CN105950588B - 一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体及其制备方法 - Google Patents

一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种兼具高转糖苷活性、低水解活性的β‑半乳糖苷酶双点突变体，该突变体是对β‑半乳糖苷酶BgaB的E303和F341两个位点进行定点突变，其中，E303点位由原谷氨酸Glu突变为半胱氨酸Cys，F341点位由原苯丙氨酸Phe突变为丝氨酸Ser，然后将双点突变体经KI氧化处理所得。本发明还涉及所述双点突变体的构建方法及应用。本发明以嗜热脂肪芽孢杆菌来源β‑半乳糖苷酶BgaB为功能改造对象，所得的双点突变体催化底物乳糖能够获得大于二糖的低聚糖混合物，合成量达到9.5％，且降低了其对合成产物的降解能力。此外，本发明的突变体适用于中性、高温度条件下催化乳糖水解与低聚半乳糖合成。

Description

一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体及 其制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体，还涉及一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体的制备方法。
【背景技术】
工业制备低聚半乳糖(GOS)主要以乳糖为底物，通过β-半乳糖苷酶的转糖苷酶催化作用合成。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)全称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside hydrolase，EC 3.2.1.23)，具有催化乳糖水解和转糖苷两种功能。但是，由于β-半乳糖苷酶转糖苷活性低，且存在底物水解的催化特点，使其成为制约低聚半乳糖合成量和导致聚合度多样化的主要技术瓶颈问题。
近年来，虽然人们也对β-半乳糖苷酶转糖苷活性进行了基础理论研究和功能改造，但对GOS合成能力的分子改良方法还存在许多不足。主要体现在三个方面，一是酶的最适作用条件不能完全适应工业生产实际条件；二是分子改造目标位点范围较大，需通过高通量筛选获得优化突变体；三是，在针对转糖苷活性的改造过程中没有考虑到水解活性的反向催化作用。如，中国发明专利申请CN 201410148999公开一种半乳糖苷酶突变体。该突变体为在亮白曲霉或米曲霉β-半乳糖苷酶的基础上通过单位点的定点饱和突变而得。由于亮白曲霉或米曲霉来源β-半乳糖苷酶为适酸性β-半乳糖苷酶，其最适pH在pH2.5～5.5，这一催化特性一定程度上限制了其作为催化剂在高温及中性条件下合成低聚半乳糖。
另一方面，CN 201410148999的突变体的成功获得需要依靠生物信息学及预测算法的准确性，同时还需要配合高灵敏度较高的高通量筛选方法，操作繁杂且成功率相对较低。这种方法应用于转糖苷活性的改造时，由于筛选的单向性，不能有效的兼顾水解活性对转糖催化效率的影响作用，导致筛选所得转糖苷活性提高突变体存在水解活性同时提高的现象。
近年来，围绕嗜热脂肪芽孢杆菌来源β-半乳糖苷酶BgaB结构与功能的研究在不断发展，2011年Yeong-su Kim等人对Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源耐热β-半乳糖苷酶(Csac_1018)的研究中发现F349位点对底物抑制作用具有影响。2013年Yi-NingDong等人对β-半乳糖苷酶BgaB的F341位点功能进行了研究报道(Yi-Ning Dong,LingWang,Qiong Gu,Haiqinin Chen,Xiaoming Liu,Yuanda Song,Wei Chen,ArnoldT.Hagler,Hao Zhang,Jun Xu.2013.Optimizing lactose hydrolysis by computer-guided modification of the catalytic site of a wild-type enzyme.Mol Divers,17:371-382)。Csac_1018与BgaB同属GH-42家族，二者比对结果显示序列同源性为98％，BgaB的F341位点与Csac_1018的F349为同一保守功能位点。
【发明内容】
本发明的目的是在现有研究的基础上，通过对Phe341位点的改造获得具有底物抑制作用的突变体酶(F341S)，再以突变体酶F341S为对象，通过对其E303位点的定点突变，获得了兼具高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶BgaB双点突变体。
此外，通过制备方案的改进，本发明将定点突变与化学修饰相结合的基因改造方法应用于β-半乳糖苷酶的双向催化功能改造，期望获得一种不依赖高通量活性筛选的高效定向功能改造方法。
为此，本发明的目的是提供一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体。
本发明的另一个目的是提供所述双点突变体的制备方法，以及所述双点突变体的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一种兼具高转糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体，该突变体是对β-半乳糖苷酶BgaB的E303和F341两个位点进行定点突变，其中，E303点位由原谷氨酸Glu突变为半胱氨酸Cys，F341点位由原苯丙氨酸Phe突变为丝氨酸Ser，然后将双点突变体经KI氧化处理所得。
在本发明中，所述β-半乳糖苷酶BgaB是嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB。
优选地，用于进行氧化处理的所述KI的浓度为0.2M或以上。
本发明还提供上述双点突变体的制备方法，该制备方法的步骤如下：
A、双点突变体酶的构建
以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的突变体耐热β-半乳糖苷酶基因BgaB’质粒pKK223-3-bgaB-F341S为模板，以快速全质粒扩增突变法对位点E303构建半胱氨酸(Cys)替换单点突变体，得到双位点突变体E303C/F341S：
B、双点突变体酶的表达与纯化
将全质粒扩增得到的双点突变PCR片段经胶回收及双酶切后，与pKK223-3载体的双酶切产物进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(由江南大学食品生物技术中心菌种库(Culture Collection ofFood Microorganisms,Jiangnan University CCFM)。挑取重组菌单克隆接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性培养基中，37℃下摇床振荡培养过夜，按以体积比计1％接种量将种子液接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，当OD600达到0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG直至终浓度为1mM，20℃过夜诱导表达后，对发酵液进行离心，去上清、收集菌体，再以5～10倍体积100mM磷酸缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破壁，得到破胞液；将破胞液进行热处理去除不耐热的杂蛋白后，离心收集上清液，得到粗酶液；
将上述粗酶液经0.22μm滤膜过滤，再用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液，然后用50mM pH 7.0磷酸缓冲液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩制得纯化的突变体酶；
C、突变体酶的氧化
将步骤B得到的突变体酶进行氧化反应，氧化反应体系如下：100μL0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液、0.2M KI溶液、10μM Br、3μM突变体酶，在温度25℃条件下处理30h，得到所述高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体。
根据一种可选的实施方式，步骤A的扩增引物为：
E303C/F341S上游引物：
5’-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3’
E303C/F341S下游引物：
5’-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3’
PCR反应条件为：94℃预变性2min；95℃变性30s；58℃～64℃30s；68℃7min，16个循环后，最后68℃延伸15min；
PCR反应体系为：
步骤A中，含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的突变体耐热β-半乳糖苷酶基因BgaB’质粒模板pKK223-3-bgaB-F341S可根据已公开的文献(Y.N.Dong,Ling Wang,Qiong Gu,HaiqinChen,Xiaoming Liu,Yuanda Song,Wei Chen,Arnold T.Hagler,Hao Zhang,JunXu.Optimizing lactose hydrolysis by computer-guided modification of thecatalytic site of a wild-type enzyme.Molecular Diversity.2013,17:371-382)直接构建获得。通过含有F341S突变的酶基因的质粒模板pKK223-3-bgaB-F341S，进过一次扩增实现相对于原始酶基因发生了两个位点突变的双位点突变体E303C/F341S。
其中，全质粒扩展产物可直接用于转化表达，优选地，步骤A中进行基因构建可防止载体发生突变干扰正常表达。
优选地，步骤B中超声波破壁的工作条件为：功率400W循环工作，每个循环包括工作1s和停止9s，总破壁时间为30min。
优选地，步骤B的热处理条件为破胞液在55℃下热处理30min。
根据另一种优选的实施方式，步骤B中，用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液的过程如下：向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2～3倍体积的含20mM咪唑的Binding buffer自然洗脱；再将经0.22μm滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱充分结合，待样品流干后分别用6倍柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质三次，最后用4倍Elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液；
所述Washing buffer分别含咪唑20mM、80mM、100mM；所述Elution buffer含250mM咪唑。
根据一种优选的实施方式，步骤C中，双点突变体氧化反应体系组成包括：100μL磷酸盐缓冲溶液中包含有KI溶液、Br、突变体酶；氧化反应条件为：在温度25℃条件下处理30h。
特别优选地，步骤C中KI溶液浓度为0.2-0.3M。
本发明还涉及上述高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体在生产低聚半乳糖中的用途。
与野生型酶对比，在乳糖初始浓度为500mM条件下，通过本发明的双点突变体催化能够获得大于二糖的低聚糖混合物，且将野生型酶在20h的GOS合成量由0％提高到9.5％。以上结果表明本发明的双点突变体相对野生型酶，降低了水解活性低，提高了转糖基活性，并同时降低了其对合成产物的降解能力。
另一方面，本发明所涉及的嗜热脂肪芽孢杆菌来源β-半乳糖苷酶BgaB属于糖苷水解酶GH42家族，是一种具有工业应用潜力的耐热酶，其最适作用pH为中性，适用于60-70℃的高温度条件下催化乳糖水解与低聚半乳糖合成，克服了现有技术中需要在酸性、较低温度下反应的限制。
此外，针对目前本研究领域存在的主要研究方法缺陷问题，本发明以嗜热脂肪芽孢杆菌来源β-半乳糖苷酶BgaB为功能改造对象，采用定点突变体与化学修饰结合的方法，实现了转糖苷活性的高效改造。并在提高转糖苷活性的同时，抑制了水解催化活性的反向水解作用，有效提高了低聚半乳糖的合成量。
本发明基于催化氨基酸位点的构建方法适用于所有采用保持型(Retaining)催化机制β-半乳糖苷酶进行转糖苷活性改造。
【附图说明】
图1为乳糖和半乳糖分子与β-半乳糖苷酶BgaB活性口袋结合模型；
其中，A、酶-乳糖结合模式；B、酶-半乳糖结合模式；
图2为野生性及突变酶SDS-PAGE分析；
其中，M为marker，泳道1为野生型，泳道2为未经过氧化的E303C/F341S突变体
图3为KI氧化处理对野生型和E303C/F341S突变体的酶活影响；
其中，A.KI浓度对野生型和突变体酶活的影响；B.时间对野生型和最优氧化处理突变体酶活的影响
图4为β-半乳糖苷酶催化乳糖合成GOS过程中的反应产物变化；
其中，A、野生型酶，B、突变体Ox-E303C/F341S；
图5为野生型酶及Ox-E303C/F341S突变体催化乳糖反应产物的HPLC图谱；
其中，A、野生型酶；B、Ox-E303C/F341S突变体。
【具体实施方式】
在本发明中如无特别声明，用于解释浓度的“％”均表示重量百分比。
实施例1
1.构建E303C/F341S双点突变体
通过分子模拟及半乳糖、与底物对接预测了参与嗜热脂肪芽孢杆菌来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB底物结合氨基酸位点，并通过点突变验证并研究了底物结合位点对酶催化活性的调控功能。其中Glu148和Glu303为催化位点(如图1所示)。而在参与底物结合的非催化位点中，Phe341位点的突变可以改变酶对水解产物半乳糖的亲和能力，调控反应产物半乳糖对酶活的抑制作用。已有的研究表明，催化氨基酸位点及非亲核作用的功能位点对酶的转糖苷活性具有调节作用。为改善和开发该酶的转糖苷催化功能，选择Glu303和Phe341氨基酸位点作为改造目标位点，通过对两个功能位点研究双点累积突变对酶的转糖苷活性调控作用
对此，以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶单点突变基因BgaB’的质粒pKK223-3-bgaB-F341S为模板(该模板中，F341点位由原苯丙氨酸Phe突变为丝氨酸Ser)，采用快速全质粒扩增突变法(site-directed mutagenesisprotocol)针对Glu303位点构建(Cys)双点突变体，引物设计如下：
PCR反应条件为94℃预变性2min；95℃变性30s；58℃～64℃30s；68℃7min，16个循环后，最后68℃延伸15min；
PCR反应体系如下：
2.突变体的表达与纯化
将全质粒扩增得到的双点突变PCR片段经胶回收及双酶切后，与pKK223-3载体的双酶切产物进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(由江南大学食品生物技术中心菌种库(Culture Collection ofFood Microorganisms,Jiangnan University CCFM)。其中，全质粒扩展产物可直接用于转化表达，此处进行基因构建是为了防止载体发生突变干扰正常表达。
野生型及突变体酶C-端均融合有6×His标签用于纯化。挑选野生型与突变体重组菌单克隆接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养过夜。按1％接种量将饱和种子液接种于200mL添加有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养。当OD600达到0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG(终浓度达1mM)。20℃过夜诱导表达后，将发酵液于3000rpm下离心20min，去上清、收集菌体。用5～10倍体积100mM磷酸缓冲液(pH7.0)重悬，加入蛋白酶抑制剂(1×Cocktail)后，超声波破壁。破壁工作条件为：工作1s，停9s，循环30min。将破胞液55℃热处理30min去除不耐热的杂蛋白后，12000rpm离心20min收集上清，即得粗酶液。
其中，LB液体培养基配方：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，余量为水。
LB抗性培养基：在LB培养基中加入氨卞青霉素至终浓度为100μg/mL，用于重组菌的培养和筛选。
将双点突变体酶的粗酶液进行镍亲和柱(Ni-Chelating Column，购自Qingen公司)纯化：向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2～3倍体积的Binding buffer(含咪唑浓度20mM)自然洗脱；再将经0.22μm滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱充分结合，待样品流干后分别用6倍柱体积的Washing buffer(分别含咪唑浓度20mM、80mM、100mM)连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质，最后用4倍Elution buffer(含250mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。然后用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)透析除去咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩得到纯化的突变体酶E303C/F341S。
采用Basic 041BR蛋白质电泳仪SDS-PAGE，经Geldoc 2000凝胶成像系统，显示野生型及双点突变体酶均得到大小为70kDa单一的蛋白条带(如图2所示)。表明双点累积突变体酶的分子量与野生型酶一致。
3.比酶活测定
按中性乳糖酶的酶活检测方法Gist-Bracades法测定野生型耐热β-半乳糖苷酶、单点突变体酶E303C和双点突变体酶E303C/F341S的酶活。
以oNPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)为底物，一个中性乳糖酶单位定义为：在温度70℃、pH6.5条件下，每分钟水解产生1μmol的oNP(邻硝基苯酚)所需的酶量为一个中性乳糖酶活性单位(NLU或U)。
分别取0.1mL酶液和0.9mL磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)加入10mL离心管中，混合，调温至70℃。加5.0mL 0.25％的oNPG，混匀，同时开始计时。反应10min后迅速取出置于冰水浴中并加入2.0mL 5％Na2CO3终止反应。室温下用分光光度计(420nm，UV-2100可见分光光度计，购自尤尼柯上海仪器有限公司)以空白值为参比测定样品吸光度。
空白值：将0.1mL酶液、0.9mL磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)和2.0mL Na2CO3混合后加5.0mL底物溶液，于420nm处测定吸光度。
按以下公式计算酶活：
其中：
E420—420nm处的吸光度值；Ew—0.1mL所用酶液含酶的重量(g)；8—反应总体积；10—反应时间(min)；4.45—在实验条件下1μmol oNP/mL的吸光度值。
其中，采用BCA法测定野生型耐热β-半乳糖苷酶、单突变体酶E303C和双突变体酶E303C/F341S的蛋白质含量。BCA蛋白定量试剂盒购自北京庄盟生物基因科技有限公司。具体测定步骤如下：
(1)试剂A：含1％BCA二钠盐、2％无水碳酸钠、0.16％酒石酸钠、0.4％氢氧化钠、0.95％碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。
(2)试剂B：4％硫酸铜。
(3)BCA工作液：试剂A 100mL+试剂B 2L，混合。
(4)蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。标准曲线及样品反应组成体系如表1所示
表1 BCA法测定蛋白质含量
Table5 The Determination of protein content by BCA method
(5)样品的浓度计算
将上述各管混匀后于37℃保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测样品中蛋白质浓度(g/L)。
野生型β-半乳糖苷酶、单突变体酶E303C和双突变体酶E303C/F341S的比酶活测定结果如表2所示。
表2野生型及突变体酶的比酶活比较
Table6 The comparison of specific activity between Wild type andmutant enzyme
结果表明，E303C突变体酶活相对野生型酶大幅度下降，仅为野生型酶活的0.6％，而F341S该位点突变为丝氨酸(Ser)虽也降低了水解催化活性，但比酶活仍保有野生型的75％，表明F341位点参与了水解底物的调控。
通过两个单点突变体的对比试验结果进一步确认了E303位点作为催化氨基酸对维持酶的催化功能具有重要作用；而双点突变体E303C/F341S几乎失去水解活性，这一研究发现表明F341位点和E303位点具有协同作用，结合针对F341位点底物抑制作用的研究结果报道，双点突变极可能对底物半乳糖基的识别和释放起到调控的作用。
6.突变体酶巯基侧链的氧化
通过分子对接对参与底物结合的氨基酸位点进行预测分析(如图1所示)，结果表明参与底物结合的氨基酸位点中不含半胱氨酸。因此，可以通过对E303C/F341S双点突变体进行氧化，并与野生型酶氧化体作进行对比分析，以研究底物结合氨基酸位点的巯基氧化对酶催化活性的影响，
为了获得最佳氧化条件，选择浓度范围为0-0.3M KI溶液对E303C/F341S双点突变体及野生型酶进行氧化处理(反应体系为100μL，含0.25M磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)，10μMBr，KI浓度为0-0.3M，余量为水。分别向反应体系中加入野生型和突变体酶3μM，反应温度为25℃)，得到经氧化的野生型和经氧化的E303C/F341S双点突变体Ox-E303C/F341S。
KI浓度及处理时间对野生型及Ox-E303C/F341S突变体酶活性影响如图3所示。
结果表明，实验表明，0-0.3M KI的氧化处理，对于野生型酶活没有显著影响；而Ox-E303C/F341S突变体比酶活性随KI浓度的增大而增加，当KI浓度达到0.2M时比酶活最高，为3.78U/mg；对比野生型酶(WT)，活性没有明显变化。因此，选择以0.2M KI作为最优氧化处理浓度。
此外，由图3B可知，Ox-E303C/F341S的水解活性在氧化处理过程中，均低于野生型酶。且在氧化处理第8天时，达到最大值3.98U/mg。而在相同处理条件下，野生型(WT)酶活随处理时间的延长酶活变化不显著。以上试验结果表明，KI对巯基的氧化作用可以提高突变体酶的催化效率，但经氧化处理的双点突变体水解能力保持在低于野生型酶的水平，有利于其催化转糖苷产物的合成。
7.突变体的转糖苷催化活性比较
通过与前述相同的方法测定野生型酶及Ox-E303C/F341S以乳糖(500mM)为底物催化反应过程中(含92mU酶)，底物与反应产物的50h反应时间内的变化规律，结果如图4所示。
野生型酶的催化反应过程中，在反应前期(10h)出现了转糖苷产物峰(GOS)，为0.75％。随着时间的延长，乳糖的水解量增大，水解产物半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glu)含量逐渐增大，而转糖苷产物的量有所减少。至20h后体系中GOS降低到0％，产物水解率达到100％。这可能是β-半乳糖苷酶对产物具有水解作用导致的。这一结果表明，在设定的反应条件下，野生型酶无法有效合成GOS。
与野生型酶相比，Ox-E303C/F341S突变体反应过程中，转糖苷产物含量在反应20h后达到最大，为8.2％。且经过50h的反应时间后，产物仍保留达6.5％，突变体酶的产物水解率仅为21％。因此，在试验条件下，Ox-E303C/F341S将野生型酶在20h的GOS合成量由0％提高到8.2％，显著高于现有技术。且突变体酶不仅转糖苷能力显著高于野生型酶，同时其对产物的水解能力也显著低于野生型酶，而且适用于中性高温反应环境。
8.突变体的转糖苷催化产物分析
通过液相色谱法分析转糖苷催化产物组成，液相色谱分析体检如下：
(1)HPLC条件：色谱柱温度维持在(45±0.5)℃/30℃；；流动相流量1.0mL/min，进样体积20μL；
(2)蒸发光散射检测器:温度45℃，N2压力3.0×105Pa；
(3)流动相乙腈/水＝77/23(V/V)
相同反应时间(50h)及加酶量(含92mU酶)条件下，野生型酶及Ox-E303C/F341S以乳糖(500mM)为底物，反应产物的液相色谱分析结果如图5所示。
结果显示，野生型酶的反应产物中，由于乳糖全部被水解为半乳糖和葡萄糖，二者在液相中很难被完全分离，显示为一个峰(如图5A)；双点突变体酶Ox-E303C/F341S在20h催化反应体系中，形成了新的产物峰，分子量大于单糖和双糖，尽管其具体聚合度通过液相暂不能确定(如图5B)，但可以表明其应为大于二糖的低聚糖，同时由于其水解能力显著低于野生型酶，反应体系中残留了一部分乳糖。
以上结果表明，Ox-E303C/F341S相对野生型酶其水解活性低，转糖苷活性提高，且降低了催化过程中对产物的降解能力。
综上所述，本发明的双点突变体相对野生型酶降低了水解活性低，提高了转糖基活性，并同时降低了其对合成产物的降解能力。此外，本发明的酶适用于pH为中性、60-70℃的高温度条件下，能够催化乳糖水解与低聚半乳糖合成，实现了转糖苷活性的高效改造。并在提高转糖苷活性的同时，抑制了水解催化活性的反向水解作用，有效提高了低聚半乳糖的合成量。
经过以上的研究过程，本发明以耐热β-半乳糖苷酶BgaB突变体酶F341S为基因改造对象，通过其E303位点的定点突变，获得了兼具高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶BgaB双点突变体。
本发明的有益效果还体现于对研究方法的改进。正如对比现有技术的CN201410148999所示，目前本研究领域以半理性分子设计的基因工程方法为主。这种方法的主要缺陷为，突变体的成功获得需要依靠生物信息学及预测算法的准确性，同时还需要配合高灵敏度较高的高通量筛选方法，操作繁杂且成功率相对较低。这种方法应用于转糖苷活性的改造时，由于筛选的单向性，不能有效的兼顾水解活性对转糖催化效率的影响作用，导致筛选所得转糖苷活性提高突变体存在水解活性同时提高的现象。针对目前的研究现况，本发明将定点突变与化学修饰相结合的基因改造方法，首次成功应用于β-半乳糖苷酶的双向催化功能改造，开发了一种不依赖高通量活性筛选的高效定向功能改造方法。

Claims (10)

1.一种兼具高转糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体，其特征在于该突变体是对β-半乳糖苷酶BgaB的E303和F341两个位点进行定点突变，其中，E303点位由原谷氨酸Glu突变为半胱氨酸Cys，F341点位由原苯丙氨酸Phe突变为丝氨酸Ser，然后将双点突变体经KI氧化处理所得。
2.根据权利要求1所述的β-半乳糖苷酶双点突变体，其特征在于所述β-半乳糖苷酶是嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB。
3.根据权利要求1所述的β-半乳糖苷酶双点突变体，其特征在于所述KI的浓度为0.2M或以上。
4.一种兼具高转糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体的制备方法，其特征在于该制备方法的步骤如下：
A、双点突变体酶的构建
以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的突变体耐热β-半乳糖苷酶基因BgaB’质粒pKK223-3-bgaB-F341S为模板，以快速全质粒扩增突变法对位点E303构建半胱氨酸Cys替换单点突变体，得到相对于原始基因发生了双点突变的酶基因E303C/F341S；
B、双点突变体酶的表达与纯化
将全质粒扩增得到的双点突变PCR片段经胶回收及双酶切后，与pKK223-3载体的双酶切产物进行连接，并转化至大肠杆菌JM109感受态细胞；挑取重组菌单克隆接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性培养基中，37℃下摇床振荡培养过夜，按以体积比计1％接种量将种子液接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养；当OD600达到0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，20℃过夜诱导表达后，对发酵液进行离心，去上清、收集菌体，再以5～10倍体积100mM磷酸缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破壁，得到破胞液；将破胞液进行热处理去除不耐热的杂蛋白后，离心收集上清液，得到粗酶液；将上述粗酶液经0.22μm滤膜过滤，再用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液，然后用50mM pH 7.0磷酸缓冲液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩制得纯化的突变体酶；
C、突变体酶的氧化
将步骤B得到的突变体酶进行氧化反应；氧化反应体系如下：100μL 0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液、0.2M或以上KI溶液、10μM Br、3μM突变体酶，在温度25℃条件下处理30h，得到所述高转糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤A中，使用如下引物进行扩增：
E303C/F341S上游引物：
5’-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3’E303C/F341S下游引物：
5’-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3’
PCR反应条件为：94℃预变性2min；95℃变性30s；58℃～64℃30s；68℃7min，16个循环后,最后68℃延伸15min；
PCR反应体系如下：
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤B中超声波破壁的工作条件为：功率400W循环工作，每个循环包括工作1s和停止9s，总破壁时间为30min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤B的热处理条件为破胞液在55℃下热处理30min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤B中，用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液的过程如下：向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2～3倍体积的含20mM咪唑的Binding buffer自然洗脱；再将经0.22μm滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱充分结合，待样品流干后分别用6倍柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质，最后用4倍Elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液；
所述Washing buffer分别含咪唑20mM、80mM、100mM；所述Elution buffer含250mM咪唑。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤C中KI溶液浓度为0.2-0.3M。
10.权利要求1-3中任一项权利要求所述的高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体或根据权利要求4-9中任一项制备方法得到的高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体在生产低聚半乳糖中的用途。
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