，作为DNA样品。
检测DNA片段电泳分离的操作和设备均为传统的，简述如下：
在DNA微流控芯片9的四个液槽中分别加入50μL的含有荧光染料的混合筛分介质，即修饰剂；先进行预电泳20分钟；待基线稳定后，将样品液槽1中的含有荧光染料的混合筛分介质6用等量的DNA样品7代替，进行电泳分离。分离后的DNA样品8通过微通道5流入缓冲废液槽2。具体的DNA片段电泳分离条件见下表。
表
| 1液槽电压(V) | 2液槽电压 | 3液槽电压 | 4液槽电压 | 时间(s) |
| (V) | (V) | (V) | |||
| 充样操作 | 0 | 100 | 200 | 120 | 50 |
| 分离操作 | 360 | 800 | 360 | 0 | 600 |
激光诱导荧光检测系统：光源采用发射波长为635nm，功率4mW的半导体激光器。激光束垂直于DNA微流控芯片9的平面，经前置带通滤光片(635±10nm，沈阳汇博光学股份有限公司)滤光，由聚焦透镜汇聚于DNA微流控芯片9的微通道5。其中激光器，前置带通滤光片，聚焦透镜三者构成一体化模块。荧光检测系统由收集透镜，小孔，带通滤光片(670±10nm，沈阳汇博光学股份有限公司)，光电倍增管(R928型，北京滨松光子技术有限公司)四部分组成。在DNA微流控芯片9正交偏45°方向上检测出射的荧光。
高压电源系统：可提供四触点高压输出，每触点电压输出(范围0-6000V)可单独控制。控制系统包括硬件和软件两部分。光电倍增管收集的荧光信号，经信号采集及放大模块处理，通过单片机A/D转换输入到外置的计算机，由计算机进行数据处理和显示。仪器的所有参数设定、控制和信号采集，均通过RS232串口线与计算机实现通讯。
本发明的方法特别适于用来对DNA微流控芯片的微通道进行修饰，使被修饰的芯片成为高效优质的DNA电泳分析器具。
Claims (8)
1、一种以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步配制修饰剂
以聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合筛分介质作为修饰剂，将2.8mg～8.4mg的聚乙烯吡咯烷酮和2.8mg～8.4mg羟乙基纤维素溶解于2.8mL的pH 9.2的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA溶液中，聚乙烯吡咯烷酮∶羟乙基纤维素的质量比为1∶1，超声搅拌，驱除溶液中的气泡，得到质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂，经0.45μm微孔滤膜过滤，放入4℃的冰箱备用；
第二步DNA微流控芯片及其微通道的预处理
先将DNA微流控芯片及其微通道放入质量浓度为98％的H2SO4溶液浸泡20分钟，去离子水洗净，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液冲洗10分钟，去离子水冲洗10分钟，吹干备用；
第三步在修饰剂中添加荧光染料
将浓度为1mmol/L的荧光染料溶液1μL添加在第一步得到的修饰剂中，得到含荧光染料的修饰剂；
第四步DNA微流控芯片微通道的修饰
将第三步得到的含荧光染料的修饰剂吸入医用注射器，通过医用注射器的针头把所述的含荧光染料的修饰剂灌入经第二步处理的DNA微流控芯片的微通道中，使之充满，静置20分钟，使该修饰剂与微通道充分相互作用，至此修饰过程全部完成。
2、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂的质量浓度为2.5％。
3、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的荧光染料是荧光花青单体染料。
4、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的医用注射器的容量为1mL。
5、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂的质量浓度为2.5％，所述的荧光染料是荧光花青单体染料。
6、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂的质量浓度为2.5％，所述的医用注射器的容量为1mL。
7、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的荧光染料是荧光花青单体染料，所述的医用注射器的容量为1mL。
8、根据权利要求1所述的以混合筛分介质修饰DNA微流控芯片微通道的方法，其特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮与羟乙基纤维素的混合溶液即修饰剂的质量浓度为2.5％，所述的荧光染料是荧光花青单体染料，所述的医用注射器的容量为1mL。
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