CN105039379A - 一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1 gp41重组抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法，先将HIV-1gp41基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组载体pIVEX2.4c-gp41；将重组载体pIVEX2.4c-gp41放到含有去污剂的大肠杆菌无细胞体系中表达，最后利用亲和层析纯化获得HIV-1gp41蛋白。本发明利用大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41蛋白，通过向反应体系中添加去污剂提高HIV-1gp41的可溶性，利用亲和层析纯化获得目标蛋白。此方法能有效提高HIV-1gp41重组抗原的生产能力，对利用大肠杆菌无细胞体系生产系列HIV重组抗原具有重要的意义。

Description

一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1 gp41重组抗原的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法。

背景技术

HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法，具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展，利用基因工程的手段，制备具有良好免疫反应性的HIV-1gp41重组抗原原料，对于HIV抗体诊断试剂的发展有着深远意义。

目前市场上所用的HIV-1gp41重组抗原主要从国外进口且价格昂贵，主要是由于HIV-1gp41是一种膜蛋白，本身的毒性使其在大肠杆菌体内难以可溶性表达。目前市场上所用的gp41抗原蛋白均是截取了全长蛋白的部分优势表位并添加融合标签来表达，此方法虽然能解决蛋白在胞内表达的问题，但是重组抗原通常以包涵体形式出现，而包涵体的复性存在困难且复兴率较低。除此之外，截短的重组抗原只含有天然抗原的部分片段，却增加了一段融合蛋白序列，这势必会使重组抗原和天然抗原在构象上存在一定的差异，从而影响其免疫反应性。具有全长序列的HIV-1型gp41重组抗原，因其包含了天然gp41抗原所含有的全部氨基酸序列，在结构上比截短融合表达的gp41重组抗原更具完整性，使其在HIV快速检测领域的应用将具有更大的潜力。

无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。相对于体内表达体系，大肠杆菌无细胞体系可以很好的解决膜蛋白表达引起的细胞毒性问题。本专利合成了经密码子优化的HIV-1gp41全长基因，通过构建pIVEX2.4c-gp41无细胞表达载体，在大肠杆菌无细胞反应体系中添加去污剂，实现了全长HIV-1gp41的可溶表达，亲和纯化获得的目标蛋白经制备乳胶HIV抗体诊断试纸评估具有免疫反应性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法，包括以下步骤：

(1)合成HIV-1gp41重组抗原全长基因，所述HIV-1gp41重组抗原全长基因的基因序列如序列SEQIDNO.1所示；

(2)将HIV-1gp41重组抗原全长基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组载体pIVEX2.4c-gp41；

(3)将步骤(2)得到的重组载体pIVEX2.4c-gp41放到大肠杆菌无细胞体系中表达，同时在体系中添加去污剂，所述去污剂为Brij78或Brij58，在大肠杆菌无细胞体系中的质量体积分数为5g/L；

(4)利用亲和层析纯化分离，得到HIV-1gp41重组蛋白。

本发明的有益效果是：因HIV-1gp41重组蛋白的高疏水性会对大肠杆菌细胞产生的毒害作用，导致HIV-1gp41重组蛋白在大肠杆菌体内难以表达，利用大肠杆菌无细胞体系开放性的特点可有效避免目标蛋白对宿主细胞的损害；通过向大肠杆菌无细胞体系中添加去污剂，提高目标蛋白的可溶性表达效率，利用pIVEX2.4c-gp41所带的6his亲和标签，可以高效的利用亲和层析纯化HIV-1gp41重组蛋白，此方法对高效制备具有良好免疫反应性的系列HIV重组抗原具有重要的意义。

附图说明

图1：重组载体pIVEX2.4c-gp41结构示意图；

图2：无细胞表达体系中添加去污剂后可溶蛋白的电泳图，其中，Lane1,蛋白marker；Lane2,对照组；Lane3,1％Tween80；Lane4,0.2％TritonX-100；Lane5,0.75％β-OG；Lane6,0.1％DDM；Lane7,0.5％Brij78；Lane8,0.5％Brij58；

图3：无细胞表达体系中添加去污剂后不溶蛋白的电泳图，其中，Lane1,蛋白marker；Lane2,对照组；Lane3,1％Tween80；Lane4,0.2％TritonX-100；Lane5,0.75％β-OG；Lane6,0.1％DDM；Lane7,0.5％Brij78；Lane8,0.5％Brij58。

具体实施方式

HIV-1gp41重组抗原的DNA序列及多肽序列分别在SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中给出。本发明的转化细胞可以使用大肠杆菌细胞。上述转化细胞可以通过电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将重组载体导入细胞。无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。本发明所涉及的无细胞体系可以是商业化的试剂盒，也可是是按实例中所描述的方法制备。蛋白中含有6his亲和标签，可以使用亲和层析进行纯化。

SEQIDNO.1：

GCTGTTGGTATTGGCGCTCTGTTCCTGGGTTTTCTGGGTGCGGCAGGCTCTACTATGGGCGCAGCGTCTATGACTCTGACTGTGCAGGCACGCCAGCTGCTGTCTGGCATTGTTCAGCAGCAGAACAACCTGCTGCGCGCGATTGAGGCTCAGCAGCACCTGCTGCAACTGACCGTTTGGGGCATCAAACAGCTGCAAGCGCGTATCCTGGCAGTTGAACGTTACCTGAAAGACCAGCAGCTGCTGGGCATCTGGGGTTGCTCTGGTAAACTGATCTGCACCACCGCTGTTCCGTGGAACGCGTCTTGGTCCAACAAATCTCTGGAGCAGATTTGGAACCACACCACTTGGATGGAATGGGACCGCGAAATCAACAACTACACCTCTCTGATTCACAGCCTGATCGAGGAATCTCAGAACCAGCAGGAGAAAAACGAACAGGAACTGCTGGAGCTGGACAAATGGGCTTCTCTGTGGAACTGGTTCAACATTACCAACTGGCTGTGGTACATCAAGCTGTTCATTATGATTGTTGGTGGCCTGGTTGGTCTGCGTATTGTGTTCGCAGTTCTGTCTATCGTTAACCGTGTGCGTCAGGGCTATTCTCCGCTGTCTTTCCAGACCCACCTGCCGACCCCGCGTGGTCCGGATCGTCCGGAAGGTATCGAAGAGGAGGGTGGCGAACGTGACCGTGATCGCTCTATCCGCCTGGTGAACGGTTCTCTGGCGCTGATTTGGGATGACCTGCGTAGCCTGTGTCTGTTCTCTTACCACCGTCTGCGCGATCTGCTGCTGATTGTGACTCGTATCGTTGAACTGCTGGGTCGTCGTGGTTGGGAGGCTCTGAAGTACTGGTGGAACCTGCTGCAATATTGGAGCCAGGAGCTGAAAAACTCTGCGGTGTCTCTGCTGAACGCAACCGCTATTGCAGTGGCGGAAGGCACCGACCGTGTTATCGAGGTGGTTCAGGGCGCATGCCGTGCAATCCGTCACATTCCGCGTCGCATTCGCCAGGGCCTGGAGCGCATCCTGCTG

SEQIDNO.2

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGACRAIRHIPRRIRQGLERILL

基于以上原理，本发明一种利用大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法，包括以下步骤：

1.HIV-1gp41重组抗原全长基因经密码子优化后由公司合成，基因序列如序列SEQIDNO.1所示；

2.将HIV-1gp41重组抗原基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组载体pIVEX2.4c-gp41；重组载体pIVEX2.4c-gp41的制备为本领域常用的技术手段，具体可参考实施例1。

3.将步骤(2)得到的重组载体pIVEX2.4c-gp41放到大肠杆菌无细胞体系中表达，同时在该体系中添加去污剂；为了实现较高的目标蛋白产量，本发明采用的去污剂为Brij78或Brij58，在大肠杆菌无细胞体系中的质量体积分数为5g/L；

4.利用亲和层析纯化分离HIV-1gp41重组蛋白，蛋白序列如序列SEQIDNO.2所示。HIV-1gp41重组蛋白的亲和层析纯化为本领域常用的技术手段，具体可参考实施例4。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1，重组载体pIVEX2.4c-gp41的制备，包括以下步骤：

1.利用上游引物和下游引物从合成的HIV-1gp41重组抗原基因上扩增gp41基因。上游引物的基因序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的基因序列如SEQIDNO.4所示。

SEQIDNO.3：

CATGCCATGGGCGCTGTTGGTATTGGCGCTCTG

SEQIDNO.4：

CGCGGATCCGCCAGCAGGATGCGCTCCAG

2.PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，其中变性、退火、延伸三个步骤重复循环30次，然后72℃持续10min，最后4℃降温至冷却取出。

3.无细胞表达载体pIVEX2.4c和gp41PCR产物分别用NcoI、BamHI在37℃酶切4h，切胶回收的酶切产物在16℃连接过夜后转化E.coliDH5α感受态细胞。采用NcoI、BamHI双酶切和测序鉴定转化子，获得构建成功的重组载体pIVEX2.4c-gp41，如图1所示。

实施例2，大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备，包括以下步骤：

1.从平板上挑取E.coliBL21(DE3)单菌落分别接种于5mLLB培养基中，37℃摇床200rpm培养过夜。

2.将步骤1培养后的全部种子液转接至500mL的无细胞发酵培养基中。

3.接种E.coliBL21(DE3)的摇瓶于37℃，200rpm培养至菌浓OD600在1.5～2之间时即可收菌。

4.将步骤3获得的菌液倒入500mL离心瓶后，4℃，6000g离心30min收集菌体，倒去上清，按照步骤5-14获得E.coliBL21(DE3)抽提物。

5.用预冷的Buffer1(10mMTris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT，7mMβ-ME)重悬菌体，每1g菌体加入16.6mLBuffer1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。

6.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。

7.用预冷的Buffer1重悬菌体，每1g菌体加入6.6mLBuffer1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。

8.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。

9.用预冷的Buffer2(10mMTris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT)重悬菌体，每1g菌体加入1.3mLBuffer1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。

10.用高压细胞破碎仪6000psi破碎菌体细胞。

11.破胞液4℃，30000g离心30min，将上清转移至新的离心管，再次4℃，30000g离心30min，取上清(抽提物)。

12.转移上清至15mL离心管，用PreincubationBuffer(300mMTris-乙酸(pH7.6)，10mM乙酸镁，10mMATP，80mM磷酸烯醇丙酮酸，5mMDTT，40μMAminoAcidmix(5mMofeachaminoacid)，8U/mL丙酮酸激酶)在37℃黑暗环境中孵育90min。每10mL抽提物加入1mLPreincubationBuffer。

13.将孵育后的抽提物装入5kDa的透析袋中，在预冷的Buffer3(10mMTris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁)中4℃透析1h，更换Buffer3，4℃透析过夜。抽提物和Buffer3的体积比为1:100。

14.转移抽提物至15mL离心管，4℃，4000g离心10min。分装上清至0.5mL离心管，每管200μL，液氮预冷后放入-80℃冰箱保存。

实施例3，HIV-1gp41重组蛋白的无细胞体系表达，包括以下步骤：

1.用实施例2所制备的大肠杆菌无细胞体系抽提物制备大肠杆菌无细胞表达体系，体系中的各组分名称及用量如表1所示。

表1：大肠杆菌无细胞表达体系组分表

Components	V(μL)
		E.coli BL21(DE3)抽提物	24
Energy Mix(EM 3.2×)	16
		Amino Acid Mix(25mM)	4

pIVEX2.4c-gp41	5
		水或去污剂	1
Total	50

其中，其中去污剂选自Tween80(1％)、TritonX-100(0.2％)、β-OG(0.75％)、DDM(0.1％)、Brij78(0.5％)、Brij58(0.5％)(质量体积分数g/ml)。EnergyMix(3.2×)的配制方法如表2所示。

表2EnergyMix(3.2×)成分表

Components	Stock	Final conc.	Volume(μL)
				DTT	1000mM	1.7mM	19.7
NTPs	30mM	1.2mM	464
				cAMP	100mM	0.65mM	75.4
Creatine phosphate	3000mM	80mM	309.3
				tRNA(E.coli)	87.5mg/mL	0.175g/L	23.2
K-Glutamate	4000mM	200mM	580
				PEG 8000	30％	2％	773.3
EM Buffer	10×		1160
				ddH2O			220
Total			3625

上表中，EMBuffer(10×)的配制方法如表3所示。

表3EMBuffer(10×)成分表

Components	Stock	Final conc.	Volume(μL)
				HEPES/KOH,pH 7.5	1380mM	550mM	3985.5
Folinic acid	1mg/mL	350μg/mL	3500
				NH4OAc	5000mM	280mM	560
Mg(OAc)2	1000mM	110mM	1100
				NaN3		0.5％	50
ddH2O			854.5
				Total			10000

2.50μL大肠杆菌无细胞表达体系在37℃恒温金属浴中以400rpm振荡反应4h后，12000g离心2min，分离反应液上清和沉淀。

3.用水和5×SDS-PAGEloadingbuffer将50μL上清稀释7.5倍，沉淀用300μL水和75μL5×SDS-PAGEloadingbuffer重悬，煮沸10min后，12％SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。

4.添加去污剂后，可溶蛋白的电泳图如图2所示，不溶蛋白的电泳图如图3所示。结果显示，除Tween80以外，所用的去污剂的加入不会阻断目标蛋白的转录和翻译过程，gp41重组蛋白能够表达在沉淀或者上清中。不同去污剂对于gp41可溶表达的效果有显著区别：加入长链聚氧乙烯烷基醚Brij78和Brij58可以有效实现gp41的可溶表达，表达水平分别为620μg/mL和605μg/mL，而加入TritonX-100、β-OG、DDM都几乎不能使gp41可溶表达，表达的gp41重组蛋白仍旧出现在沉淀中。由比较可知，本发明采用的Brij78和Brij58，浓度为0.5％(5g/L)相比于其他去污剂，具有更高的可溶性表达效率。因此，将采用去污剂Brij78(0.5％)或Brij58(0.5％)得到的HIV-1gp41重组蛋白进行下一步亲和层析纯化，以获得HIV-1gp41重组蛋白液，具体方法分别可参考实施例4和5。

实施例4，HIV-1gp41重组蛋白(Brij78，0.5％)的亲和层析纯化，包括以下步骤：

1.配制亲和层析纯化所需的缓冲液：上样缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，20mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。清洗缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，70mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。洗脱缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，500mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。

2.分别吸取2mL左右保存在20％乙醇中的Ni-NTA琼脂糖凝胶，加入2个10mL离心管，500g低速离心5min，吸出上清。

3.加入5～6mLddH₂O，颠倒离心管3～5min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤3次。

4.加入5～6mL上样缓冲液，在摇床中低速孵育平衡柱子10min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤2次，得到平衡的Ni-NTA琼脂糖凝胶。

5.实施例3步骤2所制备的4mL无细胞反应液上清(添加去污剂为Brij78(0.5％)与本实施例中步骤1中的上样缓冲液按体积比1:3混合。混合均匀后，分别吸取8mL混合液加入到步骤4得到的平衡的Ni-NTA琼脂糖凝胶中，4℃摇床振荡孵育2h。

6.孵育结束后，500g离心5min吸出的上清。加入8mL清洗缓冲液清洗杂蛋白，4℃摇床振荡孵育5min，500g离心5min吸出的上清，重复该步骤3次。

7.加入4mL洗脱缓冲液，4℃摇床振荡孵育1h后，500g离心5min，吸出的上清即为纯化后的HIV-1gp41重组蛋白液。

实施例5，HIV-1gp41重组蛋白(Brij58，0.5％)的亲和层析纯化，包括以下步骤：

1.配制亲和层析纯化所需的缓冲液：上样缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，20mmol/L咪唑，0.05％Brij58，pH7.4。清洗缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，70mmol/L咪唑，0.05％Brij58，pH7.4。洗脱缓冲液：20mmol/LTris，0.5mol/LNaCL，500mmol/L咪唑，0.05％Brij58，pH7.4。

2.同实施例4步骤2。

3.同实施例4步骤3。

4.同实施例4步骤4。

5.实施例3步骤2所制备的4mL无细胞反应液上清(添加去污剂为Brij58(0.5％)与本实施例中步骤1中的上样缓冲液按体积比1:3混合。混合均匀后，分别吸取8mL混合液加入到步骤4得到的平衡的Ni-NTA琼脂糖凝胶中，4℃摇床振荡孵育2h。

6.同实施例4步骤6。

7.同实施例4步骤7。

实施例6，HIV-1gp41重组蛋白的超滤浓缩，包括以下步骤：

1.分5次将40ml纯化后的重组HIV-1gp41蛋白液(实施例4或5纯化后的蛋白液)等体积加入15ml截留分子量为10kDa的超滤离心管中，每次加入后4℃，5000g离心30min，倒去滤出液。

2.向超滤离心管中加入10mlPBS缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O0.58％，NaH₂PO₄·2H₂O0.06％，NaCl0.88％，pH7.4)进行清洗，5000g离心30min，倒去滤出液。

3.向超滤离心管中加入50ulPBS缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O0.58％，NaH₂PO₄·2H₂O0.06％，NaCl0.88％，pH7.4)，重悬获得超滤浓缩后的重组HIV-1gp41蛋白液。

实施例7，将实施例6得到的HIV-1gp41重组蛋白制备乳胶HIV抗体诊断试纸及其免疫反应性检测，包括以下步骤：

1.超滤浓缩后的重组HIV-1gp41蛋白液初始浓度为1.5mg/mL，用PBS缓冲液(Na₂HPO₄·12H₂O0.58％，NaH₂PO₄·2H₂O0.06％，NaCl0.88％，pH7.4)分别稀释至1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.3mg/mL，直接喷点于硝酸纤维素膜的T线上，喷点量为1.0μL/cm，37℃烘干过夜。

2.将包被重组HIV-1gp41抗原的硝酸纤维素膜、预包被乳胶标记的商业化gp41抗原的聚酯纤维膜、样品垫和吸水垫组装后，切成4mm宽的试纸。

3.取3份不同滴度的HIV-1阳性标本，分别滴加25μL标本于试纸的样品垫上，然后再滴加40μL样本稀释液。

4.15min后，观察各试纸T线位置，判读T线显色强度的结果如表4所示。可见，重组HIV-1gp41蛋白T线包被浓度在0.3mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL变化的过程中，三份不同滴度HIV-1阳性标本检测的T线显色强度判读值总体呈现递增的趋势。当T线包被浓度为0.3mg/mL时，低、中、高滴度HIV-1阳性标本的T线显色强度判读值仍均大于3，符合HIV-1阳性判定的质控标准，说明本实验得到的重组HIV-1gp41蛋白具有较好的灵敏度。

表4gp41重组蛋白的灵敏度检测

^*其中，低代表低滴度；中代表中滴度；高代表高滴度。

Claims (1)

1.一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1gp41重组抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成HIV-1gp41重组抗原全长基因，所述HIV-1gp41重组抗原全长基因的基因序列如序列SEQIDNO.1所示；

(2)将HIV-1gp41重组抗原全长基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组载体pIVEX2.4c-gp41；

(3)将步骤(2)得到的重组载体pIVEX2.4c-gp41放到大肠杆菌无细胞体系中表达，同时在体系中添加去污剂，所述去污剂为Brij78或Brij58，在大肠杆菌无细胞体系中的质量体积分数为5g/L；

(4)利用亲和层析纯化分离，超滤浓缩后得到HIV-1gp41重组蛋白。