CN111484998A - 体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明第一方面提供了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：(1)建立标准曲线，建立标准蛋白质量浓度与发光值关系的标准曲线；(2)构建包含目标蛋白基因的载体，并获得体外蛋白合成体系；(3)建立目标蛋白浓度与载体浓度的关系曲线；(4)计算定量共表达多种目标蛋白的载体浓度或/及浓度比例；(5)定量共表达目标蛋白。本发明可根据目标蛋白的模板加入量的比例关系，在同一反应体系中定量共表达合成多种蛋白。本发明还提供了体外无细胞蛋白合成体系在本发明方法中的应用，用于多种不同蛋白的定量共表达。

Description

体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用。
背景技术
荧光蛋白在生物学众多研究领域中有着广泛的应用，基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为活细胞或活体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具。自1992年绿色荧光蛋白基因从水母体内克隆以来，现在已经从很多的海洋生物物种中克隆到了的新的荧光蛋白和改造得到新的突变体，它们能特异地“点亮”生物分子或细胞，并显示出生物分子的活动情况，从而能更有助于我们揭示这些分子或细胞的活动规律及本质。已报道的荧光蛋白光谱分布于整个可见光区，它们被广泛应用于基因的表达调控、蛋白质空间定位与转运、蛋白折叠、信号传导、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等研究领域，荧光蛋白的发现与应用为现代生物学的研究提供了强有力的研究手段。
生物技术的进步使得合成生物学家可快速可靠地改造生物体系及设计生产生物大分子，尤其是具备生物学功能的蛋白质大分子的设计生产。在过去多年合成生物学的发展中，主要以细胞作为宿主对蛋白质进行工程化设计，但是在细胞内部进行工程化是费时和困难的。这是因为细胞的生长及适应性过程通常与工程设计目标是不一致的，并且由于活细胞系统的复杂性、基因元件难以标准化、以及细胞膜的阻隔等问题，大大限制了生物组件的改造。这些限制使人们试图探索新的发展方向，因而推动了一门新兴的工程技术学科的发展，即无细胞合成生物学。无细胞合成生物学涉及一种新兴技术——无细胞合成体系，也称为体外合成体系，包括体外转录、翻译。无细胞蛋白合成体系是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成。无细胞蛋白合成体系合成表达蛋白质无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤等步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式。
基于荧光蛋白的特性，其在生物学研究中发挥着不可替代的重要作用，如何在体外定量共表达多种蛋白是目前面临的一项重要技术问题。经过文献查新检索，未发现采用体外无细胞蛋白合成技术在同一反应体系中进行多种蛋白的定量共表达的报道。本发明经过大量的实验探索得出如何通过调整模板DNA的体积或浓度比例来定量共表达多种荧光蛋白，可用于高效的荧光指示分子，用于各种研究或其它用途的荧光标记细胞或生物的研发等。
发明内容
本发明公开了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，可根据目标蛋白的模板(优选DNA)的浓度用量比例关系，在同一反应体系中定量共表达合成多种蛋白。
本发明第一方面提供了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)建立标准曲线。
建立各标准蛋白浓度与各自发光值关系的标准曲线。
步骤(1)中，根据拟共表达的多种目标蛋白的种类，提供与各目标蛋白相对应的标准蛋白；所述多种目标蛋白各自独立地为一种具有发光功能的蛋白，且所述多种目标蛋白相互之间能够根据所发光性质进行区分，能够实现“无相互干扰”地分别进行检测，从而得以实现对各目标蛋白的定量检测。
具体地，步骤(1)所述标准蛋白为目标蛋白的标准样品，可通过合成后分离纯化获得，也可以购买市售分析纯制品。
(2)分别构建包含不同目标蛋白基因的载体，以用于分别表达多种不同的目标蛋白。
所述“包含目标蛋白基因的载体”，指所述载体中包含所述目标蛋白的编码序列，也可称为“目标蛋白的载体”。比如，“编码GFP蛋白的载体”可以简称为“GFP的载体”。
本步骤中，分别构建包含各目标蛋白基因的独立载体，用来分别表达各目标蛋白。针对各目标蛋白分别构建含有其编码序列的独立载体，通过与其相应的独立载体，在共表达体系中进行各自的表达。
(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比的定量关系式。
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例加入到一种体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应，也即进行孵育反应，以合成所述多种目标蛋白；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1) 中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比与所述相应载体的浓度百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致。
按不同浓度比例加入所述包含各目标蛋白基因的独立载体时，在所述体外无细胞蛋白合成体系中，多次体外蛋白反应时的载体总浓度保持一致。
所述载体总浓度，指所述体外无细胞蛋白合成体系中，所有目标蛋白的载体浓度的总和。
(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度及浓度比例。
设定拟实现的所述多种目标蛋白的产物浓度比例关系(比如质量浓度比例关系)，作为多种目标蛋白的目标浓度比例关系；通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度及浓度比例。
(5)定量共表达多种目标蛋白。
根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或/和浓度比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。
当所述各目标蛋白的独立载体在各母液中的浓度均相同时，还可以简单地通过体积量或体积比例控制用量。举例如下：
一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：
第(1)、(2)步与上述一致。
第(3)步：建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比或者体积百分比的定量关系式。
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例或者体积比例加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比或者体积百分比与所述相应载体的浓度百分比或者体积百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致。
第(4)步：计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度或者载体体积，以及相应的浓度比例或者体积比例。
根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度以及浓度比例，或者计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体体积以及体积比例。
可以根据步骤(3)所述载体总浓度，计算出各目标蛋白载体所需的浓度以及浓度比例。
也可以根据步骤(3)所述载体总浓度以及各载体的母液浓度，计算出各目标蛋白载体所需的体积以及体积比例。当各载体的母液浓度相同时，各目标蛋白载体的浓度比例关系与相应的体积比例关系一致。
第(5)步：定量共表达多种目标蛋白。
根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例或者所需的各目标蛋白载体的体积以及体积比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。
所述体外无细胞蛋白合成体系至少包含除模板以外的蛋白合成所需组分。所述体外无细胞蛋白合成体系可以包括模板，也可以不包括模板。所述体外无细胞蛋白合成体系可在实验室制备，也可购买市售产品；
作为优选例之一，所述体外无细胞蛋白合成体系包括：
(a)酵母细胞提取物；
(b)聚乙二醇；
(c)任选的外源蔗糖；和
(d)任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。
其中，酵母细胞的来源细胞可以为野生型，也可以为基因改造型。
其中，(c)和(d)中的词语“任选”均指可有可无，且组分(c)和组分(d)各自独立地可有可无。
在一优选的实施方式中，所述体外无细胞蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物，磷酸钾，淀粉酶，聚乙二醇，麦芽糊精，等。
在另一优选的实施方式中，本发明提供的体外无细胞蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物，磷酸钾，淀粉酶，聚乙二醇，麦芽糊精，荧光蛋白DNA等。
在本发明中，所述酵母细胞提取物在体外无细胞蛋白合成体系中的比例不受特别限制，通常所述酵母细胞提取物在体外无细胞蛋白合成体系中所占体积为20-70％，较佳地，30-60％，更佳地，40-50％。
优选地，步骤(3)所述各目标蛋白的发光值在最大发射波长下不受其他蛋白的干扰。
步骤(3)中所述各目标蛋白的浓度百分比中的所述浓度，指的是体外无细胞蛋白合成体系中，自加入模板开始，反应一段时间后，反应液中合成的各目标蛋白的终浓度，也即指各目标蛋白产物的浓度。作为优选之一，指反应16-23h后，反应液中各目标蛋白产物的浓度。
作为优选，步骤(5)中所需反应时间与步骤(3)的所述指定的反应时间一致。
进一步地优选之一，步骤(2)中所述载体为包含目标蛋白编码序列的质粒。也即，所述包含各目标蛋白基因的独立载体分别为包含相应目标蛋白编码序列的质粒。
在另一优选例中，步骤(3)中所述体外无细胞蛋白合成体系为酵母细胞体外蛋白合成体系、大肠杆菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系之一或其组合。
在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组中任一种：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、及其其组合。
在另一优选例中，所述发光值为相对荧光单位值(RFU)。
优选地，对于测定多种蛋白中的某一待测蛋白时，在待测蛋白的最大激发波长、最大发射波长和适用滤光片的测定条件下，其发光值不受溶液中其他蛋白的干扰。
在一些优选例中，所述多种目标蛋白各自独立地为发光蛋白或者携带发光标签的融合蛋白。所述发光标签指具有发光功能的多氨基酸(至少具有2个氨基酸单元)，可以为肽，也可以为蛋白。
在另一优选例中，所述目标蛋白为发光蛋白。所述发光蛋白为天然发光蛋白、改造发光蛋白、含有发光蛋白的融合蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述发光蛋白为荧光蛋白。所述荧光蛋白为天然荧光蛋白、改造荧光蛋白、含有荧光蛋白的融合蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白。
在另一优选例中，本发明体外定量共表达多种蛋白的方法，还包括所述目标蛋白的分离或/和纯化，也即包括下述至少一个过程：所述目标蛋白的分离、所述目标蛋白的纯化。
本发明第二方面提供了所述体外无细胞蛋白合成体系在本发明第一方面所述体外定量共表达多种蛋白的方法中的应用。
本发明的第三方面提供了利用无细胞蛋白合成体系表达一种或多种荧光蛋白，其中多种荧光蛋白为同一反应体系内共表达。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次构建了体外定量共表达多种蛋白的方法，利用体外蛋白合成体系合成多种蛋白，操作简单，高效快捷；用于合成荧光蛋白时，能够产生肉眼可视可估量的荧光强度，与传统手段相比，实现了表达蛋白的实时监测，更高效直观，将复杂现象简单化。
(2)建立多个荧光蛋白的定量共表达，即在同一体系中同时合成多种蛋白的方法，可根据设定的比例，按比例定量合成目标蛋白。
(3)本发明方法可应用于治疗性蛋白的合成，比如，采用本发明方法可进行体外定量共表达抗体的重链蛋白和轻链蛋白，实现抗体重链和轻链按比例合成。
附图说明
图1显示了体外合成荧光蛋白在最大Ex/Em(激发/发射波长)为488nm/507nm 绿色系列(含青色、绿色、黄色)时相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit,简称 RFU)测定数据图。图中展示了多个荧光蛋白(包括moxCerulean3、AmCyan1、MiCy、mEGFP、Clover、mVenus、ZsYellow1和mEos3.2等19个蛋白)的总RFU(反应结束后反应液的RFU)及离心后上清液RFU,其中Amcyan1及ZsYellow1上清液中表达量相对较低。
图2显示了体外合成荧光蛋白的在最大Ex/Em为569nm/593nm识别红色系列(含红色，橘红色，远红等)时RFU测定数据图。图中展示了多个荧光蛋白(包括mKO2、TurboRFP、tdTomato、eqFP611、mKate1.3、mNeptune2和miRFP670等17个蛋白)的总RFU(反应结束后反应液的RFU)及离心后上清液RFU,其中TurboRFP上清中表达量相对较低。
图3显示了9个蛋白的荧光成像结果。其中，图3a为激发光和发射光分别为430nm和535nm下的荧光成像结果，图3b为激发光和发射光分别为530nm和605nm下的荧光成像结果。根据表1中所列出的单分子量大小，结合图3中SDS-PAGE电泳蛋白所显示的分子量大小，分析出的蛋白的聚体结构。其中AmCyan1、ZsGreen为四聚体结构，MiCy为二聚体结构，moxCerulean3、Clover、mVenus、mKO2、tdTomato、mKate1.3 为单体结构。
图4显示了对Ni-Beads纯化优化前纯化后的蛋白的考马斯亮蓝染色的凝胶成像结果，结果表明其中除蛋白mAmetrine和mEOS3.2得到单一高纯度的蛋白外， AmCyan1、ZsGreen、MiCy、moxCerulean3、Clover、mVenus、mKO2、tdTomato、 mKate1.3，mTagBFP2、ZsYellow1、mNeptune2及PAmCherry纯化条带大小正确并清晰可见，且都含有杂蛋白，miRFP670条带较弱，而eqFP611没有得到纯化的目的条带。
图5对Ni-Beads纯化优化后纯化后的蛋白的考马斯亮蓝染色的凝胶成像结果，包括AmCyan1、ZsGreen、MiCy、moxCerulean3、Clover、mVenus、mKO2、tdTomato、 mKate1.3，mTagBFP2、ZsYellow1、mEOS3.2、TurboRFP、eqFP611、mNeptune2、 miRFP670、mAmetrine及PAmCherry这18种蛋白，除tdTomato外都得到高纯度的单一目的蛋白。考马斯亮蓝染色结果显示条带大小正确并清晰可见，但eqFP611及 miRFP670条带较弱。
图6显示了单独某一蛋白的浓度与相对荧光单位值(RFU)的关系，以荧光蛋白tdTomato，clover，Micy为例，单独某一蛋白浓度与RFU成正相关的关系，且基本呈线性关系。
图7显示了单独表达某一蛋白时的DNA模板比例与相对荧光单位值(RFU)的关系，以荧光蛋白tdTomato,clover，Micy为例，分别单独表达tdTomato或Clover或MiCy时，蛋白产量和模板量不存在一定的相关关系。这里的模板比例，指以图示100％时的浓度值为基础，对模板浓度进行不同程度的稀释得到的一系列不同比例。图8显示了单独某一蛋白在两种蛋白共表达体系中的模板比例与相对荧光单位值(RFU)的关系，当两种蛋白共同表达时，如tdTomato和Clover在同一反应体系共同表达，则蛋白产量和模板量成正相关，且基本呈线性关系。这里的模板比例，指其中一种蛋白的模板量，相对于共表达的两种蛋白的模板总量的一系列不同比例。
图9显示了单独某一蛋白在三种蛋白共表达体系中的模板比例与相对荧光单位值(RFU)的关系，当三种蛋白共表达时，如tdTomato,Clover和mKate1.3，又如tdTomato,Clover和mNeptune2共表达时，蛋白产量和模板量成正相关，且基本呈线性关系。A1，B1，C1，D1，E1，F1，G1代表Clover:tdTomato:mKate1.3模板比例分别为1:1:1，1:2:3，1:3:2，2:1:3，2:3:1，3:1:2，3:2:1；而A2，B2，C2，D2，E2，F2，G2代表Clover:tdTomato:mNeptune2模板比例分别为1:1:1，1:2:3，1:3:2，2:1:3，2:3:1，3:1:2， 3:2:1如图9所示。这里的模板比例，指其中一种蛋白的模板量，相对于共表达的三种蛋白的模板总量的一系列不同比例。
图10为荧光蛋白合成流程图，利用体外蛋白合成体系合成18种荧光蛋白并对得到的蛋白进行纯化处理，最后得到了高纯度且肉眼可见的不同颜色的荧光蛋白。
图11为pD2P质粒图谱。所述pD2P质粒的长度为6384bp，其中包括以下元件：启动子元件(图中未标示)、5’UTR(包括Omega增强子)、信号肽的编码序列(SP12)、目标蛋白的编码基因、LAC4终止子、多克隆位点(MCS)、T7终止子、复制起始位点 (f1ori)、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因(AmpR基因)、高拷贝数复制起始位点(ori)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、lacI启动子、lacI的编码序列、等。
具体实施方式
术语
本发明中，“体外蛋白合成体系”、“体外无细胞蛋白合成体系”、“无细胞蛋白合成体系”均具有相同含义，可以互换使用。
本发明中，所述“基因”指编码某种蛋白的核苷酸序列。所述“基因”包含所述蛋白的编码序列。
编码序列：coding sequence，缩写为CDS。与蛋白质的密码子完全对应的核苷酸序列，该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列(不考虑mRNA加工等过程中的序列变化)。
本发明所述“具有发光功能”，指具有光敏性，可发射可检测波长的光。根据发光性质，发光功能包括但不限于荧光、磷光、紫外光、红外光等。根据发光的原理，发光功能可以为光致发光、化学发光、自发光等。
本发明中对物质浓度的表征方法没有特别限制，只要能够实现定量即可，可以采用包括但不限于质量浓度、摩尔浓度、质量体积浓度、体积浓度等方式。对蛋白、载体以及其它物质，可以各自独立地采用适合表征与定量的浓度形式。
本发明所述“目标蛋白的浓度”，优选为质量浓度或质量体积浓度，也可以选择其它可定量的浓度形式，比如摩尔浓度。
本发明所述“多种”，指两种或者两种以上。
本发明所述“多次”，指两次或者两次以上。
本发明所述“可选”，指并不必然为本发明的实施方式，而是可以根据本发明的技术方案进行选择性适用，以是否适合本发明的技术方案作为选择依据。
本发明所述“其组合”，指任意合适的组合，包括前述列举的至少两种对象。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
体外蛋白合成体系
一些优选例中，本发明提供了一种体外蛋白合成体系，所述体外蛋白合成体系包括：
(a)细胞提取物；优选之一为酵母细胞提取物；
(b)任意合适的拥挤剂，如聚乙二醇；
(c)任选的外源蔗糖；和
(d)任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。
所述(c)和(d)中的“任选”各自独立地表示可有可无。
在一优选的实施方式中，本发明提供的体外蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物，磷酸钾，淀粉酶，聚乙二醇，麦芽糊精(maltodextrin)等。所述体外蛋白合成体系中可以进一步加入荧光蛋白DNA等进行体外蛋白合成反应。
在本发明中，所述酵母细胞提取物在体外蛋白合成体系中的比例不受特别限制，通常所述酵母细胞提取物在体外无细胞蛋白合成蛋白合成体系中所占体积为20-70％，较佳地，30-60％，更佳地，40-50％(50％)。
在本发明中，所述的细胞提取物优选不含完整的细胞。所述细胞提取物的制备可以选用合适的已报道的细胞提取物制备技术。细胞提取物的制备，通常地，至少包括以下步骤：提供适量酵母细胞，破碎细胞，固液分离，及收集上清液。按照细胞提取物的制备方法而获得的提取产物，有可能残留少量或者极少量的完整细胞，这类提取产物也落在本发明的细胞提取物的涵盖范围之内。所述细胞提取物并不排除完整细胞的存在。
本发明的体外蛋白合成体系，同样地不排除完整细胞的存在，但以不影响实现本发明的目的为准，也即不能影响定量共表达的实现。这些存在的完整细胞产生的原因可能是多样的。可能是由于制备细胞提取物的过程导致的残留；也可能是有意地引入，比如加入细胞进行简单破碎后得到的细胞破碎物，该细胞破碎物可能是完全破碎的产物与完整细胞的混合物；甚还可能是由于单独加入完整的细胞。
典型的细胞提取物(包括酵母细胞提取物)中包括用于蛋白翻译的核糖体、tRNA、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子。此外，细胞提取物(包括酵母细胞提取物)中还含有一些源自细胞质中的其他蛋白，尤其是可溶性蛋白。
一些优选例中，所述酵母细胞提取物为克鲁维酵母细胞提取物。其中一些优选例中，所述克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K.lactis)、Kluyveromyces lactis var.drosophilarum、Kluyveromyces lactis var.lactis、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Kluyveromyces marxianus var.lactis、Kluyveromyces marxianus var.marxianus、 Kluyveromyces marxianus var.vanudenii、多布克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、海泥克鲁维酵母(Kluyveromycesaestuarii)、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)、威克海姆克鲁维酵母(Kluyveromyces wickerhamii)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、湖北克鲁维酵母(Kluyveromyces hubeiensis)、多孢克鲁维酵母(Kluyveromyces polysporus)、暹罗克鲁维酵母(Kluyveromycessiamensis)、亚罗克鲁维酵母(Kluyveromyces yarrowii)、等、或者其组合。
所述体外无细胞蛋白合成体系中需要的蛋白组分(举例如RNA聚合酶)，可以通过内源方式提供，也可以通过外源方式添加。通过内源方式提供时，可以参考包括但不限于文献CN108690139A、CN109423496A、CN106978439A、CN110408635A、 CN110551700A、CN110093284A、CN110845622A、CN110938649A、 CN2018116198190、“Molecular andCellular Biology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的基因改造方法，具体地，包括但不限于：将编码序列插入到细胞内游离型质粒，将编码基因整合入细胞基因组，及其组合方式。通过外源方式提供时，用量可以根据体系所需进行控制和调节。
一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物，磷酸钾，糖(葡萄糖、蔗糖、麦芽糊精中任一种或者其组合，含有麦芽糊精时，还优选含有淀粉酶)，聚乙二醇，RNA聚合酶等。所述RNA聚合酶可以通过内源方式提供，也可以通过外源方式添加。所述RNA聚合酶的更优选方式之一为T7RNA聚合酶。
一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系包括外源添加的RNA聚合酶。
一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系包括外源添加的T7RNA聚合酶。
一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物、外源添加的T7RNA聚合酶。其中一些优选例中，所述T7RNA聚合酶的浓度0.01-0.3 mg/mL。还有一些优选例中，所述T7RNA聚合酶的浓度为0.02-0.1mg/mL。还有一些优选例中，所述T7RNA聚合酶的浓度为0.027-0.054mg/mL。还有一些优选例中，所述T7RNA聚合酶的浓度为0.04mg/mL。
在本发明中，所述的酵母细胞提取物所含蛋白含量优选为20-100mg/ml,较佳为50-100mg/ml。所述的测定蛋白含量方法为考马斯亮蓝测定方法。
所述体外无细胞蛋白合成体系中的核苷三磷酸混合物优选为腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸。在本发明中，各种单核苷酸的浓度没有特别限制，通常每种单核苷酸的浓度为0.5-5mM，较佳地为1.0-2.0mM。
所述体外无细胞蛋白合成体系中的氨基酸混合物可以包括天然或非天然氨基酸，也可以包括D型或L型氨基酸。代表性的氨基酸包括(但并不限于)20种天然氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。每种氨基酸的浓度通常为0.01-0.5mM，较佳地0.02-0.2mM，如0.05 mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM。
在一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系还含有聚乙二醇或其类似物。聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度(w/v) 为0.1-8％，较佳地，0.5-4％，更佳地，1-2％，以所述蛋白合成体系的总重量计。代表性的PEG例子包括(但并不限于)：PEG3000，PEG8000，PEG6000和PEG3350。应理解，本发明的体系还可包括其他各种分子量的聚乙二醇(如PEG200、400、1500、2000、 4000、6000、8000、10000等)。
在一些优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系还含有蔗糖。蔗糖的浓度(w/v)没有特别限制，通常，蔗糖的浓度为0.2-4％，较佳地，0.5-4％，更佳地，0.5-1％，以所述蛋白合成体系的总体积计。
一些优选的体外无细胞蛋白合成体系，除了酵母提取物之外，还含有以下组分：22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，30-150mM醋酸钾，1.0-5.0mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物，0.08-0.24mM的氨基酸混合物，20-25mM磷酸钾， 0.001-0.005mg/mL淀粉酶，1％-4％聚乙二醇，320-360mM麦芽糊精(以葡萄糖单元的摩尔量计)，8-25ng/μL荧光蛋白DNA等。进一步地，所述体外无细胞蛋白合成体系的总体积为10-10000μL，较佳地，为15-100μL，优选地，为30μL。所述酵母提取物更优选克鲁维酵母细胞提取物，更优选乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
一些优选的体外无细胞蛋白合成体系，除了酵母提取物之外，还含有以下组分：22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，30-150mM醋酸钾，1.0-5.0mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物，0.08-0.24mM的氨基酸混合物，20-25mM磷酸钾， 0.001-0.005mg/mL淀粉酶，1％-4％聚乙二醇，320-360mM麦芽糊精(以葡萄糖单元的摩尔量计)，0.027-0.054mg/mL T7 RNA聚合酶等。可以和8-25ng/μL荧光蛋白 DNA混合后进行体外蛋白合成反应。反应体积优选之一为15-100μL。其中一种优选的反应体积为30μL。
模板
本发明，所述“模板”，指用于指导蛋白合成的核酸模板，可以为mRNA、DNA或者其组合，优选为DNA模板。可以为线性的，也可以为环状的，优选之一为环状质粒。
进行体外蛋白合成反应时，所述模板中用以启动目标蛋白合成的启动子可选自以下组中任一种：AOD1、MOX、AUG1、AOX1、GAP、FLD1、PEX8、YPT1、 LAC4、PGK、ADH4、AMY1、GAM1、XYL1、XPR2、TEF、RPS7、T7及其任意合适的组合。优选之一为T7启动子。
无相互干扰
在本发明中，无相互干扰是指在包含多种蛋白的混合液中，测定多种蛋白中的一种或多种待测蛋白(即目标蛋白)时，在本实验的发光检测条件下，如选择最大激发波长、最大发射波长和适用滤光片等的测定条件下，其它荧光蛋白或荧光融合蛋白对于待测的一种或多种蛋白的发光没有或很少重叠。需要说明的是，如果采用的滤光片与蛋白的发光性质不匹配，可能会导致一些线性关系的表征不准确，诸如下述实施例中蛋白量所占比例与相应载体所占百分比之间的线性关系。
需要说明的是，在本实验的荧光检测条件下，如果其它荧光蛋白或荧光融合蛋白对于待测的一种或多种蛋白的发光有部分重叠(也就是产生了干扰)，本发明的技术方案依然可能实现。所述部分重叠是指在一定的荧光检测条件下，测得的发光信号包括了待测蛋白及其他蛋白的发光信号，这种重叠不影响利用本发明的技术方案对待测蛋白进行检测。
标准蛋白
在本发明中，是指用于标定一种或多种目标蛋白浓度与发光值之间线性关系的蛋白样品。所述标准蛋白可以是荧光蛋白或者荧光融合蛋白，根据待测目标蛋白分子中所含有的发光单元来确定，例如，所述标准蛋白可以是目标蛋白本身；也可以是目标蛋白本身结构中所含有的荧光蛋白(当目标蛋白是融合荧光蛋白时，也即目标蛋白分子中融合有荧光蛋白)或者发光标签。所述标准蛋白样品纯度及浓度已知或使用前测定。
定量共表达多种蛋白
在本发明中，是指多种目标蛋白在反应体系中的产物浓度被指定某种比例，然后按此预设浓度比例启动体外蛋白合成反应，能够得到具有预设浓度比例关系的多种目标蛋白的产物；也可以指多种目标蛋白在反应体系中的产物浓度被指定某种数值，再按照此浓度启动体外蛋白合成反应，能够得到具有预期定量关系的多种蛋白的产物。
荧光蛋白
Shimomura首次从水母中分离出绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)， Chalfie首次将GFP克隆到其他物种中表达。Tsien率先阐述了GFP发光的化学机制，并于1995年通过单点突变(S65T)技术获得了荧光强度和光稳定性大大增强的GFP 突变体(GFP-S65T)。以Tsien为代表的众多科学家通过向GFP引入遗传突变，进一步改造出了蓝色荧光蛋白(BFP，blue FP)、青色荧光蛋白(CFP,Cyan FP)、绿色荧光蛋白(GFP,green FP)和黄色荧光蛋白(YFP，yellow FP)。后来，研究人员又从珊瑚和海葵等物种中克隆出光谱红移的荧光蛋白，极大地扩展了荧光蛋白的多色成像应用。近几年来，科学家巧妙地将光活化与光转换荧光蛋白应用于高分辨成像，突破光学衍射极限，分辨率达到几十纳米，这是显微成像技术史上的一次革命性的飞跃。自此，荧光蛋白成为了照亮生命科学的一盏灯。
1962年，Qsamu Shimomura首次在一种生活在北冰洋寒冰水域的水母—维多利亚多管水母(Aequoreavictoria)体内发现了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，并分离纯化了GFP。Martin Chalfie发现了GFP的价值，并第1次运用GFP 这个神奇工具投入试验研究。1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。这3位科学家由此获得了2008年诺贝尔化学奖。从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。从水母体内发现的GFP是由238个氨基酸构成，分子量为26.9kDa，第 65、66、67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)自发形成荧光发光基团-对羟苯甲基咪唑烷酮，可被光激发产生荧光。许多科学家利用荧光蛋白的发光机理，将水母中荧光蛋白基因提取出来，转入其他生物体内，使得生物变幻的多姿多彩。自1992年GFP被克隆以来，科学研究工作者设计了许多GFP突变体及非突变蛋白，为现代生物学的研究提供了强有力的研究手段。
由于荧光蛋白有多种颜色，且荧光稳定、无毒，不需要加底物及辅助因子即可显色，不受物种、细胞在种类及位置上限制，且荧光蛋白可使得复杂的系统结构可视化，可定时定位检测，因此荧光蛋白已被广泛应用。已报道的荧光蛋白光谱分布于整个可见光区，它们被广泛应用于基因的表达调控、蛋白质空间定位与转运、蛋白折叠、信号传导、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等生物研究领域，因此有了荧光鼠，荧光兔，荧光猪的出现。同时它也被应用于肿瘤发病机制，药物筛选，饲料原料改良，水生环境检测及营养代谢研究等领域。
本发明结合实际应用，选择不同激发和发射波长、亮度高、不同聚体结构不同颜色的蛋白，共11种18个蛋白，选择如表1所示的具有以下突变体(在eGFP基础上改进的蛋白)特性的蛋白。
表1荧光蛋白突变体特性
Figure 1
其它引用
已报道的包括但不限于基于大肠杆菌、麦胚细胞、兔网织红细胞、酿酒酵母、毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母等细胞类型的体外无细胞蛋白合成体系，均可以作为本发明的体外蛋白合成体系的可选方式纳入本发明。举例如，WO2016005982A1所记载的基于大肠杆菌的体外无细胞蛋白合成体系，文献“Lu,Y.Advances in Cell-Free BiosyntheticTechnology.Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, 2019,Chapter 2,23-45”中包括但不限于“2.1Systems and Advantages”部分第27-28 页所引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系，均可以在适用时用来实现本发明的体外蛋白合成体系。
本发明的体外蛋白合成体系、模板、质粒、目标蛋白、体外蛋白合成反应(孵育反应)、各种制备方法、各种检测方法等技术要素，还可以各自独立地从下述文献中选择合适的实施方式或实施方法，包括但不限于CN106978349A、CN108535489A、 CN108690139A、CN108949801A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、 CN109423497A、CN109423509A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、 CN109971775A、CN110093284A、CN110408635A、CN110408636A、CN110551745A、 CN110551700A、CN110551785A、CN110819647A(CN2018108881848)、 CN110845622A(CN2018109550734)、CN110938649A(CN2018111131300)、 CN110964736A(CN2018111423277)、CN2018116083534、CN2018116198186、 CN2018116198190、CN2019102128619、CN2019102355148、CN2019107298813、 CN2019112066163、CN2018112862093、CN2019114181518、CN2020100693833、 CN2020101796894、CN202010269333X、CN2020102693382、CN2020103469030等文献。除非和本发明目的相冲突，否则，这些文献及其引用文献以全部内容、全部目的被引用。
本发明还公开一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一：确定拟共表达的多种目标蛋白，以及各目标蛋白的目标表达量百分比；提供体外无细胞蛋白合成体系；
步骤二：分别构建包含各目标蛋白基因的载体，一种载体仅包含一种目标蛋白的编码序列，用于分别表达各目标蛋白；
步骤三:建立各目标蛋白的表达量百分比与相应的载体用量百分比之间的定量关系式；
将各目标蛋白的载体按照某种载体总浓度以及某种用量比例，一起加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应，经过一段指定的反应时间后，测量各目标蛋白产物的表达量；按照所述预设载体总浓度以及一系列不同的载体用量比例，进行多次体外蛋白合成反应，直到足以分析和拟合得到各目标蛋白产物的表达量比例与相应的载体用量比例之间的定量关系式；
步骤四：计算定量共表达所述多种目标蛋白所需的载体用量比例；
根据拟表达的所述多种目标蛋白的目标表达量比例，利用步骤三建立的所述定量关系式，计算出所述载体总浓度情况下，拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体用量或用量比例；
步骤五：定量共表达多种目标蛋白；
根据步骤四得出的拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体用量或其比例，向步骤三所述体外无细胞蛋白合成体系中，加入相应量的各目标蛋白的载体，进行体外蛋白合成反应，经过步骤三所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。
在本发明的指引下，采用非荧光方式或者非发光方式定量确定蛋白产物的表达量，进而实现定量共表达多种目标蛋白的方法也包括在本发明的范围之内。所述非发光方式定量表征蛋白表达量，比如通过紫外吸收、红外吸收的方式进行标注。
下面结合具体实施例和说明书附图1-11，进一步阐述本发明。其中，实施例1-4 所采用方法技术流程参考图10。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例以乳酸克鲁维酵母 (KluyveromyceslactisNRRL Y-1140)为例，但并非代表本发明只能适用于乳酸克鲁维酵母，其只是作为本发明的一种具体表达体系进行研究；实施例的技术方案同样适用于其他酵母细胞体外蛋白合成体系、大肠杆菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系。
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1
不同荧光蛋白表达序列的DNA筛选及密码子优化
通过检索不同数据库，对18个不同荧光蛋白基因编码序列进行Blast，并进行密码子优化，使其适用于乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成系统。
实施例2
含有真核细胞翻译调控序列、荧光蛋白的编码序列、tag(蛋白质表达纯化序列)的体外无细胞蛋白合成体系质粒的构建
2.1全基因合成
将表2中优化后的DNA序列进行基因组合成。
2.2引物设计
用oligo 7.0软件进行引物设计，引物序列如表2所示。
表2引物序列
Figure BDA0002512240380000171
Figure BDA0002512240380000181
Figure BDA0002512240380000191
2.3质粒的构建
将拟表达的目标蛋白的基因序列插入到pD2P质粒(参阅图11)中，具体构建过程如下：
利用分子克隆技术，以pD2P为模板进行质粒构建，使用两对引物分别进行PCR扩增，将两次扩增产物各8.5μL，1μL DpnI，2μL 10×Cutsmart buffer混合，37℃温浴3h。将DpnI处理后产物5μL加入到50μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入到1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出，挑取3个单克隆进行扩大培养后，进行测序确认正确后，提取质粒保存，并将质粒浓度调整为同一水平。使用前，所有质粒通过OD值测定，将浓度调整为同一浓度(450ng/μL)，也即各目标蛋白的模板/载体的母液浓度相同。
所述pD2P质粒中目标蛋白的编码基因以T7启动子启动。
实施例3
通过酵母体外无细胞蛋白合成体系表达不同荧光蛋白
利用phi29DNA聚合酶扩增的方法，以上述质粒为模板，使用随机七碱基引物将所有质粒中位于转录起始序列5’UTR和终止序列3’UTR之间的片段进行扩增，将扩增产物作为合成各种荧光蛋白的DNA模板。其中，所述转录起始序列5’UTR和终止序列3’UTR之间包含一种或多种串联组合，所述串联组合包括增强翻译调控元件和蛋白质表达纯化标签元件。
按照使用说明，将上述制备好的荧光蛋白DNA模板(不同荧光蛋白的模板母液浓度相等)加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中。
本实施例所用体外无细胞蛋白合成体系(总体积30μL)：包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，90mM醋酸钾，4.0mM 醋酸镁，3.0mM核苷三磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003 mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇(PEG-8000)，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约55mg/mL)，0.04mg/mL外源添加的RNA聚合酶，以及15ng/μL荧光蛋白DNA等。当荧光蛋白DNA的种类大于1时，这里的15ng/μL为各荧光蛋白 DNA的总浓度。
将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。反应过程之中可观察到不同荧光呈现，并且在一定时间段内，颜色逐渐变深。反应结束后，立即放置于TecanInfinite F200/M200型多功能酶标仪，选择不同滤光片，根据所测荧光蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读数，检测各荧光信号强弱，以相对荧光单位值(RelativeFluorescence Unit,RFU)作为活性单位，如图1和图2所示。
实施例4纯化荧光蛋白
将反应得到的荧光蛋白利用市售镍珠(生工，C600033)进行优化纯化，具体纯化方法步骤参考说明书，纯化后的蛋白样品进行纯度测定，获得其蛋白浓度。将纯化得到的蛋白制成溶液，取1μL，加入1μL 5×SDS-loading buffer(不含DTT)，进行SDS-PAGE，然后进行荧光成像，选取几个荧光呈现比较明显的蛋白为例，如图3(3a和3b)所示；取 10μL上述纯化得到的蛋白，加入2.5μL 5×SDS-loading buffer(含500mM DTT)，进行SDS-PAGE，进行考马斯亮蓝染色，脱色并凝胶成像，优化前如图4(图4a和图4b)，优化后如图5(图5a和图5b)所示。
实施例5建立标准曲线
1)检测单独某一蛋白的浓度与相对荧光单位值(RFU)的关系
使用实施例4中经过镍珠纯化的蛋白样品作为标准蛋白样品，以buffer(500mMNacl+20mM Tris-HCl(pH8.0))不同梯度稀释，置于Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪中，选取不同滤光片，根据所测蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读取RFU。以荧光蛋白tdTomato,clover，Micy为例，单独某一蛋白浓度与RFU成正相关的关 系，如图6(6a-6c)所示。本实施例获得的所述信号强度-蛋白浓度关系曲线的拟合而成 的蛋白质量浓度标准曲线分别为：
y1＝0.0326X1，R2＝0.9994
y2＝0.0433X2，R2＝0.9994
y3＝0.1523X3，R2＝0.9998
式中y1，y2，y3分别为待测蛋白tdTomato，Clover,Micy的质量浓度(单位：μg/mL)，X1，X2，X3为tdTomato，Clover,Micy的发光值(RFU)。
2)检测单独某一蛋白表达时的模板比例与相对荧光单位值(RFU)的关系
将上述制备好的荧光蛋白DNA模板(不同荧光蛋白的模板母液浓度相等)加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中。
本实施例所用体外无细胞蛋白合成体系(总体积30μL)：包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，90mM醋酸钾，4.0mM 醋酸镁，3.0mM核苷三磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003 mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约 55mg/mL)，以及15ng/μL荧光蛋白DNA等。
将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。反应结束后，立即放置于Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪，根据所测蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读取RFU。以荧光蛋白tdTomato，clover，Micy为例，分别单独表达tdTomato 或Clover或MiCy时，蛋白产量和模板量(每30μL体系共加1μL模板)无关，如图7 (7a-7c)所示。
实施例6定量共表达两种荧光蛋白
检测在两种蛋白共表达体系中某一蛋白的模板DNA的体积百分比(相对于两种荧光蛋白的模板DNA的总量得到的百分比)与该蛋白质量百分含量关系(即总体系中各目标蛋白质量占总目标蛋白质量的比例，以百分数计)。此处，各蛋白模板的体积百分比与各蛋白模板的浓度百分比一致。
将上述制备好的荧光蛋白DNA模板(不同荧光蛋白的模板母液浓度相等)加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中。
本实施例所用体外无细胞蛋白合成体系(总体积30μL)：包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，90mM醋酸钾，4.0mM 醋酸镁，3.0mM核苷三磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003 mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约 55mg/mL)，以及15ng/μL荧光蛋白DNA(对应模板总浓度)，其中，两种荧光蛋白模板的总体积用量为1μL。
将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。反应结束后，立即放置于Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪，根据所测蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读取RFU。当两种蛋白共同表达时，如tdTomato和Clover或tdTomato和MiCy 在同一反应体系共同表达，发现蛋白产量和模板用量成正相关，且基本呈线性关系，如图 8(8a-8d)所示。图8中以tdTomato和Clover的共表达为例，显示了其蛋白量所占比例与其载体所占百分比的线性关系；另外，tdTomato和MiCy的共表达组合也呈现出相类似的蛋白量所占比例与相应载体所占百分比之间的线性关系。
结合实施例5的标准曲线，以tdTomato和Clover的共表达为例，绘制出所述模板DNA的体积百分比(根据某个模板体积所占模板总体积的比例，数值上等于某个模板浓度所占模板总浓度的比例)与所获得的蛋白浓度百分含量(即总体系中各蛋白含量占总蛋白含量的比例)之间的标准曲线如下。
当tdTomato和Clover共表达时，
y1＝1.0371x1,R2＝0.9973(0<x1<0.96)
y2＝0.9713(1-x1)＝-0.9713x1+0.9713,R2＝0.9969
式中y1，y2分别为待测蛋白tdTomato，Clover蛋白的百分含量，x1为两种蛋白共表达时tdTomato的模板DNA的体积百分数。
实施例7定量共表达三种荧光蛋白
检测单独某一蛋白在三种蛋白共表达体系中的模板比例与相对荧光单位值(RFU)的关系。
将上述制备好的荧光蛋白DNA模板(不同荧光蛋白的模板母液浓度相等)加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中。
本实施例所用体外无细胞蛋白合成体系(总体积30μL)：包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，90mM醋酸钾，4.0mM 醋酸镁，3.0mM核苷三磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003 mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约 55mg/mL)，以及15ng/μL荧光蛋白DNA(对应模板总浓度)，其中，三种荧光蛋白模板的总体积为1μL。
将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。反应结束后，立即放置于Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪，根据所测蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读取RFU。当三种蛋白共表达时，如tdTomato,Clover和mKate1.3；以及当tdTomato,Clover和mNeptune2共表达时，呈现出与前一实施例(即实施例6)类似的线性关系，即蛋白产量和模板用量成正相关，且基本呈线性关系。A1，B1，C1，D1，E1， F1，G1代表Clover:tdTomato:mKate1.3模板比例分别为1:1:1，1:2:3，1:3:2，2:1:3，2:3:1， 3:1:2，3:2:1；而A2，B2，C2，D2，E2，F2，G2代表Clover:tdTomato:mNeptune2模板比例分别为1:1:1，1:2:3，1:3:2，2:1:3，2:3:1，3:1:2，如图9(9a-9d)所示。
本实施例获得的所述模板比例与蛋白产量比例拟合而成的蛋白百分含量标准曲线分别为：
当tdTomato,Clover和mKate1.3共表达时，
y5＝0.9147x3+0.1041,R2＝0.973(0<x3<0.979)
式中y5为待测蛋白Clover蛋白的含量(相对于各蛋白的总量)，x3为三种蛋白共表达时Clover的模板DNA的体积百分数。
当tdTomato,Clover和mNeptune2共表达时，
y6＝0.9664x4+0.0159,R2＝0.9721(0<x4<1)
式中y6为待测蛋白Clover蛋白的含量(相对于各蛋白的总量)，x4为三种蛋白共表达时Clover的模板DNA的体积百分数。
图9中仅以Clover为例显示了其蛋白量所占比例与其载体所占百分比的线性关系，共表达的另两种蛋白的也具有相类似的蛋白量所占比例与相应载体所占百分比之间的线性关系。
实施例8tdTomato和Clover两种荧光蛋白定量共表达
根据需要，预定合成后的两种目标蛋白的质量浓度比为1:1，即tdTomato蛋白为50％， Micy蛋白为50％，根据实施例6所得出的关于tdTomato和Clover共表达时的关系式，计算出两种荧光蛋白模板DNA的体积比例关系(与浓度比例关系一致)：
y1＝1.0371x1,R2＝0.9973(0<x1<0.96)
式中y1为tdTomato蛋白的百分含量，则1-y1为Clover蛋白的百分含量，x1为两种蛋白共表达时tdTomato的模板DNA的体积百分数。
即当y1为50％，计算出x1＝50％/1.0371＝48％,1-x1＝1-42％＝52％,即：tdTomato和Clover 两种蛋白的载体体积比为0.48:0.52，在两种蛋白载体的总体积为1μL时，tdTomato的载体加入0.48μL，而Clover的载体加入量为0.52μL。
按上述计算结果，将模板母液浓度相同的tdTomato和Clover两种荧光蛋白的DNA模板(450ng/μL)各取0.48μL和0.52μL加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中(总体积30μL)。其中，乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM 三羟甲基氨基甲烷(pH8)，90mM醋酸钾，4.0mM醋酸镁，3.0mM核苷三磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约55mg/mL)，以及15ng/μL 荧光蛋白DNA(指模板总浓度)，其中，两种荧光蛋白tdTomato和Clover模板的总体积为1μL。
将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。反应结束后，立即放置于Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪_，根据所测蛋白特性设定相应的最大激发和发射波长，读取RFU。tdTomato和Clover的RFU值分别为1308和975。将所得RFU值代入实施例5所述标准曲线关系式：
y1＝0.0326X1，R2＝0.9994
y2＝0.0433X2，R2＝0.9994
式中y1，y2分别为待测蛋白tdTomato，Clover的质量浓度(单位：μg/mL)，X1， X2为tdTomato，Clover的发光值(RFU)。由上述关系式得出待测蛋白tdTomato，Clover 的质量浓度分别为42.64μg/mL和42.22μg/mL，两者质量浓度之比为42.64：42.22，近似 1:1，与预定结果基本一致。由此可见，本发明方法用于体外定量共表达多种荧光蛋白准确、可行。
本发明首次构建了体外定量共表达多种蛋白的方法，利用体外蛋白合成体系合成多种蛋白，操作简单，高效快捷，用于合成荧光蛋白时，产生肉眼可视可估量的荧光强度，与传统手段相比，实现了表达蛋白的实时监测，更高效直观，将复杂现象简单化。建立多个荧光蛋白的定量共表达，即在同一体系中同时合成多种蛋白的方法，可根据预先设定的比例(目标比例)，按目标比例定量合成多种目标蛋白。
上述仅为本发明的部分实施例，本发明并不仅限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内或指导、启示下，可以有各种变化和更改，所做的任何具有等同技术效果的变化和更改，均在本发明保护范围之内。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (12)

1.体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立标准曲线；
建立各标准蛋白浓度与各自发光值关系的标准曲线；
(2)分别构建包含各目标蛋白基因的独立载体，以用于分别表达各目标蛋白；
(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比的定量关系式；
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例加入到一种体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比与所述相应载体的浓度百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致；
(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度及浓度比例；
根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度及浓度比例；
(5)定量共表达多种目标蛋白；
根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。
2.如权利要求1所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述各目标蛋白的独立载体在各母液中的浓度均相同；
(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比或者体积百分比的定量关系式；
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例或者体积比例加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比或者体积百分比与所述相应载体的浓度百分比或者体积百分比之间的定量关系式；
在所述体外无细胞蛋白合成体系中，所述载体总浓度保持一致；
(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度或者载体体积，以及相应的浓度比例或者体积比例；
根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度以及浓度比例，或者计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体体积以及体积比例；
(5)定量共表达多种目标蛋白；
根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例或者所需的各目标蛋白载体的体积以及体积比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。
3.如权利要求1所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中所述各目标蛋白的发光值在最大发射波长下不受其他蛋白的干扰。
4.如权利要求1所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述包含各目标蛋白基因的载体分别为包含相应目标蛋白编码序列的质粒。
5.如权利要求1-4中任一项所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中所述体外无细胞蛋白合成体系为酵母细胞体外蛋白合成体系、大肠杆菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系之一或其组合。
6.如权利要求5所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述酵母细胞选自下组中任一种：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、及其组合。
7.如权利要求3所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述发光值为相对荧光单位值,记为RFU。
8.如权利要求1-7任一项所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述多种目标蛋白各自独立地为发光蛋白或者携带发光标签的融合蛋白。
9.如权利要求8所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述发光蛋白为天然荧光蛋白、改造的荧光蛋白或包含荧光蛋白的融合蛋白。
10.如权利要求9所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，还包括所述目标蛋白的分离或/和纯化。
12.体外无细胞蛋白合成体系在权利要求1-11任一项所述体外定量共表达多种蛋白的方法中的应用。
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Denomination of invention: The method and application of quantitative co expression of multiple proteins in vitro

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