KR20220016191A - 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법 및 이의 용도 - Google Patents
시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
다음 단계를 포함하는 시험관 내 단백질 합성 시스템에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법을 제공한다: (1) 표준 단백질 농도 및 발광 값 사이의 상관관계의 표준 곡선을 수립하고; (2) 표적 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 생성하고, 시험관 내 단백질 합성 시스템을 수득하며; (3) 표적 단백질 농도 및 벡터 농도 사이의 상관관계의 곡선을 수립하고; (4) 다중 표적 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 벡터의 농도 또는/및 농도 비율을 계산하여; (5) 표적 단백질을 정량적으로 동시 발현한다.
Description
본 출원은 2019년 5월 30일에 출원된 중국 특허 출원번호 CN 201910460987.8에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법 및 그 응용에 관한 것이다.
형광 단백질은 생물학의 많은 연구 분야에서 널리 사용되었다. 형광 단백질 기반의 분자 프로브(probe)와 라벨링(labeling) 방법은 살아있는 세포 또는 생체 내에서 동적 이미징을 통해 생물학적 거대분자 또는 세포 기능을 연구하기 위한 중요한 연구 툴이 되었다. 녹색 형광 단백질 유전자는 1992년 해파리에서 처음 복제된 이후, 많은 해양 생물 종에서 많은 새로운 형광 단백질이 복제되었으며, 형광 단백질의 변형으로 새로운 돌연변이를 얻었다. 이러한 새로운 형광 단백질 및 돌연변이는 생체 분자 또는 세포를 “밝힐” 수 있고, 생체 분자의 활성을 나타내므로, 이러한 분자 또는 세포의 활성 법칙과 특성을 알아내는데 도움이 된다. 보고된 형광 단백질의 스펙트럼은 가시 영역 전체에 분포되어 있다. 이러한 형광 단백질은 유전자 발현 및 조절, 단백질 공간 배치 및 수송, 단백질 폴딩, 신호 전달, 프로테아제 활성 분석 및 생체 분자 상호 작용과 같은 분야에서 널리 사용된다. 형광 단백질의 발견 및 응용은 현대 생물학의 연구를 위한 강력한 연구 수단을 제공한다.
생명공학의 발전으로 인해 합성 생물학자는 생물학적 시스템을 빠르고 안정적으로 변형하고 생물학적 거대 분자를 설계 및 생산할 수 있으며, 특히 생물학적 기능을 갖는 단백질 거대 분자를 설계 및 생산할 수 있다. 지난 몇 넌 동안 합성 생물학의 발전에서 단백질은 주로 세포를 숙주로 하여 세포 내부에서 엔지니어링(engineered)되었으나, 세포 내부에서 엔지니어링 하는 것은 시간이 많이 걸리고 어렵다. 이는 세포 성장 및 적응 과정이 일반적으로 엔지니어링 설계(engineering design)의 목표와 일치하지 않고 살아 있는 세포 시스템의 복잡성, 유전적 요소 표준화의 어려움 및 세포막에 의해 생성되는 장벽으로 인해 생물학적 구성 요소의 변경이 크게 제한되기 때문이다. 이러한 한계에 앞에서 사람들은 새로운 공학 기술 분야, 즉 무세포 합성 생물학의 발전을 촉진하는 새로운 발전 방향을 모색한다. 무세포 합성 생물학은 최근에 알려진 기술, 시험관 내 전사 및 번역을 포함하는 시험관 내 합성 시스템으로도 알려진 무세포 합성 시스템을 포함한다. 무세포 단백질 합성 시스템에서는 외인성 표적 mRNA 또는 DNA가 단백질 합성의 주형 역할을 하며, 단백질 합성에 필요한 기질과 전사 및 번역과 관련된 단백질 인자를 수동으로 조절하여 표적 단백질을 합성한다. 무세포 단백질 합성 시스템은 플라스미드 구성, 형질전환, 세포 배양, 세포 수집 및 단편화의 단계를 제거하여 단백질을 합성 및 발현한다. 따라서, 빠르고, 시간을 절약하고, 편리한 단백질 발현 방법이다.
형광 단백질의 특성으로 인해 형광 단백질은 생물학적 연구에서 중요하고 대체할 수 없는 역할을 한다. 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현시킬 수 있을지는 현재 직면한 중요한 기술적 문제이다. 연구 및 문헌 검색하였을 때, 본 발명자들은 시험관 내 무세포 단백질 합성 기술을 사용하여 동일한 반응 시스템에서 다중 단백질을 정략적으로 동시 발현한다는 보고는 찾지 못하였다. 본 발명에 대한 많은 실험 및 연구 끝에 본 발명자들은 주형 DNA의 부피 또는 농도 비율을 조절함으로써 다중 형광 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법을 발견하였다. 이는 다양한 연구 또는 기타 목적을 위해 고효율 형광 지시 분자, 형광 표지된 세포 또는 생물체의 연구 및 개발에 사용될 수 있다.
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시험관 내 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법이 본 발명에 개시되어 있다. 이 방법에서는, 표적 단백질의 주형(바람직하게는 DNA 주형)의 농도 및 투여량 비례 관계에 따라 동일한 반응 시스템에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현할 수 있다.
첫 번째 측면에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 시험관 내 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법을 제공한다:
(1) 표준 곡선 수립.
각 표준 단백질의 농도와 각 발광 값 사이의 관계에 대한 표준 곡선의 수집
단계 (1)에서, 동시 발현하고자 하는 다중 표적 단백질의 종류에 따라, 각 표적 단백질에 상응하는 표준 단백질을 제공하고; 각 다중 표적 단백질은 발광 기능을 갖는 독립적인 단백질이고, 각 다중 표적 단백질은 발광 특성에 따라 서로 구별될 수 있으며, “상호 간섭 없이” 개별적으로 검출될 수 있으므로, 각 표적 단백질의 정량적 검출이 달성될 수 있다.
특히, 단계 (1)에서 표준 단백질은 표적 단백질의 표준 시료이다. 이는 표적 단백질을 합성한 후에 분리 및 정제하여 얻을 수도 있고, 시판되는 사용가능한 분석용 순수 제품을 구입할 수 있다.
(2) 상이한 다중 표적 단백질을 발현시키기 위하여 각각의 상이한 표적 단백질 유전자를 포함하는 벡터의 생성.
“표적 단백질 유전자를 포함하는 벡터”는 벡터가 표적 단백질의 암호화 서열을 포함하는 것을 의미하고, “표적 단백질의 벡터”로도 지칭될 수 있다. 예를 들면, “GFP 단백질을 암호화하는 벡터”는 단순히 “GFP 벡터”로 지칭될 수 있다.
이 단계에서, 각 표적 단백질을 각각 발현하기 위하여 표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터가 생성된다. 각각의 표적 단백질에 대해 그 암호화 서열을 포함하는 개별 벡터가 생성되고, 표적 단백질은 각각의 개별 벡터를 통해 동시 발현 시스템에서 독립적으로 발현된다.
(3) 각 표적 단백질의 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 사이의 정량적 관계 방정식의 수립.
단계 (2)에서 표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터를 시험관 내 단백질 합성 반응, 즉 인큐베이션 반응을 위해 상이한 농도 비율로 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 첨가하여 다중 표적 단백질을 합성하고: 지정된 반응시간 후, 반응 용액의 각 표적 단백질에 대한 발광 값을 얻고; 각 표적 단백질 생성물의 농도를 단계 (1)에 나타낸 표준 곡선에 따라 구하고, 각 표적 단백질 생성물 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 사이의 정량적 관계 방성식을 피팅하여 구하며; 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 벡터의 총 농도는 동일하게 유지된다.
표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터가 다른 농도 비율로 첨가될 때, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 다중 시험관 내 단백질 반응 동안의 총 벡터 농도는 동일하게 유지된다.
총 벡터 농도는 시험관 내 단백질 무세포 합성 시스템에서 모든 표적 단백질의 벡터 농도의 합을 의미한다.
(4) 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위하여 필요한 벡터의 농도 및 농도 비율의 계산.
달성하고자 하는 다중 표적 단백질의 생성물 농도 비율 관계(예: 질량 농도 비율 관계)는 다중 표적 단백질의 목표 농도로 설정하고; 발현하고자 하는 다중 표적 단백질 각각에 대한 벡터의 농도 및 농도 비율은 단계 (3)에서 수립된 방정식을 사용하여 계산한다.
(5) 다중 단백질을 정략적으로 동시 발현.
단계 (4)에서 얻은 각 표적 단백질 벡터의 필요한 농도 및/또는 농도 비율에 따라, 각 표적 단백질의 상응하는 양의 개별 벡터가 단계 (3)에 기재된 바와 같이 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가되고, 동시 발현된 다중 표적 단백질은 단계 (3)에서 정의된 시간의 특정 기간 동안 반응된 후 수득한다.
각 모용액(mother solution)에 각 표적 단백질 개별 벡터의 농도가 같을 때, 단순히 부피 또는 부피비로 투여량을 조절할 수도 있다. 예를 들면 다음과 같다:
다음 단계를 포함하는, 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법:
단계 (1) 및 (2)는 상기 기재된 바와 같다.
단계 (3), 각 표적 단백질의 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 또는 부피 백분율 사이의 정량적 관계의 방정식을 수립한다.
단계 (2)에서 표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터는 시험관 내 단백질 합성 반응을 위해 상이한 농도 비율 또는 부피 비율로 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가되고; 지정된 반응 시간 후, 반응 용액에서 각 표적 단백질에 대한 발광 값을 얻고; 단계 (1)에 나타낸 표준 곡선에 따라 각 표적 단백질 생성물의 농도를 계산하고, 각 표적 단백질 생성물의 농도 백분율 또는 부피 백분율과 상응하는 벡터의 농도 백분율 또는 부피 백분율 사이의 정량적 관계 방정식을 피팅을 통해 얻고; 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 벡터의 총 농도는 동일하게 유지한다.
단계 (4), 벡터 농도 또는 벡터 부피와 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위해 필요한 상응하는 농도 비율 또는 부피 비율을 계산한다.
발현하고자 하는 다중 표적 단백질의 표적 농도 비율에 따라, 단계 (3)에서 수립된 방정식을 사용하여 발현하고자 하는 다중 표적 단백질 각각에 대한 필요한 벡터의 농도 및 농도 비율, 또는 발현하고자 하는 다중 표적 단백질 각각에 대한 필요한 벡터의 부피 및 부피 비율을 계산한다.
각 표적 단백질 벡터에 필요한 농도 및 농도 비율은 단계 (3)에 표시된 전체 벡터 농도에 따라 계산할 수 있다.
각 표적 단백질 벡터의 필요한 부피 및 부피 비율은 단계 (3)에서 나타낸 전체 벡터 농도와 각 벡터의 모용액(mother solution) 농도에 따라 계산할 수 있다. 각 벡터의 모용액 농도가 같을 때, 각 표적 단백질 벡터의 농도 비율 관계는 해당 부피 비율 관계와 일치한다.
(5) 다중 단백질을 정량적으로 동시발현.
각 표적 단백질 벡터의 필요 농도 또는 농도 비율, 또는 단계 (4)에서 얻은 각 표적 단백질 벡터에 대한 필요 부피 또는 부피 비율에 따라, 단계 (3)에 기재된 시험관 내 단백질 합성 시스템에 상응하는 각 표적 단백질의 개별 벡터를 첨가하고, 동시 발현된 다중 표적 단백질은 단계 (3)에서 정의된 특정 시간 동안 반응 후 수득한다.
시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 주형을 제외하고 단백질 합성에 필요한 최소한의 구성 요소를 포함한다. 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 주형을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 실험실에서 준비하거나 상업적으로 이용 가능한 제품일 수도 있다.
바람직한 실시예 중 하나로서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 다음을 포함한다:
(a) 효모 세포 추출물;
(b) 폴리에틸렌 글리콜;
(c) 선택적인 외인성 수크로오스; 및
(d) 선택적인 용매, 상기 용매는 물 또는 수용액(aqueous solvent).
상기에서, 효모 세포는 야생형 세포 또는 유전자 변형 세포로부터 유래된 것일 수 있다.
상기에서, 구성요소 (c) 및 (d)에 “선택적인” 이라는 단어는 불필요함을 의미하며, 구성요소 (c) 및 (d)는 각각 독립적으로 생략 가능하다.
바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 효모 세포, 트리하이드록시메틸아미노케안(Tris), 칼륨 아세테이트, 마그네슘 아세테이트, 뉴클레오시드 3인산 혼합물(NTP), 아미노산 혼합물, 인산 칼륨, 아밀라아제, 폴리에틸렌 글리콜, 말토덱스트린 등을 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 효모 세포 추출물, Tris, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 아세테이트, 뉴클레오시드 3인산 혼합물(NTP), 아미노산 혼합물, 인산 칼륨, 아밀라아제, 폴리에틸렌 글리콜, 말토덱스트린, 형광 단백질 DNA 등을 포함한다.
본 발명에서, 시험관 내 단백질 무세포 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 비율은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 부피 기준 함량은 20%-70%, 바람직하게는 30%-60%, 더 바람직하게는 40%-50%이다.
바람직하게는, 단계 (3)에서 각 표적 단백질의 발광 값은 최대 방출 파장에서 다른 단백질에 의해 간섭되지 않는다.
단계 (3)에서 각 표적 단백질의 농도 백분율에서의 농도는 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 주형이 첨가된 이후 반응 기간 후 반응 용액에 합성된 각 표적 단백질의 최종 농도, 즉 각 표적 단백질 생산물의 농도이다. 바람직하게는, 농도는 16-23시간 동안 반응이 지속된 후 반응 용액 내 각 표적 단백질의 농도를 의미한다.
바람직하게는, 단계 (5)에서 반응 시간은 단계 (3)에서 정의된 반응 시간과 일치한다.
더 바람직하게는, 단계 (2)에서 벡터는 표적 단백질 암호화 서열을 포함하는 플라스미드이다. 즉, 각각의 표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터는 각각 상응하는 표적 단백질 암호화 서열을 포함하는 플라스미드이다.
다른 바람직한 실시예에서, 단계 (3)의 시험관 내 단백질 합성 시스템은 효모 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 대장균 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 포유동물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 식물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 곤충 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나이다.
다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이스세(Kluyveromyces) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시예에서, 발광 값은 상대적 형광 단위(RFU) 값이다.
바람직하게는, 복수의 단백질 중 특정 검사 대상 단백질을 검사할 때, 최대 여기(excitation) 파장 및 최대 방출 파장의 조건에서 단백질을 테스트할 때 테스트할 단백질의 발광 값이 용액 내 다른 단백질의 간섭을 받지 않고 광학 필터 사용에 적합하다.
일부 바람직한 실시예에서, 다중 표적 단백질은 각각 독립적으로 발광성 단백질 또는 발광성 표지를 보유한 융합 단백질이다. 발광 표지는 발광 기능을 갖는 폴리아미노산(2개 이상의 아미노산 단위를 가짐)이며, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 표적 단백질은 발광성 단백질이다. 발광성 단백질은 천연 발광성 단백질, 변형된 발광성 단백질 및 발광성 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 발광성 단백질은 형광 단백질이다. 형광 단백질은 천연 형광 단백질, 변형된 형광 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 형광 단백질은 적색 형광 단백질, 주황색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 청록색(cyan) 형광 단백질, 파란색 형광 단백질 또는 보라색 형광 단백질이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법은 표적 단백질의 분리 및/또는 정제를 추가로 포함하며, 즉, 이는 표적 단백질의 분리(isolation) 및 표적 단백질의 정제 과정 중 적어도 하나를 포함한다.
두 번째 측면에 따르면, 본 발명은 첫 번째 측면에 따라 시험관 내에서 다중 단백질을 정략적으로 동시 발현하는 방법에서 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템의 용도를 제공한다.
세 번째 측면에 따르면, 본 발명은 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 발현되는 하나 또는 복수의 형광 단백질을 제공한다. 상기에서, 복수의 형광 단백질은 동일한 반응 시스템에서 동시 발현된다.
본 발명의 주요 이점은 다음과 같다:
(1) 처음으로, 본 발명은 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 다중 단백질은 간단하고, 효율적이며 빠른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 합성된다. 형광 단백질 합성에 사용할 때, 육안으로 감지할 수 있는 측정 가능한 형광 강도를 생성할 수 있다. 기존의 방법과 비교할 때, 효율적이고 직관적인 방법으로 발현된 단백질을 실시간으로 모니터링 할 수 있으며, 복잡한 현상을 단순화할 수 있다.
(2) 다중 형광 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법, 즉 동일한 시스템에서 다중 단백질을 동시에 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 표적 단백질은 미리 정해진 비율로 정량적으로 합성될 수 있다.
(3) 본 발명의 방법은 치료 단백질을 합성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 항체의 중쇄 단백질 및 경쇄 단백질을 비율에 따라 합성하기 위하여 중쇄 단백질 및 경쇄 단백질을 정량적으로 동시 발현하도록 설정될 수 있다.
도 1은 녹색 계열(청록색, 녹색 및 노란색 포함)을 인식하기 위해 최대 Ex/Em(여기/방출파장)이 488/507nm일 때 시험관 내 합성된 형광 단백질의 상대적 형광 단위(RFU) 값을 도식화한 그래프이다. 도 1은 다중 형광 단백질(19개 단백질 포함, 예를 들어 moxCerulean3, AmCyan1, MiCy, mEGFP, Clover, mVenus, ZsYellow1 및 mEos3.2)의 총 RFU 값과 원심분리된 단백질의 상청액의 RFU 값을 나타내고, 상기에서 AmCyan1 및 ZsYellow1의 발현 수준은 상대적으로 더 낮다.
도 2는 붉은 계열(빨간색, 오랜지색(tangerine) 및 근적외선 포함)을 인식하기 위해 최대 Ex/Em(Excitation/Emission 파장)이 569/593 nm일 때 시험관 내 합성된 형광 단백질의 상대적 형광 단위(RFU) 값을 도식화한 그래프이다. 도 2는 다중 형광 단백질(17개 단백질 포함, 예를 들어 mKO2, TurboRFP, tdTomato, eqFP611, mKate1.3, mNeptune2 및 miRFP670)의 총 RFU 값과 원심분리된 단백질의 상청액의 RFU 값을 나타내고, 상기에서 상청액 중 TurboRFP의 발현 수준은 상대적으로 더 낮다.
도 3은 9개 단백질의 형광 이미징 결과를 나타낸다. 도 3a는 여기광 및 방출광 각각의 파장이 430 nm와 535nm 일 때의 형광 이미징 결과를 보여준다. 도 3b는 여기광 및 방출광 각각의 파장이 530 nm와 605nm 일 때의 형광 이미징 결과를 보여준다. 표 1에 기재된 단일 분자량에 따라 도 3에서 SDS-PAGE 전기영동 단백질이 나타내는 분자량과 함께 단백질 응집 구조를 분석하였다. 상기에서, AmCyan1 및 ZsGreen는 사량체 구조이고, MiCy는 이량체 구조이며, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, 및 mKate1.3는 단량체 구조이다.
도 4는 Ni-Bead 정제의 최적화 전에 정제된 단백질의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색의 겔 이미징 결과를 보여준다. 결과는 단백질 mAmetrine 및 mEOS3.2만이 단일 고순도 단백질을 얻는 것으로 나타났으며, AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mNeptune2 및 PAmCherry의 정제된 밴드가 정확하고 명확하게 보였고, 모두 불순물 단백질을 포함하며, miRFP670 밴드가 약하고 eqFP611은 정제된 밴드를 얻지 못하였다.
도 5는 Ni-Bead 정제의 최적화 후에 정제된 단백질의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색의 겔 이미징 결과를 보여주며, 상기 정제된 단백질은 AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mEOS3.2, TurboRFP, eqFP611, mNeptune2, miRFP670, mAmetrine 및 PAmCherry와 같은 18개의 단백질을 포함하고, tdTomato를 제외하고 상기에서 언급한 모든 단백질은 단일 고순도 단백질을 얻는다. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 결과 밴드 사이즈는 정확하고 선명하게 보이지만, eqFP611 및 miRFP670의 밴드는 약하다.
도 6은 단백질의 농도와 상대적 형광 단위(RFU) 값 사이의 관계를 나타낸다. 형광성 단백질인 tdTomato, clover 및 Micy를 예로 들면 단일 단백질의 농도는 RFU 값과 양의 상관관계가 있으며 그 관계는 실질적으로 선형이다.
도 7은 단백질 단독 발현 시 DNA 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸 것이다. 형광 단백질 tdTomato, Clover 및 Micy를 예로 들면, tdTomato 또는 Clover 또는 MiCy가 단독으로 발현될 때, 단백질 수율이 반드시 주형의 양과 관련되는 것은 아니다. 주형의 비율은 도면과 같이 100% 농도 값을 기준으로 주형 용액의 농도를 다른 정도로 희석하여 얻은 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 8은 두 개의 단백질이 동시에 발현되는 시스템에서 단백질의 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸다. 같은 반응 시스템에서 tdTomato 및 Clover가 동시 발현되는 것과 같은 두 개의 단백질이 동시 발현될 때, 단백질 수율은 주형의 양과 양의 상관 관계에 있고, 그 관계는 실질적으로 선형이다. 여기서 주형 비율은 동시 발현된 두 단백질의 주형 총량에 대한 단백질 중 하나의 주형 양 양의 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 9는 세 개의 단백질이 동시에 발현되는 시스템에서 단백질의 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸다. tdTomato, Clover 및 mKate1.3과 같은 세 개의 단백질이 동시 발현 될 때, 단백질 수율은 주형의 양과 양의 상관관계가 있고, 관계는 실질적으로 선형이다. 도 9에서 A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1은 Clover: tdTomato: mKate1.3 주형 비율이 각각 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1임을 보여준다. 여기서 주형 비율은 동시 발현된 세 개의 단백질의 주형의 총량에 대한 단백질 중 하나의 주형의 양의 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 10은 형광 단백질 합성 과정을 나타낸 순서도이다. 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 합성된 18개의 형광 단백질을 합성하고, 합성된 단백질을 정제하여 다양한 색상의 형광 단백질을 얻는다. 얻어진 형광 단백질은 순도가 높기 때문에 육안으로 볼 수 있다.
도 11은 pD2P 플라스미드의 프로파일을 보여준다. pD2P 플라스미드의 길이는 6384bp이며 다음 요소로 구성된다: 프로모터 요소(도면에 표시되지 않음), 5'UTR(오메가 인핸서 포함), 신호 펩타이드 코딩 서열(SP12), 표적 단백질 코팅 서열, LAC4 종결자, 다중 복제 사이트(MCS), T7 종결자, 복제 개시점(f1ori), AmpR 프로모터, 암피실린 내성 유전자(AmpR gene), 고복제수 복제 개시점(high copy number replication origin(ori)), 플라스미드의 복제수를 조절하는 유전자(rop gene), lacI 프로모터, lacI 코딩 서열, 등.
도 2는 붉은 계열(빨간색, 오랜지색(tangerine) 및 근적외선 포함)을 인식하기 위해 최대 Ex/Em(Excitation/Emission 파장)이 569/593 nm일 때 시험관 내 합성된 형광 단백질의 상대적 형광 단위(RFU) 값을 도식화한 그래프이다. 도 2는 다중 형광 단백질(17개 단백질 포함, 예를 들어 mKO2, TurboRFP, tdTomato, eqFP611, mKate1.3, mNeptune2 및 miRFP670)의 총 RFU 값과 원심분리된 단백질의 상청액의 RFU 값을 나타내고, 상기에서 상청액 중 TurboRFP의 발현 수준은 상대적으로 더 낮다.
도 3은 9개 단백질의 형광 이미징 결과를 나타낸다. 도 3a는 여기광 및 방출광 각각의 파장이 430 nm와 535nm 일 때의 형광 이미징 결과를 보여준다. 도 3b는 여기광 및 방출광 각각의 파장이 530 nm와 605nm 일 때의 형광 이미징 결과를 보여준다. 표 1에 기재된 단일 분자량에 따라 도 3에서 SDS-PAGE 전기영동 단백질이 나타내는 분자량과 함께 단백질 응집 구조를 분석하였다. 상기에서, AmCyan1 및 ZsGreen는 사량체 구조이고, MiCy는 이량체 구조이며, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, 및 mKate1.3는 단량체 구조이다.
도 4는 Ni-Bead 정제의 최적화 전에 정제된 단백질의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색의 겔 이미징 결과를 보여준다. 결과는 단백질 mAmetrine 및 mEOS3.2만이 단일 고순도 단백질을 얻는 것으로 나타났으며, AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mNeptune2 및 PAmCherry의 정제된 밴드가 정확하고 명확하게 보였고, 모두 불순물 단백질을 포함하며, miRFP670 밴드가 약하고 eqFP611은 정제된 밴드를 얻지 못하였다.
도 5는 Ni-Bead 정제의 최적화 후에 정제된 단백질의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색의 겔 이미징 결과를 보여주며, 상기 정제된 단백질은 AmCyan1, ZsGreen, MiCy, moxCerulean3, Clover, mVenus, mKO2, tdTomato, mKate1.3, mTagBFP2, ZsYellow1, mEOS3.2, TurboRFP, eqFP611, mNeptune2, miRFP670, mAmetrine 및 PAmCherry와 같은 18개의 단백질을 포함하고, tdTomato를 제외하고 상기에서 언급한 모든 단백질은 단일 고순도 단백질을 얻는다. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 결과 밴드 사이즈는 정확하고 선명하게 보이지만, eqFP611 및 miRFP670의 밴드는 약하다.
도 6은 단백질의 농도와 상대적 형광 단위(RFU) 값 사이의 관계를 나타낸다. 형광성 단백질인 tdTomato, clover 및 Micy를 예로 들면 단일 단백질의 농도는 RFU 값과 양의 상관관계가 있으며 그 관계는 실질적으로 선형이다.
도 7은 단백질 단독 발현 시 DNA 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸 것이다. 형광 단백질 tdTomato, Clover 및 Micy를 예로 들면, tdTomato 또는 Clover 또는 MiCy가 단독으로 발현될 때, 단백질 수율이 반드시 주형의 양과 관련되는 것은 아니다. 주형의 비율은 도면과 같이 100% 농도 값을 기준으로 주형 용액의 농도를 다른 정도로 희석하여 얻은 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 8은 두 개의 단백질이 동시에 발현되는 시스템에서 단백질의 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸다. 같은 반응 시스템에서 tdTomato 및 Clover가 동시 발현되는 것과 같은 두 개의 단백질이 동시 발현될 때, 단백질 수율은 주형의 양과 양의 상관 관계에 있고, 그 관계는 실질적으로 선형이다. 여기서 주형 비율은 동시 발현된 두 단백질의 주형 총량에 대한 단백질 중 하나의 주형 양 양의 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 9는 세 개의 단백질이 동시에 발현되는 시스템에서 단백질의 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값의 관계를 나타낸다. tdTomato, Clover 및 mKate1.3과 같은 세 개의 단백질이 동시 발현 될 때, 단백질 수율은 주형의 양과 양의 상관관계가 있고, 관계는 실질적으로 선형이다. 도 9에서 A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1은 Clover: tdTomato: mKate1.3 주형 비율이 각각 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1임을 보여준다. 여기서 주형 비율은 동시 발현된 세 개의 단백질의 주형의 총량에 대한 단백질 중 하나의 주형의 양의 일련의 다른 비율을 나타낸다.
도 10은 형광 단백질 합성 과정을 나타낸 순서도이다. 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 합성된 18개의 형광 단백질을 합성하고, 합성된 단백질을 정제하여 다양한 색상의 형광 단백질을 얻는다. 얻어진 형광 단백질은 순도가 높기 때문에 육안으로 볼 수 있다.
도 11은 pD2P 플라스미드의 프로파일을 보여준다. pD2P 플라스미드의 길이는 6384bp이며 다음 요소로 구성된다: 프로모터 요소(도면에 표시되지 않음), 5'UTR(오메가 인핸서 포함), 신호 펩타이드 코딩 서열(SP12), 표적 단백질 코팅 서열, LAC4 종결자, 다중 복제 사이트(MCS), T7 종결자, 복제 개시점(f1ori), AmpR 프로모터, 암피실린 내성 유전자(AmpR gene), 고복제수 복제 개시점(high copy number replication origin(ori)), 플라스미드의 복제수를 조절하는 유전자(rop gene), lacI 프로모터, lacI 코딩 서열, 등.
용어
본 명세서에서 "시험관 내 단백질 합성 시스템", "시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템", "무세포 단백질 합성 시스템"은 동일한 의미를 가지며 혼용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유전자"는 특정 단백질을 암호화하는 염기 서열을 의미한다. 용어 "유전자"는 단백질의 코팅 서열(CDS)을 포함한다.
코딩 서열은 CDS로 약칭된다. 뉴클레오타이드 염기서열은 단백질의 코돈과 완전히 일치하며, 염기서열은 단백질에 해당되지 않는 다른 염기서열을 포함하지 않는다(mRNA 처리 과정 및 기타 과정 동안의 염기서열 번화는 고려하지 않음).
본 명세서에서 "발광 기능을 갖는다"라는 표현은 감광성을 갖고 검출 가능한 파장의 빛을 방출하도록 하는 것을 의미한다. 발광 특성에 따라 여기서 방출되는 빛은 형광, 인광, 자외선, 적외선 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 발광의 원리에 따라 발광 기능은 광발광, 화학발광, 자가발광 등일 수 있다.
본 발명에서 기질 농도의 특성화 방법은 특별히 제한되지 않으나, 질량 농도, 몰 농도, 질량 부피 농도 및 부피 농도를 포함하는 방법을 사용하여 정량화가 달성될 수 있다. 단백질, 벡터 및 기타 기질의 경우, 특성화 및 정량화를 적절한 농도 형태를 독립적으로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, "목표 단백질의 농도"는 바람직하게는 질량 농도 또는 질량 부피 농도이고, 몰 농도와 같은 다른 정량 가능한 농도 형태도 또한 선택될 수 있다.
본 명세서에서, "다수"는 둘 이상을 의미한다.
본 명세서에서, "여러 번"은 2회 이상을 의미한다.
본 명세서에서, "선택적"은 반드시 본 발명의 일 실시예는 아니며, 본 발명의 기술적 방안에 따라 선택적으로 적용될 수 있음을 의미한다. 또한 그것이 본 발명의 기술적 방안에 적합한지를 선택 기준으로 삼는다.
본 명세서에서, "그들의 조합"은 상기에 열거된 적어도 2개의 대상을 포함하는 임의의 적합한 조합을 의미한다.
본 발명의 상기 언급된 기술적 특징 및 이하에 구체적으로 설명된 기술적 특징(예를 들어 실시예)은 서로 결합되어 새로운 또는 바람직한 기술 방안을 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
시험관 내 단백질 합성 시스템
일부 바람직한 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 시험관 내 단백질 합성 시스템을 제공한다:
(a) 세포 추출물; 바람직하게는, 효모 세포 추출물;
(b) 어느 적절한 클라우딩제(crowding agent), 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜;
(c) 선택적인 외인성 수크로오스; 및
(d) 선택적인 용매, 상기 용매는 물 또는 수용액.
상기에서 (c) 및 (d)에 “선택적인” 이라는 단어는 불필요함을 의미하며, 구성요소 (c) 및 (d)는 각각 독립적으로 생략 가능하다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 시험관 내 단백질 합성 시스템은 효모 세포, tris, 칼륨 아세테이트, 마그네슘 아세테이트, 뉴클레오시드 3인산 혼합물(NTPs), 아미노산 혼합물, 인산 칼륨, 아밀라아제, 폴리에틸렌 글리콜, 말토덱스트린 등을 포함한다. 형광 단백질 DNA 및 다른 기질들은 시험관 내 단백질 합성 반응을 위해 시험관 내 단백질 시스템에 더 포함될 수 있다.
본 발명에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 비율은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 효모 세포 추출물의 부피 기준 함량은 20%-70%, 바람직하게는 30%-60%, 더 바람직하게는 40%-50%이다.
본 발명에서, 세포 추출물은 바람직하게는 온전한 세포(intact cell)를 포함하지 않는다. 알려진 적절한 세포 추출물 제조 기술을 선택하여 세포 추출물을 제조할 수 있다. 세포 추출물의 제조는 일반적으로 적어도 다음 단계를 포함한다: 적절한 양의 세포 추출물의 제공하고, 세포를 파괴하고, 고액 분리를 수행하고, 상청액을 수집한다. 세포 추출물의 제조 방법에 따라 수득한 추출 생성물은 미량 또는 극소량의 온전한 세포가 남아있을 수 있으며, 추출 생성물의 이러한 형태 또한 본 발명의 세포 추출물의 범위에 속한다. 세포 추출물은 온전한 세포의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명의 시험관 내 단백질 합성 시스템은 또한 본 발명의 목적 실현에 영향을 미치지 않는 한, 즉 정량적 동시 발현의 실현에 영향을 미치지 않는 한 온전한 세포의 존재를 배제하지 않는다. 이러한 온전한 세포의 존재 이면에는 많은 요인들이 있다. 온전한 세포는 세포 추출물을 제조하는 과정에 의해 발생하는 잔류물일 수도 있고, 의도적으로 유도된 것일 수도 있으며, 예를 들어 추가된 세포의 단순 파쇄에 의해 얻은 세포 단편은 완전히 파쇄된 생성물 및 온전한 세포의 혼합물일 수 있고; 또는 온전한 세포는 온전한 세포 단독의 추가로 인해 존재한다.
전형적인 세포 추출물(효모 세포 추출물 포함)은 단백질 번역을 위한 리보솜, tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소와 단백질 합성을 위해 필요한 개시 인자, 연장 인자 및 종결 방출 인자를 포함한다. 더욱이 세포 추출물(효모 추출물 포함)은 또한 세포질로부터 유래한 일부 다른 단백질, 특히 용해성 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 효모 세포 추출물은 클루이베로마이세스 세포 추출물이다. 일부 바람직한 실시예에서, 클루이베로마이세스는 클루이베로마이세스락티스(Kluyveromyceslactis(K. lactis)), 클루이베로마이세스 변종(Kluyveromyceslactis var): 드로소필라럼(drosophilarum), 클루이베로마이세스 락티스 변종 락티스(lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 마르시아누스 변종 락티스(Kluyveromyces marxianus var. lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 변종 바누데니이(vanudenii), 클루이베로마이세스 도브잔스키(Kluyveromyces dobzhanskii), 클루이베로마이세스 아에스투아리(Kluyveromyces aestuarii), 클루이베로마이세스 논페르멘탄스(Kluyveromyces nonfermentans), 클루이베로마이세스 위커하미이(Kluyveromyces wickerhamii), 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로마이세스 푸레질리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 후베이엔시스(Kluyveromyces hubeiensis), 클루이베로마이세스 폴리스포루스(Kluyveromyces polysporus), 클루이베로마이세스 시아멘시스(Kluyveromyces siamensis), 클루이베로마이세스 야로이(Kluyveromyces yarrowii) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
시험관 내 무세포 단백질 합성에 필요한 단백질 성분(예: RNA 폴리머라아제)은 내인성으로 제공되거나 외인성으로 추가될 수 있다. 내인성으로 제공될 경우, 이는 다음의 기존 문서 및 인용 문서에서 제공되는 유전자 변형 방법을 참조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: CN108690139A, CN109423496A, CN106978439A, CN110408635A, CN110551700A, CN110093284A, CN110845622A, CN110938649A, CN2018116198190, “Molecular and Cellular Biology, 1990,10(1):353-360”. 이러한 방법은 암호화 서열을 세포 내 에피소멀 플라스미드(episomal plasmid)에 삽입하는 것, 암호화 유전자를 세포 게놈에 통합하는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다. 외인성으로 제공되는 경우 해당 내용물은 시스템에서 요구하는 대로 제어 및 조정할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 효모 세포 추출물, tris, 칼륨 아세테이트, 마그네슘 아세테이트, 뉴클레오시드 3인산 혼합물(NTPs), 아미노산 혼합물, 인산 칼륨, 설탕(글루코오스, 수크로오스, 말토덱스트린 및 이들의 조합 중 어느 하나이며, 말토덱스트린을 함유하는 경우, 아밀라아제도 포함하는 것이 바람직하다.), 폴리에틸렌 글리콜, RNA 폴리머라아제 등을 포함한다. RNA 폴리머라아제는 내인성으로 제공되거나 외인성으로 첨가될 수 있다. RNA 폴리머라아제의 보다 바람직한 형태 중 하나는 T7 RNA 폴리머라아제이다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 RNA 폴리머라아제를 외인성으로 첨가하는 것을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 T7 RNA 폴리머라아제를 외인성으로 첨가하는 것을 포함한다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 클루이베로마이세스 락틱스 세포 추출물 및 T7 RNA 폴리머라아제를 외인성으로 첨가하는 것을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, T7 RNA 폴리머라아제의 농도는 0.01-0.3 mg/mL이다. 일부 더 바람직한 실시예에서, T7 RNA 폴리머라아제의 농도는 0.02-0.1 mg/mL이다. 일부 다른 바람직한 실시예에서 T7 RNA 폴리머라아제의 농도는 0.027-0.054 mg/mL이다. 일부 다른 바람직한 실시예에서, T7 RNA 폴리머라아제의 농도는 0.04 mg/mL이다.
본 발명에서, 효모 추출물의 단백질 함량은 바람직하게는 20mg/mL-100 mg/mL, 더 바람직하게는 50mg/mL-100 mg/mL이다. 단백질 함량을 측정하기 위한 방법은 쿠마시 브릴리언트 블루 분석이다.
시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 뉴클레오시드 3인산은 바람직하게는 아데노신 3인산, 구아노신 3인산, 시티딘 3인산, 우리딘 3인산을 포함한다. 본 발명에서, 다양한 모노뉴클레오타이드의 농도는 제한되지 않는다. 일반적으로, 각 모노뉴클레오타이드의 농도는 0.5mM 내지 5 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 2.0 mM이다.
시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 아미노산 혼합물은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있으며, D형 아미노산 또는 L형 아미노산을 포함할 수 있다. 대표적인 아미노산은 20가지의 천연 아미노산을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 클루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티틴. 각 아미노산의 농도는 일반적으로 0.01 mM 내지 0.5 mM, 바람직하게는 0.02 mM 내지 0.2 mM, 예를 들면 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM 및 0.08 mM이다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유사체를 더 포함할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유사체의 농도 (w/v)는 단백질 합성 시스템의 총 중량 대비 0.1% 내지 8%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 더 바람직하게는 1% 내지 2%이다. PEG의 대표적인 예로는 PEG3000, PEG8000, PEG6000 및 PEG3350을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 시스템은 다른 다양한 분자량(예: PEG 200, 400, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 등)을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
일부 바람직한 실시예에서, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 수크로오스를 더 포함한다. 수크로오스의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 수크로오스의 농도(w/v)는 단백질 합성 시스템의 총 부피 대비 0.2% 내지 4%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 더 바람직하게는 0.5% 내지 1%이다.
효모 추출물 이외에, 일부 특히 바람직한 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 성분을 더 포함한다: 22 mM Tris(pH 8), 30-150 mM 칼륨 아세테이트, 1.0-5.0 mM 마그네슘 아세테이트, 1.5-4 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.08-0.24 mM 아미노산 혼합물, 20-25 mM 인산 칼륨, 0.001-0.005 mg/mL 아밀라아제, 1%-4% 폴리에틸렌 글리콜, 320-360mM 말토덱스트린(포도당 단위의 분쟈량을 기준으로), 8-25 ng/uL 형광 단백질 DNA 등. 또한, 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템의 총 부피는 10 uL 내지 10000 uL, 바람직하게는 15 uL 내지 100 uL, 바람직하게는 30 uL이다. 효모 추출물은 더 바람직하게는 클루베로마이세스 세포 추출물, 및 더 바람직하게는 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물이다.
효모 추출물 이외에, 일부 특히 바람직한 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템은 다음 성분을 더 포함한다: 22 mM Tris(pH 8), 30-150 mM 칼륨 아세테이트, 1.0-5.0 mM 마그네슘 아세테이트, 1.5-4 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.08-0.24 mM 아미노산 혼합물, 20-25 mM 인산 칼륨, 0.001-0.005 mg/mL 아밀라아제, 1%-4% 폴리에틸렌 글리콜, 320-360mM 말토덱스트린(포도당 단위의 분쟈량을 기준으로), 0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 폴리머라아제 등. 이러한 구성요소는 시험관 내 단백질 합성 반응을 위해 8-25 ng/uL 형광 단백질 DNA와 혼합될 수 있다. 반응 부피는 바람직하게는 15uL 내지 100uL이다. 가장 바람직한 부피는 30uL이다.
주형
본 발명에서, 용어 “주형”은 단백질 합성을 지시하는 핵산 주형을 지칭하며, mRNA, DNA 주형 또는 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는 DNA 주형이다. 이는 선형 또는 원형일 수 있으며, 가장 바람직한 주형 중 하나는 원형 플라스미드이다.
시험관 내 단백질 합성 과정 동안에, 표적 단백질 합성을 개시하기 위한 주형에서의 프로모터는 AOD1, MOX, AUG1, AOX1, GAP, FLD1, PEX8, YPT1, LAC4 , PGK, ADH4, AMY1, GAM1, XYL1, XPR2, TEF, RPS7, T7 및 이들의 임의의 적절한 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직한 프로모터 중 하나는 T7 프로모터이다.
상호 간섭 없음(No mutual interference)
본 발명에서, 상호 관섭이 없다는 것은 복수의 단백질을 포함하는 혼합 용액에서 복수의 단백질 중 하나 이상의 검사 대상 단백질(즉, 표적 단백질)을 측정할 때, 다른 형광 단백질 또는 융합 단백질의 발광 값은 최대 여기 파장, 최대 방출 파장 및 광학 필터의 사용에 적합한 조건과 같은 실험의 발광 검출 조건 하에 테스트할 하나 이상의 단백질의 발광 값과 거의 또는 전혀 겹치지 않음을 의미한다. 이는 사용된 광학 필터가 단백질의 광학 특성과 일치하지 않으면, 다음의 실시예에서 단백질 비율과 해당 벡터의 백분율 간의 선형 관계와 같은 일부 선형 광계의 부정확한 특성화로 이어질 수 있다.
이 실험의 형광 검출 조건 하에서 다른 형광 단백질 또는 형광 융합 단백질의 발광 값이 테스트할 하나 이상의 단백질의 발광 값과 부분적으로 겹친다면(즉, 간섭하는), 본 발명에서의 기술적 방안이 구현될 수 있다. 부분적으로 겹치는 것은 특정 형광 검출 조건 하에, 측정된 발광 신호가 시험 대상 단백질 및 다른 단백질의 발광 신호를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 겹침은 본 발명의 기술적 방안을 사용함으로써 시험할 단백질의 검출에 영향을 미치지 않는다.
표준 단백질
본 발명에서, 표준 단백질은 하나 이상의 표적 단백질과 발광 값 사이의 선형 관계를 보정(calibrating)하기 위한 단백질 샘플을 지칭한다. 표준 단백질은 형광 단백질 또는 형광 융합 단백질일 수 있고, 이는 시험할 표적 단백질 분자에 포함된 발광(light-emitting) 단위에 따라 결정된다. 예를 들어, 표준 단백질은 표적 단백질의 구조에 포함된 표적 단백질 또는 형광 단백질(표적 단백질이 융합 형광 단백질일 때, 표적 단백질 분자가 형광 단백질과 융합됨을 의미함) 또는 발광 표지일 수 있다. 표준 단백질의 순도 및 농도는 사용 전에 알려지거나 결정된다.
정략적 동시발현 다중 단백질
본 발명에서, 이러한 과정은 미리 설정된 농도 비율 관계를 갖는 다중 표적 단백질의 생성물이 얻어질 수 있도록 반응 시스템에서 다중 단백질의 생성물 농도를 특정 비율로 할당하고, 이와 같이 미리 설정된 농도 비율에서 시험관 내 단백질 합성 반응을 개시하는 것을 의미하며; 또는, 반응 시스템에서 다중 표적 단백질의 생성물 농도에 특정 값이 할당되고, 이러한 농도에서 시험관 내 단백질 합성을 개시하는 것을 말하며, 이는 원하는 정량적 관계를 가진 다중 단백질의 산물을 얻을 수 있다.
형광 단백질
Shimomura는 처음으로 해파리에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 분리하였고, Chalfie는 처음으로 발현을 위해 GFP를 다른 종에 복제하였다. Tsien은 GFP 발광의 화학적 메커니즘을 정교화하는데 앞장섰고, 단일 점 돌연변이(S65T) 기술을 통해 형광 강도 및 광 안정성이 크게 향상된 GFP 돌연변이 (GFP-S65T)를 얻었다. 많은 과학자들, 대표적으로 Tsien은 GFP에 유전적 돌연변이를 도입하여 GFP를 추가로 변형시켜 파란색 형광 단백질(BFP, blue FP), 청록색 형광 단백질(CFP, Cyan FP), 녹색 형광 단백질(GFP, 녹색 FP) 및 황색 형광 단백질((YFP, 황색 FP)을 얻었다. 이후에, 연구자들은 산호, 말미잘 및 다른 종으로부터 적색-이동(red-shifted) 형광 단백질을 복제하여 형광 단백질의 다색 이미징 응용을 크게 확장하였다. 최근 몇 년 동안, 과학자들은 광 활성화 및 광 변환 형광 단백질을 고해상도 이미징에 능숙하게 적용하여 광학 회절의 한계를 깨고 나노미터의 해상도를 갖도록 해결하였다. 이는 현미경 이미징 기술의 역사에서 획기적인 도약이다. 그 이후로, 형광 단백질은 생명 과학의 더 나은 발전을 위한 원동력이 되었다.
1962년 Qsamu Shimomura는 북극해의 얼음 바다에 서식하는 해파리인 에쿠오리아 빅토리아(Aequorea Victoria)에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 처음 발견하여 GFP를 분리 정제하였다. Martin Chalfie는 GFP의 값을 발견하고, 처음으로 특별한 도구인 GFP를 사용하여 실험적 연구를 수행하였다 1994년, Yongjian Qian은 GFP의 형광을 더 강하고 색이 바뀌도록 만들기 위해 변형시켰다. 이러한 세 명의 과학자는 2008년 노벨 화학상을 수상하였다. 그 후로, 형광 단백질은 생명공학에서 새로운 혁명을 가져왔다. 해파리에서 발견된 GFP는 26.9kDa의 분자량을 갖는 238개의 아미노산으로 구성되고 있고, 65, 66 및 67번 위치의 아미노산이 자발적으로 형광 발광 그룹 -- p-하이드록시벤질이미다졸디논(p-hydroxybenzylimidazolidinone)을 형성하고, 이는 빛에 의해 여기되어 형광을 생성할 수 있다. 많은 과학자들은 발광 메커니즘을 사용하여 해파리에서 형광 단백질 유전자를 추출하고, 이를 다른 유기체에 전달함으로써 생물학적 변화를 더욱 다양하도록 하였다. GFP가 1992년에 복제된 후, 과학 연구자들은 현대 생물학적 연구를 위하여 강력한 연구 수단을 제공하는 많은 GFP 돌연변이 및 비 돌연변이 단백질을 설계하였다.
형광 단백질을 다양한 색상을 가지고 있고, 이러한 형광은 안정적이고 무독성이므로, 기질 및 보조 인자의 첨가 없이 발색이 가능하며, 이는 종, 세포 타입, 위치에 제한받지 않고, 형광 단백질은 복합 시스템 구조를 가시화할 수 있으며, 일정한 시간 및 특정 위치에서 검출할 수 있으므로, 형광 단백질은 널리 이용되고 있다. 알려진 형광 단백질 스펙트럼은 가시 영역 전체에 분포되어 있고 유전자 발현 및 조절, 단백질 공간 위치 및 수송, 단백질 폴딩, 신호 전달, 프로테아제 활성 분석, 생체분자 상호 작용 등의 생물학적 연구 분야에서 널리 사용되고 있기 때문에 형광 쥐, 형광 토끼 및 형광 돼지가 생겨났다. 그 사이에 형광 단백질은 종양 발병기전, 약물 스크리닝, 사료 물질 개선, 수중 환경 탐지 및 영양 대사 연구 등의 분야에서 사용된다.
본 발명에서, 실제 사용을 고려하여, 다양한 여기 및 방출 파장, 고선명도, 다양한 응집체 구조 및 다양한 색상을 갖는 단백질을 선택하였다. 표 1에 나타난 다음과 같은 변이체(eGFP를 기반으로 변형된 단백질)의 특성을 갖는 18개의 단백질 중 총 11가지 유형을 선별하였다.
| 분류 | 명칭 | 최대 여기 파장 (nm) |
최대 방출 파장 (nm) |
밝기 | 입단 구조 | 흡광 계수 (l/mol.cm) |
분자량 (KDa) |
| 파란색/UV | mTagBFP2 | 399 | 456 | 32 | 이합체화 용이 | 29005 | 29.7 |
| 청록색 | moxCerulean3 | 434 | 474 | 36 | 단량체 (A206k) |
22920 | 29.8 |
| AmCyanl | 453 | 486 | 11 | 사량체 | 26150 | 28.5 | |
| MiCy | 472 | 495 | 25 | 이량체 | 26025 | 29.3 | |
| 녹색 | ZsGreen | 493 | 505 | 39 | 사량체 | 37400 | 29.3 |
| Clover | 505 | 515 | 84 | 이합체화 용이 | 19035 | 29.8 | |
| 황색 | mVenus | 515 | 528 | 53 | 단량체 (A206K) |
23505 | 29.9 |
| ZsYellow 1 | 529 | 539 | 8 | 사량체 | 37400 | 29.3 | |
| 주황색 | mKO2 | 551 | 565 | 40 | 단량체 | 26025 | 27.5 |
| TurboRFP | 553 | 574 | 62 | 이량체 | 26150 | 29.3 | |
| tdTomato | 554 | 581 | 95 | 탠덤-이량체 | 74720 | 57.4 | |
| 적색 | eqFP611 | 559 | 611 | 35 | 사량체 | 24660 | 29.2 |
| 원적색 | mKate1.3 | 588 | 635 | 25 | 단량체 | 27640 | 29.2 |
| mNeptune2 | 600 | 650 | 21 | 이화합체 용이 | 27765 | 30.6 | |
| 근적외선 | miRFP670 | 642 | 670 | 12 | 단량체 | 18045 | 37.7 |
| 긴 스토크스 이동 | mAme-trine | 406 | 526 | 26 | 단량체 (A206K) |
24535 | 30 |
| 광활성 | PAmCherry 2 | 570 | 596 | 13 | 단량체 | 34380 | 29.9 |
| 광전환 | mEos3.2 | 507/572 | 516/580 | 53/18 | 단량체 | 27515 | 28.7 |
기타 인용
대장균, 밀 배아 세포, 토끼 망상적혈구 용혈물(rabbit reticulocyte lysate)(RRL), 사카로마이세스 세레비지에, 피히아 파스토리스, 클루이베로마이세스 마르시아누스 및 다른 세포 유형과 같은 세포 타입을 기반으로 공지된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 본 발명의 시험관 내 단백질 합성 시스템의 대안적 형태로서 본 발명에 통합될 수 있다. 예를 들어, WO2016005982A1에 기재된 대장균 기반 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템과 섹션에 인용된 문서에 기재된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 인용문헌 “Lu, Y. Advances in Cell-Free Biosynthetic Technology. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, 2019, Chapter 2, 23-45”의 27-28페이지의 “2.1 Systems and Advantages”을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 적절한 경우 본 발명의 시험관 내 단백질 합성 시스템을 구현하는데 사용될 수 있다.
시험관 내 단백질 합성 시스템, 주형, 플라스미드, 표적 단백질, 시험관 내 단백질 합성 반응(인큐베이션 반응), 다양한 준비 방법, 다양한 검출 방법 및 본 발명의 다른 기술적 요소는 다음을 포함하는 문서로부터 적절한 구현 방법을 독립적으로 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: CN106978349A, CN108535489A, CN108690139A, CN108949801A, CN108642076A, CN109022478A, CN109423496A, CN109423497A, CN109423509A, CN109837293A, CN109971783A, CN109988801A, CN109971775A, CN110093284A, CN11048635A, CN110408636A, CN110551745A, CN110551700A, CN110551785A, CN110819647A (CN201808881848), CN110845622A (CN201809550734), CN110938649A (CN2018111131300), CN110964736A (CN2018111423277), CN2018110683534, CN2018116198186, CN2018116198190, CN201902128619, CN2019102355148, CN2019107298813, CN2019112066163, CN2018112862093, CN2019114181518, CN2020100693833, CN2020101796894, CN20201026933X, CN2020102693382, CN2020103469030. 본 발명의 목적과 상충되지 않는 한, 이들 문헌 및 이들의 인용된 문헌은 그 전체가 여기에 인용된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 시험관 내 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법을 추가로 개시한다:
단계 1, 동시 발현될 다중 표적 단백질 및 각 표적 단백질의 표적 발현 백분율을 결정하고; 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 제공하며;
단계 2, 각각의 표적 단백질을 발현시키기 위한 각각의 표적 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 생산하고; 벡터는 하나의 표적 단백질의 암호화 유전자만을 포함하며;
단계 3, 각 표적 단백질의 발현 백분율과 해당 벡터의 양에 대한 백분율 사이의 정량적 관계의 방정식을 수립하며;
상기에서, 시험관 내 단백질 합성 반응을 위해 각각의 표적 단백질의 벡터는 특정 총 벡터 농도 및 특정 양 비율에 따라 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가되고; 지정된 시간 이후에, 각 표적 단백질 생성물의 발현 수준을 측정하며; 시험관 내 단백질 합성 반응은 효율적으로 분석하고, 표준 단백질 생성물의 발현 수준의 백분율과 이에 대응하는 벡터의 양의 백분율 사이의 정량적 관계를 수립할 때까지 피팅하여 미리 설정된 총 벡터 농도 및 일련의 다른 벡터 양 비율에 따라 여러 번 수행한다.
단계 4, 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위해 필요한 벡터의 양의 백분율을 계산하고;
발현하고자 하는 다중 표적 단백질의 표적 발현 수준의 비율에 따라, 벡터의 양 또는 발현하고자 하는 다수의 표적 단백질 각각에 필요한 벡터 양의 비율은 전체 벡터 농도를 계산하는 조건 하에 단계 3에서 수집된 방정식을 사용하여 구한다;
단계 5, 다수의 표적 단백질을 정량적으로 동시 발현하고;
벡터의 양 또는 발현하고자 하는 다수의 표적 단백질에 필요한 벡터의 총 백분율에 따라, 각 표적 단백질에 상응하는 양의 벡터는 시험관 내 단백질 합성 반응을 위한 단계 3에 기재된 바와 같이 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가하고, 동시 발현된 다중 표적 단백질은 단계 3에서 확인된 특정 기간 동안 반응된 후에 수득한다.
본 발명의 가이드 하에, 비형광 방식 또는 비발광 방식으로 단백질의 발현 수준을 정량적으로 결정하는 방법에 의해 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현시키기 위한 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 단백질 발현 수준은 자외선 흡광도 및 적외선 흡광도와 같은 비발광 방식에 의해 정량적으로 특성화된다.
본 발명은 구체적인 실시예 및 첨부된 도 1 내지 11과 관련하여 하기 추가로 설명한다. 실시예 1 내지 4에서 사용된 공정의 기술적 흐름은 도 10에 나타내었다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용된 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적으로 기재된 조건이 없는 실험 방법과 관련하여, 한 사람은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 조건 또는 제조 업체에서 권장하는 조건에 따른다. 달리 명시되지 않는 한 백분율 및 부분은 중량 백분율 및 부분을 나타낸다. 다음 실시예에서 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140)는 설명을 위한 예시일 뿐이며, 이는 본 발명이 클루이베로마이세스 락티스에만 적용된다는 것을 의미하지 않으며, 단지 연구를 위해 본 발명의 특정 발현 시스템으로서 사용되며; 실시예에서 기술 방안은 다른 효모 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 대장균 기분 시험관 내 단백질 합성 시스템, 포유 동물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 식물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 곤충 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템에 또한 적용된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시예에 사용된 재료 및 시약은 모두 시판되는 제품이다.
실시예 1. DNA 스크리닝 및 상이한 형광 단백질 발현 서열의 코돈 최적화
상이한 데이터 베이스를 조사하여 18개의 상이한 형광 단백질 유전자의 암호화 서열을 블라스트(blast)에 적용하고, 코돈은 클루이베로마이세스 락티스 기반 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 적합하도록 최적화하였다.
실시예 2. 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 위한 진핵 세포 번역 조절 서열, 형광 단백질 암호화 서열, Tag(단백질 발현 및 정제 서열)의 설계
2.1 전장 유전자 합성
표 2의 최적화된 DNA 서열은 게놈 합성을 위해 사용되었다.
2.2 프라이머 디자인
프라이머 디자인은 Oligo 7.0 소프트웨어로 수행하였으며, 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다.
| No. | 프라이머 명칭 | 프라이머 서열 (5'to3') |
| 1 | vector-FP-F1 | TAAATAAGGATTAATTACTTGGATGCCAAT |
| 2 | vector-FP-R1 | GCCGCTCCCGTGATGGTGGTGGTGATGGTGGTGTTTCCCACTGTGGGAGAAT |
| 3 | AmCyan1-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGCTTTGTCAAATAAGTTCATCGGTGACG |
| 4 | AmCyan1-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTAGAATGGAACAACTGAAGTAATATGAGCAAC |
| 5 | Clover-F1 | ACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCAAAGGGTGAAGAATTGTTTACTGGT |
| 6 | Clover-R1 | AAGTAATTAATCCTTATTTAATACAATTCATCCATACCATGAGTAATACCAGC |
| 7 | eqFP611-F1 | ACCACCATCACGGGAGCGGCAACTCATTGATCAAGGAAAACATGAGAATGATG |
| 8 | eqFP611-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTACAATCTACCCAATTTTGATGGCAAATCAC |
| 9 | mAmetrine-F1 | CCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTAAGGGTGAAGAATTGTTCACTGGT |
| 10 | mAmetrine-R1 | AAGTAATTAATCCTTATTTATTTATACAATTCATCCATACCTGGAGTAATACCAGC |
| 11 | mEos3.2-F1 | CCACCACCATCACGGGAGCGGCTCAGCTATTAAGCCAGATATGAAAATTAAGTTGAGG |
| 12 | mEos3.2-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTATCTAGCATTATCTGGCAAACCAGAATGAG |
| 13 | MiCy-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTTACTCTAAGCAAGGTATTGCTCAAGAA |
| 14 | MiCy-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTATTTAACTTTCAATGGATTAACATGAGCTTCAGCA |
| 15 | miRFP670-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGTTGCTGGTCATGCTTCTGGTT |
| 16 | miRFP670-R1 | CATCCAAGTAATTAATCCTTATTTAAGATTCCAAAGCAGTAATTCTAGTAGCAATTC |
| 17 | mKate1.3-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTGAATTGATCAAGGAAAACATGCACATG |
| 18 | mKate1.3-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTATCTATGACCCAACTTAGATGGCAAATCACA |
| 19 | mKO2-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTGTTATCAAGCCAGAAATGAAAATGAG |
| 20 | mKO2-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTAATGAGCAACAGCATCTTCAACTTGTTC |
| 21 | mNeptune2-F1 | CCACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCAAAGGGTGAAGAATTGATTAAGG |
| 22 | mNeptune2-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTACTTGTACAATTCATCCATACCATTCAATTTATGACC |
| 23 | moxCerulean3-F1 | CCACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTAAGGGTGAAGAATTGTTCACTGGT |
| 24 | moxCerulean3-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTACTTGTACAATTCATCCATACCCAAAGTAATACC |
| 25 | mTagBFP2-F1 | ACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCAAAGGGTGAAGAATTGATTAAGGAAAATATGC |
| 26 | mTagBFP2-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTACAACTTATGACCCAATTTTGATGGC |
| 27 | mVenus-F1 | CACCACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTAAGGGTGAAGAATTGTTTACTGGTG |
| 28 | mVenus-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTAGTACAATTCATCCATACCCAAAGTAATACCAGC |
| 29 | PAmCherry2-F1 | ACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCTAAGGGTGAAGAAGATAATATGGCTATTATTAAG |
| 30 | PAmCherry2-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTACTTATACAATTCATCCATACCACCAGTTGAATG |
| 31 | tdTomato-F1 | CCACCACCATCACGGGAGCGGCGTTTCAAAGGGTGAAGAAGTTATTAAGGAG |
| 32 | tdTomato-R1 | CCAAGTAATTAATCCTTATTTATTTGTACAATTCATCCATACCATACAAGAACAAATG |
| 33 | TurboRFP-F1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCTCAGAATTGATCAAGGAAAACATGCACATG |
| 34 | TurboRFP-R1 | CAAGTAATTAATCCTTATTTATCTATGACCCAATTTAGATGGCAAATCAC |
| 35 | ZsGreen-F1 | CCACCATCACCACCACCATCACGGGAGCGGCGCTCAATCAAAACATGGTTTGACTAAGG |
| 36 | ZsGreen-R1 | GGCATCCAAGTAATTAATCCTTATTTATGGCAAAGCTGAACCAGAAGC |
| 37 | ZsYellow1-1 | CACCACCATCACGGGAGCGGCGCTCATTCTAAGCATGGTTTGAAGGAAG |
| 38 | ZsYellow1-R1 | CATCCAAGTAATTAATCCTTATTTAAGCCAAAGCTGATGGGAAAGC |
2.3 플라스미드 설계
pD2P 플라스미드에 발현하고자 하는 표적 단백질의 유전자 서열을 삽입하였으며(도 11 참조), 플라스미드의 설계 과정은 다음과 같다.
pD2P 플라스미드를 주형으로 하여 분자 클로닝 기술을 이용하여 플라스미드를 설계하였다. 두 번의 PCR 증폭 과정은 각각 두 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 수행하였다. 각 PCR 증폭 과정의 8.5 μL 생성물에 DpnI 1μL 및 10 × Cutsmart buffer 2 μL를 첨가 및 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 생성물 5μL를 DH5α 컴피턴트 세포(competent cell) 50 μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음에 둔 후, 42℃에서 45초 동안 열충격을 가한 다음, LB 액체 배지 1mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후에, 혼합물을 Amp 내성 LB 고체 배지 표면에 코팅한 후, 모노클로날 콜로니가 자랄 때까지 37℃에서 도립배양(inverted culture)하였다. 세 개의 모노클로날 콜로니를 고른 다음 확장(expansion)을 위해 배양하였다. 그 후, 스퀀싱을 위해 적합한 것으로 확인한 후, 플라스미드를 추출 및 보관하고, 플라스미드 농도는 동일한 수준으로 조정하였다. 사용하기 전에, 모든 플라스미드는 OD 값을 기반으로 측정하고, 농도는 동일한 농도(450 ng/ μL)로 조정하였으며, 따라서 각 표적 단백질의 주형/벡터의 모용액의 농도는 동일하다.
pD2P 플라스미드에서 표적 단백질의 암호화 유전자는 T7 프로모터로 개시되었다.
실시예 3. 효모 기반 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 상이한 형광 단백질의 발현
모든 플라스미드에서 전사 개시 서열 5’ UTR 및 종결 서열 3’ UTR 사이의 모든 단편을 phi29 DNA 폴리머라아제를 이용한 증폭 과정을 수행하기 위한 방법에 따라 무작위의 7-염기 프라이머를 이용하여 상기 언급된 플라스미드를 주형으로 증폭하였다. 증폭된 생성물은 다양한 형광 단백질의 합성을 위한 DNA 주형으로서 이용된다. 하나 또는 그 이상의 탠덤 조합(tandem combinations)은 전사 개시 서열 5’ UTR 및 종결 서열 3’ UTR 사이에 포함된다. 탠덤 조합은 번역-향상 조절 인자와 단백질 발현 및 정제 tag 요소를 포함한다.
설명에 따르면, 형광 단백질(상이한 형광 단백질 주형의 모용액 농도는 같음)의 준비된 DNA 주형은 자체 제작한 클루베로마이세스 락티스 기반 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가된다.
실시예에서 사용된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템(총 부피가 30 μL)은 다음을 포함한다: 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물 50%(v/v), 22mM Tris, 90 mM 칼륨 아세테이트, 4.0 mM 마그네슘 아세테이트, 3.0 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.16 mM 아미노산 혼합물, 22 mM 인산 칼륨, 0.003 mg/mM 아밀라아제, 3% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-8000), 340 mM 말토덱스트린 (포도당 단위에서, 55mg/mL 등가물), 0.04 mg/mL 외인성 첨가 RNA 폴리머라아제 및 15 ng/μL 형광 단백질 등. 형광 단백질 DNA의 유형이 1보다 큰 경우에, 여기에서 15 ng/μL은 모든 형광 단백질 DNA의 총 농도이다.
상기에서 언급된 반응 시스템은 20-30℃의 환경에 둔 다음, 약 20시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응 과정 동안에, 상이한 형광이 관찰될 것이고, 형광의 색상은 일정 시간 동안 점자 어두워진다. 반응이 완료된 이후에, 반응 시스템을 즉시 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더(multifunctional microplate reader)에 두었다. 다른 광학 필터를 선택한 다음, 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하고, 값의 측정, 각 형광 신호의 강도를 감지하고, 상대적 형광 단위(RFU) 값을 활성 단위로 하여 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
실시예 4. 형광 단백질의 정제
반응을 통해 수득한 형광 단백질을 상업적으로 이용 가능한 니켈 비드(Sangon, C600033)에 의해 최적화하고 정제하였다. 특정 정제 방법에 대한 지침을 참조한다. 정제된 단백질 샘플의 순도는 단백질 농도를 얻기 위해 결정하였다. 정제된 단백질을 용액으로 만들었다. 1 μL 5x SDS 로딩 완충액(DTT 제외)를 SDS-PAGE용 용액 1 μL에 첨가하고; 그 다음 형광 이미징을 수행하였다. 도 3(3a 및 3b)에 나타낸 바와 같이, 뚜렷한 형광을 나타내는 여러 단백질을 예시로 선택하였다. 상기 정제된 단백질 10 μL를 취하고, 25 μL 5x SDS 로딩 완충액(500 mM DTT 포함)을 SDS-PAGE를 위해 정제된 단백질 10 μL를 첨가하였으며; 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, 탈색 및 겔 이미징은 연속적으로 수행하고; 최적화하기 전의 상기 결과는 도 4(4a 및 4b)에 나타내었으며, 최적화한 후의 결과는 도 5(5a 및 5b)에 나타내었다.
실시예 5. 표준 곡선 생성
1) 단일 단백질의 농도와 상대적 형광 단위(RFU)의 관계 검출
실시예 4에서 니켈 비드를 사용하여 정제된 단백질 샘플을 표준 단백질 샘플로 사용하였다. 단백질 샘플을 다양한 구배 방식으로 버퍼(500 mM NaCl + 20 mM Tris-HCl (pH8.0))로 희석하고, 다른 농도의 단백질을 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더에 두었다. 상이한 광학 필터를 선택하고, 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하여 RFU 값을 읽었다. 형광 단백질 tdTomato, clover 및 Micy를 실시예로 취하였으며, 단일 단백질의 농도는 도 6(6a-6d)에 나타낸 바와 같이 양의 상관 관계에 있었다. 단백질 질량 농도 표준 곡선은 단백질 농도에 대한 신호 강도를 플롯팅하여 곡선을 피팅함으로써 얻었으며, 상기 단백질 질량 농도 표준 곡선은 다음과 같다:
y1=0.0326X1, R2=0.9994
y2=0.0433X2, R2=0.9994
y3=0.1523X3, R2=0.9998
식에서, y1, y2 및 y3은 각각 테스트할 단백질 tdTomato, Clover 및 Micy의 질량 농도(단위: μg/mL)를 나타내고; X1, X2 및 X3은 각각 tdTomato, Clover 및 Micy의 발광 값(RFU)을 나타낸다.
2) 단일 단백질을 발현할 때 주형 비율 및 상대적 형광 단위(RFU) 사이의 관계를 검출한다. 준비된 형광 단백질의 DNA 주형(상이한 형광 단백질 주형의 모용액 농도는 같다)를 자체 제작한 클루베로마이세스 락티스 기반 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가한다.
다음을 포함하는 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템(총 부피 30μL)을 실시예 사용하였다: 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물 50%(v/v), 22mM Tris(pH8), 90 mM 칼륨 아세테이트, 4.0 mM 마그네슘 아세테이트, 3.0 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.16 mM 아미노산 혼합물, 22 mM 인산 칼륨, 0.003 mg/mM 아밀라아제, 3% (v/v) 폴리에틸렌 글리콜, 340 mM 말토덱스트린 (포도당 단위에서, 55mg/mL 등가물), 및 15 ng/μL 형광 단백질 등.
상기 언급된 반응 시스템을 20-30℃의 환경에 둔 다음, 약 20시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응 시스템을 즉시 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더에 두었다. 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하고, 값의 측정하였다. 형광 단백질 tdTomato, clover 및 Micy를 실시예로 취하였다. tdTomato, Clover 또는 MiCy가 개별적으로 발현될 때, 단백질 수율은 도 7(7a-7c)에 나타낸 바와 같이 주형의 양에 영향을 받지 않는다.
실시예 6. 두 단백질의 정량적 동시 발현
두 개의 단백질이 동시 발현된 시스템에서 단백질의 주형 NDA의 부피 백분율(즉, 두 개의 형광 단백질의 주형 DNA의 총 양에 대해 얻은 백분율)과 단백질 질량의 백분율(즉, 총 표적 단백질 질량에서 각 표적 단백질 질량의 비율, 백분율) 사이의 관계를 검출한다. 여기서 각 단백질 주형의 부피 백분율은 각 단백질의 농도 백분율과 일치하였다.
준비된 형광 단백질의 DNA 주형(상이한 형광 단백질 주형의 모용액 농도는 같다)을 자체 제작한 클루베로마이세스 락티스 기반 시험관 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가하였다.
다음을 포함하는 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템(총 부피 30μL)을 실시예로 사용하였다: 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물 50%(v/v), 22mM Tris(pH8), 90 mM 칼륨 아세테이트, 4.0 mM 마그네슘 아세테이트, 3.0 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.16 mM 아미노산 혼합물, 22 mM 인산 칼륨, 0.003 mg/mM 아밀라아제, 3% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 340 mM 말토덱스트린 (포도당 단위에서, 55mg/mL 등가물), 및 15 ng/μL 형광 단백질 DNA(주형의 총 농도는 같다), 상기에서 두 형광 단백질의 총 부피는 1 μL이다.
상기 언급된 반응 시스템을 20-30℃의 환경에 둔 다음, 약 20시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응 시스템을 즉시 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더에 두었다. 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하고, RFU 값을 측정하였다. 두 단백질이 동시 발현되었을 때, 예를 들어, 같은 반응 시스템에서 tdTomato 및 Clover, 또는 tdTomato 및 MiCy가 동시 발현되었을 때, 단백질 수율은 주형의 양과 양의 상관관계가 있음을 발견하였고, 이러한 관계는 도 8(8a-8d)에 나타낸 바와 같이 대체로 선형이었다. 도 8에서, tdTomato 및 Clover의 동시 발현은 단일 단백질의 비율과 그 벡터의 백분율 사이의 선형 관계를 보여주기 위하여 실시예로 들었고; 추가로, tdTomato 및 MiCy의 동시 발현도 단백질의 비율과 그 벡터의 백분율 사이에 유사한 선형 관계를 보여주었다.
실시예 5의 표준곡선을 조합하여 tdTomato와 Clover의 동시 발현을 실시예로 하여, 얻어진 단백질 농도 백분율(즉, 전체 시스템에서 전체 단백질에 대한 각 단백질의 비율)에 대한 주형 DNA의 부피 백분율(즉, 전체 주형 부피에 대한 특정 주형 부피의 비율, 이는 전체 주형 농도에 대한 특정 주형 농도의 비율과 수치적으로 동일함)을 플롯팅하여 표준 곡선을 생성한다.
tdTomato 및 Clover가 동시발현 될 때,
y1=1.0371x1, R²=0.9973 (0<x1<0.96)
y2=0.9713(1-x1)=-0.9713x1+0.9713, R²=0.9969
식에서, y1 및 y2는 단백질 tdTomato, Clover의 백분율을 나타내고, x1은 두 단백질이 동시 발현될 때, tdTomato의 주형 DNA의 부피 백분율을 나타낸다.
실시예 7. 세 개 단백질의 정량적 동시 발현
세 개의 단백질이 동시 발현된 시스템에서 단일 단백질의 주형 비율과 상대적 형광 단위(RFU) 값 사이의 관계를 검출한다.
준비된 형광 단백질의 DNA 주형(상이한 형광 단백질 주형의 모용액 농도는 같다)을 자체 제작한 클루베로마이세스 락티스 기반 시험관 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가하였다.
다음을 포함하는 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템(총 부피 30μL)을 실시예로 사용하였다: 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물 50%(v/v), 22mM Tris(pH8), 90 mM 칼륨 아세테이트, 4.0 mM 마그네슘 아세테이트, 3.0 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.16 mM 아미노산 혼합물, 22 mM 인산 칼륨, 0.003 mg/mM 아밀라아제, 3% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 340 mM 말토덱스트린 (포도당 단위에서, 55mg/mL 등가물), 및 15 ng/μL 형광 단백질 DNA(주형의 총 농도와 동일), 상기에서 세 개의 형광 단백질의 총 부피는 1 μL이다.
상기 언급된 반응 시스템을 20-30℃의 환경에 둔 다음, 약 20시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응 시스템을 즉시 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더에 두었다. 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하고, RFU 값을 측정하였다. 세 개의 단백질, 예를 들어 tdTomato, Clover, 및 mKate1.3가 동시 발현되었을 때; 및 tdTomato, Clover, 및 mNeptune2가 동시 발현되었을 때, 이전의 실시예(즉, 실시예 6)에 나타난 바와 유사하게 선형 관계를 나타내었으며, 이는 단백질 수율이 주형의 양과 양의 상관관계가 있었고, 상관관계는 대체로 선형이었다. 도 9(9a-9d)에 나타낸 바와 같이, A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1에서 Clover: tdTomato: mKate1.3 주형 비율은 각각 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 3:2:1이고; A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2에서 Clover: tdTomato: mNeptune2 주형 비율은 각각 1:1:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2이다.
본 실시예에서 주형 비율과 단백질 수율 비율에 의해 피팅된 단백질 백분율 표준 곡선은 다음과 같다:
tdTomato, Clover 및 mKate1.3가 동시 발현될 때,
y5=0.9147x3+0.1041, R2=0.973 (0<x3<0.979)
식에서, y5는 측정하고자 하는 단백질 Clover의 함량(전체 단백질의 총량 대비)이고, x3은 세 개의 단백질이 동시 발현될 때 Clover의 주형 DNA의 부피 백분율이다.
tdTomato, Clover 및 mNeptune2가 동시 발현될 때,
y6=0.9664x4+0.0159, R2=0.9721 (0<x4<1)
식에서, y6은 측정하고자 하는 단백질 Clover의 함량(전체 단백질의 총량 대비)이고, x4는 세 개의 단백질이 동시 발현될 때 Clover의 주형 DNA의 부피 백분율이다.
도 9에는, 단백질의 비율과 그 벡터의 백분율 사이의 선형 상관 관계를 보여주기 위해 Clove만 예시로 들었고; 추가적으로 동시 발현된 다른 두 단백질도 단백질의 비율과 그에 해당하는 벡터의 비율 사이에 유사한 성형 관계를 보였다.
실시예 8. 네 개의 형광 단백질, tdTomato 및 Clover의 정량적 동시 발현
합성된 두 표적 단백질의 농도 비율은 필요에 따라 1:1, 즉 tdTomato 단백질의 농도는 50%, Micy 단백질의 농도는 50%였다. 두 형광 단백질의 주형 DNA의 부피 비율 관계(농도비 관계와 일치)는 tdTomato 및 Clover가 동시 발현될 때 실시예 6에서 얻은 방정식에 따라 계산되었다:
y1=1.0371x1, R2=0.973 (0<x1<0.96)
식에서, y1은 tdTomato 단백질의 백분율을 나타내고, 1- y1은 Clover 단백질의 백분율은 나타내며, x1은 두 개의 단백질이 동시 발현될 때, tdTomato 주형 DNA의 부피 백분율이다.
이는 다시 말해, y1이 50%일 때 x1=50%/1.0371=48%, 1-x1=1-42%=52%로 계산되었고, 즉, 두 개의 단백질 tdTomato 및 Clover의 벡터 부피 비율은 0.48 : 0.52이다. 두 개의 단백질 벡터의 총 부피 비율이 1 μL일 때, 상기에 첨가된 tdTomato 벡터의 부피는 0.48 μL이고, 첨가된 Clover의 부피는 0.52 μL이다.
상기 계산된 결과에 따라 자체 제작된 클루베로마이세스 락티스 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템(총 부피 30 μL)에 동일한 주형 모용액 농도를 갖는 두 형광 단백질, tdTomato 및 Clover의 DNA 주형(450ng/μL) 0.48 μL 및 0.52 μL을 첨가하였다. 상기 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 클루베로마이세스 락티스 세포 추출물 50%(v/v), 22mM Tris(pH8), 90 mM 칼륨 아세테이트, 4.0 mM 마그네슘 아세테이트, 3.0 mM 뉴클레오시드 3인산 혼합물, 0.16 mM 아미노산 혼합물, 22 mM 인산 칼륨, 0.003 mg/mM 아밀라아제, 3% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 340 mM 말토덱스트린 (포도당 단위에서, 55mg/mL 등가물), 및 15 ng/μL 형광 단백질 DNA(주형의 총 농도와 동일), 상기에서 두 개의 형광 단백질 tdTomato 및 Clover의 주형의 총 부피는 1 μL이다.
상기 언급된 반응 시스템을 20-30℃의 환경에 둔 다음, 약 20시간 동안 인큐베이션 하였다. 반응이 완료된 이후에, 반응 시스템을 즉시 Tecan Infinite F200/M200 다기능 마이크로플레이트 리더에 두었다. 측정하고자 하는 형광 단백질의 특성에 따라 최대 여기 및 방출 파장을 설정하고, RFU 값을 측정하였다. tdTomato 및 Clover의 RFU 값은 각각 1308 및 975였다. 얻어진 RFU 값을 실시예 5에 기재된 표준 곡선 관계식에 대입하였다:
y1=0.0326X1, R2=0.9994
y2=0.0433X2, R2=0.9994
식에서, y1 및 y2는 각각 측정하고자 하는 단백질 tdTomato 및 Clover의 질량 농도(단위: μg/mL)를 나타내고; X1, X2는 tdTomato 및 Clover의 발광 값(RFU)을 나타낸다. 상기 식으로부터 시험할 tdTomato 및 Clover의 질량 농도는 각각 42.64μg/mL 및 42.22μg/mL임을 알 수 있고, 두 단백질의 질량 농도의 비율은 1:1과 비슷하게 42.64 : 42.22이다. 이러한 결과는 본 발명에서 예상했던 것과 실질적으로 동일하였다. 그 결과, 본 발명의 방법은 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위해 정확하고 실현 가능하다.
처음으로, 본 발명은 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 다중 단백질은 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 이용함으로써 합성되고, 이는 간단하고, 효율적이며 빠르다. 이를 형광 단백질 합성에 사 용할 때, 육안으로 관찰할 수 있는 측정 가능한 형광 강도가 생성될 수 있다. 기존 방법에 비해, 이는 효율적이고 직관적인 방식으로 실시간으로 발현 단백질을 모니터링 할 수 있으며, 복잡한 현상을 단순화할 수 있다. 다중 형광 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 방법은, 즉, 같은 시스템에서 여러 단백질을 동시에 합성하는 방법이 제공된다. 이 방법은, 미리 설정된 비율(표적 비율)에 따라, 다중 표적 단백질을 표적 비율로 정량적으로 합성할 수 있다.
상기 설명은 본 발명의 실시예의 일부일 뿐이며, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다. 본 발명의 기술적 해결책의 안내 및 교시 하에, 동일한 기술적 효과를 갖는 많은 보정 및 변형이 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이고, 이는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에서 언급된 모든 문서는 각각 문서가 개별적으로 참고로 포함되는 것처럼, 본 발명은 본 출원에서 참조로 포함된다. 또한, 당업자는 전술한 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이러한 유사한 형태는 본 출원에 첨부된 청구항에 의해 정의된 범위 내에 속한다는 것을 이해해야 한다.
이상에서 본 발명의 구체적인 실시예에 대해 설명하였지만, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이는 예시일 뿐이고, 발명의 원리 및 목적을 벗어나지 않고 이러한 실시예에 대한 많은 보정 및 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된다.
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catccaagta attaatcctt atttaagcca aagctgatgg gaaagc 46
Claims (12)
- 다음 단계를 포함하는 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법:
(1) 표준 곡선 수립 단계:
해당 표준 단백질을 사용하여 각 동시 발현 단백질에 대한 단백질 농도-발광 강도의 표준 곡선 수립;
(2) 각 표적 단백질을 각각 발현시키기 위한 각 표적 단백질 유전자를 포함하는 개별 벡터 생성 단계;
(3) 각 표적 단백질의 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 사이의 정량적 관계 방정식 수립 단계;
표적 단백질 유전자를 포함하는 상기 단계 (2)의 개별 벡터는 단백질 합성 반응을 위한 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 위하여 다른 농도 비율로 첨가하고; 지정된 반응 시간 후에, 반응 용액의 각 표적 단백질에 대한 발광 값을 얻고; 각 표적 단백질 생성물의 농도를 단계 (1)에 나타낸 표준 곡선에 따라 구하고, 각 표적 단백질 생성물 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 사이의 정량적 관계 방정식을 피팅하여 구하며; 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 벡터의 총 농도는 동일하게 유지된다;
(4) 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하기 위한 벡터의 농도 및 농도 비율의 계산 단계;
상기에서, 발현하고자 하는 다중 표적 단백질의 표적 농도 비율 관계에 따라, 발현될 다중 표적 단백질 각각에 대한 벡터의 농도 및 농도 비율을 단계 (3)에서 수립된 방정식을 사용하여 계산한다;
(5) 다중 단백질 정량적 동시 발현 단계;
단계 (4)에서 얻은 각 표적 단백질 벡터의 필수 농도 또는 농도 비율에 따라, 각 표적 단백질의 상응하는 양의 개별 벡터가 단계 (3)에 기재된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가되고, 동시 발현된 다중 표적 단백질은 단계 (3)에서 정의된 시간의 특정 기간 동안 반응된 후 수득한다.
- 제1항에 있어서, 상기 각 모용액에서 각 표적 단백질의 개별 벡터의 농도는 동일한 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법;
(3) 각 표적 단백질의 농도 백분율과 해당 벡터의 농도 백분율 사이의 정량적 관계 방정식 수립 단계;
상기 단계 (2)에서 표적 단백질 유전자를 포함하는 별도의 벡터를 시험관 내 단백질 합성 반응을 위해 상이한 농도 비율 또는 부피 비율로 시험관 내 무세포 단백질 시스템에 첨가하고; 지정된 반응 시간 후에, 반응 용액의 각 표적 단백질에 대한 발광 값을 얻고; 각 표적 단백질 생성물의 농도를 단계 (1)에 나타낸 표준 곡선에 따라 구하고, 각 표적 단백질의 농도 백분율 및 해당 벡터의 농도 백분율 또는 부피 백분율 사이의 정량적 관계 방정식을 피팅하여 구한다;
시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에서 벡터의 총 농도는 동일하게 유지된다;
(4) 벡터 농도 또는 벡터 부피, 및 해당 농도 비율 또는 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는데 필요한 부피비 계산 단계;
상기에서, 발현하고자 하는 다중 표적 단백질의 표적 농도 비율 관계에 따라, 발현하고자 하는 다중 표적 단백질 각각에 필요한 벡터의 농도 및 농도 비율을 계산하거나, 발현하고자 하는 다중 표적 단백질 각각에 필요한 벡터의 부피 및 부피 비율을 단계 (3)에서 수립된 방정식을 사용하여 계산한다;
(5) 다중 단백질 정량적 동시 발현;
상기에서, 단계 (4)에서 얻은 각 표적 단백질 벡터의 필수 농도 또는 농도 비율, 또는 각 표적 단백질 벡터의 필수 부피 및 부피 비율에 따라, 각 표적 단백질의 상응하는 양의 별도의 벡터가 단계 (3)에 기재된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템에 첨가되고, 동시 발현된 다중 표적 단백질은 단계 (3)에서 정의된 시간의 특정 기간 동안 반응된 후 수득한다.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 각 표적 단백질의 발광 값은 최대 방출 파장에서 다른 단백질에 의한 간섭을 받지 않는 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 각각의 표적 단백질 유전자를 포함하는 벡터는 각각 상응하는 표적 단백질 암호화 서열을 포함하는 플라스미드인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템은 효모 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 대장균 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 포유 동물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 식물 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템, 곤충 세포 기반 시험관 내 단백질 합성 시스템 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 클루이베로마이스세(Kluyveromyces), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 발광 값은 상대적 형광 단위(RFU)인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제1항 내지 제7항에 있어서, 상기 다중 표적 단백질은 각각 독립적으로 발광 단백질 또는 형광 표지를 갖는 융합 단백질인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 발광 단백질은 천연 발광 단백질, 변형된 형광 단백질 또는 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질, 주황색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 청록색(cyan) 형광 단백질, 파란색 형광 단백질 또는 보라색 형광 단백질인 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 청구항 제1항 내지 제10항에 있어서, 표적 단백질의 분리 및/또는 정체를 더 포함하는 것인, 시험관 내 다중 단백질의 정량적 동시 발현 방법.
- 청구항 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 시험관 내에서 다중 단백질을 정량적으로 동시 발현하는 방법에 따른 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템의 용도.
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